Synthèse, caractérisation et application de nanosons à oxyde de fer superparamagnetic pour la détection de la tuberculose extrapulmonaire

Medicine

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Summary

Pour améliorer les tests de diagnostic sérologiques pour les antigènes de mycobacterium tuberculosis, nous avons développé des nanosondes d’oxyde de fer superparamagnetic pour détecter la tuberculose extrapulmonaire.

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

Une sonde d’imagerie moléculaire comprenant des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnetic (SPIO) et un anticorps de surface De mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) a été synthétisée pour améliorer la sensibilité d’imagerie pour la tuberculose extrapulmonaire (ETB). Une nanosonde SPIO a été synthétisée et conjuguée avec MtbsAb. La nanoprobe purifiée de SPIO-MtbsAb a été caractérisée utilisant TEM et NMR. Pour déterminer la capacité de ciblage de la sonde, les nanosondes SPIO-MtbsAb ont été incubées avec Mtb pour des essais d’imagerie in vitro et injectées dans des souris inoculées par Mtb pour une recherche in vivo avec résonance magnétique (MR). La réduction d’amélioration de contraste sur la formation image de résonance magnétique (MRI) des cellules de Mtb et de THP1 a montré proportionnelle à la concentration de nanoprobe de SPIO-MtbsAb. Après 30 min d’injection intraveineuse de nanoprobe de SPIO-MtbsAb dans les souris Mtb-infectées, l’intensité de signal du site granulomatous a été augmentée par 14 fois dans les images de MR T2-weighted comparées à cela dans les souris recevant l’injection de PBS. Les nanosondes MtbsAb peuvent être utilisées comme une modalité nouvelle pour la détection ETB.

Introduction

À l’échelle mondiale, la tuberculose extrapulmonaire (ETB) représente une proportion importante des cas de tuberculose. Néanmoins, le diagnostic d’ETB est souvent manqué ou retardé en raison de sa présentation clinique insidieuse et de la performance pauvre sur des essais diagnostiques ; les faux résultats incluent des frottis de sputum négatifs pour les bacilles acide-rapide, le manque de tissu granulomatous sur l’histopathologie, ou l’échec à la culture Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Par rapport aux cas typiques, etB se produit moins fréquemment et implique peu de libération du bacille de Mtb. En outre, il est généralement localisé à des sites difficiles d’accès, tels que les ganglions lymphatiques, pleura, et les zones ostéo-articulaires1. Ainsi, les procédures invasives pour l’obtention de spécimens cliniques adéquats, ce qui rend la confirmation bactériologique risquée et difficile, sont essentielles2,3,4.

Les tests de détection d’anticorps disponibles dans le commerce pour etb ne sont pas fiables pour la détection clinique en raison de leur large gamme de sensibilité (0,00-1,00) et de leur spécificité (0,59-1,00) pour tous les sites extrapulmonaires combinés5. Des tests immunospot liés à l’enzyme (ELISPOT) pour l’interféron, la protéine de filtrate de culture (CFP) et la cible antigénique de sécrétion précoce (ESAT) ont été utilisés pour diagnostiquer la tuberculose latente et active. Cependant, les résultats varient entre les différents sites de la maladie pour diagnostiquer ETB6,7,8. En outre, la PPD de peau (dérivé purifié de protéine) et QuantiFERON-TB ont fréquemment fourni de faux résultats négatifs9. QuantiFERON-TB-2G est un test de réactivité immunitaire du sang entier, qui ne nécessite pas un spécimen de l’organe affecté et cela peut être un outil de diagnostic alternatif6,10,11. D’autres méthodes diagnostiques généralement utilisées pour la méningite tuberculeuse, comme la réaction en chaîne de polymérase, sont encore trop insensibles pour exclure en toute confiance le diagnostic clinique12,13. Ces tests conventionnels démontrent l’information diagnostique insuffisante pour découvrir le site d’infection extrapulmonaire. Ainsi, de nouvelles modalités diagnostiques sont cliniquement requises.

