前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。

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Immunology and Infection

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Summary

ここでは、最初の初乳の授乳と組み合わせて新生児ラット脳における脳核を分離するプロトコルを提案します。この技法は、上皮細胞のシグナリングを用いた変調、脳の栄養不足ストレスの研究をできます。

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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Abstract

このプロトコルの目的は、最初の初乳の授乳の前後に新生児の脳でオキシトシン受容体豊かな脳核を分離することです。西部にしみが付くことを使用して脳核分離株における代謝ストレス応答する知られていた蛋白質の発現を測定しました。これは、体内代謝ストレス誘発性の栄養不全が神経ストレスをトリガーするかどうかを評価するために行われました。以前新生児の栄養不全が腸内代謝ストレスを引き出すことができた。さらに、初乳オキシトシンは、最初のフィードの前後前に新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジー マーカーを変調します。小胞体ストレスに関連付けられている蛋白質のマーカーをシグナリング [小胞体シャペロン結合免疫グロブリン蛋白質 (BiP) 真核生物翻訳開始因子 2 a (eIF2a) と eIF2a キナーゼ蛋白質キナーゼ R (p PKR)]、2 だけでなく、炎症シグナル伝達蛋白質 [核因子 κ B (NF kB) および阻害剤 κB (IkB)] 新生児脳核測定した [孤 (NTS)、室傍核 (PVN)、スープラ網膜神経核 (息子)、野 (CX)、線条体核 (STR) の核と内側視索前野核 (MPO)] 最初のフィード (初乳处置 p) の前に (初乳によってプライミング) 看護の開始後。Bip/grp78 と p eIF2a の発現はプライミング NTS 組織、处置 p で亢進とダウンレギュ レート。NF kB は、NF kB が低いとそのまま国税庁、PVN と息子の両方の条件に対し CX、STR と MPO の細胞質 (高) 保持されました。集団 BiP と p eIF2 所見は、ストレス応答と一致しています。eIf2a はだった息子、CX、STR、MPO で dsRNA 依存型キナーゼ (PKR-p) によりリン酸化されます。ただし、国税庁 (および PVN でより少ない程度に)、eIf2a は別のキナーゼ、一般制御 nonderepressible 2 キナーゼ (GCN2) によりリン酸化されます。いくつかの OTR の豊富な脳領域でミラー化される以前新生児の腸上皮細胞に見られるストレス変調構造が表示されます。国税庁、PVN 可能性があります他の地域から別のリン酸化機構 (栄養不足) 下を利用し、栄養不足の影響に抵抗性であります。総称して、このデータは、初乳プライミング上皮細胞からのシグナルによって栄養不足ストレス脳応答をオフセットすることを示唆しています。

Introduction

日-週に産後のコース上に発生する初期の脳の発達の理解と対照をなして比較的少し知られている無数のラットでの生活の最初の数時間で発生する動的な変更について。重要な課題は、ラット新生仔脳と離散脳領域または単一の細胞を分離するハイテク ツールのための要件の小さなサイズをされています。研究は、遺伝子の転写と翻訳ではない1,2, 活性化シグナル伝達分子の機能レベルのしっかりした理解を与えていないしばしば評価します。他の人は表現のレベル3の定量化のため許可しない参照脳領域に免疫組織化学を使用して式を調べます。これまでの研究はラットの最初初乳の迅速単離と犠牲と蛋白質の表現、蛋白質のリン酸化を使っている西の測定を要求する離散脳のフィードに関連付けられているシグナルの活性化は検査されません。しみが付きます。古いより大きい頭脳の脳レーザーマイクロダイ セクションが実行、間ない P0 脳の非単一細胞脳パンチを実行する参照を同定しました。比較的小規模なサンプルの蛋白質の表現を測定する比較的ローテクなパンチ法とウエスタンブロット プロシージャを用いた新生児の脳の制限された領域を分離するためのプロトコルを提案する.このプロトコルは蛋白質の表現およびポスト翻訳の修正の評価を必要とする研究課題に適した可能性があります (e.g、リン酸化)、任意の種の小さな脳の比較的制限された地域で提供する、。ユーザーは、アトラスと明確な目標物興味の脳の領域を視覚的に識別できます。

この技術は、フィード、オキシトシン (OT) が豊富である新生児ラットの最初の初乳の結果として脳の変化を理解するために開発されました。OT は、ミルクの失望と子宮の収縮を刺激するために、その能力の長い知られています。しかし、OT は今多くの身体機能や動作4規制の役割の広い範囲を再生する知られています。たとえば、OT が胃排出遅延、腸の通過を遅くにストレスと適応の親和行動5と組み合わせて炎症に反対します。OT 受容体 (OTR) は、腸溶性ニューロンと腸上皮6,7,8で識別されています。OT の消化管の効果は、出生後早期の間に幼児に特に重要です。例えば、母乳は新生児の腸9,10OT の大量の配信に関連付け、データ表示、OTR 大きくにおいて過剰発現十二指腸絨毛ミルク哺乳期間8時。

