Author Produced

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol beschrijft een netto schimmel gebaseerde methode om te maken van driedimensionale steiger-vrije cardiale weefsels met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit protocol beschrijft een roman en eenvoudige netto schimmel gebaseerde methode om het maken van driedimensionale (3-D) cardiale weefsels zonder extra Steiger materiaal. Mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), menselijke cardiale fibroblasten (HCFs) en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) zijn geïsoleerd en gebruikt voor het genereren van een celsuspensie met 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs. Ze zijn samen gekweekt in een ultra-lage "opknoping drop" verbindingssysteem, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer. De cellen samenvoegen en spontaan vormen kloppend spheroïden na 3 dagen van co cultuur. De spheroïden zijn geoogst, zaadjes in de holte van een nieuwe schimmel en gekweekt op een shaker in de incubator. De spheroïden uitgegroeid tot een volwassen functionele weefsel ongeveer 7 dagen na het zaaien. Het resulterende meerdere lagen weefsel bestaan uit gesmolten spheroïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag. Deze nieuwe methode heeft veelbelovende potentieel als een reproduceerbare en kosteneffectieve methode maken van gemodificeerde weefsels voor de behandeling van hartfalen in de toekomst.

Introduction

Het doel van huidige cardiale weefselengineering is het ontwikkelen van een therapie te vervangen of repareren van de structuur en functie van gewonde myocardiale weefsel1. Methoden voor het maken van 3D-cardiale weefsel modellen tentoonstellen van de belangrijke eigenschappen van de contractiele en elektrofysiologische van inheemse cardiale weefsel hebben al snel groeiende2,3. Een verscheidenheid van strategieën zijn onderzocht en gebruikt in studies4,5. Deze verificatiemethoden variëren van het gebruik van specifieke synthetische en natuurlijke bioactieve hydrogels, zoals collageen, gelatine, fibrine en peptiden6, tot bio-inkt afzetting technologieën2 en bioprinting technologieën7.

Het is aangetoond dat de steiger-vrije methoden vergelijkbare weefsels als biomaterial gebaseerde methoden, zonder de nadelen van de integratie van buitenlandse steigers materiële8kunnen produceren. Oren Caspi et al. aangetoond dat de opname van verschillende soorten cellen in staat de generatie van zeer gevacuoliseerd menselijke gemanipuleerde cardiale weefsel9 stelt. Kin et al. ontwikkelde een 3D-afdrukmethode voor cardiale patch creatie van spheroïden. Resulterende patches zijn samengesteld uit cardiomyocytes en fibroblasten, endotheliale cellen in een 70:15:15 ratio10. Spheroïden hebben aangetoond dat effectieve "bouwstenen" van de steiger-vrije cardiale weefsel schepping, als ze resistent zijn tegen hypoxie en bezitten voldoende mechanische integriteit voor implantatie11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende fabricage methoden voor sferoïde creatie, met inbegrip van het gebruik van de opknoping drop methode, spinner kolven13, microfluidic systemen14en niet-aanhanger cultuur oppervlakken ongecoat of bekleed met agarose micro-mallen15. In dit protocol, gebruiken we de opknoping drop apparaat, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer.

Deze studie geeft een roman en efficiënte steiger-vrije methode voor cardiale weefsel creëren, waarin de spheroïden handmatig te zaaien in een vierkante mal Holte en broeden van het weefsel op een shaker voor rijping. Onder gebruikelijke statische kweekomstandigheden is zuurstof diffusie beperkt tot de uiterlijke aspecten van de constructie van weefsel, wat resulteert in centrale necrose. Echter met de netto schimmel, worden alle spheroïden die zaadjes in de mal ondergedompeld in de media met een constante fluidic beweging, rekening houdend met de toegenomen verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof. Bovendien, deze schimmel gebaseerde methode zorgt voor de gelijktijdige oprichting van verschillen in de grootte weefsel patches met minimale handmatige inspanning en het resulterende weefsel kan gemakkelijk worden verwijderd uit de mal. Deze nieuwe methode zorgt voor de efficiënte en reproduceerbare oprichting van steiger-vrije, meerdere lagen cardiale patches.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van Cardiomyocytes

