慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

Cancer Research

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Summary

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ) の使用のためのプロトコルを紹介します。

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H. G., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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Abstract

慢性リンパ性白血病 (CLL) と悪性 B 細胞のクローンの拡張によって特徴付けられる欧米で最も一般的な白血病を表します。CLL の患者の大半は病気の怠惰なコースだけでなく、白血病細胞アネルギーの表現型を表示し、B 細胞受容体の外部刺激に応答を参照します。我々 は最近、CLL のアネルギーの重要な調節因子である転写因子 NFAT2 を示しています。さまざまな病気における転写因子の役割の解析における主要な課題は、その特定のターゲット遺伝子の id です。これは発病メカニズムと潜在的な治療上の介在の解明にとって重要なのです。クロマチン免疫沈降 (チップ) 蛋白質 DNA の相互作用を示すための古典的な手法は、したがって、哺乳類細胞における転写因子の標的遺伝子を識別するために使用できる、.ここでは、チップは、CLL 細胞における NFAT2 の直接の標的遺伝子としてLCKを識別するために使用されました。DNA と関連するタンパク質架橋ホルムアルデヒドを使用して、その後約 200-500 塩基対 (bp) の DNA 断片に超音波処理によるせん断。NFAT2 に関連付けられた架橋の DNA のフラグメントが、選択的に αNFAT2 抗体を用いた細胞の残骸から沈澱。浄化後関連付けられている DNA のフラグメントは量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) によって検出されます。明らか濃縮 DNA シーケンスは、生体内でNFAT2 がターゲットにしているゲノムの領域を表しています。DNA と必要な抗体の選択の適切な剪断がこのメソッドの成功のアプリケーションのため特に重要です。このプロトコルは NFAT2 の標的遺伝子との直接相互作用のデモに最適です。その主要な制限は、そのまま生物における複数の転写因子のターゲット遺伝子を分析大規模な試金でチップを採用するが困難です。

Introduction

CD5、CD23、CD19 の明確な蓄積を展示表現成熟 B 細胞1、慢性リンパ性白血病 (CLL) は、欧米の成人の最も一般的な白血病を表します。ほとんどの患者は、長年にわたり特定の治療を必要としない怠惰病コースを展示します。対照的に、何人かの患者は、免疫化学療法または他の目標とされた療法2,3で即時の治療的介入を必要とする急速な進行を示します。活性化 T 細胞 (NFAT) の核因子は様々 な発達を制御する転写因子と多数のセル型4,5,6活性化プロセスの家族です。我々 は最近怠惰病7患者の過剰発現と CLL 細胞における NFAT2 の憲法活性化を示した。ここでは、それはアネルギー7と呼ばれる B 細胞受容体刺激に応答していない状態を調節します。NFAT2 リンパ球特定の蛋白質のチロシンのキナーゼ (LCK) プロモーターに結合しを CLL 細胞特定のクロマチン免疫沈降分析におけるLCKの発現を調節することを示す (チップ) を開発、採用します。

チップは8遺伝子発現における転写因子の役割を調査するいくつかのテクニックのひとつです。遺伝子発現はしっかりと演出した非常に複雑な方法でいくつかの規制当局がこのプロセス9,1011,12かけがえのない参加転写因子。多数種 (例えばの開発と分化)13,14,15、時空のコンテキストにおける遺伝子発現を調節する転写因子が同定されています。 16,17,18。転写因子が関与する複雑な制御機構でのエラーは、がん19,20を含む病理学的プロセスの様々 な可能性があります。したがって、転写因子とそのそれぞれのターゲットの同定は、新しい治療の道21,22を提供しています。チップ、ゲルシフトアッセイ (EMSA)、様々 な DNA プルダウン ・ アッセイ、レポーターの試金8,11,12,のようないくつかの方法がありますこの興味をそそられる分野を調査するには23,24

特定の転写因子がゲノムの特定の地域と対話することを実証するには、生体内で、チップは理想的な手法25です。このため、DNA と細胞内タンパク質関連は紫外線照射またはホルムアルデヒド (架橋チップ、XChIP) を使用して架橋します。良い DNA とタンパク質の回収いわゆるネイティブ チップ (NChIP)26を取得するこの手順は省略されます。DNA 蛋白質の複合体はその後 200-500 の塩基対 (bp) および興味の転写調節因子に対する特異抗体を用いた細胞の残骸から沈澱の断片に sonication によって毛を刈る。関連付けられている DNA のフラグメントは精製し、PCR、分子クローニングおよび順序によって特徴付けられます。代替技術は、沈澱の DNA を分析するのに (チップ ・ オン ・ チップ) のマイクロ アレイや次世代シーケンス (チップ Seq) を使用します。

