一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法

Cancer Research

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Summary

慢性淋巴细胞白血病 (cll) 是西方世界最常见的白血病。nfat 转录因子是多种细胞类型发育和激活的重要调节剂。在这里, 我们提出了一个在人的 cll 细胞中使用染色质免疫沉淀 (chip) 来识别 nfat2 的新靶向基因的协议。

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H. G., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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Abstract

慢性淋巴细胞白血病 (clones) 的特点是恶性 b 细胞克隆的扩张, 是西方国家最常见的白血病。大多数 cll 患者表现出疾病的懒散过程, 以及他们的白血病细胞的过敏性表型, 指的是 b 细胞受体对外部刺激没有反应。我们最近已经证明, 转录因子 nfat2 是 cll 过敏的关键调节剂。在分析转录因子在不同疾病中的作用方面的一个主要挑战是确定其特定的目标基因。这对于阐明发病机制和潜在的治疗干预措施具有重要意义。染色质免疫沉淀 (chip) 是一种典型的技术, 以证明蛋白质与 dna 的相互作用, 因此, 可以用来识别直接的目标基因转录因子在哺乳动物细胞。在这里, chip 被用来鉴定lck作为人 cll 细胞中 nfat2 的直接靶向基因。dna 和相关蛋白质使用甲醛交联, 然后通过超声剪断成大约200-500 碱基对 (bp) 的 dna 片段。然后, 使用α-nfat2 抗体从细胞碎片中选择性地进行免疫沉淀。纯化后, 通过定量实时 pcr (qrt-pcr) 检测相关的 dna 片段。具有明显富集的 dna 序列代表了 nfat2在体内所针对的基因组区域。适当的 dna 剪切和所需抗体的选择对这种方法的成功应用特别关键。该方案是证明 nfat2 与目标基因直接相互作用的理想方案。其主要局限性在于难以在大规模检测中应用 chip 分析完整生物体内多种转录因子的靶向基因。

Introduction

慢性淋巴细胞白血病 (cll) 是西方国家成年人中最常见的白血病, 表现出明显的 cd19、cd23 和 cd5 积累, 表达成熟的 b 细胞1。大多数患者表现出懒散的疾病过程, 这不需要多年的具体治疗。相反, 一些患者表现出快速进展, 需要立即采取免疫化疗或其他靶向治疗的治疗干预 2,3。活化 t 细胞 (nfat) 的核因子 (nfat) 是控制 456 种多种细胞类型的各种发育和活化过程的转录因子家族。我们最近从懒散病患者7中证明了 nfat2 在 cll 细胞中的过度表达和宪法激活。在这里, 它调节 b 细胞受体刺激的无反应状态称为过敏 7。为了证明 nfat2 与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 (lck) 启动子结合并调节人 cll 细胞中lck 的表达, 研制并应用了一种特异性染色质免疫沉淀法 (chip)。

chip 是研究转录因子在基因表达中的作用的几种技术之一.基因表达是由几个调控者以非常复杂的方式紧密协调的, 转录因子在这一过程占不可替代的作用 9101112。在许多物种中 (例如, 用于发育和分化), 已经确定了在空间和时间范围内调节基因表达的转录因子 (例如,用于发育和分化)131415 16,17,18。涉及转录因子的复杂控制机制中的错误可导致各种病理过程, 包括癌症19,20。因此, 转录因子及其各自靶点的鉴定可能提供新的治疗途径21,22。为了研究这个有趣的领域, 有几种方法可用, 如 chip, 电泳移动转移分析 (emsa), 各种 dna 下拉分析和报告检测 8,11, 12,23,24岁

为了证明一定的转录因子与体内基因组的特定区域相互作用, chip 是一种理想的技术25。为此, 使用紫外线照射或甲醛 (交联 chip, xchip) 将活细胞中的 dna 和相关蛋白质交联。这一步被省略, 以获得更好的 dna 和蛋白质恢复在所谓的本地 chip (nchip)26。dna-蛋白质复合物随后通过超声复制被剪切成大约200-500 碱基对 (bp) 的片段, 并利用针对感兴趣的转录因子的特定抗体从细胞碎片中免疫沉淀。然后通过 pcr、分子克隆和测序对相关的 dna 片段进行纯化和定性。替代技术使用微阵列 (芯片上的 ChIP-on-Chip) 或下一代测序 (ChIP-on-Chip) 来分析免疫沉淀的 dna。