  1. Jas 6-Wells-platen met kelder membraan matrix en cultuur mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs)17zoals hiervoor is beschreven.
  2. Differentiëren hiPSCs in hiPSC-CMs met behulp van de eerder beschreven methoden18.
  3. Op 16-18 d na differentiatie, schorsen de cardiomyocytes door elk putje met 2 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) spoelen zonder calcium of magnesium, gevolgd door incubatie met 1 mL/goed van trypsine of cel dissociatie reagens (Zie tabel van Materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) cel media aangevuld met B-27 (RPMI/B-27 cel media). Pipetteer omhoog en omlaag om het zelfklevend cellen los.
  5. De zwevende cardiomyocytes serologische Pipetteer 10 mL verzamelen en overbrengen naar een conische buis van 50 mL.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen van een cel-pellet.
  7. Resuspendeer de pellet in 10 mL RPMI/B-27 cel media.
  8. 20 µL celsuspensie combineren met een gelijke hoeveelheid van 0,4% Trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.
  9. Gebruik een handmatige hemocytometer te tellen en het verkrijgen van de concentratie en cel levensvatbaarheid van de celsuspensie.

2. voorbereiding van de fibroblasten

  1. Het initiëren van een cultuur van een lijn van de cel van menselijke cardiale fibroblast (HCF)-(volwassen ventriculaire type), zoals eerder beschreven16.
  2. Opschorten van de HCFs door aan het broeden ze met een passend bedrag van trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur16. Voor een T175 kolf, werd 10 mL trypsine of cel dissociatie reagens gebruikt.
  3. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume van medium, vervolgens het monster overbrengen in een conische buis van 50 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen een pellet.
  4. Resuspendeer de pellet in 10 mL fibroblast groeimedium (Zie Tabel van materialen).
  5. 20 µL van de celsuspensie HCF combineren met een gelijke hoeveelheid van 0,4% trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.
  6. Gebruik een geautomatiseerde cel teller of handmatige hemocytometer te tellen en de concentratie en cel levensvatbaarheid van de nieuwe celsuspensie te krijgen.

3. voorbereiding van de endotheliale cellen

  1. Het initiëren van een cultuur van een lijn van menselijke navelstreng ader endothelial cel (HUVEC), zoals eerder beschreven17. Opschorten van de HUVECs door aan het broeden ze met een passend bedrag van trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) gedurende 3 minuten op kamer temperatuur17. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume van medium, vervolgens overbrengen naar een conische buis van 50 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen van een pellet.
    Opmerking: Voor een T175 kolf, 10 mL trypsine of cel dissociatie reagens werd gebruikt.
  2. Resuspendeer de pellet in 10 mL endothelial cel groeimedium (Zie Tabel van materialen).
  3. Combineer 20 µL van de HUVEC ophanging en vlek met een gelijke hoeveelheid van 0,4% Trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.
  4. Gebruik een geautomatiseerde cel teller of een handmatige hemocytometer te tellen en het verkrijgen van de concentratie en cel levensvatbaarheid van de celsuspensie.

4. oprichting van opknoping Drop spheroïden

  1. Plaats de opknoping drop apparaat dat 850 micropores (elk met een diameter van 350 µm) in steriele 6-Wells-platen bevat.
  2. Isoleren van de drie soorten cellen zoals hierboven beschreven: hiPSC-CMs, HCFs en HUVECs. Combineer ze in een verhouding van 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs in een conische buis van 50 mL met RPMI/B-27 cel media bij een concentratie van 2,475,000 cellen per mL.
  3. Breng 4 mL van de celsuspensie (2,475,000 cellen per mL) aan elk putje van een ultra-lage gehechtheid systeem van de daling (met een schoon diameter van 350 µm) zitten in een 6-well-bord hangen.
  4. Spheroïden zal spontaan vormen binnen de 12 uur van de verstrekking van de celsuspensie in de opknoping drop apparaat. Cultuur voor een totaal van 72 uur (3 d) bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid blijven voor de rijping van de spheroïden.
  5. Na 72 uur van cultuur, oogsten de spheroïden door de poriën aan de onderkant van het hangende drop systeem door het plaatsen van het apparaat in een schotel met medium en het zachtjes om vrij van de spheroïden van de ophanging te zwenken drop apparaat.