L’imagerie moléculaire vise à concevoir de nouveaux outils qui peuvent examiner directement les cibles moléculaires spécifiques des processus de la maladie in vivo14,15. L’oxyde de fer superparamagnetic (SPIO), un agent de contraste RmN pondéré par T2, peut augmenter de manière significative la spécificité et la sensibilité de l’imagerie par résonance magnétique (IRM)16,17. Cette nouvelle modalité d’imagerie fonctionnelle peut esquisser avec précision les changements tissulaires au niveau moléculaire par le biais d’interactions ligand-récepteur. Dans cette étude, une nouvelle sonde d’imagerie moléculaire, comprenant des nanoparticules DePIO, a été synthétisée pour conjuguer avec l’anticorps de surface DeMtb (MtbsAb) pour le diagnostic ETB. Les nanosondes SPIO sont peu invasives pour les tissus et les corps soumis à l’examen18,19. En outre, ces nanosondes peuvent démontrer des images précises de M. à de faibles concentrations en raison de leurs propriétés paramagnétiques. En outre, les nanosondes SPIO semblent susciter les réactions allergiques les moins graves parce que la présence d’ions de fer fait partie de la physiologie normale. Ici, la sensibilité et la spécificité des nanosondes SPIO-MtbsAb ciblant ETB ont été évaluées dans les modèles cellulaires et animaux. Les résultats ont démontré que les nanoprobes étaient applicables en tant qu’agents d’imagerie ultrasensibles pour le diagnostic d’ETB.

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Protocol

Tout protocole concernant l’expérimentation animale suit les procédures d’exploitation standard pour l’élevage d’animaux de laboratoire conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (8e édition, 2011) et est approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

1. Synthèse des nanoparticules SPIO

  1. Préparer des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer recouvertes de dextran en remuant vigoureusement un mélange de dextran T-40 (5 ml; 50 % w/w) et de FeCl aqueuse3x 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) et de FeCl2x 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) à température ambiante.
  2. Ajouter NH4OH (10 mL; 7,5% v/v) rapidement.
  3. Remuer encore la suspension noire pendant 1 h; par la suite, centrifugeuse à 17 300 x g pendant 10 min, puis retirer les agrégats.
  4. Séparer les produits SPIO finals de dextran T-40 non lié par la chromatographie de filtration de gel20.
  5. Chargez le mélange de réaction (volume total de 5 ml) dans une colonne de 2,5 cm à 33 cm et élichez-vous à l’abri d’une solution tampon contenant 0,1 M d’acétate Na et 0,15 M NaCl au pH 7,0.
  6. Recueillir les nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer purifiés enduits de dextran dans le volume vide et d’analyse de la colonne élute pour le fer et le dextran à 330 et 490 nm en utilisant l’acide chlorhydrique et les méthodes de phénol/acide sulfurique20, respectivement.

2. Synthèse SPIO-MtbsAb

  1. Synthétiser l’EDBE conjugué à SPIO à l’aide de méthodes précédemment signalées21,22.
  2. Synthétiser l’anhydride SPIO-EDBE-succinic (SA).
    1. Remuer une solution alcaline (5 M NaOH; 10 ml)) de SPIO-EDBE et SA (1 g; 10 'mol) à température ambiante pendant 24 h.
    2. Dialyser la solution avec 20 changements de 2 L d’eau distillée à l’aide d’un tube à membrane poreux moléculaire (coupure de 12 000 à 14 000 MW). 6 h pour chaque changement.
  3. Enfin, ajouter 100 oL de SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml de Fe) à 400 oL de MtbsAb de 4,5 mg/mL pour synthétiser SPIO-MtbsAb en utilisant 1-hydroxybenzotriazole et (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate comme catalyseurs et remuer la solution à température ambiante pendant 24 h.
  4. Enfin, séparer les solutions de l’anticorps non lié par la chromatographie de filtration de gel.
  5. Chargez le mélange de réaction (5 ml) sur une colonne de 2,5 cm à 33 cm et élichez-vous à l’aide d’un tampon PBS. Confirmer le complexe d’Ab-nanoparticules (c.-à-d. nanoprobe) à l’aide d’un kit d’analyse de protéines d’acide bicinchoninique23.