そのオキシトシン シグナリング経路11,12ストレスに重要な分子を調節してタンパク質の翻訳で規制の役割を果たして、細胞レベルで実証しているの腸細胞株を用いたin vitro実験12. これらの研究は、母親からの外因性のオキシトシンを含む牛乳の成分、細胞ストレス13を減らすために新生児の小胞体ストレス応答に重要な示唆しています。

体内体外の研究は、初乳 OT が新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジーのマーカーを調節することを示しています。新生児の腸内細菌叢に初乳14,15と OT9などのホルモンを含む多数の蛋白質の母親から腸を同時に公開する場合の内腔側に実質的なの細胞圧力に苦しむ,10,16

脳に OT の効果は、研究17をされています。しかし、出生後早期に腸内で示した OT シグナリング メカニズム脳に研究されていません。本稿で新生児ラット脳幹と視床下部の電気泳動を用いた離散脳核を分離するためメソッドを使用して、分離脳の領域をプロファイルします。このメソッドの全体的な目標は、細胞内情報伝達の脳領域誕生、最初のミルクは最小のグリア ・ ニューロン インデックスの脳組織で、授乳の前後にできるだけ近い状態をキャプチャすることです。この技術の開発のための根拠は、自動化された西部のしみを使用して前のヴィヴォ研究のためのニューロンより均質なコレクションと新生児子犬に制限された、微細な脳領域の急速な隔離のためできます。方法論は、比較的小規模な解剖サンプルに非常に一貫した結果を提供しています。前の仕事の欠点 (脳スライスまたは全脳) 総郭清より古い動物18,19を含まれます。若い子犬の脳は、非常にダイナミック、グリア分化を生れの後の波を搭載します。子犬の最初の供給によって影響を受け脳変化を研究するために再現可能な郭清を伴う制限された神経細胞核を勉強が必要です。

脳の発達中の脳の領域への影響はほとんど勉強したに対し、牛乳フィードは通常 (たとえば、腸20,21)、健康や遺伝子発現への免疫学的および栄養の影響を分析します。腸コレシストキニン受容体迷走リレー脳幹核が細胞内シグナル伝達経路22参考腸に牛乳輸送が脳機能に及ぼす影響を調べた。妊娠23日中に母親の栄養失調に発展途上の新生児脳の脆弱性に関する膨大な文献があるが、ストレスと炎症シグナルは扱われません。重要なは、現在のメソッドは、内臓刺激の迷走神経の中継から初乳の血生まれる刺激を分離する日ゼロ ラット新生児における現象の活用します。これは孤束の未熟な核 (NTS) によって特徴付けられるいわゆるストレス低刺激応答性期間-国税庁、室傍核 (PVN) を制限する出生24,25の直後に視床下部の回路と視索上核 (SON) は、血生まれる刺激に通知します。

このメソッドは複数のシグナル伝達経路の分析に役立つ、脳組織は母親が挑戦されているかどうかに加えて、または治療の任意の種類ではなく、ラットの生後日 0 で収穫される神経細胞に比較的制限妊娠中。リットルは、pre-feeding 信号対フィード初乳の影響を分析できます。豊富な蛋白質収量の比較と脳領域間の信号を比較すると、このメソッドは、毛細血管が蛋白質の抗原の免疫定量と並行でポリペプチド バンドの総蛋白質の毛細血管に決定をできます。このメソッドは、標準的な定量曲線なし同じ抗体と毛細血管あたり総蛋白への参照によって得られた結果の任意の単位を使用して、定量的な比較をできます。異なった抗体によって得られた結果を比較することは、定量的標準曲線を使用して可能です。

このメソッドは、双方向の両方の器官の26の機能に影響を与える可能性、腸と脳との間で発生するシグナル伝達の評価できました。近年27で広範囲にわたって研究されてきた、オキシトシンと食物の摂取の間の関連付けは、増加オキシトシン シグナリングと栄養アベイラビリティの間のリンクをサポートします。これらの研究は、赤字は、視床下部のオキシトシンがシグナル伝達の削減と結合エネルギー コンバース概念もサポートします。

OT の脳活動に及ぼす影響の以前の研究では、迷走神経切断術28耐火が視床下部の PVN、扁桃体、および梨状皮質における Cfo 転写を誘導腸の炎症に誘発を示した。ただし、セクレチンと OT の全身投与は腸28で誘発される炎症反応に対する脳の Cfo 反応を減少しました。これは外因性の OT の効果はおそらくエリア後野6,29を介して運ばれる血液媒介性シグナル分子で、迷走神経のリレー以外のルートで実施された提案しました。

本研究では、腸内で以前に観察した細胞ストレスのシグナル伝達経路は脳で評価されました。順番に及ぼす脳機能、乳成分、保護、又は微生物やその他の代謝物、腸の透過性におよぼす炎症を延期しました。IkB で明確な拮抗の違い BiP シグナリング初乳13によるプライミングの前後に絨毛が見つかりましたと提案を開発する過程で、まだ新生児の脳がこれらの腸の免疫誘導信号を感じるかもしれない。

小胞体ストレスに関連付けられている以前の腸実験で使用されるシグナリング蛋白質のマーカーを測定しました。彼らは小胞体シャペロン BiP、翻訳開始因子 eIF2a (ストレス応答インテグレーター30となる)、eIF2a キナーゼが含まれて-PKR、および 2 つの炎症シグナル伝達蛋白質 (NF kB とその阻害剤、IkB)。