5. 3D-Patch creëren met behulp van de roman netto schimmel

  1. De base, vierkante bodemplaat onder netto en 10 gelaagde kant netten worden geassembleerd om de nieuwe mal maken met behulp van een paar steriel pincet. Eerst stapelen en uitlijnen van de basis, de vierkante bodemplaat en onderste net met behulp van de hoek posten. Vervolgens stapelen en laag van de netten van de 10 kant afwisselend instructies voor het maken van een net van fijne roestvrij stalen uitsteeksels.
  2. Spoel de basis met PBS of medium te verlagen de oppervlaktespanning, breng de geassembleerde schimmel op de vulling base vulling.
  3. Natte de netto schimmel holte met PBS of medium in dezelfde methode. Langzaam vullen van de spheroïden in de veronderstelde holte van de gewenste grootte (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, of 6 x 6 x 1 mm).
    Opmerking: Zorg ervoor dat de 120% van de verwachte hoeveelheid spheroïden in de holte wordt gevoed, zodat de cel aggregaten in strakke verbinding worden en statisch blijven.
  4. Monteer de top netto en bovenste vierkante plaat op de hoek posten en veilig de stoppers en bedrijf buizen om te voorkomen dat een wegspoeling van de spheroïden.
  5. Het systeem gevuld netto schimmel overbrengen in een 6-well plaat met 6 mL RPMI/B-27 cel media of in een steriele container met genoeg medium ter dekking van de gehele geassembleerde schimmel.
  6. Incubeer de 6-well plaat met de gevulde mal-systeem op een swingende shaker voor 7-10 dagen bij 3.000-4.000 x g.
    Opmerking: De duur van de incubatie wordt bepaald door de grootte van de cardiale patches. Met grotere patches moet de incubatietijd voor cardiale patch rijping worden verhoogd.

6. verwijdering van de Patch van de roman netto schimmel

  1. Het systeem van de schimmel uit de media verwijderen en plaats deze op de mat gesteriliseerde behandeling in een steriele 10-cm schotel.
  2. Verwijder de buis bedrijf, stoppers, de bovenste vierkante plaat en het bovenste net. Schuif voorzichtig uit de gelaagde kant netten één voor één met een paar steriel pincet. Na decannulation, wordt een intact cardiale patch verkregen bovenop de bodem net.
  3. Pikken net onder met de patch steriel pincet gebruiken en breng de bodem net in een 35-mm schotel met 5 mL RPMI/B27 media. Voorzichtig los van de patch van de bodem net door langzaam zwenken van het net in de schotel, of met een steriele cel schraper. Na detachement van de bodem net, kan het cardiale weefsel met RPMI/B27 media worden gekweekt.
  4. Blijven broeden van de vrij zwevende 3D-cardiale patch in de 35-mm schotel. Functionele synchrone afstraffing kan zo spoedig 24 h na het verwijderen van de mal worden waargenomen.
  5. Na het verwijderen van de patch van de netto schimmel, observeren dat zijn vorm behouden blijft met de integriteit en de intensiteit van de verhogingen van de synchrone gewonnen met de tijd.
    Opmerking: De 3D-net schimmel gebaseerde cardiale patches tentoongesteld elektrische integratie van component cardiospheres na decannulation. We hebben vastgesteld dat een frequentie van de afstraffing variërend van 60 tot 80 slagen per minuut dat al meer dan 60 dagen duurt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In onze experimenten gebruikt wij een celsuspensie van 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs in RPMI/B-27 cel media bij een concentratie van 2,475,000 cellen per mL. Na het maken van de celsuspensie, afgezien we 4 mL van de celsuspensie aan elk putje van ultra-lage beslagleggingsbevel opknoping drop systeem, zoals beschreven in stap 4.3 van het protocol. Het gebruik van de opknoping drop systeem resulteerde in de spontane vorming van honderden verslaan spheroïden na 3 dagen van cultuur bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid. De spheroïden waren gemakkelijk waargenomen worden gewonnen onder de lichte microscopie van 4 X en 10 X vergroting met een gemiddelde diameter van 350 µm na 72 uur van cultuur (Figuur 1).

Aan het eind van stap 6.5 van het protocol, na de oogst van de spheroïden, werd de mal gemakkelijk bezaaid met eenvoudige pipetting methoden. Kweken van de schimmel die is toegestaan voor een fusie van de spheroïden; latere verwijdering van de schimmel resulteerde in een intact cardiale patch met mechanische integriteit. Na het verwijderen van de schimmel en de 24 uren van cultuur, werd functionele en synchrone afstraffing van de cardiale weefsel waargenomen, bevestiging van de mechanische integratie van de spheroïden (Figuur 2, links). We hebben ook vastgesteld dat de vele lagen van spheroïden spontaan werden gewonnen op een gecoördineerde wijze op de lichte microscopie (Figuur 2, rechts).