チップ ギルモア初と UV を使用時 1984 年に Lis クロスリンク DNA 共有結合する光し体内蛋白質をバインド細菌27。セル換散、細菌 RNA ポリメラーゼの免疫沈降の時に知られていた遺伝子の特定のプローブは体内分布と RNA ポリメラーゼの密度をマップする使用されました。メソッドは、熱ショック蛋白質遺伝子ショウジョウバエ28の真核生物の RNA ポリメラーゼ II の分布を分析する同じ捜査官によってその後使用されました。XChIP アッセイは、・ バーシャフ スキーと最初熱ショック蛋白質遺伝子29,30とヒストン H4 の関連を研究する架橋ホルムアルデヒドを使用した同僚によってさらに洗練されました。NChIP のアプローチは、自然そのままのエピトープによるより良い DNA および蛋白質の回復の利点を運ぶと、したがってより抗体の特異性は、最初 Hebbes と 1988年31同僚によって記述されていた。

DNA 蛋白質の相互作用を分析する他の技術と比較してチップの利点は、実際には、転写因子の実際の相互作用は調査生体内でないプローブすることができます、バッファーまたはゲルによって作成された人工の条件811,12を採用しました。次世代シーケンサーとチップを組み合わせて、複数のターゲットを同時に識別できます。

この技術の主要な制限は、そのまま生物25大規模の試金への限られた適用性です。差動遺伝子発現パターンの解析は、低レベルでのみまたは狭い時間帯にそれぞれの蛋白質を表現する場合、チップの技術を使用してやりがいのあることができます。別の可能性のある要因は、チップ11適して適切な抗体の可用性です。

定量的リアルタイム PCR (qRT PCR) による転写因子の標的遺伝子を生体内で識別するためここで示したチップ プロトコルを使用できます。具体的には、目標は、CLL の NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するためにだった。チップは、直接細胞 CLL 患者の自然な条件の下で別のターゲット遺伝子のプロモーター領域の NFAT2 結合を示す潜在性のために選ばれました。

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Protocol

ひと由来の材料とすべての実験は、テュービンゲン大学の倫理委員会によって承認され、本研究のサンプルを貢献したすべての患者から文書によるインフォームド コンセントを得た。

1. 分離および刺激の Jurkat 細胞

注: プロトコルを最適化して、NFAT2 の高レベル表現に知られている Jurkat 細胞ラインを使用します。すべての手順は、層流フードの下で実行されます。

  1. 37 の ° C の水浴中に温暖化によって 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを RPMI 1640 の 50 mL を準備します。
  2. 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン約 2 × 10 の密度に6セル/mL 添加 RPMI 1640 20 mL に CO2を 37 ° C、5% で細胞培養用フラスコ 1 2 d の Jurkat 細胞の培養 (細胞はトリパン ブルーとカウント ブルー染色とノイバウアーは顕微鏡下で商工会議所) 200 x gで 5 分間遠心分離によってそれらを収穫。
  3. ピペットで上澄みを除去し、10 mL の 10% の FCS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン RPMI 1640 に細胞を再懸濁します。その後、従来トリパン ブルー染色と顕微鏡下でノイバウアー室セルをカウントします。
  4. 手順 1.3 200 x gで 5 分間から細胞を遠心し、吸引により、上清を除去します。その後、ピペッティングにより 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと転送新しい従来の 5 mL の管に 1 mL を添加した RPMI 1640 年に 2 × 107細胞/ml の密度で細胞を再懸濁します。
  5. 32.4 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) およびイオノマイシン 1 μ M を追加することで、細胞を刺激します。オープン チューブのふた付きの 37 ° C および 5% の CO2で 16 時間細胞をインキュベーションして (汚染を避けるためには、空気を透過する封止フィルムが使用することができます)。