六つの脳領域が分泌する、または OT に応答する大人の能力に基づいて選ばれました。上部髄質にある国税庁は、内臓の入力の最初のリレーで腸31とサイトカインは、おそらく血液生まれて、毒素、隣接する野32を介してホルモンで迷走神経の感覚ニューロンから直接信号を受け取る。PVN、視索上核 (SON), 線条体核 (STR)、大脳皮質 (CX) と内側視索前野核 (MPO) 国税庁を介して腸から信号を受信します。

その結果、細胞ストレス応答初乳プライミング前、PVN と息子と比較して国税庁で異なるが摂餌開始直後すぐ産後の期間中CX のシグナリング、STR と MPO 異なって PVN と息子同様。細胞ストレスと腸内の炎症を調節する前に示した OT の明確な保護機能、脳のいくつかの領域によって検出される可能性が高い。まとめて、データを示す細胞レベルで出産後、最初の時間の間に脳に応答する代謝ストレス栄養不足に関連付けられています。データも表示範囲とフィード初乳の変調効果の方向が地域依存性であること、および彼らの腸の例で示した OT 効果ミラー、いくつかの地域では。

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Protocol

本研究は、動物介護制度とコロンビア大学、ニューヨーク州立精神医学研究所利用委員会によって承認されました。

1. ティッシュの準備

  1. ベンダーからタイミング妊娠ラットを注文します。
  2. 続くタイミング妊娠ラット到着後数週間で成長している腹部を観察し、その後、ケージを調べることによって出産予定日に子犬を探してすべての 2 h 配信が開始されるまで。
  3. 处置 p 子犬 (白いミルク腹がない明白な腹部を表示しているとき) または後 (その時点で白の胃が表示されます自分の腹部に) 発動を促された子犬の最初のフィードの最初のフィードの前に彼らの尾、timeli に従って手袋をはめた手で子犬を削除します。ne (図 S1)。
    注: 最初の初乳フィード; 子犬をプライミングと呼ばれるしたがって、この子犬はその後初乳プライミングしている最初のフィードまで先読みです。
  4. すぐに、シャープできれいな手術のはさみを使用して無麻酔の子犬の首をはねます。
  5. 鼻に正中線と頭蓋骨の上面を皮膚を切断することによって脳を削除します。その後、鉗子を使用して、優しく詮索離れて脳 (図 1 a) を公開および前、骨板が削除されると、ペンでマーキング (図 1 b) をローカライズする骨。
  6. 急速に室温室温 (図 1) でスライス コロナ ポリメチル ・ メタクリ レート脳金型に脳全体を配置します。
  7. 、遅滞なく新鮮なかみそりの刃を使用して 500 mm の厚さにスライスします。(図 2) のセクションの方向を維持するためにペトリ皿で尾側吻側のスライスを置きます。
  8. すぐに (アプライド; 1.0 mM KH2PO4、26 mM NaHCO3、118.6 mM NaCl、KCl、3.0 mM 203.3 mM MgCl2-6 H2O) の人工髄液糖なしを追加し、常に攪拌の 28-30 ° C で 60 分のスライスを孵化させなさい、代謝と特異的に初乳プライミング組織対、处置 p 挑戦する軌道のシェーカー。
  9. ティッシュ セクションの脳アトラス33と解剖学的ランドマークを使用してパンチに必要な脳核を識別します。ペトリ皿に関心の核を持つこのスライスを置き、解剖顕微鏡に移動します。
  10. 可視化、一度すぐに 4 6 の異なる核最適問題の核をパンチするサイズを選択する掘削ツールを使用して、一貫してサンプル (図 2) の間をパンチします。
    注: 残りの脳スライス、脳組織が削除された穴がある今。使用して次の核を摘出し, 本研究では、座標の下。すべて前方/後方 (A ・ P) 座標は、NTS、ショウブ Scriptorius に関連してある) を除く前から。すべての背/腹 (D/V) 座標は、NTS、髄質の表面からである) を除く皮質の表面からです。次の座標を含める A/P、内側/外側 (M ・ L)、および mm D/V: 1) 孤束核 (NTS、A/P、0.4 から 0.8;± 0.2 LD/V、0.3 (髄質の表面) から、2) 室傍核 (PVN、-0.8; ± 0.2 0)、3) スープラ網膜 (-1.1 息子; ± 1.4; 4.3), 4) 皮質 (CX、部分的な皮質領域 1、-2.8; ± 1.5; 0.6), 5) 線条体核 (STR、-0.0; ± 1.6 1.8)、6) 内側 preoptic核 (MPO、-0.6; ± 0.2 4.2)。
  11. 急速に (手順 2.3 参照) 60 分のプロテアーゼ阻害剤・ フォスファターゼ阻害剤を含む、氷、タンパク質抽出バッファーの 0.06 mL でパンチの核を浸します。