Een analyse van immunohistochemical van het net schimmel gebaseerde 3D-cardiale patch is ook uitgevoerd met de cardiale marker troponine T. Confocal beeldvorming is gebleken dat het goed uitgelijnde cardiomyocytes alle tentoongesteld troponine T expressie (Figuur 3).

Figure 1
Figuur 1 : Oprichting van opknoping drop spheroïden. Mens-geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes (hiPSC-CMs), menselijke cardiale fibroblasten (HCFs) en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) werden geïsoleerd en gebruikt voor het genereren van een celsuspensie met 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs, op een concentratie van 2,475,000 cellen per mL. Na 72 uur, werden de spontaan gevormde spheroïden in elke schoon gemakkelijk te verslaan onder de lichte microscopie van waargenomen. De bar van de schaal in het linker paneel = 1.000 µm; de bar van de schaal in het rechter paneel = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Oprichting van een meerdere lagen cardiale weefsel worden getoond van de integratie van de component spheroïden. Na detachement van de netto mal, de 3D-cardiale patch onderhouden zijn vorm en aangetoond synchrone gewonnen, met vermelding van de mechanische integratie van de spheroïden, zoals wordt weergegeven in het linker paneel (waar de schaal bar = 1.000 µm). De gestapelde multilagen van spheroïden werden geïnspecteerd met de lichte microscopie, zoals wordt weergegeven in het rechter paneel (waar de schaal bar = 400 µm), en waargenomen te worden spontaan gewonnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Immunofluorescentie evaluatie van de cardiale weefsel. Op immunofluorescentie analyse bleek het netto schimmel gebaseerde 3D-cardiale weefsel bestaat uit goed uitgelijnde cardiomyocytes met troponine T expressie. De schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het belang van deze methode ligt in de reproduceerbaarheid en de effectiviteit van het daaruit voortvloeiende meerdere lagen cardiale weefsel. Op het gebied van cardiale weefselengineering is één van de huidige doelstellingen het identificeren van een methode voor de bouw van slaand, meerdere lagen en functionele 3D-cardiale patches. Wij rapporteren een efficiënte en reproduceerbare methode van het creëren van meerdere lagen cardiale weefsels door directe handmatige zaaien van spheroïden samengesteld van cardiomyocytes, endotheliale cellen en fibroblasten in een roman netto mal. De netto mal gebruikt bij deze methode heeft een verscheidenheid van verschillende grootte voor de oprichting van weefsels, variërend van 2 x 2 x 1 mm tot 6 x 6 x 1 mm. De technieken die wij hebben beschreven, kunnen ook worden gewijzigd voor verschillende schimmel vormen en systemen afhankelijk van de gewenste weefsel geometrie. De beschreven cel concentraties en ratio's waren eerder geoptimaliseerd voor hiPSC-CMs, en wijzigingen in een andere celtype vergt extra evaluatie.

De in vitro -creatie van 3D-cardiale weefsels met behulp van bioprinter technologie is onderzocht met de hoop van de ontwikkeling van therapeutische en diagnostische modellen. Echter, huidige bioprinting methoden zijn omslachtig en vereist veel tijd en het gebruik van aanvullende ondersteunende structuren zoals naalden of Steiger materiaal. De aanwezigheid van deze bijkomende steun structuren vermindert de verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof18. Centrale necrose is daarom een belangrijk aandachtspunt in de huidige 3D-cardiale constructies, vanwege het ontbreken van haarvaten te leveren van zuurstof en voedingsstoffen19. Sakaguchi et al. toegepast de coördinatiemethode sodat georiënteerde cel bladen en gebruik van vasculaire bed bioreactoren om te ontwikkelen een endothelial netwerk20. In de netto schimmel systeem hier gepresenteerd, kunnen de matrijs holte voldoende verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof zonder de eis van ondersteunende structuren of steigers. Bovendien, de netto schimmel gebaseerde methode is efficiënt en vereist geen speciale vaardigheden hebben voor zowel het zaaien van de spheroïden in de mal en het onderhoud van de latere patch. Als zodanig is het een snelle en goedkope manier te verwerven synchroon verslaan en functionele cardiale patches.

