Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar

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Summary

Para melhorar os testes diagnósticos sorológicos para antígenos de tuberculose mycobacterium, desenvolvemos nanoprobes de óxido de ferro superparamagnético para detectar tuberculose extrapulmonar.

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

Uma sonda de imagem molecular composta por nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) e anticorpo de superfície mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) foi sintetizada para aumentar a sensibilidade à imagem para tuberculose extrapulmonar (ETB). Uma nanosonda SPIO foi sintetizada e conjugada com MtbsAb. A nanoprobe SPIO-MtbsAb purificada foi caracterizada usando TEM e NMR. Para determinar a capacidade de direcionamento da sonda, as nanoprobes SPIO-MtbsAb foram incubadas com Mtb para ensaios de imagem in vitro e injetadas em camundongos inoculados em Mtb para investigação in vivo com ressonância magnética (MR). A redução do aumento do contraste na ressonância magnética (Ressonância Magnética) das células Mtb e THP1 mostrou-se proporcional à concentração de nanoprobe SPIO-MtbsAb. Após 30 min de injeção de nanosonda SPIO-MtbsAb intravenosa em camundongos infectados por Mtb, a intensidade do sinal do sítio granulomatoso foi reforçada por 14 vezes nas imagens de MR ponderadas t2 em comparação com a dos camundongos que recebem injeção de PBS. As nanoprobes MtbsAb podem ser usadas como uma nova modalidade para detecção de ETB.

Introduction

Globalmente, a tuberculose extrapulmonar (ETB) representa uma proporção significativa de casos de tuberculose (TB). No entanto, o diagnóstico de ETB é muitas vezes perdido ou atrasado devido à sua apresentação clínica insidiosa e ao baixo desempenho nos testes diagnósticos; resultados falsos incluem manchas de esputados negativos para bacilos rápidos ácidos, falta de tecido granulomatoso na histopatologia ou falha na cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Em relação aos casos típicos, o ETB ocorre com menos frequência e envolve pouca libertação do bacilo Mtb. Além disso, geralmente é localizado em locais de difícil acesso, como linfonodos, pleura e áreas osteoarticulares1. Assim, os procedimentos invasivos para a obtenção de amostras clínicas adequadas, o que torna a confirmação bacteriológica arriscada e difícil, são essenciais2,3,4.

Testes de detecção de anticorpos disponíveis comercialmente para ETB não são confiáveis para detecção clínica devido à sua ampla gama de sensibilidade (0,00-1,00) e especificidade (0,59-1,00) para todos os locais extrapulmonares combinados5. Ensaios imunospotas ligados à enzima (ELISPOT) para interferon-γ, proteína filtrante de cultura (PCP) e alvo antigênico secreto (ESAT) precoce têm sido usados para diagnosticar tb latente e ativa. No entanto, os resultados variam entre diferentes locais da doença para o diagnóstico de ETB6,7,8. Além disso, o PPD da pele (derivado de proteína purificada) e a QuantiFERON-TB frequentemente forneceram resultados negativos falsos9. QuantiFERON-TB-2G é um ensaio de reatividade imunoambiental sanguínea inteiro, que não requer umespécime do órgão afetado e esta pode ser uma ferramenta de diagnóstico alternativa6,10,11. Outros métodos diagnósticos tipicamente utilizados para meningite de TB, como a reação da cadeia de polimerase, ainda são muito insensíveis para excluir com confiança o diagnóstico clínico12,13. Estes testes convencionais demonstram informações diagnósticas insuficientes para descobrir o local da infecção extrapulmonar. Assim, novas modalidades diagnósticas são clinicamente exigidas.

A imagem molecular visa projetar novas ferramentas que possam rastrear diretamente alvos moleculares específicos de processos de doenças em14,15. Óxido de ferro superparamagnético (SPIO), um agente de contraste nmr ponderado t2, pode aumentar significativamente a especificidade e sensibilidade da imagem de ressonância magnética (MR) (MrI)16,17. Esta nova modalidade de imagem funcional pode esboçar precisamente as alterações teciduais no nível molecular através de interações ligand receptores. Neste estudo, uma nova sonda de imagem molecular, composta por nanopartículas SPIO, foi sintetizada para conjugar com anticorpo superficial Mtb (MtbsAb) para diagnóstico de ETB. As nanosondas spio são minimamente invasivas a tecidos e corpos exame18,19. Além disso, essas nanoprobes podem demonstrar imagens precisas de Mr em baixas concentrações devido às suas propriedades paramagnéticas. Além disso, as nanosondas SPIO parecem provocar reações menos alérgicas porque a presença de íons de ferro faz parte da fisiologia normal. Aqui, foram avaliadas a sensibilidade e especificidade das nanoprobes SPIO-MtbsAb voltadas para o ETB em modelos celulares e animais. Os desfechos demonstraram que as nanoprobes eram aplicáveis como agentes de imagem ultrasensíveis para o diagnóstico de ETB.

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Protocol

Todo o protocolo em relação ao experimento animal segue os procedimentos operacionais padrão para a criação de animais laboratoriais de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais (8ª Edição, 2011) e é aprovado pelo Instituto Nacional de Diretrizes de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais (8ª Edição, 2011) e aprovado pelo comitê institucional de cuidados e animais.

1. Síntese de nanopartículas spio

  1. Prepare nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestida de dextran, mexendo vigorosamente uma mistura de soluções Dextran T-40 (5 mL; 50% w/w) e FeCl3×6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) e FeCl2×4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) em temperatura ambiente.
  2. Adicione NH4OH (10 mL; 7,5% v/v) rapidamente.
  3. Ainda agita a suspensão preta por 1h; posteriormente, centrífuga a 17.300 x g por 10 min e, em seguida, remover os agregados.
  4. Separe os produtos SPIO finais do T-40 dextran unbound dextran by gel filtration chromatography20.
  5. Carregue a mistura de reação (volume total = 5 mL) em uma coluna de 2,5 cm × 33 cm e lute com uma solução tampão contendo 0,1 M Na acetato e 0,15 M NaCl no pH 7.0.
  6. Colete as nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestida suspida purificada no volume vazio e rediga que a coluna se esluata para ferro e dextran a 330 e 490 nm usando ácido clorídrico e os métodos de ácido fenol/sulfúrico20, respectivamente.

2. Síntese SPIO-MtbsAb

  1. EdBE conjugado pelo Synthesize spio usando métodos relatados anteriormente21,22.
  2. Anidrida sinthesize SPIO-EDBE-succinic (SA).
    1. Mexa uma solução alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) de SPIO-EDBE e SA (1 g; 10 μmol) em temperatura ambiente por 24 h.
    2. Difundir a solução com 20 alterações de 2 L de água destilada usando tubos de membrana porosa molecular (corte de 12.000-14.000 MW). 6 h para cada mudança.
  3. Por fim, adicione 100 μL de SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL da Fe) a 400 μL de 4,5 mg/mL MtbsAb para sintetizar SPIO-MtbsAb usando 1-hidroxibenzotriazol e (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfato como catalisadores e agitam a solução em temperatura ambiente por 24 h.
  4. Por fim, separe as soluções do anticorpo sem limites através da cromatografia de filtragem de gel.
  5. Carregue a mistura de reação (5 mL) na coluna de 2,5 cm × 33 cm e lute usando um tampão PBS. Confirme o complexo de ab-nanopartículas (ou seja, nanoprobe) usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinchoníco23.

3. Observação de morfologia de partículas e medição de nível de relaxamento

  1. Examine o tamanho médio da partícula, a morfologia e a distribuição de tamanho usando microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de 100 kV.
    1. Lançar a dispersão composta em uma grade de cobre de 200 malhas e secar o ar à temperatura ambiente antes de carregá-la no microscópio.
  2. Meça os valores de tempo de relaxamento (T1 e T2) das nanoprobes utilizando o relaxômetro nmr a 20 MHz e 37,0 °C ± 0,1 °C.
    1. Calibrar o relaxômetro antes de cada medição.
    2. Registre os valores r1 e r2 dos oito pontos de dados gerados através da inversão-recuperação e da sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivamente, para determinar as relaxividades r1 e r2 2.

