Author Produced

أسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثي الأبعاد

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول وصف أسلوب المستندة إلى القالب صافي لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثية الأبعاد مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويصف هذا البروتوكول الرواية وسهلة الأسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء ثلاثية الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) أنسجة القلب دون مواد إضافية سقالة. وتعزل cardiomyocytes المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان (اللجنة التوجيهية-المهاجرة) والليفية القلب البشري (هكفس)، والخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس) وتستخدم لتوليد تعليق خلية مع 70% اللجنة التوجيهية-المهاجرة، هكفس 15%، و 15% هوفيكس. أنها تربى اشتركت في نظام "قطره معلقة" مرفق منخفضة للغاية، الذي يحتوي على ميكروبوريس للتكثيف مئات الماغنيسيوم في وقت واحد. تجميع الخلايا وتشكل الماغنيسيوم الضرب تلقائياً بعد 3 أيام ثقافة المشارك. الماغنيسيوم تحصد، المصنفة في تجويف قالب رواية، ومثقف في شاكر في الحاضنة. الماغنيسيوم تصبح أنسجة فنية ناضجة حوالي 7 أيام بعد البذر. الأنسجة المتعددة الطبقات الناتجة تتألف من الماغنيسيوم تنصهر مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن. هذا الأسلوب الجديد إمكانات واعدة كأسلوب استنساخه وفعالة من حيث التكلفة لإنشاء هندسة الأنسجة لعلاج فشل القلب في المستقبل.

Introduction

هندسة الأنسجة القلبية الحالي يهدف إلى تطوير علاج لاستبدال أو إصلاح هيكل ووظيفة النسيج المصاب احتشاء عضلة القلب1. طرق لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد من أنسجة القلب نستعرض خصائص الهوس والكهربية الهامة من أنسجة القلب الأصلي وقد تم التوسع بسرعة2،3. تم استكشاف مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات والمستخدمة في الدراسات4،5. أساليب تتراوح هذه استخدام محددة الاصطناعية والطبيعية النشطة بيولوجيا الهلاميات المائية، مثل الببتيدات وفيبرينوجين، الجيلاتين والكولاجين6، تقنيات الترسيب بيو-حبر2 وبيوبرينتينج التكنولوجيات7.

لقد ثبت أن أساليب خالية من سقالة يمكن أن تنتج أنسجة قابلة للمقارنة كالطرق على أساس مادة بيولوجية، دون عيوب إدراج مواد السقالات الخارجية8. كاسبي أورين et al. أثبت أن دمج أنواع مختلفة من الخلايا يمكن توليد عالية vascularized أنسجة القلب هندسيا البشرية9. الذقن وآخرون وضع طريقة طباعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء تصحيح القلب من الماغنيسيوم. تتألف البقع الناتجة من cardiomyocytes، والخلايا الليفية، وخلايا بطانية في 70:15:15 نسبة10. الماغنيسيوم قد ثبت أن تكون فعالة "لبنات" لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة، كما أنها تقاوم ضد نقص وتمتلك سلامة ميكانيكية كافية لغرس11،12. أظهرت الدراسات السابقة تلفيق العديد من الطرق لإنشاء كروي، بما في ذلك استخدام المعلقة إسقاط غزل قوارير13وموائع جزيئية نظم14، الأسلوب والأسطح غير ملتصقة الثقافة غير المصقول أو المطلي مع [اغروس] قوالب الصغيرة15. في هذا البروتوكول، نستخدم معلقة جهاز الإسقاط، الذي يحتوي على ميكروبوريس للتكثيف مئات الماغنيسيوم في وقت واحد.