3. Observation de morphologie de particules et mesure de niveau de relaxation

  1. Examiner la taille moyenne des particules, la morphologie et la distribution de la taille à l’aide d’un microscope électronique de transmission à une tension de 100 kV.
    1. Déposer la dispersion composite sur une grille de cuivre de 200 mailles et sécher à l’air à température ambiante avant de la charger sur le microscope.
  2. Mesurer les valeurs de temps de relaxation (T1 et T2) des nanoprobes à l’aide du relaxomètre RMN à 20 MHz et 37,0 oC et 0,1 oC.
    1. Calibrer le relaxomètre avant chaque mesure.
    2. Enregistrez les valeurs r1 et r2 des huit points de données générés par l’inversion-récupération et la séquence d’impulsion Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivement, pour déterminer r1 et r2 relaxivités20.

4. Imagerie cellulaire

  1. Cultiver les monocytes humains THP-1 dans RPMI 1640 avec 10 % de sérum bovin fœtal, 50 g/mL de sulfate de gentamycine, 100 unités/mL de pénicilline G sodium, 100 g de sulfate de streptomycine et 0,25 g/mL de fongicides dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC.
  2. Incuber les nanosons SPIO-MtbsAb (2 mM) avec 106 unités de formation de colonies (CFU) de Mycobacterium bovis BCG préincubtées avec 1 à 107 monocytes activés dans des tubes microcentrifuges (1 ml) dans un incubateur de CO2 de 5 % à 37 oC pour 1 h.
  3. Tubes centrifugeà à 200 x g et jetez le supernatant. Redissoudrez les granulés dans le milieu (200 l).
  4. Scanner les échantillons à l’aide d’une séquence d’impulsion d’écho à gradient rapide (temps de répétition (TR) 500; Temps d’écho (TE) 20; Angle de basculement à 10 degrés) par IRM 3.0-T pour déterminer la spécificité et la sensibilité de la nanoprobe21,22.

5. Vaccination BCG (Bacillus Calmette-Guérin)

  1. Reconstituer le vaccin lyophilisé ou le stock bactérien dans le milieu de Sauton, puis diluer le stock avec salin jusqu’à ce qu’il soit correctement dispersé comme décrit précédemment24.
  2. Inoculer une souche vivante atténuée de M. bovis BCG, obtenue à partir d’ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (souche Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) à un volume de 0,1 ml/souris (c.-à-d., 107 CFU) intraderdement dans la peau scapulaire dorsal gauche ou droite de souris, comme décrit précédemment23. Injecter de la salin dans les souris comme contrôle négatif. Surveillez les animaux tous les jours après l’inoculation du BCG.
  3. Sacrifiez les animaux 1 mois après l’inoculation de bactéries utilisant l’euthanasie de dioxyde de carbone. Récoltez le tissu du site d’inoculation intradermique. Fixer le tissu en formaline à 10 % et incorporer dans la paraffine pour les sections de série à 5-10 m. Les sections de tissu de tache avec l’hématoxylin/eosin et les taches de Ziehl-Neelsen pour les bactéries acide-rapide24 et avec le bleu de Berlin pour le fer ferrique25.

6. IRM in vivo

  1. Injecter de la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) et de la xylazine (12 mg/kg de poids corporel) sous-cutanée chez les souris pour l’anesthésie animale.
  2. Injecter des sondes SPIO-TbsAb (2 nmol/200 l) dans les veines de la queue des souris. Souris d’image de M. avant et immédiatement après l’injection de sonde et puis toutes les 5 minutes pendant 30 min pour acquérir des images d’écho rapide de spin-écho T2 -(TR - 3000 ; TE 90; champ de vision no 8).
  3. Analyser quantitativement toutes les images MR à l’aide de l’intensité du signal (SI), une mesure des régions définies d’intérêt dans des endroits comparables d’un centre de granulome Mtb et le muscle arrière adjacent à une zone granulomateuse.
  4. Calculer les améliorations relatives du signal à l’aide de la mesure SI avant (SIpre; contrôle) et 0-3 h après l’injection (SIpost) des agents de contraste à l’aide de la formule

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] 100

    où SIpre est le SI de la lésion sur le scan pré-amélioré et SIpost est le SI de la lésion sur le scan post-amélioré21,22.