2. 分離と人間の患者からプライマリ CLL 細胞の刺激

注: 患者サンプルに買収され前述7として刺激します。すべての手順は、層流フードの下で実行されます。

  1. 患者から採血し、密度勾配分離を実行して必要な機器を準備: 21 G 針、止血帯、NH4-ヘパリン-血のコレクション注射器 (例えば、S-monovettes)、PBS、密度勾配の中小 x 1 (密度 1.077 g/mL).
  2. 、採血時に注射器に CLL 患者 (約 40 mL の血液患者あたり) からの血を引きます。50 mL の円錐管に血液を転送します。10 mL の PBS でシリンジを洗浄し、プールを (血の容積にチューブの数を調整) 50 mL チューブに血液 PBS サスペンション。
  3. 新鮮な 50 mL の円錐管に密度勾配媒体の 15 mL を準備します。その後、レイヤー密度勾配媒体に慎重に血 PBS サスペンションの 35 mL。この目的のため平らな角度で管を保持し、ゆっくりピペット 50 mL の円錐管の下の壁に血 PBS サスペンション。50 mL の円錐管に血液 PBS 懸濁液のより多くが蓄積、直角まで管の角度を増加します。血液 PBS 懸濁液の量に応じてこの手順を繰り返します。
  4. (ブレーキ)、なし 20 分 560 × gで遠心分離を実行し、末梢血単核球 (PBMCs) を含んだ単核細胞の段階を抽出します。5 mL の血清ピペットと密度勾配分離の白の相間を収集し、新しい 50 mL の円錐管にそれを転送します。
  5. PBS と 360 x gで 5 分間遠心分離 50 mL に細胞懸濁液を入力します。吸引により上清を削除します。275 × gで 5 分間遠心分離でこの手順を繰り返します。その後、50 mL の円錐管に 5-10 mL の PBS で一人の患者の細胞をプールします。
  6. 1.3 で説明したようのセルをカウントします。
    注: 割合 CLL 細胞分離の PBMCs は、セルは、このプロシージャで直接使用する場合は B 細胞の分離が行われるが、例えば、磁気細胞分離 (MAC) 経由で異なります。B 細胞の分離はお勧めですが、CLL の細胞の割合 (フローサイトメトリーによって決まります) リンパ球の合計の 95% を超えている場合は省略できます。血の CLL 患者を固定して、製造元の指示に従って分離します。製造元の指示に従い CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色し、細胞をフローサイトメトリーで分析します。1 つの模範的な患者は、図 1CLL の細胞の割合は 89.03% に表示されます。したがって、この患者で実行される B 細胞分離がいます。生理学的な B 細胞の割合はごくわずか (例では 3.72%) です。
  7. 10 %fcs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mM 非本質的なアミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム 50 mM β-メルカプトエタノール 200 x gで 5 分間と予め温めておいた (37 ° C) 添加 RPMI 1640 10 mL で細胞を洗浄し、吸引により、上清を除去します。
  8. 2 x 107セル/ml 10 %fcs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mM 非本質的なアミノ酸、1 mM ナトリウム ピルビン酸と 50 mM β-メルカプトエタノール (37 ° C) 塗りつぶし細胞懸濁液の 1 mL と 5 mL チューブに RPMI 1640 にセルを調整します。
    注: β-メルカプトエタノールは酸化ストレスに対抗するため用いられます。
  9. 32.4 nM PMA と 1 μ M イオノマイシンを追加することにより細胞を刺激します。オープン チューブのふた付きの 37 ° C および 5% の CO2で 16 時間細胞をインキュベーションして (汚染を避けるためには、空気を透過する封止フィルムが使用することができます)。
    注: ストレスのレベルを減らすために細胞は刺激の 16 時間前にインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 1 時間休んだことができます。