تقدم هذه الدراسة الرواية والأسلوب كفاءة خالية من السقالة لإنشاء أنسجة القلب، والتي تشمل البذر يدوياً الماغنيسيوم في تجويف قالب مربعة وتفرخ الأنسجة على شاكر للنضج. نشر الأوكسجين تحت ظروف الثقافة الثابتة المعتادة، ويقتصر على الجوانب الخارجية لبناء الأنسجة، أسفر عن نخر المركزية. ومع ذلك، مع الصافي العفن، مغمورة جميع الماغنيسيوم تبذر في القالب في وسائل الإعلام مع حركة فلويديك مستمرة، مما يسمح لزيادة نشر المواد المغذية والأكسجين. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب القائم على العفن يسمح بإنشاء متزامنة من بقع الأنسجة مختلفة الأحجام مع الحد الأدنى من الجهد اليدوي، ويمكن بسهولة إزالة الأنسجة الناتجة من العفن. يسمح هذا الأسلوب رواية لإنشاء كفاءة واستنساخه من بقع القلب خالية من السقالة، متعدد الطبقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد كارديوميوسيتيس

  1. معطف لوحات 6-جيدا مع الغشاء مصفوفة والثقافة التي يسببها الإنسان pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسكس) كما هو موضح سابقا17.
  2. تفرق هيبسكس في هيبسك-CMs باستخدام الأساليب المذكورة سابقا18.
  3. في د 16-18 ما بعد التمايز، تعليق كارديوميوسيتيس بدهن كل بئر مع 2 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم، تليها الحضانة مع 1 مل/جيدا لكاشف الانفصال التربسين أو الخلية (انظر الجدول من المواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحييد الكاشف الانفصال التربسين أو الخلية (انظر الجدول للمواد) باستخدام وحدة تخزين تساوي معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) خلية الإعلام تستكمل مع B-27 (وسائل الإعلام خلية ربمي/ب-27). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لتخفيف أي خلايا التقيد بها.
  5. جمع cardiomyocytes مع وقف التنفيذ مع ماصة 10 مل مصلية وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  6. الطرد المركزي بتعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه خلية.
  7. ريسوسبيند بيليه في 10 مل الإعلام خلية ربمي/ب-27.
  8. الجمع بين 20 ميليلتر من تعليق خلية مع مبلغ مساو من محلول تريبان الأزرق 0.4% وتخلط برفق.
  9. استخدام هيموسيتوميتير يدوي للاعتماد والحصول على جدوى تركيز وخلية من تعليق خلية.

2-إعداد الخلايا الليفية

  1. بدء ثقافة خط الخلية (نوع البطين الكبار) تنتجها الخلايا الليفية القلب البشري (HCF) كما هو موضح سابقا16.
  2. تعليق هكفس التي تفرخ لهم بمبلغ مناسب لكاشف الانفصال التربسين أو الخلية (انظر الجدول للمواد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة16. قارورة T175، استخدمت 10 مل كاشف الانفصال التربسين أو الخلية.
  3. تحييد الكاشف الانفصال التربسين أو الخلية (انظر الجدول للمواد) باستخدام وحدة تخزين متساوية من المتوسطة، ثم نقل العينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه.
  4. ريسوسبيند بيليه في 10 مل متوسط النمو تنتجها الخلايا الليفية (انظر الجدول للمواد).
  5. الجمع بين 20 ميليلتر من تعليق خلية HCF مع مبلغ مساو من محلول تريبان الأزرق 0.4% وتخلط برفق.
  6. استخدام العداد الآلي الخلية أو هيموسيتوميتير اليدوي للاعتماد والحصول على جدوى تركيز وخلية من تعليق خلية جديدة.

3-إعداد خلايا بطانية

  1. بدء ثقافة خط الخلية غشائي (هوفيك) الوريد السري البشرية كما هو موضح سابقا17. تعليق هوفيكس التي تفرخ لهم بمبلغ مناسب لكاشف الانفصال التربسين أو الخلية (انظر الجدول للمواد) لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة17. تحييد الكاشف الانفصال التربسين أو الخلية (انظر الجدول للمواد) باستخدام وحدة تخزين متساوية من المتوسطة، ثم نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه.
    ملاحظة: لقارورة T175، استخدمت 10 مل كاشف الانفصال التربسين أو الخلية.
  2. ريسوسبيند بيليه في 10 مل متوسط نمو الخلايا البطانية (انظر الجدول للمواد).
  3. الجمع بين 20 ميليلتر من تعليق هوفيك ووصمة عار بمبلغ مساو من محلول تريبان الأزرق 0.4% وتخلط برفق.
  4. استخدام عداد الآلي خلية أو هيموسيتوميتير يدوي للاعتماد والحصول على جدوى تركيز وخلية من تعليق خلية.