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Representative Results

Synthèse et caractérisation des nanosons SPIO-MtbsAb
Les nanoparticules SPIO ont été conçues pour se conjuguer avec MtbsAb. Le dextran stabilisé à la surface des nanoparticules SPIO a été relié par l’épichlorohydin. Les nanoparticules SPIO ont ensuite été incorporées avec EDBE pour activer les groupes fonctionnels primaires d’amine aux extrémités dextran. SA a ensuite été conjugué pour former SPIO-EDBE-SA. Les nanosondes SPIO-MtbsAb se sont formées dans la dernière étape par la conjugaison de MtbsAb avec SPIO-EDBE-SA en présence des agents de couplage. L’image TEM des nanosondes SPIO-MtbsAb (Figure 1) démontre que les nanosondes SPIO-MtbsAb avaient une apparence bien dispersée. La taille moyenne du noyau de nanoprobe SPIO-MtbsAb était de 3,8 à 0,4 nm (200 calculs de particules).

En solution aqueuse, les valeurs de détente, r1 et r2, des nanoprobes étaient de 23 à 3 et 151 à 8 mM-1s-1,respectivement, à 20 MHz et 37,0 oC et 0,1 oC. Le rapport r1/r2 des nanoprobes SPIO-MtbsAb était similaire à celui de Resovist; cependant, r1 et r2 de Resovist (26 et 164 mM-1s-1, respectivement) étaient un peu plus élevés que ceux des nanoprobes SPIO-MtbsAb.

Caractérisation et imagerie de nanoprobe sPIO-MtbsAb in vitro
Tout d’abord, nous avons détecté M. bovis BCG, une bactérie acide-rapide, par la coloration Ziehl-Neelsen (Figure 2A). Les bactéries ont été isolées puis cultivées avec des sondes contenant du fer ferrique, identifiables par la coloration bleue de Berlin (Figure 2B). Le degré de ciblage de Mtb de la nanoprobe de SPIO-MtbsAb a été déterminé par l’IRM T2-weighted ; l’amélioration négative a été proportionnée à la quantité de sondes attachées à la cellule bactérienne. La diminution de l’IS en présence des nanoprobes s’est produite d’une manière dépendante de la concentration (figure 2C). À 2, 1 et 0,5 mm, les nanoprobes conjuguées avec Mtb présentaient des Si de 97,67 à 3,05, 131,67 et 4,51 et 257,33 à 5,03, respectivement, toutes plus élevées que l’IS de 90,75 à 2,47 pour 1 mM de nanoprobe non conjuguée. Par rapport au PBS (SI 1073,43 - 13,62), presque aucune réduction du signal n’a été notée dans le groupe de la tuberculose seulement (SI 957,33 à 12,53). Ainsi, les sondes SPIO ciblaient spécifiquement les bacilles de Mtb; en outre, sur les images M améliorées, le SI a diminué avec l’augmentation de la quantité de nanoparticules SPIO.

De même, les réductions de SI sur les images améliorées de MR ont été notées 1 h après la culture des monocytes de THP-1 avec les nanoprobes. Une réduction significative de l’IS du groupe de la tuberculose a été notée lorsque 1 mM (SI 225,33 - 8,58) et 2 mM (SI - 104 - 2,16) concentrations des nanoprobes ont été utilisés par rapport aux groupes administrés avec PBS seulement (SI 1005,33 - 16,74) ou non administrés avec le nanopr obe (SI 991 à 8,98). La réduction de SI de MRI dans les groupes de Mtb pour 1 et 2 nanoprobes mM était comparable à celle dans le groupe positif de nanoprobe de 1 mM seul (SI 112.33 - 3.68). Selon les résultats ci-dessus, les nanosondes SPIO-MtbsAb pourraient aider à surveiller le trafic de monocytes THP-1 activé par les nanoprobes.

Imagerie in vivo de nanoprobe SPIO-MtbsAb
Après la formation image cellulaire, nous avons déterminé l’efficacité de l’IRM in vivo pour ETB. Les nanosondes SPIO-MtbsAb ont été injectées par voie intraveineuse à des souris infectées par Mtb. Un signal mM clairement détectable a été noté dans la zone granulomatetous de Mtb 0,5 h après injection; cependant, le SI le plus élevé à l’arrière-plan a été observé après 1 h d’injection. Une réduction significative de la signalisation MR a été constatée dans la zone granulomatetous de Mtb (figure 3). SI a été mesuré avant (SIpre) et après (SIpost) injection d’agent de contraste. Une heure après l’injection de la sonde, l’amélioration pondérée par T2 de la réduction du signal dans les zones granulamateuses de Mtb (figure 3B) était environ 14 fois plus élevée que celle des sites témoins(figure 3A;-1,68 % - 1,32 % et -23,43 % - 7,24 %; p lt; 0,001).

Évaluation histologique et immunohistochimique des nanosondes SPIO-MtbsAb
Un granulome sous-cutané a été développé 1 mois après infection dans les souris de C57BL/6. La nouvelle vascularisation de sang a été notée dans ces lésions avec le lymphocyte et les agrégats épithélioïdes-macrophages. Le granulome organisé s’était progressivement développé (Figure 4A). La corrélation des lésions de TB avec des signaux de Mr de SPIO-MtbsAb a été plus loin déterminée par la réaction immunohistochemical de l’antigène de surface de Mtb avec anti-MtbsAb. L’expression positive de MtbsAb a été révélée dans les secteurs granulomatous (figure 4B), avec la coloration acide-rapide de bacilles positive au site de lésion (figure 4C). Le bleu berlinois, une tache ferrique de fer positif, a été utilisé pour déterminer la sensibilité des sondes à la sonde SPIO bleu-positive de Berlin a été trouvée au même endroit que MtbsAb(figure 4D). Toutes les paires colocalisées ont été montrées dans la figure 4A-D.