3. 固定、セル換散およびクロマチンせん断

注: 患者サンプルと Jurkat 細胞固定は、市販のチップ キット変更7を前述のように製造元の指示に従ってと分離します。固定は、層流フードの下で実行されます。

  1. セルの固定のための 37% ホルムアルデヒド、1.25 M のグリシンの 1 mL と 1.5 mL チューブ、4 ml の 1x PBS の 5 mL チューブ、アイス ボックスの 1 mL と 1.5 mL チューブを準備します。
  2. 1.5 または 2.9 の手順でそれぞれの培養時間の細胞の刺激後スピン 5 分 200 x gで 5 mL チューブ、5 mL チューブで 500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。
  3. 340 μ M ホルムアルデヒド (37% ホルムアルデヒドの 13.5 μ L) をセルに追加します。慎重に上下にピペッティングによる簡単な混合後懸濁液 2.5 分 (Jurkat 細胞) または室温で 5 分 (患者サンプル) を孵化させなさい。
    注: 最適なせん断を保証する初代培養細胞用長期固定時間が必要です。
  4. 固定を停止し、その後すぐに氷と 500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心する細胞を入れて別の 5 分間インキュベートする 125 mM グリシン (1.25 M のグリシンの 57 μ L) を追加します。吸引により上清を削除します。
  5. 1 mL の 4 ° C で 5 分間 200 x gで氷冷 PBS で 2 回細胞を洗浄し、吸引により毎回清を除去します。
    注: 固定後、プロトコルを一時停止することができます。固定セルは-80 ° C で保存する必要があります。テストして固定を介して次のプロトコルで使用する意図した抗体のエピトープはマスクされない場合、SDS ページのゲルの電気泳動、ウエスタンブロット解析の追加のサンプルを使用できます。これらの手順は、製造元の指示に従って蛋白質の 100 μ g で実行されます。すべての αNFAT2 抗体が 1: 1000、1:10000 の希釈で GAPDH 抗体の希釈に使用されます。適切と不適切な抗体 Jurkat 細胞から固定サンプルの模範的なイメージを図 2に示します。
  6. 上下にピペットで 5 mL の市販の換散バッファー 1 で細胞ペレットを再懸濁します。シェーカーに氷の上、サンプルを配置し、揺れながら 10 分間インキュベートします。
    注: 換散、前にセルすることができますが崩壊した 10 液体窒素で s。これは Jurkat 細胞のため便利ですが、プライマリ患者サンプルで避けるべきであります。崩壊、5 の 5 mL の管の場所特定のコンテナーに液体窒素の 5-10 mL の s。保護メガネ ・適切な安全手袋を着用します。
  7. その後、4 ° C で 5 分間 500 x gでチューブを遠心分離、ピペットで上澄みを慎重に削除します。
  8. 上下にピペットで 5 mL の市販の換散バッファー 2 のセルを均質化し、振りながら氷で 10 分間インキュベートします。4 ° C で 5 分間 500 x gでチューブを遠心し、ピペットで上澄みを慎重に削除します。
  9. 500 μ L (Jurkat 細胞) の細胞ペレットを再懸濁しますまたはせん断の 140 μ L (患者サンプル) バッファー 1 プロテアーゼ阻害剤を含む 1 (5 μ L または 1.4 μ L、それぞれ) と氷で 10 分間混合物を孵化させなさい。
  10. クロマチンはシャーリング、超音波発生装置のチューブ (空気の泡と繰り返しこの手順に応じてサンプル ボリュームのための生産を避けるため) にステップ 3.9 から細胞懸濁液の 140 μ L を転送します。超音波発生装置 200 500 bp の DNA のフラグメントを取得する 9.375 W の平均入射電力で 7 ° C とせん断 (セル線) 10 分または 7.5 分 (患者サンプル) の温度で焦点を当てた超にチューブを置きます。
  11. 最後に、15700 x g小型遠心分離機で 4 ° C で 10 分間遠心し、新しい 1.5 mL チューブに上清を収集します。
  12. 適切なフラグメントのサイズをテストするため、1.5% TBE agarose のゲルの電気泳動のゲルを介してせん断クロマチンの 20 μ L を分析します。良いと悪い品質の Jurkat 細胞からせん断クロマチンの模範的なイメージを図 3に示します。この時点で、プロトコルは潜在的休止できます。せん断クロマチンは-80 ° C で保存する必要があります。

4. クロマチン免疫沈降

注: 変更7製造元の指示に従って市販チップ キットをクロマチン免疫沈降を行った。

  1. Immunoprecipitations (70 μ L (Jurkat 細胞) またはせん断クロマチン プラス 1 つの抗体の 15 μ L (患者サンプル)) の数を計算し、タンパク質 A コーティング ビーズ 1.5 mL チューブの沈殿物ごとの 20 μ L を準備します。上下にピペッティングによる沈殿物ごとのバッファー内蔵の 1 × 1 の 40 μ L でビーズを洗う、ビーズ 1 分のマグネッ トラックの残りの部分し、ピペットで上澄みを除去できます。合計で 4 回のこの手順を実行します。最終的には、元のボリュームで 1 x チップ バッファー 1 でビーズを再懸濁します。
  2. 自体免疫沈降にバインドされているターゲット シーケンス NFAT2 をキャプチャするのに αNFAT2 抗体 (7A6) 10 μ g を使用します。IgG コントロールとしてウサギ IgG 抗体 (DA1E) の 2.5 μ g を使用します。表 1に示されているように、新鮮な 1.5 mL チューブに反応を準備します。
    注: このプロトコルの固定中にそのエピトープはマスクされません高親和性モノクローナル抗体を使用することが重要です。ポリクローナル抗体は、受信した結果を適切に解釈する著しく難しくバリエーションの追加レベルをご紹介します。
  3. 6 rpm で回転ホイール上の 4 ° C で一晩手順 4.2 からの混合物を孵化させなさい。
  4. 次の日スピン チューブ 5、小型遠心分離機で 7,000 x gで s 1 分の磁気ラックにそれらをインキュベートし、清を吸引により除去します。1、2、3、4 種類の洗浄バッファーの各 1 回、ビーズを連続して洗ってください。
  5. 350 μ L の洗浄バッファーのビードを再停止しなさいし、それら 6 rpm で回転ホイールに 4 ° C で 5 分間インキュベートします。
  6. その後、スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s。磁気ラックで 1 分間置いて、上澄みを除去し、次の洗浄バッファーを追加します。
  7. 最後の洗浄工程後ピペットで上澄みを除去、溶出バッファー 1 の 100 μ L のビーズを取るし、6 rpm で回転ホイール上で 30 分間インキュベートします。
  8. チューブをすぐスピン (5 小型遠心分離機で 7000 x gで s) と 1 分の磁気ラックに置いて。
  9. 上清を新しい 1.5 mL チューブに分注して転送し、溶出バッファー 2 の 4 μ L を追加します。
  10. 99 μ L の溶出バッファー 2 溶出バッファー 1 と 4 μ L の入力コントロールを作成するミックスせん断クロマチンの 1 μ L (この設定では、患者 1 人あたりの 3 つの管: 1 つの入力コントロール、1 つの IgG コントロールおよび 1 つの αNFAT2 サンプル)。
  11. 1.5 mL チューブ シェーカーで 1300 rpm 65 ° C で 4 時間のサンプルをインキュベートします。100% イソプロパノール、渦とスピンの 100 μ L を追加 5 サンプル小型遠心分離機で 7000 x gで s。
  12. 徹底的にボルテックスによって利用可能な磁気ビーズを再懸濁します各サンプルにビーズの 10 μ L を追加し、6 rpm で回転ホイールに室温で 1 時間インキュベートします。
  13. 、孵化後スピン 5 チューブ s 小 7000 x gで遠心し、磁気ラックで 1 分間置いて。吸引により上清を削除します。
  14. 洗浄バッファー 1 の 100 μ L でビーズを再懸濁します。ミックス 6 rpm で回転ホイールに室温で 5 分間インキュベートしてチューブを反転します。
  15. スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s 磁気ラックで 1 分間置いて、ピペットで上澄みを除去。洗浄バッファー 2 と 4.13 4.14 手順を繰り返します。
  16. その後、吸引洗浄バッファーを削除 55 μ L の溶出バッファーのビードを再停止しなさい、沈殿させた DNA を溶出する 6 rpm で回転している車輪に室温で 15 分間インキュベートします。最後に、スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s 磁気ラックで 1 分間配置し、新しい 1.5 mL チューブに上清を移します。
    注: ここでプロトコル可能性があります一時停止できます。溶離された DNA、-20 ° C で保存します。

5. NFAT CLL 細胞標的遺伝子を検出します。

  1. 表 2に示されているようにすべてのサンプルの重複で qRT PCR 反応を行います。
    注: ターゲット遺伝子の検出のため量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) が行われる市販 qRT PCR ミックスを用いたリアルタイム PCR 装置。
  2. 反応と RT-PCR の器に白 96 ウェル プレートを使用します。サイクリングの条件は次のとおりです: 95 ° C、30 s、[95 ° C、5 s、30 ° C、60 s] x 40 サイクル。
    メモ: (原液または希釈 1:10、1: 100、1: 1000 ヌクレアーゼ フリー水で) 入力のシリアル希薄化は相対的な強化の計算に使用されます。Jurkat 細胞におけるIL-2は肯定的な制御32として使用されました。CD40L、B 細胞の NFAT2 の既知のターゲットは、CLL33,34NFAT2 の新規標的遺伝子の例として CLL 細胞の研究者が LCK肯定的な制御として使用されました。CD40LIL-2LCKのプロモーター領域のためのプライマーは、特定の試薬や機器の表に示します。

6. ノーマライゼーションとデータ分析

注: (IL-2CD40LLCK) プロモーター領域の相対的な強化は、正規化の IgG コントロールを使用して計算されます。

  1. まず、入力シリアル希釈、 IL-2CD40L qRT PCR のデータから評価版ソフトウェアを介してLCKプロモーター領域の Ct (しきい値サイクル) 値を決定します。
  2. 入力のシリアル希釈によって濃度の標準曲線を定義します。この標準曲線とIL-2、CD40Lの濃度とすべてのサンプルの重複は、それぞれの研究者が LCKプロモーター領域を計算します。
  3. 次に、重複の平均値を計算します。次に、参照として IgG 免疫沈降サンプルを設定します。1.0 としてこのサンプルの相対的な強化を定義し、この参照 (NFAT2 法) から他のサンプルと比較します。
  4. 最後に、IgG 参照濃度によるサンプルの濃度で割って相対濃縮を計算します。

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Representative Results

図 1は、CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色後実行 CLL 患者の模範的な流れフローサイトメトリー解析を示しています。図 1a CLL の患者の血液中の細胞の大半を表す、リンパ球のゲートを示しています。図 1 bは、CD19 の割合を示しています+/CD5+ CLL 細胞は、この例ではリンパ球の 89.03% を表します。CD19 の割合+/CD5- B 細胞はそれぞれ患者の 3.72%。

図 2では、期間ごとに SDS のページおよび西部のしみにより評価した固定 Jurkat 細胞抗体パフォーマンスの例を示します。異なるメーカーの異なる抗体を行った。図 2 aは、緑色蛍光抗マウス抗体で検出されたさまざまなメーカーから αNFAT2 抗体 (クローン 7A6) のパフォーマンスを示しています。抗体製造業者 1 の示した固定 (A バンド) および Jurkat 細胞が 2.5 分または 5 分の修正されたときもせずそのエピトープに結合 (帯域 B または C、それぞれ)。ΑNFAT2-抗体 (クローン 7A6) メーカー 2、その一方から Jurkat 細胞でもない弱い性能を示した (バンド D) を修正しました。固定時に、このメーカーの抗体はも弱い結果 (バンド E (2.5 分固定) と F (5 分固定)) を達成しました。図 2 bは、赤い蛍光抗家兎抗体で検出された別のメーカーから αNFAT2 抗体 (クローン D15F1) の性能を示しています。この抗体はまた固定されていないサンプル (A バンド) で弱く行われる、バンドの不在は固定 (バンド B (2.5 分固定) と C (5 分固定)) によってそのエピトープのマスキングを示します。

図 3は、異なる固定とにより評価した良いと低品質の時代をせん断のゲルの電気泳動後 Jurkat 細胞からせん断クロマチンの例を示します。バンド A, B (0 分固定または 2.5 分固定、それぞれ) を良質せん断クロマチンは、典型的な塗抹標本として agarose のゲルに検出することができます 200 500 bp の DNA のフラグメントのサイズが特徴です。一方で、質の悪いのせん断のクロマチンは、塗抹標本より大きいまたは予想されるフラグメント サイズの範囲 (バンド D F) より小さいと同様、期待される DNA スミア (C バンド) のほぼ完全なまたは完全な不在によって認識できます。塗抹標本の完全な欠如は、出発原料の不十分な量の使用を示します。小さい DNA の検出に過剰な DNA せん断 (バンド E) 不十分なせん断に大きな DNA 断片のヒント、ヒントを断片します。

Jurkat 細胞での典型的な実験の結果を図 4に示します。潜在的な NFAT2 ターゲットとしてLCKを行った。T 細胞における NFAT2 の明確に定義されたターゲット遺伝子であるIL-2は、肯定的な制御として使用されました。コントロール IgG 抗体は、正規化に利用されました。図 4 aは、最適な結果のIL-2の肯定的な制御の大幅な強化により文書化と実験を示しています。この実験からLCK LCKが Jurkat 細胞で直接 NFAT2 ターゲットであることを示す沈殿した DNA 配列の重要な濃縮があることを締結することができます。図 4 bは、固定またはIL-2肯定的な制御で低濃縮度を引き起こす最適せん断プロシージャが見つからないため質の悪い DNA の実験を示しています。

図 5は、プライマリ CLL 細胞で実験の結果を示しています。CD40L肯定的な制御およびLCKを務めた B 細胞で知られている NFAT2 のターゲットであるは、実験対象として解析しました。図 5 aは、肯定的な制御のCD40L DNA の濃縮のかなりのレベルでの実験を示しています。LCK DNA のさらに強力な濃縮から、 LCKもプライマリ CLL 細胞で直接 NFAT2 ターゲットであることが締結される可能性が。図 5bは、不十分なせん断の最も可能性の高いため低品質 DNA 実験を示しています。肯定的な制御実験のデータを無意味なレンダリングのCD40L DNA の実質的な充実は検出されませんでした。

Figure 1
図 1: CLL 患者の模範的なフロー フローサイトメトリー分析します。(CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色後 CLL の患者のサンプル a) フローサイトメトリーで分析し、リンパ球がゲートします。(CD19 の割合 b) その後、+/CD5+ CLL 細胞と CD19+/CD5- B 細胞を調べた。ここでは、CD19+/CD5+ CLL 細胞リンパ球、89.03% を占めるに対し CD19+/CD5- B 細胞はリンパ球の 3.72% を表します。1 つの模範的な患者がいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: SDS ページとウエスタン ・ ブロットで評価固定 Jurkat 細胞の抗体のパフォーマンスの例です。(a) Jurkat 細胞が異なった製造業者から αNFAT2 抗体 (クローン 7A6) や (C および F) 5 分 2.5 分 (バンド B および E) の 0 分 (バンド A と D)、修正された (A ~ C のバンド = メーカー 1、バンド D F = メーカーを比較 2) しました。メーカー 1 の抗体より全体的なパフォーマンス、バインド (A ~ C のバンドとバンド D F を比較) 固定のサンプルにも高い親和性を示した。(b) αNFAT2 抗体 (クローン D15F1) 別のメーカーから使用されていました。この抗体が固定されていないサンプル (A バンド) のパフォーマンスが低下を示したし、エピトープ固定時に覆面を被っていました。したがって、固定 (バンド B および C) 後、抗体の結合が検出されません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: ゲルの電気泳動によって評価 Jurkat 細胞から良いと低剪断の品質の chromatin の例。Jurkat 細胞固定、異なる時間帯にせん断されました。2.5 分 (B と E のバンド)、または (C および F) 5 分、0 分 (バンド A と D)、固定が行われていた。10 分 (A ~ C バンド) または 20 分 (バンド D F) 剪断を行った。せん断良質のクロマチンは、(バンド A と B) のそれぞれの地域で塗抹標本として検出することができます 200 500 bp の DNA のフラグメントのサイズが特徴です。不適切な剪断条件 (のために開始材料を使用 (C バンド) のまたはより小さいまたは大きいサイズ領域での細胞診で十分な量のために中傷 DNA のほぼ完全なまたは完全な不在によってどちらか質の悪いクロマチンを認識できます。バンド D F)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: qRT PCR による評価 Jurkat 細胞チップ。(a) NFAT2 は、 LCKおよび Jurkat 細胞におけるIL-2プロモーターにバインドします。NFAT2 抗体と沈殿LCKIL-2のプロモーター領域の相対的な強化が qRT PCR で分析したように表示されます。± SEM を意味する 3 つの独立したチップ実験が表示されます (スチューデントの t 検定 * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001)。(b) せん断質の悪いクロマチンのサンプルからの DNA が使用されました。ターゲット シーケンスに NFAT2 の関連するバインドは検出されませんでした。固定がないまたは NFAT2 抗体培養時間が足りなかった場合、類似画像を検出できます。± SEM を意味する 3 つの独立したチップ実験が表示されます (スチューデントの t 検定 * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 一次人間 CLL 細胞 qRT PCR による評価のチップです。(a) NFAT2 は具体的に病気の緩慢な経過症例からひと初代 CLL 細胞におけるLCKCD40Lのプロモーターにバインドします。NFAT2 抗体 qRT PCR による解析と沈殿LCKCD40Lのプロモーター領域の相対的な強化を示しています。± SEM を意味する 3 つの独立したチップ実験が表示されます (スチューデントの t 検定 * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P < 0.001)。(b) せん断クロマチンが使用された質の悪い患者試料からの DNA。それぞれのターゲット シーケンスに NFAT2 の結合は観察できなかった。± SEM を意味する 3 つの独立したチップ実験が表示されます (スチューデントの t 検定 * P < 0.05; * * P < 0.01 * * * P 0.001 <)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

項目 IP ごとにボリューム (μ L)
5% BSA 6
プロテアーゼ阻害剤 100 3
バッファー内蔵 1 x 5 56
せん断クロマチン x (15 μ L または 70 μ L)
タンパク質 A コーティング磁気ビーズ 20
チップ seq グレード水 185 x y
抗体 (αNFAT2 または IgG コントロール) y (1.09 μ L または 1 μ L)
合計 270

表 1: クロマチン免疫沈降をピペッティングのスケジュール。クロマチン免疫沈降は、表に示されているように、反応の準備によって行われました。

項目 qRT PCR ごとにボリューム (μ L)
沈澱 DNA 9
qRT PCR ミックス 10
前方のプライマー (LCK/CD40L/IL-2) 0.5
逆のプライマー (LCK/CD40L/IL-2) 0.5
合計 20

表 2: qRT PCR をピペッティングのスケジュール。QRT PCR は、表に示されているように、反応の準備によって行われました。

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Discussion

成功したチップ試金の実行の重要なステップは、適切な抗体の選択とプロセス25をせん断クロマチンの最適化です。ΑNFAT2 抗体の選択は、このプロトコルの開発時に特に難しいことがわかった。市販のいくつかの αNFAT2 抗体と西部にしみが付くことの罰金これらの作品や他のアプリケーションの大半が、クローン 7A6 だったチップ7正常に使用できる唯一の抗体です。でもおそらく異なった製造業者からの同一 7A6 抗体チップでのパフォーマンスに関して有意差を出展しました。主要な挑戦は XChIP プロトコル25で使用される固定のプロセスによってターゲット蛋白質エピトープの潜在的な混乱です。

プロシージャをせん断クロマチンも XChIP で適切な結果を取得するため重要です。Agarose のゲルの電気泳動によって評価 200 500 bp のフラグメントのサイズは、この NFAT2 チップ議定書7に最適なことが判明しました。この分析を実行するとき、DNA 材料または小さいまたは大きいサイズの DNA 断片を通常起動の不足の結果不適切な剪断条件が最適ではない結果に します。準最適せん断も認めた冷凍および rethawed PBMCs。 したがってを使用するとき DNA 断片の過剰な剪断の増加と同様、セルからの DNA の低収量で起因した PBMCs の解凍。

さまざまなチップ キットおよび抗体チップ グレードの可用性はチャレンジです広い文脈のテクニックを使用する可能性を提供しています。したがって、異なる種類の細胞での転写因子の多様性を調べることができます。たとえば、(NFAT1 および NFAT4) の NFAT 家族の他のメンバーについて検討した最近チップ35,36,37

ここで使用されるチップ キットも我々 のニーズに合わせて変更しなければならなかった。最初に、使用される抗体によって認識エピトープのマスキングを避けるために、最適な剪断に、固定の時刻が調整されました。換散および剪断に使用されるバッファーの量も異なる洗浄のステップの間に細胞の損失を減らすために変更されました。さらに、200-500 bp の範囲で DNA のフラグメントを取得するせん断条件を最適化しました。プロテアーゼ阻害剤とコントロール IgG 抗体は、彼らと同等よりコスト効率の高いことがわかったと他の市販試薬と交換されました。DNA の沈殿物で干渉と、製造元によって提供されるキャリアを含む工程は省略されました。最後に、DNA を溶出に使用されるバッファーの量は、qRT PCR に使用される十分な量を生成する適応されました。

様々 な企業から利用できるいくつかの他のキットがあるし、キットのないチップを実行する可能性もあります。ただし、テストと確立は、非常にチャレンジングな分析細胞やタンパク質の異なる固定方法をせん断との相性のような考慮されるべき多くの要因があります。当研究室で確立されただったので、述べられるキットが使用されました。

識別または各個々 の転写因子の生成に適切な抗体を持っているので、このメソッドの主要な制限は大規模な調査のままのモデル生物におけるその適用対象が限定です。チップを使用してセルのまたは制限されている時間ウィンドウの中に小さい数で、低レベルでのみ発現遺伝子の解析に挑戦することができますも。

タンパク質と DNA の相互作用を調査する他の技術の数があるチップは、そのまま真核細胞25でのそれぞれのターゲット遺伝子を特定の転写因子の直接的な相互作用を実証するゴールド スタンダードは、.EMSA は、携帯 lystates24低豊富な DNA 結合タンパク質を検出する便利な方法です。体系的 DNA プローブの変異分析を通じて特定のタンパク質の結合親和性の特性評価にも使えます。チップと比較して EMSA の主な利点は、それぞれの試金を確立する一般的に大幅により少なく時間のかかるだという事実です。DNA プルダウン ・ アッセイ、マイクロ プレートのキャプチャと検出アッセイおよびレポーターの試金は蛋白質 DNA 相互作用23を分析する他の技術。

最近の進展は、マイクロ アレイ技術 (チップ ・ オン ・ チップ)38,,3940または次世代シーケンス (Seq チップとの組み合わせによるゲノムワイド アプローチにチップ試金を適用すること)41,42,43

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

この作品は、DFG によって支えられた MU 3340/1-1 およびドイツ Krebshilfe 付与 111134 (M.R.M. に授与の両方) を付与します。ありがとうエルケ Malenke 優れたテクニカル サポート)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5 BD Biosciences 555353 Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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References

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