4-إنشاء شنقاً الماغنيسيوم قطره

  1. ضع معلقة جهاز الإسقاط الذي يحتوي على ميكروبوريس 850 (كل قطره من 350 ميكرون) إلى معقمة جيدا 6 لوحات.
  2. عزل ثلاثة أنواع من الخلايا كما هو موضح أعلاه: هيبسك-اتفاقية الأنواع المهاجرة، وهكفس، وهوفيكس. الجمع بينهما في نسبة 70% اللجنة التوجيهية-اتفاقية الأنواع المهاجرة وهكفس 15% هوفيكس 15% في أنبوب 50 مل مخروطية مع ربمي/ب-27 خلية الإعلام بتركيز الخلايا 2,475,000 كل مل.
  3. الاستغناء عن 4 مل تعليق خلية (خلايا 2,475,000 كل مل) لكل بئر من مرفق فائقة منخفضة شنقاً إسقاط نظام (يبلغ قطرها ميكروبوري 350 ميكرون) يجلس في لوحة 6-جيدا.
  4. الماغنيسيوم ستشكل تلقائياً ضمن ح 12 من الاستغناء عن تعليق خلية في معلقة جهاز الإسقاط. لا تزال الثقافة لما مجموعة 72 ح (3 د) في 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95% لنضوج الماغنيسيوم.
  5. بعد 72 ساعة ثقافة، حصاد الماغنيسيوم عن طريق المسام في الجزء السفلي من معلق إسقاط النظام بوضع الجهاز في طبق مع المتوسطة ويحوم برفق للإفراج عن الماغنيسيوم من الشنق جهاز الإسقاط.

5-إنشاء تصحيح ثلاثي الأبعاد باستخدام القالب الصافي رواية

  1. القاعدة، أسفل لوحة مربعة، أسفل الصافية، والجانب الطبقات 10 شبكات يتم تجميعها لإنشاء قالب الرواية مع المعونة من زوج من الملقط العقيمة. أولاً، كومة ومحاذاة قاعدة، أسفل لوحة مربعة، وصافي استخدام الوظائف الزاوية السفلي. ثم المكدس وطبقة الشباك الجانبية 10 في توجيهات لإنشاء شبكة من غرامة الفولاذ المقاوم للصدأ شوكات بالتناوب.
  2. تدفق ملء قاعدة مع برنامج تلفزيوني أو متوسطة خفض التوتر السطحي، وثم قم بنقل العفن المجتمعون على قاعدة ملء.
  3. ويت تجويف القالب الصافي مع برنامج تلفزيوني أو المتوسطة في نفس الأسلوب. ملء ببطء الماغنيسيوم في تجويف المنطلقات للحجم المطلوب (2 × 2 × 1 مم، 4 × 4 × 1 مم، أو 6 × 6 × 1 مم).
    ملاحظة: تأكد من أن يتم تغذية 120% الحجم المتوقع من الماغنيسيوم في التجويف حيث تكون المجاميع الخلية في اتصال ضيقة وتبقى ثابتة.
  4. تجميع أعلى صافي وأعلى لوحة مربعة على ركن الوظائف وتأمين السدادات وأنابيب القابضة لمنع تبييض الماغنيسيوم.
  5. نقل النظام العفن صافية مليئة بلوح 6-جيدا مع 6 مل ربمي/ب-27 خلية الإعلام أو في حاوية معقمة مع المتوسطة ما يكفي لتغطية العفن مجمع بأكملها.
  6. احتضان لوحة 6-جيدا مع النظام العفن شغلها على شاكر يتأرجح لمدة 7-10 أيام في 3,000-4,000 س ز.
    ملاحظة: مدة الاحتضان يقررها حجم البقع القلب. مع بقع أكبر، سوف تحتاج فترة حضانة المرض زيادة نضج القلب التصحيح.