Figure 1
Figure 1 : Taille centrale moyenne des nanosondes SPIO-MtbsAb dans TEM. La taille moyenne du noyau de nanoprobe SPIO-MtbsAb était de 3,8 à 0,4 nm, mesurée à l’aide de l’analyse d’image TEM (200 calculs de particules). Barre d’échelle de 15 nm. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation in vitro de la nanoprobe SPIO-MtbsAb. Les bacilles acides-rapides sont identifiés par (A) Ziehl-Neelsen coloration et (B) la conjugaison du fer ferrique de la nanoprobe aux bactéries identifiées par la coloration bleue de Berlin. (C) Irm pondérée par T2 affichant une amélioration négative après que les nanosondes SPIO-MtbsAb sont incubées avec Mtb. Élimination de SI se produisant dose-dépendante après l’incorporation des nanoprobes avec Mtb : (1) 90,75 - 2,47 (1,0 mM Sonde); (2) 97,67 à 3,05 (Mtb et 2,0 mM de sonde); (3) 131,67 à 4,51 (Mtb 1,0 mM Sonde); (4) 257,33 à 5,03 (Mtb - 0,5 mM Sonde); (5) 957,33 ' 12,53 (Mtb '0 mM Sonde); (6) 1073,43 à 13,62 (PBS). Aucune réduction détectable de signal notée dans le groupe témoin de PBS. (D) Amélioration négative dépendante de la dose dans les monocytes THP-1 1 h après l’incubation avec les nanoprobes. Les barres d’échelle en (C) et (D) sont de 5 mm. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Nanoprobes In vivo SPIO-MtbsAb dans les lésions etB sous-cutanées de la souris C57BL/6. (A) Contrôle et (B) Mtb zones granulomatetous. Une réduction significative de 14 fois de la signalisation MR est constatée dans les zones granulomateuses mtb par rapport aux zones de contrôle 1 h après l’administration de la sonde (-1,68% - 1,32% vs -23,43% - 7,24%, p 'lt; 0,001). Les résultats sont donnés par des moyens et des DD. Comparaisons statistiques utilisées à deux queues des tests t de l’étudiant. p lt; 0,05 a été considéré comme significatif. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Corrélations de l’histologie, de l’immunohistochimie, de l’acide-rapide, et de la coloration bleue de Berlin. Histologie des secteurs granulomatous de Mtb démontrant principalement des lymphocytes et des macrophages épithélioïdes. Néovascularisation et agrégation abondante des lymphocytes et des macrophages épithélioïdes observés dans ces lésions. (A) Les granulomes organisés semblent se développer progressivement. (B) Coloration immunohistochimique démontrant l’expression de MtbsAb dans les lésions granulomatetous, tandis que (C) les bacilles acid-fast sont dispersés dans les mêmes secteurs. (D) Des sondes SPIO à coloration bleue de Berlin se trouvent dans les zones colocalisées de MtbsAb. La coloration bleue de Berlin pour le fer ferrique démontre la conjugaison de sonde aux barres d’échelle de Mtb. sont 100 'm. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre étude précédente26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Semblable aux études pertinentes, nos résultats concernant les nanoprobes de SPIO-MtbsAb ont démontré une spécificité significative pour Mtb27,28. Le granulome sous-cutané de Mtb a été trouvé 1 mois après injection de tb dans les modèles de souris. Les résultats typiques d’histologie granulomatetous de TB ont inclus l’infiltration de lymphocyte, la présence des macrophages épithélioïdes, et la néovascularization. Des bacilles acide-rapides ont été dispersés dans les lésions de TB, corroborant les résultats d’immunohistochemistry de MtbsAb. Ceci a indiqué une réaction immunologique entre l’antigène de surface de Mtb et MtbsAb. Le bleu de Berlin a mis en évidence les mêmes zones avec MtbsAb, corroborant la spécificité des sondes pour la conjugaison avec l’acide-rapide Mtb.

Notamment, l’ampleur de l’amélioration négative de contraste sur MRI pour des cellules de Mtb et monocytic THP1 était proportionnelle à la concentration de nanoprobe de SPIO-MtbsAb. Quand des souris portant des granulomes de Mtb ont été administrées des nanoprobes de SPIO-MtbsAb, une réduction de signal 14 fois à l’emplacement granulomatous a été notée sur des images de MR T2-weighted comparées à un emplacement opposé avec l’injection de PBS. Cela indique une accumulation significative de l’agent de contraste. Les résultats démontrent une possibilité d’obtenir un ciblage spécifique de l’agent de contraste, ce qui pourrait réduire l’exigence de dose pour le diagnostic clinique.

Nos résultats indiquent que ces nanoprobes accumulent un volume détectable dans les lésions granulomatous de Mtb. Ces résultats peuvent être confirmés par le développement d’une nanoprobe SPIO utilisant anti-hMtbsAb. Comme le noyau magnétique d’oxyde de fer du SPIO a été appliqué pour induire le raccourcissement de T2 dans des agents de contraste de MRI, les résultats suggèrent une approche pratique et non invasive pour détecter des comportements cellulaires semblables pour des applications cliniques de diagnostic.

Ici, nous fournissons le protocole comprenant 2 parties : les sections 4 à 6 sont l’imagerie cellulaire et animale. Les techniques couvrent la culture cellulaire, les expériences animales et l’imagerie optique. Les sections 1 à 3 sont des synthèses de sonde. Certaines étapes critiques aideront à reproduire l’expérience. L’étape critique de la synthèse des nanoparticules SPIO consiste à préparer des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer recouvertes de dextran; il est crucial de remuer vigoureusement et de mélanger complètement les solutions Dextran T-40, aqueuse FeCl3-6H2O, et FeCl2-4H2O solutions à température ambiante. L’étape critique pour la section 2, la synthèse SPIO-MtbsAb, consiste à conjuguer MtbsAb à SPIO-EDBE-SA pour synthétiser SPIO-MtbsAb. Il est également essentiel de sélectionner les catalyseurs appropriés et de remuer adéquatement la solution à température ambiante. Et l’étape critique pour la section 3, observation de la morphologie des particules et la mesure de niveau de relaxation, est de calibrer le relaxomètre avant chaque mesure. Afin de calculer avec précision la taille des sondes, un étalonnage du relaxomètre est également crucial.

Dans cette étude, M. bovis BCG et lapin anti-Mtb ont été utilisés. La croisement des sources bovines et de lapin a été considérée comme bénigne, bien que les données aient prouvé que le SPIO conjugué par MtbsAb a révélé de fortes interactions avec M. bovis BCG. Notre conclusion a suggéré que les nanosondes de SPIO ciblent spécifiquement la tuberculose. L’incubation des nanoprobes et des bactéries Mtb a montré une manière négative d’amélioration dose-dépendante, tandis que la diminution de l’amélioration observée pour les nanosondes SPIO sur MRI a été corrélée avec l’existence des particules DePIO. D’après nos données, d’autres recherches visant à explorer d’éventuelles approches de conjugaison d’anticorps afin d’améliorer la spécificité de la nanosonde seraient les bienvenues.

Des études antérieures démontrent que SPIO montre une cytotoxicité minimale sans altérer l’activité cellulaire à une concentration utilisée dans cette étude29,30. En accord avec la recherche antérieure, nos résultats ont démontré l’effet minimal des nanoprobes de SPIO aux cellules de THP-1. Les cellules THP-1 ont été incubées avec des nanosondes SPIO avec conjugaison de bactéries pendant 1 heure. SI a présenté un déclin significatif dans les groupes de Mtb avec la concentration de 1 mM ou 2 mM nanoprobes, comparant au groupe témoin sans traitement de nanoprobe ou PBS seul. Le résultat soutient l’innocuité de la nanosonde SPIO, et d’autres études appliquant d’autres charges bactériennes pour valider la sensibilité de la nanosonde sont les bienvenues.

L’une des limites de notre étude était que nous n’avons pas quantifié la biodistribution de la nanosonde SPIO-MtbsAb chez la souris. En outre, nous n’avons pas étudié la demi-vie intravasculaire et le dépôt de foie de la nanoprobe, qui pourrait modifier le temps d’exposition des sondes aux cellules de THP-1 situées aux lésions de Mtb. D’autres recherches sur la biodégradation sont justifiées. De plus, l’IRM ne pouvait pas différencier si les nanosondes SPIO pouvaient se lier spécifiquement aux bactéries ou aux monocytes ou si ces sondes étaient endocytosed.

En conclusion, nous avons développé un protocole clair et faisable pour préparer et caractériser les nanosondes sPIO-MtbsAb biocompatibles. Ces nanosondes sont hydrophiles et se dispersent bien dans des conditions physiologiques; ils sont peu cytotoxiques à de faibles concentrations. En outre, ces nanosondes SPIO-MtbsAb permettent le ciblage et la détection de l’infection à Mtb, comme le démontrent nos études in vitro et in vivo. Ainsi, les nanosondes SPIO-MtbsAb peuvent être appliquées comme agents de contraste IRM pour la détection ETB.

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Disclosures

Aucun des auteurs n’a d’intérêt exclusif dans les documents examinés dans cette étude.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du ministère de l’Économie taiwanais (subventions NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) pour effectuer ce travail de recherche. Ce manuscrit a été édité par Wallace Academic Editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

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References

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