4. Imagem celular

  1. Cultivar monocitos humanos THP-1 em RPMI 1640 com soro bovino 10% fetal, 50 μg/mL gentamicina sulfato, 100 unidades/mL penicilina G sódio, 100 μg de sulfato de estreptomicina e 0,25 μg/mL fungizone em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C.
  2. Incubato SPIO-MtbsAb nanoprobes (2 mM) com 106 unidades de formação de colônias (CFU) de Mycobacterium bovis BCG preincubados com 1 × 107 monocitos ativados em tubos de microcentrífuga (1 mL) em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C por 1 h.
  3. Tubos de centrífuga a 200 x g e descartar o supernatante. Redissolva pelotas no meio (200 μL).
  4. Escaneie as amostras usando uma sequência rápida de pulso de eco gradiente (Tempo de repetição (TR) = 500; Tempo de eco (TE) = 20; Ângulo de flip = 10°) através da ressonância magnética 3.0-T para determinar a especificidade e sensibilidade da nanoprobe21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) inoculação

  1. Reconstituir a vacina liofilizada ou o estoque bacteriano no meio de Sauton e, em seguida, diluir o estoque com soro fisiológico até se dispersar adequadamente como descrito anteriormente24.
  2. Inocular uma cepa atenuada ao vivo de M. bovis BCG, obtida da ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (cepa Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a um volume de 0,1 mL/mouse (ou seja, 107 CFU) intradermally na pele dorsal esquerda ou direita de camundongos, como descrito anteriormente23. Injete salina em camundongos como controle negativo. Monitore os animais diariamente após a inoculação do BCG.
  3. Sacrificar animais 1 mês após a inoculação de bactérias usando eutanásia de dióxido de carbono. Retire o tecido do local de inoculação intradermal. Fixar o tecido em 10% de formalina e incorporar em parafina para seções seriais a 5-10 μm. Seções de tecido manchacom as manchas hematoxilina/eosina e manchas ziehl-neelsen para bactérias rápidas ácidas24 e com azul de Berlim para ferro-féico25.

6. In vivo MRI

  1. Injetar cetamina (80 mg/kg de peso corporal) e xilazina (12 mg/kg de peso corporal) subcutâneamente em camundongos para anestesia animal.
  2. Injete sondas SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) em veias traseiras de camundongos. Ratos de imagem MR antes e imediatamente após a injeção de sonda e, em seguida, a cada 5 min por 30 min para adquirir imagens de spin-echo rápido ponderadas t2 (TR = 3000; TE = 90; campo de visão = 8).
  3. Analisar quantitativamente todas as imagens de Mr utilizando intensidade de sinal (SI), uma medição de regiões definidas de interesse em locais comparáveis de um centro de granuloma Mtb e o músculo traseiro adjacente a uma área granulomatosa.
  4. Calcule os aprimoramentos relativos do sinal usando a medição si antes (SIpre; controle) e 0-3 h após a injeção (SIpost) dos agentes de contraste usando a fórmula

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100

    onde o SIpre é o SI da lesão na varredura pré-aprimorada e o SIpost é o SI da lesão na varredura pós-aprimorada21,22.

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Representative Results

Síntese e caracterização de nanoprobe SPIO-MtbsAb
As nanopartículas spio foram projetadas para conjugar com MtbsAb. O dextran estabilizado na superfície das nanopartículas SPIO foi cruzado por epichlorohydrin. As nanopartículas spio foram posteriormente incorporadas ao EDBE para ativar grupos funcionais primários de amina nas extremidades dextran. SA foi então conjugado para formar SPIO-EDBE-SA. Nanoprobes SPIO-MtbsAb formaram-se na etapa final através da conjugação de MtbsAb com SPIO-EDBE-SA na presença dos agentes de acoplamento. A imagem TEM das nanoprobes SPIO-MtbsAb(Figura 1)demonstra que as nanoprobes SPIO-MtbsAb tiveram uma aparência bem dispersa. O tamanho médio do núcleo spio-MtbsAb nanoprobe foi de 3,8 ± 0,4 nm (cálculo de 200 partículas).

Na solução aquosa, os valores de relaxamento, r1 e r2, das nanoprobes foram 23 ± 3 e 151 ± 8 mM-1s-1, respectivamente, a 20 MHz e 37,0 °C ± 0,1 °C. A proporção r1/r2 de nanoprobes SPIO-MtbsAb foi semelhante à do Resovist; no entanto, r1 e r2 de Resovist (26 e 164 mM-1s-1, respectivamente) foram um pouco maiores do que os de nanoprobes SPIO-MtbsAb.

Caracterização e imagem de nanoprobe SPIO-MtbsAb in vitro
Primeiro, detectamos M. bovis BCG, uma bactéria ácida-rápida, através da coloração Ziehl-Neelsen (Figura 2A). As bactérias foram isoladas e depois cultivadas com sondas contendo ferro férrico, identificáveis através da coloração azul de Berlim(Figura 2B). O grau de mira de Mtb de nanoprobe SPIO-MtbsAb foi determinado através de ressonância magnética ponderada por T2; o aprimoramento negativo foi proporcional à quantidade de sondas ligadas à célula bacteriana. A diminuição do SI na presença das nanoprobes ocorreu de forma dependente de concentração (Figura 2C). Às 2, 1 e 0,5 mM, as nanosondas conjugadas com Mtb apresentaram IsIs de 97,67 ± 3,05, 131,67 ± 4,51 e 257,33 ± 5,03, respectivamente, todas maiores o SI de 90,75 ± 2,47 para 1 mM nanosonda não conjugada. Em comparação com pbs (SI = 1073,43 ± 13,62), quase nenhuma redução de sinal foi observada no grupo somente tb (SI = 957,33 ± 12,53). Assim, sondas SPIO especificamente visaram bacilo Mtb; além disso, nas imagens aprimoradas de Mr, o SI diminuiu com aumento na quantidade de nanopartículas SPIO.

Da mesma forma, as reduções no SI em imagens de Ressonância Magnética aprimoradas foram notadas 1h após o cultivo de monocitos THP-1 com as nanoprobes. Observou-se redução significativa das concentrações si do grupo TB quando foram empregadas concentrações de 1 mM (SI = 225,33 ± 8,58) e 2 mM (SI = 104 ± 2,16) concentrações das nanoprobes em comparação com os grupos administrados apenas com PBS (SI = 1005,33 ± 16,74) ou não administrados com o nanopr obe (SI = 991 ± 8,98). A redução do Ressonância Magnética nos grupos Mtb para nanoprobes de 1 e 2 mM foi comparável à do grupo positivo de nanosonda de 1 mM (SI = 112,33 ± 3,68). De acordo com os resultados acima, as nanoprobes SPIO-MtbsAb poderiam ajudar no monitoramento do tráfico monocito THP-1 ativado por nanosonda.

Em imagens de nanoprobe spio-MtbsAb ao vivo
Após a imagem celular, determinamos a eficácia da ressonância magnética in vivo para ETB. Nanoprobes SPIO-MtbsAb foram intravenosamente injetados em camundongos infectados por Mtb. Um sinal mr claramente detectável foi notado na área granulomatosa Mtb 0,5 h após a injeção; no entanto, o Maior IS para o fundo foi observado após 1h de injeção. Observou-se redução significativa da sinalização mr na área de Granulomatos(Figura 3). O SI foi medido antes (SIpre) e após a injeção de agente de contraste (SIpost). Uma hora após a injeção de sonda, o aprimoramento ponderado pelo T2 da redução de sinal nas áreas granulamatos de Mtb(Figura 3B) foi aproximadamente 14 vezes maior do que nos locais de controle (Figura 3A; -1,68% ± 1,32% e -23,43% ± 7,24%; p < 0,001).

Avaliação histológica e imunohistoquímica de nanoprobes SPIO-MtbsAb
Um granuloma subcutâneo foi desenvolvido 1 mês após a infecção em camundongos C57BL/6. A nova vascularização sanguínea foi notada dentro dessas lesões, juntamente com agregados linfócitos e epithelioides-macrófagos. O granuloma organizado tinha crescido progressivamente (Figura 4A). A correlação das lesões de TB com sinais de Ressonância Magnética SPIO-MtbsAb foi ainda mais determinada através da reação imunohistoquímica do antígeno superficial Mtb com anti-MtbsAb. A expressão positiva de MtbsAb foi revelada nas áreas granulomatosas (Figura 4B),com bacilos ácido-rápidos positivos no local da lesão (Figura 4C). O azul-berlim, uma mancha ferric-positiva de ferro, foi usado para determinar a sensibilidade das sondas para a sonda SPIO azul-positiva de Mtb. Berlin foi encontrada no mesmo local que mtbsAb (Figura 4D). Todos os pares colocalizados foram mostrados na Figura 4A-D.

Figure 1
Figura 1: Tamanho médio do núcleo de nanoprobes SPIO-MtbsAb em TEM. O tamanho médio do núcleo spio-MtbsAb nanoprobe foi de 3,8 ± 0,4 nm, medido por meio de análise de imagem TEM (cálculo de 200 partículas). Barra de escala = 15 nm. Esse número foi modificado do nosso estudo anterior26. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Caracterização in vitro da nanoprobe SPIO-MtbsAb. Os bacilos ácido-rápidos são identificados através(A) coloração ziehl-neelsen e (B) a conjugação do ferro ferric da nanosonda para bactérias identificadas através da coloração azul de Berlim. (C)Ressonância Magnética ponderada com T2 apresentando aprimoramento negativo após as nanoprobes SPIO-MtbsAb serem incubadas com Mtb. Eliminação da dose de SI que ocorre- dependente após a incorporação das nanoprobes com Mtb: (1) 90,75 ± 2,47 (Sonda 1,0 mM); (2) 97,67 ± 3,05 (Mtb + 2,0 mM Sonda); (3) 131,67 ± 4,51 (Mtb +1,0 mM Sonda); (4) 257,33 ± 5,03 (Mtb + 0,5 mM Sonda); (5) 957,33 ± 12,53 (Mtb +0 mM Probe); (6) 1073,43 ± 13,62 (PBS). Não há redução detectável de sinal observada no grupo controle pbs. (D) Aumento negativo dependente de dose em monócitos THP-1 1 h após a incubação com as nanoprobes. Barras de escala em (C) e (D) são 5 mm. Esse número foi modificado do nosso estudo anterior26. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: In vivo SPIO-MtbsAb nanoprobes em lesões etb subcutâneas de c57BL/6 mouse. (A) Controle e (B) áreas granulomatosa mtb. Uma redução significativa de 14 vezes na sinalização mr é encontrada nas áreas granulomatosas Mtb em comparação com as áreas de controle 1h após a administração de sondas (-1,68% ± 1,32% vs. -23,43% ± 7,24%, p < 0,001). Os resultados são dados como meio ± SDs. Comparações estatísticas utilizadas nos testes t do estudante de duas caudas. p < 0,05 foi considerado significativo. Esse número foi modificado do nosso estudo anterior26. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Correlações de histologia, imunohistoquímica, ácido-rápido, e coloração azul de Berlim. Histologia de áreas granulomatosas mtb predominantemente demonstrando linfócitos e macrófagos epitelióides. A neovascularização e a agregação abundante de linfócitos e macrófagos epitelióides observados nessas lesões. (A) Grânulos organizados aparentando se desenvolver progressivamente. (B) A coloração imunohistoquímica demonstra ndo a expressão mtbsAb nas lesões granulomatosas, enquantobacilosácido-rápidos estão espalhados nas mesmas áreas. (D)Sondas SPIO de coloração azul de Berlim são encontradas nas áreas de MtbsAb colocalizadas. A coloração azul de Berlim para ferro-férrico demonstra conjugação de sondas para barras de escala Mtb. Esse número foi modificado do nosso estudo anterior26. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

Semelhante aos estudos relevantes, nossos achados sobre nanoprobes SPIO-MtbsAb demonstraram uma especificidade significativa para Mtb27,28. O subcutâneo Mtb granuloma foi encontrado 1 mês após injeção de TB nos modelos do mouse. Os achados típicos de histologia granulomatosa da TB incluíram infiltração linfócito, presença de macrófagos epitelióides e neovascularização. Bacilos rápidos de ácido foram espalhados nas lesões de TB, corroborando os achados de imunohistoquímica MtbsAb. Isso indicou uma reação imunológica entre antígeno superficial Mtb e MtbsAb. O azul de Berlim destacou as mesmas áreas com MtbsAb, corroborando a especificidade das sondas para conjugação com Mtb rápido ácido.

Notavelmente, a extensão do aumento negativo do contraste na ressonância magnética para células Mtb e THP1 monocíticos foi proporcional à concentração de nanoprobe SPIO-MtbsAb. Quando os camundongos com granulomas Mtb foram administrados nanoprobes SPIO-MtbsAb, uma redução de sinal de 14 vezes no local granulomatoso foi notada em imagens de MR ponderadas pelo T2 em comparação com um local oposto com injeção de PBS. Isso indica um acúmulo significativo do agente de contraste. Os resultados demonstram a possibilidade de obtenção de direcionamento específico do agente de contraste, o que poderia reduzir a exigência de dose para o diagnóstico clínico.

Nossos achados indicam que essas nanoprobes acumulam um volume detectável em lesões granulomatosas Mtb. Esses resultados podem ser confirmados desenvolvendo uma nanosonda SPIO usando anti-hMtbsAb. Como o núcleo de óxido de ferro magnético do SPIO foi aplicado para induzir o encurtamento t2 em agentes de contraste de ressonância magnética, os achados sugerem uma abordagem prática e não invasiva para detectar comportamentos celulares semelhantes para aplicações de diagnóstico clínico.

Aqui, fornecemos o protocolo composto por 2 partes: as seções 4 a 6 são imagens de células e animais. As técnicas abrangem o cultivo celular, experimentos em animais e imagens ópticas. Seções 1 a 3 são sintetas de sonda. Alguns passos críticos ajudarão a replicar o experimento. O passo crítico da síntese de nanopartículas SPIO é preparar uma nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestido de dextran; é crucial agitar vigorosamente e misturar completamente as soluções Dextran T-40, FeCl3-6H2O e FeCl2-4H2O a uma temperatura ambiente. O passo crítico para a seção 2, síntese SPIO-MtbsAb,é conjugar MtbsAb para SPIO-EDBE-SA para sintetizar SPIO-MtbsAb. Para selecionar os catalisadores apropriados e agitar adequadamente a solução à temperatura ambiente também são críticos. E o passo crítico para a seção 3, observação de morfologia de partículas e medição de nível de relaxamento, é calibrar o relaxômetro antes de cada medição. Para calcular precisamente o tamanho das sondas, uma calibração do relaxômetro também é crucial.

Neste estudo, foram utilizados M. bovis BCG e rabbit anti-Mtb. A crossreactivity de fontes bovina e de coelhos foi considerada leve, embora os dados tenham provado que o SPIO conjugado pela MtbsAb revelou fortes interações com m. bovis BCG. Nossa descoberta sugeriu que as nanosondas SPIO visam especificamente a TB. A incubação de bactérias nanoprobe e Mtb mostrou uma dose de forma de aprimoramento negativa dependente, enquanto a diminuição do aprimoramento observado para nanoprobes SPIO na ressonância magnética estava correlacionada com a existência de partículas SPIO. Com base em nossos dados, novas pesquisas para explorar possíveis abordagens de conjugação de anticorpos para melhorar a especificidade da nanosonda seriam bem-vindas.

Estudos anteriores demonstram que o SPIO mostra citotoxicidade mínima sem alterar a atividade celular em uma concentração utilizada neste estudo29,30. De acordo com pesquisas anteriores, nossos resultados demonstraram efeito mínimo das nanoprobes SPIO para as células THP-1. As células THP-1 foram incubadas com nanoprobes SPIO com conjugação de bactérias por 1 hora. O SI apresentou um declínio significativo nos grupos Mtb com concentração de 1 mM ou 2 mM nanoprobes, comparando-se ao grupo de controle sem tratamento de nanosonda ou PBS sozinho. O resultado suporta a segurança da nanosonda SPIO, e mais estudos aplicando outras cargas bacterianas para validar a sensibilidade da nanoprobe é bem-vinda.

Uma limitação do nosso estudo foi que não quantificamos a biodistribuição da nanosonda SPIO-MtbsAb em camundongos. Além disso, não investigamos a meia-vida intravascular e a deposição hepática da nanosonda, o que poderia alterar o tempo de exposição das sondas às células THP-1 localizadas nas lesões de Mtb. Mais pesquisas sobre biodegradação são justificadas. Além disso, a ressonância magnética não poderia diferenciar se as nanoprobes SPIO poderiam se ligar especificamente a bactérias ou monocitos ou se essas sondas foram endócitos.

Em conclusão, desenvolvemos um protocolo claro e viável para preparar e caracterizar nanoprobes SPIO-MtbsAb biocompatíveis. Essas nanosondas são hidrofônicas e se dispersam bem condições fisiológicas; eles são minimamente citotóxicos em baixas concentrações. Além disso, esses nanoprobes SPIO-MtbsAb permitem a segmentação e detecção da infecção por Mtb, como demonstrado por nossos estudos in vitro e in vivo. Assim, as nanoprobes SPIO-MtbsAb podem ser aplicadas como agentes de contraste de ressonância magnética para detecção de ETB.

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Disclosures

Nenhum dos autores tem interesse proprietário nos materiais examinados neste estudo.

Acknowledgments

Os autores são gratos pelo apoio financeiro do Ministério da Economia taiwan (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) para realizar este trabalho de pesquisa. Este manuscrito foi editado pela Edição Acadêmica wallace.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

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References

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