6-إزالة التصحيح من العفن صافي رواية

  1. إزالة هذا النظام العفن من وسائل الإعلام ووضعه على حصيرة المناولة المعقم في صحن 10 سم معقم.
  2. إزالة أنبوب عقد والسدادات وأعلى لوحة مربعة وصافي أعلى. عناية تنزلق الشباك الجانب الطبقات واحدة تلو الأخرى مع زوج من الملقط العقيمة. بعد ديكانولاتيون، هو الحصول تصحيح القلب سليمة فوق أسفل الصافي.
  3. التقاط أسفل الصافي مع التصحيح باستخدام الملقط المعقم ونقل الجزء السفلي الصافية إلى طبق 35 ملم مع 5 مل الإعلام ربمي/B27. بلطف ترخي التصحيح من أسفل الصافي بدوامات الصافية ببطء في الطبق، أو مع مكشطة خلية عقيمة. بعد مفرزة من أسفل الصافي، يمكن مثقف أنسجة القلب مع وسائط الإعلام ربمي/B27.
  4. الاستمرار في احتضان التصحيح القلب ثلاثي الأبعاد التعويم الحر في الطبق 35 ملم. ويمكن ملاحظة الضرب متزامن الوظيفية أقرب وقت 24 ساعة بعد الإزالة من العفن.
  5. بعد إزالة التصحيح من العفن الصافية، مراعاة المحافظة على شكله مع سلامة وكثافة الزيادات الضرب متزامن مع مرور الوقت.
    ملاحظة: عرضت ثلاثي الأبعاد صافي المستندة إلى القالب القلب البقع الكهربائية إدماج مكون كارديوسفيريس بعد ديكانوليشن. لاحظنا تردد ضرب تتراوح من 60 إلى 80 نبضة في الدقيقة التي استمرت لأكثر من 60 يوما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أننا استخدمت في تجاربنا، تعليق خلية 70% اللجنة التوجيهية-اتفاقية الأنواع المهاجرة وهكفس 15% هوفيكس 15% في ربمي/ب-27 خلية الإعلام بتركيز الخلايا 2,475,000 كل مل. بعد إنشاء تعليق خلية، نحن في الاستغناء عن 4 مل تعليق خلية لكل بئر من مرفق فائقة منخفضة شنقاً إسقاط النظام، كما هو موضح في الخطوة 4، 3 من البروتوكول. استخدام معلقة إسقاط النظام أسفرت عن تشكيل عفوية المئات من الضرب الماغنيسيوم بعد 3 أيام ثقافة في 5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95%. الماغنيسيوم لوحظت بسهولة أن الضرب تحت مجهر الضوء في 4 س و 10 X التكبير مع قطر متوسط من 350 ميكرون بعد 72 ساعة ثقافة (الشكل 1).

في نهاية الخطوة 6، 5 من البروتوكول، وبعد الحصاد الماغنيسيوم، كان المصنف العفن بسهولة مع أساليب بيبيتينج بسيطة. استزراع القالب يسمح لمزيج من الماغنيسيوم؛ وأسفرت إزالة اللاحقة من العفن على تصحيح القلب سليمة مع السلامة الميكانيكية. بعد إزالة من العفن وح 24 من الثقافة، لوحظ الضرب الوظيفية ومتزامن من أنسجة القلب، يؤكد التكامل الميكانيكية من الماغنيسيوم (الشكل 2، يسار). لاحظنا أيضا أن طبقات متعددة من الماغنيسيوم قد ضرب تلقائياً بطريقة منسقة على الخفيفة الميكروسكوب (الشكل 2، حق).