chip 最初是由 gilmour 和 lis 在1984年引入的, 当时它们利用紫外光在活细菌27中共价交联 dna 和结合蛋白.在细菌 rna 聚合酶的细胞裂解和免疫沉淀时, 利用已知基因的特异性探针绘制 rna 聚合酶的体内分布和密度图。该方法随后被同一研究人员用于分析真核rna 聚合酶 ii 在果蝇28热休克蛋白基因上的分布。varshavsky 和同事们进一步完善了 xchip 检测方法, 他们首先使用甲醛交联研究组蛋白 h4 与热休克蛋白基因2930 的相关性。nchip 方法, 具有更好的 dna 和蛋白质恢复的优势, 由于自然完整的表位, 因此, 更大的抗体特异性, 首次由 hebbes 和他的同事在 1988年31年描述

与其他分析 dna-蛋白质相互作用的技术相比, chip 的优势在于, 转录因子的实际相互作用可以在体内进行研究, 而不是由缓冲液或凝胶产生的探针或人工条件。雇用8,11,12。通过将 chip 与下一代测序相结合, 可以同时识别多个目标。

这种技术的主要局限性在于它对完整生物体中的大规模检测的适用性有限25。差异基因表达模式的分析也可以挑战使用 chip 技术, 如果各自的蛋白质只在低水平或在狭窄的时间窗口表达。另一个潜在的限制因素是是否有适合 chip11的合适抗体。

本文提出的 chip 协议可用于定量实时 pcr (qrt-pcr) 在体内识别转录因子的靶基因。具体而言, 目标是在 cll 中识别 nfat2 的新靶向基因。选择 chip 是因为它有可能直接证明 nfat2 在人 cll 患者细胞自然条件下与不同靶向基因的启动子区域的结合。

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Protocol

所有使用人类材料进行的实验都得到了图宾根大学道德委员会的批准, 并获得了为这项研究提供样本的所有患者的书面知情同意。

1. 陪审员室的分离和刺激

注: 若要优化协议, 请使用已知表示高级别 nfat2 的 jurkat 细胞系。所有步骤都是在层流罩下执行的。

  1. 在水浴中将 rpmi 1640 加入50毫升, 并加入10% 的 fcs 和1% 的青霉素/链霉素。
  2. 在37°c 的细胞培养瓶中培养 1-2 d 的 jurkat 细胞, 在 rpmi 1640 的20毫升中培养 5% co2, 辅以10% 的 fcs 和1% 的 penicillin/streptomycin, 密度约为 2 x6 6细胞/ml (细胞用 trypan blue 染色和 a 计数neubauer 室在显微镜下), 并通过离心 5分钟, 在 200 x g
  3. 用移液器取出上清液, 在 rpmi 1640 的10毫升中重新悬浮细胞, 辅以10% 的 fcs 和1% 的青霉素/链霉素。随后, 用传统的色氨酸蓝色染色和显微镜下的 neubauer 室数着细胞。
  4. 将步骤1.3 中的细胞在 200 x处离心 5分钟, 并通过抽吸去除上清液。然后, 在 rpmi 1640 中以 2 x10 7 cellsl 的密度重新悬浮细胞, 辅以10% 的 fcs 和1% 的 penicilinm®链霉素, 并通过移液在新的常规 5 ml 管中转移1毫升。
  5. 通过添加 32.4 nm phorbol 12-myristate 13-cate (pma) 和 1μm ionomycin 来刺激细胞。然后在37°c 下孵育细胞 16小时, 在管盖打开的情况下孵育 5% co 2 (为避免污染, 可以使用渗透空气的密封膜)。

2. 人患者原发性 cll 细胞的分离与刺激

注: 如前面所述, 患者样本被采集并受到刺激。所有步骤都是在层流罩下执行的。

  1. 准备必要的设备, 以提取患者的血液和进行密度梯度分离:21 g 针, 止血带, nh4肝素血液收集注射器 (例如, s-单肝), 1x pbs, 和密度梯度介质 (密度 077 g/ml).
  2. 静脉穿刺后, 将 cll 患者的血液 (每个患者约40毫升血液) 抽入注射器。然后将血液转移到50毫升的锥形管中。用10毫升 pbs 清洗注射器, 并将血 pbs 悬浮液集中在50毫升管中 (根据血量调整试管数量)。
  3. 在一个新鲜的50毫升锥形管中制备密度梯度介质的15毫升。随后, 血 pbs 悬浮液层35毫升在密度梯度介质上仔细。为此, 将管保持在一个平坦的角度, 并慢慢地将血 pbs 悬液移到50毫升锥形管的底壁上。由于更多的血 pbs 悬浮液在50毫升锥形管中积累, 将管的角度增加到直角。根据血 pbs 悬浮液的体积重复此步骤。
  4. 在 560 x克进行离心 20分钟 (不刹车), 然后提取含有外周血单个核细胞 (pbmc) 的单个核细胞相。为此, 用5毫升血清学移液器收集密度梯度分离的白色间相, 并将其转移到新的 50 ml 锥形管。
  5. 用 pbs 和离心机将细胞悬浮液灌满50毫升, 时间为 5分钟, 在 360 x g。通过抽吸去除上清液。在 275 x g 处离心 5分钟, 重复此步骤. 然后, 将一个病人的细胞集中在一个50毫升的锥形管中, 在5-10 毫升的 pbs 中。
  6. 按1.3 中所述对单元格进行计数。
    注: 这取决于 cll 细胞在隔离 pbmc 中的比例, 如果这些细胞可以直接用于此过程, 或者必须进行 b 细胞分离,例如,通过磁性细胞分选 (macs)。建议使用 b 细胞分离, 但如果 cll 细胞的比例超过总淋巴细胞的 95% (通过流式细胞仪确定), 则可以省略 b 细胞分离。cll 患者的血液根据制造商的说明进行固定和裂解。然后根据制造商的说明对 cd19-fitc 和 cd5-pe 抗体进行染色, 并通过流式细胞仪对细胞进行分析。图 1显示了一个模范患者, 其中 cll 细胞的比例为8903。因此, 必须在这个病人身上进行 b 细胞隔离。生理 b 细胞的比例可以忽略不计 (例子中为 3.72)。
  7. 用10毫升的预热 (37°c) rpmi 1640 清洗细胞, 辅以10% 的 fcs, 1% 青霉素/链霉素, 100 mm 非必需氨基酸, 1 mm 丙酮酸钠和 50 mm β-丙醇, 5分钟, 200 x g, 并通过吸入去除上清液.
  8. 在 rpmi 1640 中, 将细胞调整为 2x10 7 cellsl, 辅以10% 的 fcs, 1% 青霉素/链霉素, 100 mm 非必需氨基酸, 1 mm 丙酮酸钠和 50 mm β-硫醇 (37°c), 并将细胞悬浮液的1毫升填充到5毫升的管中。
    注: z-硫醇用于抵消氧化应激。
  9. 通过添加 32.4 nm pma 和 1μm ionomycin 刺激细胞。然后在37°c 下孵育细胞 16小时, 在管盖打开的情况下孵育 5% co 2 (为避免污染, 可以使用渗透空气的密封膜)。
    注: 为了降低压力水平, 在刺激16小时之前, 细胞可以在37°c 时休息 1小时, 在孵化器中休息5%。

3. 固定、细胞裂解和染色质剪切

注: 患者样本和 jurkat 细胞是固定的, 并与商业上可用的 chip 套件根据制造商的说明, 并进行修改, 如前面述7。固定是在层流罩下进行的。

  1. 准备一个 1.5 ml 管与1毫升的37% 甲醛, 1.5 ml 管与1毫升 1.25 m 甘氨酸1毫升, 5 ml 管与4毫升的 1x pbs 和一个盒子与冰的固定细胞。
  2. 在步骤1.5 或2.9 中刺激细胞各自的培养时间后, 将 5 ml 管在 200 x g下旋转 5分钟, 并在5毫升管中重新悬浮500μl 的 pbs 中的细胞。
  3. 在细胞中加入340μm 甲醛 (13.5μl, 即37% 的甲醛)。经过短暂的混合, 在室温下通过仔细的向上和向下移液孵育悬浮液2.5 分钟 (jurkat 细胞) 或 5分钟 (患者样本)。
    注: 原代细胞需要延长固定时间, 以确保最佳剪切。
  4. 加入 125 mm 甘氨酸 (57μl 的 1.25 m 甘氨酸), 停止固定, 再孵育 5分钟, 然后立即将细胞放在冰上, 在4°c 时以 500 x g离心5分钟。通过抽吸去除上清液。
  5. 在4°c 下, 用 200 x g的冰冷 pbs 用1毫升清洗细胞 5分钟, 每次通过吸入取出上清液。
    注: 固定后, 可以暂停该方案。固定单元应存储在-80°c。为了测试, 如果打算在以下协议中使用的抗体表位没有通过固定掩盖, 则可以通过 sds-page 凝胶电泳和西方印迹进行分析。根据制造商的说明, 这些步骤使用100μg 的蛋白质。所有的α-nfat2 抗体在稀释1:1000 时使用, gapdh 抗体在稀释1:1000 时使用。图 2显示了来自 jurkat 细胞的固定样本的示例图像, 其中含有适当和不适当的抗体。
  6. 通过上下移液, 将细胞颗粒在市售裂解缓冲液1的5毫升中重新使用。然后, 将样品放在摇床上的冰上, 在晃动的同时孵育 1 0分钟。
    注: 在裂解之前, 细胞可以在液氮中分解10秒。这对 jurkat 细胞很有用, 但在初级患者样本中应避免使用。对于崩解, 将5毫升管在5-10 毫升液氮中的5毫升放置在一个特定的容器中。戴上安全眼镜, 戴上适当的安全手套。
  7. 随后, 在4°c 下, 以 500 x g的速度离心管 5分钟, 并通过移液仔细取出上清剂。
  8. 通过上下移液, 使细胞在5毫升的5毫升中同质化, 并在晃动时在冰上孵育10分钟。然后在4°c 下, 以 500 x g的速度离心管 5分钟, 并通过移液仔细取出上清剂。
  9. 将含有1x 蛋白酶抑制剂 (分别为5μl 或 1.4μl) 的剪切缓冲液1的细胞颗粒在 500μl (jurkat 细胞) 或 140μl (患者样本) 中重新注射, 并在冰上孵育混合物10分钟。
  10. 对于染色质剪切, 将140μl 的细胞悬浮液从步骤3.9 转移到声纳管中 (避免产生气泡, 并在必要时由于样品体积而重复此步骤)。将管放在聚焦的超超声器中, 温度为 7°c, 剪切时间为 10分钟 (细胞系) 或 7.5分钟 (患者样本), 平均入射功率为 9.375 w, 以获得 200-500 bp dna 片段。
  11. 最后, 在 15700 x g的离心机在4°c 下, 在小型离心机中进行10分钟的离心, 并将上清液收集在一个新的 1.5 ml 管中。
  12. 为了测试合适的片段尺寸, 通过凝胶电泳在 1.5% tbe 琼脂糖凝胶中分析了剪切染色质的20μl。图 3显示了从质量好和质量差的 jurkat 细胞中剪切染色质的典型图像。此时, 协议可能会暂停。剪切染色质应存放在-80°c。

4. 染色质免疫沉淀

注: 染色质免疫沉淀是根据制造商的说明进行的, 并进行了修改7

  1. 计算剪切染色质的免疫沉淀 (70μl (jurkat 细胞) 或 15μl (患者样本) 加上一个抗体) 的数量, 并在 1.5 ml 管中每次沉淀制备20μl 的蛋白质 a 包覆珠子。每次沉淀时, 用40μl 的 chip 缓冲液1清洗珠子, 上下移液, 让珠子在磁性机架中休息 1分钟, 并通过移液去除上清液。总共执行此步骤四次。最终, 使用 1x chip 缓冲区1重新挂起原始卷中的珠子。
  2. 对于免疫沉淀本身, 使用10μg 的αnfat2 抗体 (7a6) 捕获带有约束目标序列的 nfat2。使用2.5 微克的兔 igg 抗体 (da1e) 作为 igg 对照。如表 1所示, 用新鲜 1.5 ml 管准备反应。
    注: 重要的是使用高亲和力的单克隆抗体, 其表位在固定过程中没有被掩盖的该方案。多克隆抗体引入了额外的变异水平, 使其更难以正确地解释收到的结果。
  3. 在转速为旋转轮提供4.2 步4.2 隔夜的旋转轮。
  4. 第二天, 在小型离心机中以 7000xg 的速度将管旋转 5秒, 将其在磁性机架中孵育 1分钟, 并通过吸入去除上清液。用每个洗涤缓冲液1、2、3和4连续清洗珠子一次。
  5. 为此, 请将珠子重新悬挂在350μl 的洗涤缓冲液中, 并在4°c 的旋转轮上, 在下午6点将其孵育5分钟。
  6. 此后, 在小型离心机中以 7000 x的速度将管材旋转5秒。然后, 将它们放置在磁性机架中 1分钟, 取出上清液并添加下一个洗涤缓冲液。
  7. 最后一步洗涤后, 通过移液去除上清液, 在100μl 洗脱缓冲液1中取出珠子, 并在转速为6转的旋转轮上孵育30分钟。
  8. 很快旋转管 (在 7000 x g的小离心机 5 s), 并将它们放在一个磁性机架1分钟。
  9. 然后通过移液将上清液转移到新的 1.5 ml 管中, 加入4μl 洗脱缓冲液2。
  10. 要创建输入控制, 请将剪切染色质的1μl 与99μl 洗脱缓冲液1和4μl 洗脱缓冲液2混合 (在此设置中, 每个患者有三个管: 一个输入控制、一个 igg 控制和一个αnfat2 样品)。
  11. 在65°c 下将样品培养 4年, 在 1.5 ml 管振动台中培养1300转/分。在小型离心机中加入100μl 的100% 异丙醇, 涡旋, 并将样品在 7000 x的情况下旋转5秒。
  12. 通过彻底的涡流重新注入可用的磁珠, 在每个样品中加入10μl 的磁珠, 并在室温下在转速的旋转轮上孵育1小时。
  13. 孵育后, 将管在 7000 x的小型离心机中旋转 5秒, 并将其放置在磁性机架中1分钟。通过抽吸去除上清液。
  14. 将珠子重新用100μl 的洗涤缓冲液1重新填充。将管材倒置, 在室温下在转速 6 rpm 的旋转轮上混合和孵育5分钟。
  15. 将管道在 7000 x的小型离心机中旋转 5秒, 将其放置在磁性机架中 1分钟, 并通过移液去除上清液。重复步骤 4.13-4.13 与洗涤缓冲液2。
  16. 随后, 通过抽吸取出洗涤缓冲液, 在55μl 洗脱缓冲液中重新悬浮珠子, 并在室温下在旋转轮上孵育 15分钟, 以在下午6点将沉淀的 dna 洗掉。最后, 在小型离心机中以 7000 x的速度将管旋转 5 s, 将其放置在磁性机架中 1分钟, 并将上清液转移到新的 1.5 ml 管中。
    注: 在这里, 协议可能会暂停。然后, 洗脱的 dna 应储存在-20°c。

5. 检测 cll 细胞中的 nfat 靶基因。

  1. 表 2所示, 对每个样品进行一式两份的 qrt-pcr 反应。
    注: 为了检测目标基因, 使用市售的 qrt-pcr 混合物和实时 pcr 仪器进行定量实时 pcr (qrt-pcr)。
  2. 使用白色96孔反应板进行反应和 rt-pcr 仪器。循环条件如下: 95°c 30秒, [95°c 为 5秒, 60°c 为 30秒] x 40周周期。
    注: 在无核酸酶水中, 采用连续稀释输入 (未稀释或稀释 1:10、1: 100 和 1: 1000) 来计算相对富集。在 jurkat 细胞中, il-2被用作阳性对照 32cd40l是 b 细胞中众所周知的 nfat2 靶点, 在 cll细胞中作为阳性对照, lck作为 cll 3334中 nfat2 新靶点基因的一个例子。在特定试剂和设备的表中描述了cd40lil-2lck促进剂区域的引物。

6. 规范化和数据分析

注: 有关促进器区域 (il-2cd40llck) 的相对富集是使用 igg 控制进行归一化计算的。

  1. 首先, 通过 qrt-pcr 数据的评估软件, 确定输入串行稀释、 il-2cd40llck启动子区域的 ct (阈值循环) 值。
  2. 通过输入的串行稀释, 定义浓度的标准曲线。利用该标准曲线计算每个样品的每个副本的 il-2、cd40llck启动子区域的浓度。
  3. 接下来, 计算重复项的平均值。然后, 将 igg 免疫沉淀样本设置为参考。将此样本的相对富集定义为 1.0, 并将其他样品 (来自 nfat2 免疫沉淀) 与此参考进行比较。
  4. 最后, 通过将样品浓度除以 igg 基准的浓度来计算相对富集。

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Representative Results

图 1显示了用 cd19-fitc 和 cd5-pe 抗体染色后对 cll 患者进行的典型流式细胞仪分析。图 1a显示了淋巴细胞的门控, 代表了 cll 患者血液中的大多数细胞。图 1b显示了 cd19+/cd5+ cll 细胞的比例, 在本例中占淋巴细胞的8.9.03%。cd19+/cd5-b 细胞在患者中的比例为3.72。

图 2显示了由 sds-page 和 west 笔画评估的用于不同时间段的 jurkat 细胞的抗体性能示例。对不同制造商的不同抗体进行了分析。图 2a显示了使用绿色荧光抗小鼠抗体检测到的不同制造商的αnfat2 抗体 (克隆 7a6) 的性能。制造商1的抗体显示与其表位结合无固定 (a 区), 甚至当 jurkat 细胞固定2.5 分钟或 5分钟 (分别为 b 区或 c 区) 时也是如此。另一方面, 制造商2的α-nfat2 抗体 (克隆 7a6) 即使在不固定的 jurkat 细胞中也表现较弱 (d 波段)。固定后, 该制造商的抗体获得了更弱的结果 (带 e (2.5 分钟固定) 和 f (5分钟固定))。图 2b显示了用红色荧光抗兔子抗体检测到的不同制造商的αnfat2 抗体 (克隆 d15f1) 的性能。这种抗体在不固定的样本 (a 波段) 中也表现较弱, 没有带表示其表位通过固定 (带 b (2.5 分固定) 和 c (5分钟固定)) 来遮挡。

图 3显示了经凝胶电泳评估, 在不同的固定和质量较差的剪切时间后, 从 jurkat 细胞中获得的剪切染色质的例子。带 a 和 b (分别为0分钟固定或2.5分钟固定) 显示出良好的质量剪切染色质, 其特点是 dna 片段大小 200-500 bp, 可检测到琼脂糖凝胶作为一个典型的涂片。另一方面, 质量差的剪切染色质可以通过几乎完全或完全没有预期的 dna 涂片 (c 波段) 以及在大于或小于预期的片段大小范围 (d-f 波段) 的涂片来识别。完全没有涂片表明使用了足够数量的起始材料。对较小 dna 片段的检测提示 dna 剪切过多 (e 波段), 而较大的 dna 片段则暗示剪切不足。

图 4显示了 jurkat 细胞的典型实验结果。lck被分析为潜在的 nfat2 目标。il-2是 t 细胞中 nfat2 的明确靶向基因, 作为阳性对照。利用 igg 控制抗体进行归一化。图 4a显示了一个实验, 其最佳结果记录在il-2阳性控制的显著浓缩上。从这个实验中可以得出结论, 在沉淀的 dna 中, lck序列有显著的丰富, 这证明lck是 jurkat 细胞中的一个直接 nfat2 靶点。图 4b显示了由于缺失固定或不理想的剪切过程而对质量差的 dna 进行的实验, 该过程导致il-2阳性对照中的富集程度较低。

图 5显示了对原代人 cll 细胞进行实验的结果。cd40l是 b 细胞中已知的 nfat2 靶点, 作为阳性对照,并以 lck为实验目标进行了分析。图 5a显示了一个实验, 在阳性对照中对 cd40l dna进行了相当程度的富集。从lck dna的更强富集, 可以得出结论, lck也是一个直接的 nfat2 目标在初级人类 cll 细胞。图 5b显示了对质量差的 dna 进行的实验, 很可能是由于剪切不足造成的。在阳性对照中, 未检测到cd40l dna的大量富集, 使实验数据变得毫无意义。

Figure 1
图 1: cll 患者的典型流式细胞术分析.(a) 用 cd19-fitc 染色后, 通过流式细胞仪对 cll 患者的样本进行分析, 并对 cd5-pe 抗体和淋巴细胞进行染色。随后, 确定了 cd19+/cd5 + cll细胞和 cd19+/cd5-b 细胞的比例。在这里, cd19+/cd5 + cll细胞占淋巴细胞的 8.03%, 而 cd19+/cd5-b 细胞占淋巴细胞的 3.72.显示了一位模范患者。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: sds-page 和西方细胞评估的固定 jurkat 细胞的抗体性能示例.(a) jurkat 细胞固定为 0分钟 (a 和 d 波段)、2.5分钟 (b 和 e 波段) 或 5分钟 (c 和 f), 并比较了来自不同制造商 (波段 a-c = 制造商 1, 波段 d-f = 制造商 2) 的αmaf2 抗体 (克隆 7a6)。制造商1的抗体表现出更好的整体性能, 结合与更高的亲和力, 甚至固定样品 (比较带 a-c 和 d-f 带)。(b) 使用了来自不同制造商的αnfat2 抗体 (克隆 d15f1)。这种抗体在未固定样本 (a 波段) 中表现不佳, 表位固定后被遮挡。因此, 固定后 (b 和 c 带) 无法检测到抗体的结合。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 凝胶电泳评估的 jurkat 细胞剪切质量好、剪力差的例子.jurkat 细胞被固定和剪切在不同的时间段。固定时间为 0分钟 (a 和 d 波段), 2.5 分 (b 和 e 带), 或 5分钟 (c 和 f)。剪切时间为 10分钟 (a-c 波段) 或 20分钟 (d-f 波段)。剪切质量好的染色质的特征是 dna 片段大小为 200-500 bp, 可检测为在相应区域 (a 和 b 带) 的涂片。质量差的染色质可以通过几乎完全或完全没有 dna 涂片, 由于使用的起始材料数量不足 (c 波段), 或在较小或较大的区域因剪切条件不当而涂片 (波段 d-f)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 由 qrt-pcr 评估的 jurkat 细胞的 chip.(a) nfat2 与 jurkat 细胞中的 lckil-2启动子结合。用 qrt-pcr 对 nfat2 抗体沉淀的lckil-2启动子区域的相对富集进行了分析。三个独立的 chip 实验显示为平均±sem (学生的 t-测试, * p & lt; 0.05; * * p & lt; 0.01 * * * p & lt; 0.001)。(b) 使用了质量差的剪切染色质样品中的 dna。无法检测到 nfat2 与目标序列的相关绑定。如果没有固定, 或者 nfat2 抗体的孵育时间不足, 也可以检测到类似的情况。三个独立的 chip 实验显示为平均±sem (学生的 t-测试, * p & lt; 0.05; * * p & lt; 0.01 * * * p & lt; 0.001)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 用 qrt-pcr 评估的原代人 cll 细胞的芯片.(a) nfat2 专门与患有懒散病程的患者的原代人 cll 细胞中的lckcd40l启动子结合。该图显示了用 nfat2 抗体沉淀的lckcd40l启动子区域的相对富集, 并通过 qrt-pcr 进行了分析。三个独立的 chip 实验显示为平均±sem (学生的 t-测试, * p & lt; 0.05; * * p & lt; 0.01 * * * p & lt; 0.001)。(b) 使用了质量差的剪切染色质患者样本中的 dna。无法观察到 nfat2 与各自目标序列的结合。三个独立的 chip 实验显示为平均±sem (学生的 t 测试, * p & lt; 0.05; * * p & lt; 0.01 * * * p & lt & lt; 0.001) 请点击这里查看此图的更大版本.

项目 每个 ip 的体积 (μl)
5% bsa 6
100 x 蛋白酶抑制剂 3个
5个 chip 缓冲区1 56
剪切染色质 x (15μl 或 70μl)
蛋白质 a 涂层磁珠 20
chip seq 级水 185 x-y
抗体 (α-nfat2 或 igg 控制) y (1.09μl 或 1μl)
1270

表 1: 将染色质免疫沉淀的时间表.染色质免疫沉淀是通过准备反应进行的, 如表所示。

项目 体积 (μl)/qrt-pcr
免疫沉淀 dna 9
qrt-pcr 混合 10
底漆前进 (lck/cd40l/il-2) 0。5
底漆反转 (lck/cd40l/il-2) 0。5
20

表 2: 对 qrt-pcr 进行移液的时间表.qrt-pcr 是通过准备表中所示的反应来完成的。

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Discussion

执行 chip 分析成功的关键步骤是选择合适的抗体和优化染色质剪切过程25。在该协议的开发过程中, α-nfat2 抗体的选择被证明是特别具有挑战性的。虽然有几种α-nfat2 抗体在商业上可以买到, 其中大多数适用于西方印迹和其他应用, 克隆7a6 是唯一可以成功用于 chip7的抗体。即使是来自不同制造商的相同的7a6 抗体在 chip 中的性能也有显著差异。一个主要的挑战是在 xchip 协议25中使用的固定过程可能会破坏目标蛋白表位。

染色质剪切过程对于获得 xchip 中的适当结果也是至关重要的。在该 nfat2 chip 协议7中, 琼脂糖凝胶电泳评估的碎片尺寸为 200-500 bp, 是最佳的.不适当的剪切条件导致 dna 起始材料或较小或较大尺寸的 dna 片段短缺, 通常会导致执行此检测时的结果不理想。在使用冷冻和解冻的 pbmc 时, 也观察到剪切不理想, 因此, 解冻 pbmc 会降低细胞 dna 的产量, 并增加 dna 片段的过度剪切。

提供种类繁多的 chip 试剂盒和 chip 级抗体具有挑战性, 但也提供了在广泛的环境中使用该技术的可能性。因此, 可以在不同的细胞类型中研究转录因子的多样性。例如, 最近使用 chip353637对 nfat 家族的其他成员 (nfat1 和 nfat4) 进行了调查。

这里使用的 chip 套件也必须进行修改, 以满足我们的需要。首先, 调整固定时间, 避免掩盖所使用的抗体所识别的表位, 并实现最佳剪切。用于裂解和剪切的缓冲液体积也发生了变化, 以减少不同清洗步骤中细胞的损失。此外, 还对剪切条件进行了优化, 以获得 200-500 bp 范围内的 dna 片段。蛋白酶抑制剂和 igg 控制抗体与其他市售试剂交换, 因为它们被证明是可比较的, 更具成本效益。制造商提供的涉及载体的步骤被省略, 因为它干扰了 dna 的沉淀。最后, 对用于洗脱 dna 的缓冲量进行了调整, 以产生足够的体积用于 qrt-pcr。

有其他几个套件可从不同的公司, 也有可能执行的 chip 没有套件。然而, 测试和建立是非常具有挑战性的, 因为有许多因素需要考虑, 如分析细胞和蛋白质的兼容性与不同的固定和剪切方法。上述试剂盒在我们的实验室中已经很好地使用了。

这种方法的一个主要限制是, 它对完整模型生物的大规模调查的适用性有限, 因为必须为每个单独的转录因子确定或产生适当的抗体。使用 chip, 对仅在低水平、少量细胞或在有限时间窗口中表达的基因进行分析也可能具有挑战性。

虽然 chip 是在完整的真核细胞25中证明特定转录因子与其各自目标基因直接相互作用的黄金标准, 但还有许多其他技术可以研究蛋白质和 dna 之间的相互作用.emsa 是检测细胞裂解状态 24中低丰度 dna 结合蛋白的一种有效方法。它还可用于通过系统的 dna 探针突变分析来表征特定蛋白质的结合亲和力。与 chip 相比, emsa 的一个主要优点是, 建立相应的检测方法通常要省时。dna 下拉分析、微板采集和检测分析以及记者检测是分析蛋白质与 dna 相互作用的其他技术23

最近的发展使得通过将 chip 分析与芯片芯片技术 (芯片上的 chip-g)3839、40或下一代测序 (ChIP-on-chip) 相结合, 将其应用于全基因组方法成为可能)41,42,43

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

这项工作得到了 dfg 赠款 mu 3340/1-1 和德国 krebshilfe 赠款111134的支持 (均授予 m. r. m.)。我们感谢艾克·马伦克提供的出色技术援助)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5 BD Biosciences 555353 Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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References

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32, (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121, (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17, (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5, (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10, (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8, (1), 755 (2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9, (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39, (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69, (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433, (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11, (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38, (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. Wiley & sons. (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10, (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53, (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283, (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7, (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273, (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154, (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106, (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, (1), 130 (2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12, (9), e0184724 (2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222, (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28, (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290, (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409, (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316, (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131, (5), author reply 832-833 831-832 (2007).

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