2. 蛋白質の抽出

  1. 予想される子犬配信前日にタンパク質溶解キット (資材表) を使用して蛋白質抽出溶液を準備します。
  2. 解凍 (氷上) 換散バッファー キットのホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤の水溶液の凍結 (-20 ° C)、氷の上の換散バッファーとプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の DMSO 溶液を配置します。
  3. きれいな冷たい 15 mL チューブに 1.85 mL の溶解バッファーを追加します。次に、阻害剤の水溶液と DMSO 溶解阻害剤 0.05 mL の 0.1 mL を追加します。最後に、キャップと簡単に渦管使用まで-20 ° C でそれを保つ。
  4. 溶解手順 24 のきれいなマイクロ遠心チューブ用 (0.5 mL) のラベルを付けます。初乳处置 p グループ (U) 【 6 左 (L) と 6 の右側 (R) 脳核 】 と核の頭字語によるとラベルのための脳につき指定 12 管側し、条件 (e.g。 NTS L U、NTS R U、)。初乳先読みサンプル 12 チューブの 2 番目のグループにラベルを付けます。
  5. ステップ 2.4 株式蛋白質のエキス (1.5 mL エッペン型チューブを使用して)、(0.5 mL チューブを使用して) サンプル準備の最初のセットでチューブの 2 つの追加セットのラベルを付けます。これらの管を 2 つ別のラベルが付いた凍結ボックス (それぞれ 100 管用に設計された) にしてください。1 つのボックスは、处置 p サンプルおよびプライミングのサンプルの他に使用されます。
  6. 子犬は、配信日に氷溶解液を解凍し、アプライドで脳スライスを抱卵中溶解手順に因数 0.06 mL 換散解決方法 (ステップ 2.4) から管し核パンチを追加し、60 分氷で孵化させなさい。
  7. 14000 rpm (10,000 x g) で冷却ミニ遠心機で 30 分間インキュベートした分離核を遠心し、慎重に正しく設定ピペットで上澄みの 0.055 mL を吸引します。(ステップ 2.5) から予冷の 1.5 mL のストック チューブに上清を転送し、氷の上に置きます。(-20 ° C) で蛋白質のストック チューブの凍結、前に (ステップ 2.5) から最初のサンプル準備のため 0.5 mL の予冷管清 0.012 mL に転送、氷の上にそれらを残します。

3. 毛細血管でタンパク質の測定の前処理

  1. キットを使用し、製造元の指示に従って分離試薬を準備します。標識蛋白質のエキスの 0.012 mL を含む氷の上 (ステップ 2.5) からチューブ 0.5 mL で 12 個の試料のそれぞれにマスター ミックス試薬の 0.003 mL を追加します。
  2. 95 ° C に加熱ブロックをオンにし、手順 3.1 0.016 mL の脱イオン水で管内のビオチン化分子 (MW) はしごで試薬の 0.004 mL を追加します。はしごとサンプルの変性、95 ° C、5 分で熱ブロックではしごチューブと处置 p タンパク質抽出物の 12 のサンプルを配置使用するまで 4 ° C で保存します。
  3. 初乳で刺激したラットからパンチ核試料調製に蛋白質の抽出から 2.0 に 3.2 の手順を繰り返します。

4 電気泳動の準備

  1. ビオチン標識、ベンチ (-80 oC でディープ フリーザーに格納) 剤を解凍し、製造元の指示に従って 4 ° C で氷の上タンパク質検出キットを用意します。
  2. 過酸化水素の 0.15 ml ルミノールの 0.15 mL をミックスし、25 の井戸 (行 E、井戸 1-25) 西部機械用プレートに 0.01 mL を読み込みます。ストレプトアビジン-HRP の 0.008 mL をキットから D25 に井戸 D1 に読み込む
  3. C25 と B1 C1 を井戸に抗体希釈液 0.01 mL をロードします。
  4. チューブ キャップから、minicentrifuge での蒸発させた水をプールに 24 の蛋白質のサンプルおよび梯子チューブ簡潔に (2、3 秒) をスピンします。
  5. 井戸 A2 A13、A25、A14 井戸に 12 初乳先読みサンプル 0.003 mL とも A1 にビオチン化はしごの 0.005 mL 12 处置 p サンプルの 0.003 mL に読み込みます。
  6. F の行を空のままにし行 F. カバー、プラスチック製のふた付きプレート残りの手順中に蒸発を避けるために以下の 3 行の各 5 区画のそれぞれに 0.45 mL の洗浄バッファーを読み込みます。
  7. 簡単に渦解凍ビオチン標識剤およびその指定管に試薬の 0.15 mL を追加それに総蛋白溶解剤 0.15 mL を追加し、均一に混ぜます。
  8. プレートからカバーを取り外し、エージェント 1 と 2 の 0.01 mL を B25 に井戸 B2 に読み込みます。プレートをカバーし、様々 なソリューションから空気の泡を削除する 1,000 x g で 10 分間遠心します。バランスをとるのための遠心分離機の空板を使用します。

5. 電気泳動

  1. プレートが回転しながら、総蛋白質の試金を実行する「ファイル」からドロップダウンのページに示す、それぞれのスポットをクリックすると自動西部機械に接続されたコンピューターで実行ファイルを開きます。
  2. コンピューターの井戸によってサンプルの注釈を付けます。遠心分離機削除カバーからプレートを削除し、慎重に分離ソリューションのコンパートメントからアルミのカバーをはがします。
  3. 自動化された西洋楽器でプレートを置き、キャピラリー カートリッジ ボックスからカバーを剥がし、その指定された場所にカートリッジを挿入して、ドアを閉めます。
  4. 「実行」ボタンをクリックしてし、試金 (「総蛋白質」) のタイプのメッセージが表示されたら、サンプルの名前を入力 (たとえば、"2-13 と初乳プライミング 14-25" 处置 p)。"OK"をクリックし、活性化の実行日付と実行ファイルの ID 番号でメッセージが表示されたら、実行を終了する時刻のメモしておきます。
  5. (開始後 170 分) の実行の最後に、楽器の扉を開く、キャピラリー カートリッジを取り外し、シャープ処理に破棄します。生物学的問題の処分でプレートを破棄します。
  6. 実行ファイルの解析ページの分離曲線アイコンをクリックし、すべてのサンプルが正常に実行がすべて毛細血管で複数のタンパク質の曲線を示していることを確認します。

6. シグナル伝達タンパク質の解析

  1. ラベル付き 1.5 mL チューブに抗リン eIF2a (p eIF2a) 抗体ウサギの 0.003 mL を追加し、抗体希釈適切な検出キットから 0.3 mL (1: 100 希釈) にそれを中断します。その後、氷の上それを保ちます。
  2. ルミノール チューブにラベルを付けるとこの検出モジュール キットから 0.15 mL ルミノールと過酸化物 0.15 mL を追加し、新鮮な自動化された西部のプレートの E25 に井戸 E1 に 0.01 mL を分注します。
  3. 抗うさぎ抗体 D25、D2 井戸に二次 0.01 mL を塗布し、よく D1 にキットからストレプトアビジン-HRP の 0.01 mL を追加します。
  4. C25、C2 の井戸に (ステップ 6.1) から一次抗体の 0.01 mL を分注、C1 および B1 B25 からの井戸に抗体希釈 2 液 0.01 mL を追加します。
  5. 空行 F 井戸のまま F 行の下 3 行の 5 区画に 0.45 mL の洗浄バッファーを記入してください。
  6. 3 冷凍のサンプルを簡単にスピン s、A25 に A2 から始まって、総蛋白質の試金のため追加された順序と同じ順序で行 A に各サンプルの 0.003 mL を追加。A1 をよくし、プレートをカバーするビオチン化 MW ラダーの 0.005 mL を追加します。
  7. 4.8 のステップでは、プレートを遠心します。プレートが回転しながら (自動化されたウエスタン関連ソフトウェアとコンピューター) で新しい実行ファイルを開くし、それぞれのスポットをクリックして分子サイズ測定を実行する「ファイル」からドロップダウンのページで示します。
  8. 試金のページで各毛管にサンプル名を入力し、割り当てられたスポットの下に二次抗家兎抗体一次抗体の名前を入力します。
  9. 遠心分離の終わり、今回実行ファイルに与えられた名前は「p-eIF2a 处置 p 2-13、14-25 の初乳先読み」をする必要があります除いて手順 5.3-5.5 を繰り返します。
  10. 電気泳動分離後 40-43 kDa のサイズで抗原の免疫反応のピーク時に実行ファイルをチェックします。MW のピークのこのサイズが不足しているは、曲線の下を右クリックし、サイズとカーブの下の任意の量を記録することにより、ピークに MW を追加するドロップダウン リストの内部を示します。

7. 結果を処理します。

  1. 開く自動ウエスタンで全体蛋白質のためのスプレッドシート ファイルを実行ファイルを実行し、ID 番号を提供します。
  2. 曲線モードで解析ページで総蛋白質の試金の実行ファイルを開き、個々 の毛細血管でのすべてのピークをマークします。その後、コピー、スプレッドシートに貼り付けることと全体の毛細血管に記録されているすべてのピークの曲線の下の領域の合計します。
  3. 別の列にキャピラリー数、それぞれ脳核と実行ファイルの ID 番号の名前と各列のタンパク質の総量を手配します。
  4. P eIF2a 抗原の単一の列のスプレッドシートを開き、それぞれのキャピラリー数、脳神経核、および実行ファイルの ID 番号の名前各キャピラリー サイド ・ バイ ・ サイドから曲線の下の領域を記録します。
  5. 総蛋白列 (p eIF2a 曲線量に平行) を第 3 のスプレッドシートにコピーし、p を計算-3 番目の列の eIF2a:total 蛋白質の比率。
  6. 手順 4 ~ 6 各脳核から結果を収集、核のグループでそれらを整理、バー グラフを生成します。

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Representative Results

総蛋白に対する免疫反応性の代表的なバンド示す非常に低い収穫された蛋白質と脳核。標準的な西部のしみに比べて高感度である自動化された西部のしみの技術の使用が必要です。このアプローチは、西部のしみのレーンあたりと比較して毛細血管あたり fortyfold より少ない蛋白質を実行できます。

差分脳核 BiP レベルに及ぼす初乳プライミング

ラットの頭脳のコロナ セクションは、初めての給餌 (準備万端) 前後送り (处置 p) 最初の初乳に収穫されました。サンプル (ウェス) のキャピラリー電気泳動で分画されましたし、毛細血管で総蛋白染色 (プロトコルを見なさい) キットを使用して蛋白質の定量を行った。自動化された西部の追加免疫キャピラリー分別には、それぞれの蛋白質の抗原の同定が用意されています。図 3 a、代表的な BiP 蛋白質の表現は以下に示す対応する総蛋白と上部のパネルで示されて。BiP は、小胞体シャペロン タンパク質です。図 3 b、量的に表わされる成績は対応する総蛋白基準バー グラフで掲載されています。

处置 p ティッシュ サンプル内 NTS の BiP レベル大幅に比べて増加しましたその他の地域 (p < 0.05、n = 4 核)。初乳と腸のティッシュのプライミング増加 BiP 处置 p ティッシュ (図 3 b) を基準にして、他の地域と比較して国税庁に反対効果があった。プライミングは国税庁 (図 3 b) の BiP を減少し、PVN と停止に影響を与えなかった。しかし、プライミングは、プライマー処理していない組織に対する CX、STR、MPO で BiP を増加しました。このデータは、さまざまなテスト脳核 BiP レベルに応答する異なる腸プライミング、そこテスト様々 な核間のないまだ、実証のクロストークを意味します。

差分脳核における ElF2a と p elF2a レベルに及ぼす初乳プライミング

脳組織サンプルを準備、分析し、定量化図 3A3Bに示すように。として BiP レベル (図 3 b)、elF2a と p elF2a の国税庁であった高値 (図 4 b 4 C) 他の核に対してプライマーなし状態で。BiP のレベルで示されているように初乳と腸のティッシュのプライミングに国税庁の応答は他の核とは逆でした。处置 p ティッシュを基準にして elF2a と国税庁の p elF2a の両方のレベルに減った。他のすべてのテストされた核 elF2a の p-elF2a 处置 p ティッシュ (図 4 b 4 C) を基準にして上昇をプライミングします。

初乳プライミング後国税庁、PVN のキナーゼ GCN2 による elF2a のリン酸化

脳組織サンプルを準備、分析、として、図 3に示すように定量化します。PVN の故人 p PKR をプライミング (χ2 p = 0.025) とは異なり、増加した他のすべての地域で。レベルの調査結果 (図 4)、p elF2a に反して p PKR の国税庁 (図 5 a) の発動を促されたサンプルの处置 p サンプルで低かった。ElF2a のリン酸化は通常触媒ウイルス34に応えてそのプロテインキナーゼ PKR、OT、腸内で説明した11。しかし、p PKR のレベルが非常に低い处置 p (他の核は、図 5 a) を基準にして発動を促された国税庁対強く事実を示唆別のキナーゼ必要があります elF2a をリン酸化に関与すること (図 4)。したがって、それはまた知られているキナーゼ elF2a35のため、GCN2 レベルは NTS および PVN でテストされました。国税庁と (図 5 b)、PVN と GCN2 でプライムのサンプルと比較して处置 p サンプルの p-GCN2 (アクティブなフォーム) のレベルが高かった (非アクティブなフォーム) が p と比較して-GCN2、反比例 PVN (図 5) で表現しました。国税庁 (図 5) で pGCN2 は、プライマー処理していないと発動を促された国税庁に pPKR (図 5 a) に反比例表現されました。発動を促された組織で p eIF2a かなり低かったよりも他のすべての脳領域で国税庁に [PVN (p < 0.01)、息子 (p < 0.01)、CX (p < 0.01)、および MPO (p = 0.02)]。これは pPKR ではなく、pGCN2、NTS eIF2 抑制に責任があったことを示します。

初乳プライミングを抑制する CX、STR、MPO で NF kB

図 6Aショー IkB レベルの大幅高かった息子にプライマーなしサンプル準備万端対サンプル。息子、CX、STR、MPO の IkB レベルは、同じ方向に高い傾向。図 6CX、STR、MPO で NF kB レベルが有意に高かった处置 p 組織対準備万端します。ただし、NF kB レベルに比べ明らかに低かったプライミングの NTS 組織を初乳がこの脳領域の異なる抗炎症効果を持っていたことを示唆しています。その阻害剤 IkB の低され、そのまま発動を促されたサンプルにゾル性細胞質の NF kB (剰余) で高い国税庁サンプル处置 p であった。これは異なる抗炎症メカニズムは国税庁で Nf-kb を規制する示唆しています。この栄養不足ストレス効果、ストレス マーカー BiP と p eIF2a 両方初乳プライミングの存在によって規制されて現在の調査結果と一致して (図 3および4、それぞれ)、以前の BiP と p elF2a で示すように結果10。IkB と CX、STR、MPO と比較して国税庁で Nf-kb の明確な応答の理由はまだよくわかっていません。ただし、腸から脳に信号をリレーする NTS は末梢炎症36に比べて他の頭脳領域と一意にし、逆の対応で重要な役割を果たす可能性があります観測と一貫性があります。CX、STR、MPO で IkB のレベルが低い (図 6 a)、同じ地域 (図 6) では Nf-kb の高いレベルに比較して。この発見が明らかに矛盾する前提 IkB はバインドと保持 NFkB 細胞質、結合と MPO の回帰分析の結果を使用して、STR、CX すべて先読みサンプルを比較データの別の計算で、NF kB 高中IkB と相関 (p < 0.0001、n = 24)

Figure 1
図 1: ラット新生仔脳を解剖します。(A) 解剖脳が表示されます骨を削除前に吻側。前、残りの骨板が削除された後で行を描画されている後は、脳 (B) が表示されます。(C) 脳は、かみそりの刃でスライスされる直前ポリメチル ・ メタクリ レート脳型に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 脳のスライスから尾側と吻側パンチ (赤丸) を配置します。略語: CX: 野、頭頂葉。MPO: 内側視索前野の領域;国税庁: 核孤 solitaries;PVN: 室傍核;息子: 視索上核;STR: 線条体。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 国税庁の bip/grp78 応答が他の核の反転します。(A) 全蛋白質の下のパネルの提示に対して相対的に上部パネルの代表 BiP 蛋白質の表現。メモさまざまな毛細血管の総蛋白濃度が異機種混在、これらパネル B. (B) 表示のタンパク質あたりそれぞれ BiP 式を均等に使用されますは处置 p サンプル (脳核蛋白に対する平均 BiP青) 初乳先読みサンプル (ブラウン) 対。それぞれ色のアスタリスクの重要な相違を示し (p < 0.05、n = 4 核) 他の核の BiP と国税庁の BiP の間。プライマーなしで BiP 式 NTS の先読みサンプル対が STR で反転大幅 (χ2 p = 0.028、n = 4)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: アクティブおよび非アクティブ eIF2a (p eIF2a) に対する国税庁の他の核の反転の处置 p サンプル対初乳プライミング。(A) 代表的な eIF2a と p eIF2a タンパク質の発現が上部のパネルに表示されます。総蛋白レーンは、下パネルに表示されます。(B) 表示は初乳先読みサンプル (ブラウン) 対 (青) 处置 p サンプルと (C) eIF2a の不活性形の脳核 (下図 A) から全体蛋白質に関連して表現 4 サンプルの平均 eIF2a (p eIF2a)。それぞれ色のアスタリスクの重要な相違を示し (p < 0.05、n = 4 核) 他の核のそれぞれのレベルに対して国税庁の両方の eIF2a フォーム間。プライマーなしでアクティブな eIF2a 式 NTS の発動を促されたサンプルと大幅に反転している CX、STR や MPO で (χ2 p < すべての 3 つの核、n 対 0.05 = 4)。誤差は、標準エラーを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 国税庁表現 eIF2a キナーゼ p GCN2 p eIF2 レベルと反比例 p PKR のレベルに一致します。(A) p PKR (eIF2a のキナーゼ活性の dsRNA) のレベルで表されます 1 に反比例初乳プライミング国税庁対处置 p) PVN の pkr からの p のレベル (χ2 p = 0.025) と 2) 期待 (そのリン酸化後基板 eIF2a を対象とp-eIF2a、図 2)。息子、CX、STR、初乳先読みサンプル対处置 p の MPO の pkr からの p のパターン図 2から p eIF2a のそれぞれのパターンに合うことに注意してください。(B)図 2から p eIF2a 式の同様のパターンと図 3 aから pPRK 式の逆パターン、活性 eIF2a キナーゼ (p GCN2) で unprimed プライミング国税庁サンプル次対 (χ2 p = 0.028)。C = 非アクティブな GCN2 の平均レベル。誤差は、標準エラーを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 細胞質处置 p と初乳プライミング腸サンプルから脳核で発現 Nf-kb など IkB 。(A) 平均細胞質発現 IkB 総蛋白質 (パネル C) から示された頭脳核を基準。(B) 代表的な細胞質バンド IkB 蛋白質の上部パネルと下部のパネルにそれぞれの車線で総蛋白濃度に掲載されています。(C) 平均細胞質発現 Nf-kb 総蛋白質 (パネル D) から示された頭脳核を基準にして。上部パネルと下部のパネルにそれぞれの車線で総細胞蛋白質密度 (D) NF kB バンドの代表的な細胞質バンドが掲載されています。色のアスタリスクを指定指定されたサンプル間の有意差 (p < 0.05、n = 4)。細胞質の NF kB レベルは Nf-kb 阻害剤 (IkB) のレベルとの不一致に視床下部核 NTS、PVN と息子に初乳プライミング CX、STR、MPO より高いことに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 初乳プライミングの腸と脳の領域で OT シグナリング仮説概略比較します。上皮 (A) 初乳 OT 増加 IkB 下流シグナルを介した炎症を抑える、OTR と直接相互作用を介してその受容体を活性化します。P を増やすことによってタンパク質の翻訳を抑制-pkr からは、リン酸化 elF2a 活性が低下します。恒常性が増加 BiP 遺伝子式13,37経由で復元されます。(B) 神経や循環 OT 脳の CS、STR、MPO の地域で受容体を活性化腸として同じ分子 downregulating 炎症およびタンパク質翻訳 (パネルを参照してください)。(C)、仮説脳の国税庁地域で初乳プライミングの効果がありパネル A と B. GCN2 のアミノ酸供給に敏感であるからの反対の増加 eIF2a とタンパク質の翻訳。同時に IkB の低レベルは、核を入力し、炎症を誘発する NF kB を許可します。BiP 行為同様に脳で国税庁の腸内の恒常性を復元することに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Supplementary Figure
補足図 1: プロトコル タイムライン図この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

離散の顕微解剖法、新生児ラット脳における脳核 OTR は、本稿で提示されます。脳内のよ特徴付けられた核内であっても、ニューロンを専門性の高いことも認識されます。特定の OTR の豊富な核を分離するこの再現性の高い方法により、堅牢な仮説のテストします。自動ウェスタンブロッティングを使用して、一貫性と結果の再現性がさらに向上。この技法の制限のまま適度な脳パンチ変動;このテクニックは、単一セル、全脳や脳スライス アプローチに対する事前を表します。単一セルのアプローチは、非常に限られたスナップ ショットを提供することによって複雑になります。脳全体を使用すると、任意の結果を効果が脳の領域や神経細胞サブタイプの制限場合希釈可能性があります。レーザーマイクロダイ セクションなし脳スライス アプローチは、特に明瞭な核のタイトなクラスタ リングのための本の研究では視床下部に問題があるスライスは単なるミクロン以内の結果の深遠な可変性を導入できます。標準化されたパンチと顕微鏡の援助を使って、蛋白質測定の変動が減少しました。

このプロトコルではいくつかの重要な手順があります。最初のフィードに関して組織収穫のタイミング、分子阻害剤や覚醒剤を使用することがあります、タンパク質抽出バッファー、アプライドで脳スライスのインキュベーションの最小量を使用して敏感なを使用してこれらのほか免疫電気泳動装置です。可能な変更には、培養用試薬の選択とインキュベーションと处置 p 飢餓の時間を延長期間相当時の脳を比較するが含まれます。(この非常に早期新生児期) の中にもいくつかの非神経細胞と新生児の 1 リットルから 1 日で準備できるサンプルの限られた数の重要な制限事項を含んでいます。さらに、このアプローチは、子犬が生まれているに完全に依存です。既存のメソッドによって、この年齢で、脳における遺伝子発現は通常かつ容易に評価転写レベルで。ただし、セルシグナ リング解析、プロテオミクス コア設備によって実行はデスクトップの自動計測器より高価です。従来の西部のしみ方法はより多くのタンパク質を必要とする、完了するために数日を取る、技術的なマンパワーによっていくつかの操作手順が含まれます。この自動化されたアプローチ毛細血管あたり 0.8 μ g のタンパク質が必要です、人間手の干渉と実行を完了する 2 時間 50 分を取るしないで手順が実行されるすべての計測器に読み込まれる。この手法は、ラットおよびマウスの遺伝子操作モデルの広い範囲の即時の生後の脳の発達を研究するために使用できます。

この手法を使用すると、出産と授乳、間非常に重要な期間で具体的には、細胞レベルでの OT の効果を調べた OTR は上皮8で最大限に表現されるとき。以前腸セル、セル行37と生体内で13の両方の分子をシグナル伝達細胞に対する OT の変調効果を示した。本研究は, 腸細胞に見られる効果 OTR の豊富な脳領域で評価されました。Bip/grp78 の p eIF2a 式だった (ストレスに予想される応答と一致) 处置 p で亢進とダウンレギュ レート (ストレスに減衰応答に一貫した)、プライムの NTS 組織で NF kB だった両方の条件で安定性の高いに対し38。 式の BiP と Nf-kb 处置 p とプライミング条件の他のテスト地域で同じであった。eIf2a はだった息子、CX、STR、MPO で dsRNA 依存型キナーゼ (pPKR) によりリン酸化されます。ただし、国税庁、および PVN でより少ない程度に、eIf2a は別のキナーゼ、一般制御 nonderepressible 2 キナーゼ (GCN2) によりリン酸化されます。脳の伝達を違いを仮説図描いたと初乳露出によって誘発される腸は図 7に表示されます。

このレーザーマイクロダイ セクション法になります新生児脳で離散の OTR の豊富な核シグナリング ストレス関連フィード最初の初乳の影響に関連する仮説をテストすることが可能。このデータは、NFKB (PVN、息子 CX や STR、MPO) の高められた細胞質保持のよう以前生まれた腸上皮細胞にみられるストレス変調機構が豊富 OTR は、特定の脳領域にミラーリングされていることをお勧めします。国税庁、PVN が栄養不足の影響に抵抗性である可能性があります他の地域からの別のリン酸化機構を利用することも示唆されました。以下、総称してデータを示すことは脳における細胞シグナル伝達次の生れは細胞の同じ条件の下で腸内でシグナル伝達に類似した最初の時間中に栄養やホルモン機能不全に関連します。このデータは、腸と脳の両方の応力変調の誕生の時に母乳の重要性をサポートします。これらの結果は、脳機能に初乳の影響のさらなる探鉱のための必要性を強調します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、このプロトコルの準備に彼らの支援のマノン レンジャーとアレクサンドラ ・ シュルツをありがとうございます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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