تحليلاً المناعي لصافي أيضا تم إجراء التصحيح القلب ثلاثي الأبعاد المستندة إلى القالب مع التصوير [كنفوكل] ت. تروبونين العلامة القلبية أظهرت أن كارديوميوسيتيس جيدا الانحياز جميع معارضها تروبونين تي التعبير (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1 : إنشاء شنقاً الماغنيسيوم قطره. Cardiomyocytes المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان (هيبسك-المهاجرة) والليفية القلب البشري (هكفس)، والخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس) كانت معزولة واستخدامها لتوليد تعليق خلية مع 70% اللجنة التوجيهية-المهاجرة و 15% هكفس هوفيكس 15%، في تركيز للخلايا 2,475,000 كل مل. بعد 72 ساعة، لوحظت الماغنيسيوم شكلت تلقائياً في كل ميكروبوري بسهولة أن الضرب تحت المجهر الخفيفة. شريط مقياس في اللوحة اليسرى = 1,000 ميكرومتر؛ شريط مقياس في اللوحة اليسرى = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : إنشاء الأنسجة القلبية الطبقات عرض اندماج الماغنيسيوم المكون. بعد مفرزة من العفن الصافية، الحفاظ على شكله التصحيح القلب ثلاثي الأبعاد وأظهرت الضرب متزامن، مشيراً إلى التكامل الميكانيكية من الماغنيسيوم، كما هو مبين في اللوحة اليسرى (حيث شريط المقياس = 1,000 ميكرومتر). وتم تفتيش مولتيلاييرس مكدسة من الماغنيسيوم مع الفحص المجهري الخفيفة، كما هو مبين في اللوحة اليسرى (حيث شريط مقياس = 400 ميكرون)، ولاحظ أن الضرب تلقائياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التقييم الفلورة أنسجة القلب. في تحليل الفلورة، عثر على أنسجة القلب ثلاثي الأبعاد صافي المستندة إلى القالب تتألف من كارديوميوسيتيس جيدا من حيث المحاذاة مع التعبير تروبونين تي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتكمن أهمية هذا الأسلوب في إمكانية تكرار نتائج وفعالية الأنسجة القلبية الطبقات الناتجة. في مجال هندسة الأنسجة القلبية، أحد الأهداف الحالية لتحديد أسلوب لبناء بقع القلب ثلاثي الأبعاد الضرب، والطبقات، والوظيفية. ونحن التقرير وسيلة كفؤة واستنساخه لإنشاء أنسجة القلب متعدد الطبقات بالبذر اليدوي المباشر من الماغنيسيوم تتألف من كارديوميوسيتيس وخلايا بطانية والليفية في رواية العفن صافية. صافي القالب المستخدمة في هذا الأسلوب قد مجموعة متنوعة من الأحجام المختلفة لإنشاء أنسجة تتراوح من 2 × 2 × 1 مم إلى 6 × 6 × 1 مم. يمكن أيضا تعديل التقنيات التي وصفناها للأشكال المختلفة من العفن ونظم تبعاً لهندسة الأنسجة المرجوة. تركيزات الخلية وصف ونسب كانت الأمثل سابقا هيبسك-اتفاقية الأنواع المهاجرة، والتعديلات على نوع خلية مختلفة سوف يتطلب تقييم إضافي.

تم استكشافها في المختبر إنشاء أنسجة القلب ثلاثي الأبعاد باستخدام تقنية بيوبرينتير مع الأمل في تطوير النماذج التشخيصية والعلاجية. ومع ذلك، أساليب بيوبرينتينج الحالية هي إجراءات مرهقة وتتطلب قدرا كبيرا من الوقت، واستخدام هياكل الدعم الإضافية مثل الإبر أو المواد سقالة. وجود هذه المساعدة دعم هياكل النقصان نشر المواد المغذية والأكسجين18. ولذلك، نخر المركزية مصدر قلق كبير في بنيات القلب ثلاثي الأبعاد الحالية، نظراً لعدم وجود الشعيرات الدموية لتوفير الأوكسجين والمغذيات19. ساكاجوتشى et al. تطبيق أسلوب يقحم موجهة نحو خلايا الأوراق واستخدام المفاعلات الحيوية سرير الأوعية الدموية لتطوير شبكة بطانية20. يمكن أن تسمح تجويف القالب في النظام العفن الصافية المقدمة هنا، نشر كافية من المواد المغذية والأكسجين دون اشتراط أي هياكل أو السقالات الداعمة. وعلاوة على ذلك، الأسلوب القائم على العفن صافي كفاءة ولا تتطلب مهارات متخصصة لكلا البذر الماغنيسيوم العفن والحفاظ على التصحيح اللاحقة. على هذا النحو، هو طريقة سريعة وغير مكلفة للحصول على شكل متزامن الضرب وبقع القلب الوظيفية.