Voor het optimaliseren van de sferoïde-diameter en het aantal spheroïden gebruikt in elk opknoping drop apparaat, voerden we oplossen en wijzigingen met betrekking tot de celtypen en hoeveelheden. Voor deze schimmel gebaseerde nettomethode waren de sferoïde-diameter en het aantal spheroïden gebruikt van het allergrootste belang aan het maken van een functionele cardiale weefsel van voldoende grootte. We hebben geprobeerd de verschillende cel concentraties voor het optimaliseren van de beste sferoïde grootte voor de oprichting van de cardiale weefsel. Drie soorten cellen werden gebruikt voor het maken van cardiale spheroïden door de opknoping drop apparaat, waaronder 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs. Onder de lichte microscopie, werden de spontaan gevormde spheroïden in elke schoon gemakkelijk waargenomen te verslaan na 72 uur. We waargenomen dat de diameter van de spheroïden verhoogd met de concentratie van de cel van de opknoping drop apparaat. We hebben geprobeerd de verschillende concentraties van spheroïden, van 100 spheroïden naar 300 spheroïden in elk apparaat, met 4 mL van RPMI/B27 medium. Met talrijke proeven vonden we dat de concentratie van 2,475,000 cellen per mL leverde een optimale diameter van de resulterende spheroïden. Met de geoptimaliseerde diameter van spheroïden ervaren we moeiteloos verzamelen en verzorgt de seeding van de spheroïden in de gestapelde netto schimmel, die belangrijke stappen tot de netto schimmel gebaseerde methode voor gelaagde cardiale weefsel creatie waren.

De meest kritische stap van het protocol is het optimaliseren van de grootte van de sferoïde. Het is vermeldenswaard dat het spheroïden gebruikt bij deze methode kleiner dan de grootte van sferoïde instanties gebruikt in andere bioprinting technieken21 zijn. Grotere spheroïden is gebleken dat centrale necrose als gevolg van de ontoereikende verspreiding van voeding en zuurstof22. Met spheroïden met een kleinere diameter, voldoende verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof naar het midden van elke sferoïde is meer eenvoudig te realiseren, verhoging van de cellulaire levensvatbaarheid in alle gebieden van de resulterende patch. In het protocol hier gepresenteerd, een sferoïde diameter van 350 µm zorgt voor de levensvatbaarheid van de cellen van de betere en meer contact oppervlakte tussen de spheroïden, die naar onze mening draagt bij tot het succes bij de oprichting van de cardiale weefsel met behulp van deze netto schimmel. Daarom is dit een cruciale stap in de beschreven methodologie. Aanpassing van het protocol bij andere celtypes, zijn extra sferoïde grootte optimalisatie experimenten vereist.

De beperkingen van deze aanpak is onder meer het onvermogen om exact bepalen de stapeling van de spheroïden. Dit resulteert in gebieden van non-uniformiteit van de resulterende weefsel patches en heterogene dikte. Bovendien, hoewel de werkelijke hands-on tijd voor het zaaien van de spheroïden minimaal is, het creëren van grote meerdere lagen patches vereist een uitgebreide cultuur de gelegenheid te geven voor de fusie van de spheroïden.

Wat betreft de toekomstige toepassingen is deze roman netto schimmel gebaseerde methode een efficiënte en reproduceerbare methode voor het maken van 3D-, steiger-gratis cardiale weefsels met minimale handmatige inspanning. Het resulterende meerdere lagen weefsel bestaan uit gesmolten spheroïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag. Deze schimmel gebaseerde nettomethode presenteert een kosteneffectieve en schaalbare alternatief voor de huidige bio-fabricage methoden van gemodificeerde weefsels en heeft de potentie om klinisch toepasselijke cardiale weefsels voor de behandeling van hartfalen maken met als doel ter vervanging van ischemische of disfunctionele cardiomyocytes23. Bovendien, kan deze methode worden gebruikt om het maken van cardiale weefsel voor patiënt-specifieke vertoningen van potentiële nieuwe drug therapieën24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de volgende financieringsbron: het Fonds van de Magic dat de zaken voor cardiovasculair onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120, (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120, (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66, (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11, (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23, (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11, (1), 163 (2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100, (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7, (1), 4566 (2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148, (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863, (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6, (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288, (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2, (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20, (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125, (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127, (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10, (8), 814-822 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics