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スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

Bioengineering

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Summary

このプロトコルでは、満足のいく構造的整合性と同期打撃動作立体足場無料心臓組織を作成する純金型ベースの方法について説明します。

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Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

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Abstract

このプロトコルでは、小説と追加足場材料なし三次元 (3 D) の心筋組織を作成する簡単な純金型ベース方法をについて説明します。人間誘導された多能性幹細胞由来心筋細胞 (iPSC CMs)、心臓 (HCFs)、線維芽細胞およびひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) は、隔離され、70 %ipsc - cms、15 %hcfs と 15 %huvec 細胞懸濁液を生成するために使用します。回転楕円体の数百人を一度に凝縮用孔を含む超低添付ファイル「ハンギング ドロップ」システムの共培養しています。セルを集計、自発的に共培養 3 日後暴行スフェロイドを形成します。スフェロイドは収穫され、新規金型に播種、シェーカーのインキュベーター内で培養しました。スフェロイドは播種後約 7 日成熟した機能的な組織になります。結果多層組織は満足のいく構造的整合性と同期打撃動作溶かされた回転楕円体から成っています。この新しいメソッドでは、将来的に心不全の治療のために設計された組織を作成する再現性とコスト効果の高い方法として有望な可能性があります。

Introduction

現在の心臓組織工学の目的は、交換または構造と負傷した心筋組織1の機能を修復する治療法を開発することです。ネイティブの心臓組織の重要な収縮と電気生理学的特性を示す心筋組織の 3次元モデルを作成する方法には2,3を急速に拡大しています。様々 な戦略を模索、研究4,5で使用されます。これらの方法はゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ペプチド6などの合成と天然特定の生理活性物質ゲルの使用からバイオ インク蒸着の技術2バイオプリンティング技術の7まであります。

足場自由な方法が外部足場材料8を組み込むことの欠点がなく、生体材料ベースのメソッドとして匹敵する組織を作り出すことができることが示されています。オレン カスピーは、種々 の細胞の結合が高度に血管人間設計された心臓ティッシュ9の生成を有効を示した。あごは、回転楕円体から心臓のパッチを作成するための 3次元印刷法を開発しました。結果として得られるパッチ参照比10で血管内皮細胞、線維芽細胞、心筋細胞で構成されます。回転楕円体は、効果的な「ビルディング ブロック」足場無料心臓組織の作成の彼らの低酸素状態に対する耐性があるし、注入11,12の十分な機械的完全性を持って示されています。以前の研究は、回転楕円体を作成するためのいくつかの製造方法を示している、絞首刑の使用を含むドロップ メソッド、スピナー フラスコ13、マイクロ流体システム14、および非付着性文化の表面光沢をめっきしたものアガロース マイクロ金型15。このプロトコルでは絞首刑を使用してドロップ デバイスは、一度に何百もの回転楕円体を凝縮の細孔が含まれています。

本研究は、小説と正方形の金型に、回転楕円体を手動でシードとシェーカーで組織の成熟をインキュベートを含む心臓組織の創造のための効率的な足場無料メソッドを示します。いつも静置培養条件下で酸素の拡散は中心壊死をもたらす組織構成要素の外側の側面に限定されます。ただし、ネット型で金型にシードすべての楕円は、栄養素や酸素の増加の拡散を可能にする一定の流体運動とメディアに没頭しています。また、この金型ベースのメソッドは、最小限の労力でサイズの異なる組織パッチの同時作成、金型から得られた組織を簡単に削除できます。この手法スキャフォールド フリー、多層の心筋パッチの効率的かつ再現可能な作成できます。

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Protocol

1. 心筋細胞の調製

  1. 17と前述したように、コート 6 ウェル基底膜マトリックスと文化人間誘導された多能性幹細胞 (hiPSCs)。
  2. 上記の方法18を使用してによる CMs に hiPSCs を区別します。
  3. 16-18 d 後の分化には、カルシウムやマグネシウム、孵化 1 ml/トリプシンまたは細胞解離試薬 (のテーブルを参照のも続いてせず、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 mL の各ウェルを洗浄によって心筋細胞を一時中断します。材料) 室温で 5 分間。
  4. トリプシンまたは細胞解離試薬を中和 (材料表参照) ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) セル培地 B-27 (RPMI/B-27 携帯メディア) の等量を使用して。上下のピペット、付着細胞を緩める。
  5. 10 mL の血清ピペットで中断された心筋細胞を収集し、50 mL の円錐管にそれらを転送します。
  6. 250 x g細胞ペレットを取得するために室温で 5 分間で細胞懸濁液を遠心します。
  7. RPMI/B-27 携帯メディアの 10 mL にペレットを再懸濁します。
  8. 細胞懸濁液の 20 μ L を組み合わせて 0.4% トリパン ブルー溶液の同量入れ、軽く混ぜます。
  9. マニュアルの検定を使用してカウントし、細胞懸濁液の濃度と細胞の生存率を入手します。

2. 線維芽細胞の作製

  1. 16を前述のよう人間心臓線維芽細胞 (HCF) (成人心室型) 細胞株の培養を開始します。
  2. トリプシンまたはセルの解離試薬の適切な量でそれらをインキュベートし、HCFs を中断 (材料表参照) 室温16で 5 分間。T175 フラスコ 10 mL のトリプシンまたはセルの解離試薬の使用しています。
  3. トリプシンまたは細胞解離試薬を中和 (材料の表を参照してください)、50 mL の円錐管にサンプルを転送し、250 x gを入手する部屋の温度で 5 分間で細胞懸濁液を遠心分離媒体の等量を使用して、ペレット。
  4. 線維芽細胞成長培地 10 mL にペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)。
  5. HCF 細胞懸濁液の 20 μ L を組み合わせて 0.4% トリパン ブルー溶液の同量入れ、軽く混ぜます。
  6. 自動化された細胞カウンターまたは手動検定を使用してカウントし、新しい細胞懸濁液の濃度と細胞の生存率を入手します。

3. 血管内皮細胞の調製

  1. ひと臍帯静脈内皮細胞 (株) 線、17を前述の培養を開始します。トリプシンまたはセルの解離試薬の適切な量でそれらをインキュベートし、比較を中断 (材料表参照) 室温17で 3 分間。トリプシンまたは細胞解離試薬を中和する (材料の表を参照してください)、50 mL の円錐管に転送中の等量を使用して、250 x gペレットを取得するために室温で 5 分間で細胞懸濁液を遠心分離します。
    注: T175 フラスコ 10 mL のトリプシンまたはセルの解離試薬が使用されました。
  2. 内皮細胞成長培地 10 mL にペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)。
  3. 新生活懸濁液 20 μ L を組み合わせると 0.4% トリパン ブルー溶液の同量とそれを汚す、軽く混ぜます。
  4. 自動化された細胞カウンターまたは手動検定を使用してカウントし、細胞懸濁液の濃度と細胞の生存率を入手します。

4. ドロップ回転楕円体の作成

  1. 絞首刑の場所ドロップ デバイス滅菌 6 ウェル プレートに 850 の細孔 (それぞれ 350 μ m の直径) が含まれています。
  2. 前述のようにセルの 3 種類を分離: による CMs、HCFs、および比較します。1 mL あたり 2,475,000 細胞の濃度で RPMI/B-27 携帯メディアで 70% iPSC CMs、15 %hcfs と 50 mL の円錐管に 15 %huvec の比率で結合します。
  3. ハンギング 6 ウェル プレートに装着されているドロップ システム (350 μ m の細孔径) と超低添付ファイルの各ウェルに 4 mL (1 mL あたり 2,475,000 細胞) の細胞懸濁液を調剤します。
  4. 回転楕円体が絞首刑に細胞懸濁液を調剤の 12 h の中で形成される自発的にドロップ デバイス。37 ° C、5% CO2、湿度 95%、72 時間 (3 d) の合計のための文化、回転楕円体の成熟のために続けます。
  5. 文化の 72 時間後収穫は絞首刑の下部孔を通って回転楕円体中皿にデバイスを配置し、絞首刑からスフェロイドをリリースに優しくそれを旋回システムをドロップ ドロップ デバイス。

5. 3-D パッチ作成新規純金型を使用

  1. 基本、底正方形板、底網、10 レイヤード サイド滅菌ピンセットのペアの助けを借りて新規金型を作成する網をまとめます。まず、スタック ベースで底正方形板を合わせ、コーナー ポストを使用してネットを底します。スタックし、層の良いステンレス製熊手の網を作成する方向を交互に 10 側網。
  2. 表面張力を軽減し、その後、充填ベースの上に組み立てられた金型を転送 PBS またはメディア ベースの充填をフラッシュします。
  3. PBS と同じ方法でメディア ネット金型キャビティを濡れています。希望するサイズの前提の空洞に、回転楕円体をゆっくり記入 (2 × 2 × 1 mm、4 × 4 × 1 mm、または 6 × 6 × 1 mm)。
    注: ので、細胞凝集塊はタイトな接続で、静的なまま、空洞に回転楕円体の予想量の 120% を供給することを確認します。
  4. Net トップ、コーナー ポストの上に四角い天板を組み立てる、ストッパーとスフェロイドのにじみを防ぐためにホールディング チューブを固定します。
  5. いっぱいネット金型システムを 6 ml RPMI/B-27 携帯メディアの全体の組み立てられた金型をカバーする十分な培地で無菌容器に 6 ウェル プレートに転送します。
  6. 3,000-4,000 x gで 7-10 日間スイング シェーカーで塗りつぶされた金型システム 6 ウェル プレートを孵化させなさい。
    注: 孵化の持続期間は、心臓のパッチのサイズによって決定されます。大規模なパッチ、インキュベーション時間心臓パッチ成熟増加すべき必要があります。

6. 新規純金型からのパッチの削除

  1. メディアから金型システムを取り外して滅菌 10 cm 皿に滅菌処理マットの上に置きます。
  2. ホールディング チューブ、ストッパー、正方形天板上の net を削除します。慎重に滅菌ピンセットのペアを持つ層状側網 1 つずつをスライドさせます。抜後、そのまま心臓パッチは、ネットの底の上に取得されます。
  3. 滅菌鉗子を使用してパッチでネットの下をピックアップし、RPMI/B27 メディアの 5 ml 35 mm ディッシュにネットの下を転送します。軽く料理、または無菌細胞スクレーパーとネットをゆっくりと旋回してネットの下からパッチを緩めます。ネットの下から剥離後 RPMI/B27 メディアで心筋組織を培養することができます。
  4. 35 mm ディッシュの浮遊 3次元心筋パッチをインキュベートし続けます。機能同期鼓動は、鋳型から取り出した後、早ければ 24 時間観察できます。
  5. Net の金型からパッチを削除した後整合性と時間同期暴行増加の強度とその形状が維持されることを確認します。
    注: 3-D ネット金型ベース心筋パッチ抜後コンポーネント cardiospheres の電気的統合を出展しました。60 から 80 ビート/分 60 日間以上の永続化に至るまで、周波数を見ました。

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Representative Results

実験では、我々 は 70% iPSC CMs、15% HCFs mL あたり 2,475,000 細胞の濃度で RPMI/B-27 携帯メディアで 15 %huvec の細胞懸濁液を利用しました。プロトコルの手順 4.3 細胞懸濁液を作成した後は、ハンギング ドロップ システム、超低添付ファイルの各ウェルに細胞懸濁液 4 mL を分配しました。絞首刑の使用ドロップ システムは湿度 95%、5% CO2、37 ° C で培養 3 日後回転楕円体を破っての何百もの自発の形成で起因しました。スフェロイドは 4 X、10 X 倍率平均直径 350 μ m の文化 (図 1) の 72 時間後に顕微鏡下で叩いている簡単に観察されました。

、回転楕円体を収穫後、プロトコルの手順 6.5 の終わりに金型は簡単に単純なピペッティング メソッドをシードだった。回転楕円体の融合で使用できるカビの養殖金型の後廃止機械的完全性とそのまま心臓パッチでしました。カビや文化の 24 h から取り出した後、回転楕円体 (図 2左) の機械的統合を確認する心臓組織の機能と同期の鼓動は観察されました。また観測された回転楕円体の複数の層が光顕 (図 2右) に整合的で自発的に打っていた。

モールド ベース 3次元心筋パッチを心筋マーカーのトロポニン t. 共焦点イメージングも行ったネットの免疫組織化学的解析が示唆された配向心筋トロポニン T 式 (図 3) が一堂に出展します。

Figure 1
図 1: ハンギング ドロップ スフェロイド作成します。人間誘導された多能性幹細胞由来心筋細胞 (による CMs)、心臓 (HCFs)、線維芽細胞およびひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) が分離・で 70% iPSC CMs、15% HCFs 15 %huvec と細胞懸濁液を生成するために使用、1 mL あたり 2,475,000 細胞の濃度。72 時間後各孔で自発的に形成された回転楕円体は、光学顕微鏡を叩いている簡単に観察されました。左側で、[スケール バー = 1,000 μ m;右側のパネルでスケール バー = 400 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: コンポーネントの回転楕円体の統合を表示する多層心臓組織を作成します。純モールドから剥離後 3次元心筋パッチその形を維持して、左側のパネルに示すように、回転楕円体の機械的統合を示す同期の鼓動を実証 (、スケールバー = 1,000 μ m)。右側のパネルに示すように、回転楕円体の積層多層膜は光学顕微鏡で検査された (、スケール バー = 400 μ m)、自発的に叩いているを観察しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 心臓の組織の蛍光評価します。蛍光分析に配向心筋トロポニン T 式を構成する純金型ベースの 3次元心筋組織が見つかりました。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

この法の意義は、その再現性と結果の多層の心臓組織の有効性であります。心臓組織工学分野での現在の目標の一つ、打撃、多層、および機能の 3次元心筋パッチを作成する方法を特定します。心筋細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞から成る小説ネット型に回転楕円体の手動直播による多層心臓組織を作成する効率的かつ再現性のある方法を報告する.このメソッドで使用される純金型は、様々 な異なるサイズ 6 × 6 × 1 mm 2 × 2 × 1 mm に至る組織を作成するために。については技術を別金型形状と目的組織のジオメトリに応じて、システムの変更もできます。記載されている濃度と比は以前、による CMs に最適化した、異なる細胞型への変更追加の評価が必要になります。

治療および診断モデルの開発の希望を持つ bioprinter 技術を用いた 3次元心臓組織の体外作成を検討されています。ただし、現在バイオプリンティング法は面倒で、膨大な時間と針や足場材料などの補助的なサポート構造の使用を必要です。これらの補助的な存在は、栄養素や酸素18の拡散構造減少をサポートします。したがって、中心壊死は19酸素と栄養を供給する毛細血管の不足のため、現在の 3次元心臓構造の主要な関心事であります。坂口は挟む指向の手法を適用した細胞シートと血管床バイオリアクターを使用して内皮細胞ネットワーク20を開発します。ここで紹介するネット型システム、金型キャビティは栄養素や酸素、サポート構造や足場の必要なしの十分な拡散を許可できます。さらに、金型ベース方式は効率、両方、シードには回転楕円体の金型やその後の修正プログラムのメンテナンスに特殊なスキルは必要ありません。そのため、同期的に暴行を取得迅速かつ安価な方法と心臓機能のパッチです。

回転楕円体の直径と回転楕円体のそれぞれで使用される数を最適化するトラブルシューティングや細胞の種類と量に関する変更を実施したドロップ デバイスをハングしています。このネットの金型ベースのメソッドの回転楕円体径と回転楕円体の使用数は適切なサイズの機能的な心筋組織を作成する非常に重要だった。心臓組織を作成するため最適な回転楕円体のサイズを最適化するために別の細胞濃度を試みた。セルの 3 種類は、絞首刑によって心臓の回転楕円体の作成に使われた 70% iPSC CMs、15 %hcfs と 15 %huvec 含まれてドロップ デバイス。光学顕微鏡各孔で自発的に形成された回転楕円体は、72 時間後を叩いている簡単に観察されました。絞首刑の濃度が細胞スフェロイドの直径が増加したことがわかったドロップ デバイス。濃度の異なる回転楕円体、各デバイスで 300 回転楕円体に 100 回転楕円体から RPMI/B27 培地 4 ml を試みた。数多くの試験で、結果として回転楕円体の最適な直径が得られた mL あたり 2,475,000 細胞の濃度を分かった。回転楕円体の最適化された直径、楽なコレクションおよび多層の心臓組織作成 net 金型ベース メソッドする重要なステップであった積み上げ純金型の回転楕円体のシードを経験しました。

プロトコルの最も重要なステップは、回転楕円体サイズの最適化です。このメソッドで使用されている回転楕円体が他バイオプリンティング テクニック21で使用されている回転楕円体ボディのサイズよりも小さいことを言及する価値があります。大きい回転楕円体は、栄養と酸素の22の十分な拡散のための中心壊死が発見されています。小さい直径の回転楕円体と各回転楕円体の中心に栄養と酸素の十分な拡散がより容易に行え、結果パッチのすべての領域で細胞の生存率を増加します。ここで提示されたプロトコル、これネットを用いた心筋の正常に作成に貢献 350 μ m の回転楕円体の直径は、改良されたセル実行可能性とより接触面積、回転楕円体間と信じてします。したがって、これは記述の方法論の重要なステップです。他のセルタイプをプロトコルに合わせて、追加の回転楕円体サイズ最適化実験が必要です。

このアプローチの限界、スフェロイドの積み重ねを正確に制御することができないことがあります。結果組織パッチと異種の厚さの不均一性の領域でこの結果します。また、スフェロイドの播種の実際の実践的な時間は最小限、大規模な多層パッチの作成、回転楕円体の融合のために許可するように拡張された文化時間が必要です。

将来のアプリケーションのこの小説の純金型ベースのメソッドは最小限の労力で 3次元、無料の足場の心臓組織を作成する効率的かつ再現性のある方法。結果として得られる多層組織は満足のいく構造的整合性と同期打撃動作溶かされた回転楕円体から成っています。この金型ベース方式設計組織の方法、コスト効率と拡張性の高い現在代替バイオ加工を紹介を目標に心不全の治療のため臨床応用可能な心臓組織を作成する可能性があります。虚血性または機能不全心筋23を交換します。さらに、このメソッドを活用して、潜在的な新規薬物療法24の患者固有の上映のため心臓の組織を作成することできます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、次の資金源を認める: 心血管の研究のため魔法、事項の資金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

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References

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