لتحسين القطر كروي وعدد الماغنيسيوم المستخدمة في كل معلقة جهاز إسقاط، قمنا بتنفيذ استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات المتعلقة بأنواع الخلايا والكميات. لهذا الأسلوب على أساس العفن الصافية، قطر كروي وعدد الماغنيسيوم المستخدمة ذات أهمية قصوى لإنشاء نسيج القلب وظيفية ذات حجم كاف. لقد حاولنا تركيزات خلية مختلفة لتحسين حجم كروي أفضل لإنشاء أنسجة القلب. ثلاثة أنواع من الخلايا المستخدمة لإنشاء الماغنيسيوم القلب شنقاً جهاز الإسقاط، التي شملت 70% اللجنة التوجيهية-المهاجرة و 15% هكفس هوفيكس 15%. تحت المجهر الخفيفة، لوحظت الماغنيسيوم شكلت تلقائياً في كل ميكروبوري بسهولة أن الضرب بعد 72 ساعة. لاحظنا أن قطر الماغنيسيوم زادت مع تركيز الخلية معلقة جهاز الإسقاط. لقد حاولنا تركيزات مختلفة من الماغنيسيوم، من الماغنيسيوم 100 إلى 300 الماغنيسيوم في كل جهاز، مع 4 مل متوسطة ربمي/B27. مع العديد من المحاكمات، وجدنا أن تركيز الخلايا 2,475,000 كل مل أثمر قطر أمثل الماغنيسيوم الناتجة عن ذلك. مع القطر الأمثل من الماغنيسيوم، عانينا من عناء جمع والبذر من الماغنيسيوم في القالب الصافي مكدسة، وخطوات هامة على طريقة إنشاء أنسجة القلب متعدد الطبقات صافي المستندة إلى القالب.

أن الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هي الأمثل لحجم كروي. تجدر الإشارة إلى أن الماغنيسيوم المستخدمة في هذا الأسلوب أصغر من حجم كروي الهيئات المستخدمة في سائر تقنيات بيوبرينتينج21. وقد وجد الماغنيسيوم أكبر قد نخر المركزية بسبب نشر غير كاف من التغذية والأوكسجين22. مع الماغنيسيوم مع قطر أصغر، يتم بسهولة أكثر انتشارا كافياً للمواد المغذية والأكسجين إلى المركز لكل كروي، زيادة صلاحية الخلوية في جميع المجالات على تصحيح ما نتج عن ذلك. في البروتوكول المعروضة هنا، قطرها 350 ميكرون كروي يسمح ببقاء الخلية محسنة وأكثر من مساحة سطح الاتصال بين الماغنيسيوم، التي نعتقد أنها تساهم الإنشاء الناجح لانسجة القلب باستخدام هذا القالب الصافي. ولذلك، هذا خطوة حاسمة في وصف المنهجية. للتكيف مع البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى، تجارب الأمثل حجم كروي إضافية مطلوبة.

وتشمل القيود المفروضة على هذا النهج عدم القدرة على التحكم بدقة في التراص الماغنيسيوم. وهذا يؤدي في المناطق غير التوحيد بقع الأنسجة الناتجة وسمك المتباينين. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الوقت الفعلي العملي للبذر الماغنيسيوم الحد الأدنى، يتطلب إيجاد بقع متعددة الطبقات كبيرة وقت ثقافة موسعة للسماح للانصهار الماغنيسيوم.

أما بالنسبة للتطبيقات المستقبلية، هذا الأسلوب القائم على العفن صافي رواية وسيلة كفؤة واستنساخه لإنشاء أنسجة القلب ثلاثي الأبعاد، وخالية من السقالة مع الحد الأدنى من الجهد اليدوي. الأنسجة المتعددة الطبقات الناتج يتكون من الماغنيسيوم تنصهر مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن. هذا الأسلوب القائم على العفن صافي يقدم فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير بديلة الحالية بيو-اختﻻق أساليب هندسة الأنسجة، ولديه القدرة على إنشاء أنسجة القلب المطبقة سريرياً لعلاج فشل القلب بهدف استبدال كارديوميوسيتيس الدماغية أو اختلال23. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لإنشاء أنسجة القلب للعروض الخاصة بالمريض من العلاجات المخدرات رواية المحتملة24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب يعترف مصدر التمويل التالية: "السحر أن الصندوق المسائل" "أبحاث القلب والأوعية الدموية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120, (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120, (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66, (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11, (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23, (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11, (1), 163 (2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100, (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7, (1), 4566 (2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148, (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863, (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6, (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288, (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2, (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20, (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125, (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127, (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10, (8), 814-822 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics