Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

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Immunology and Infection

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de cérebro em cérebro de ratos neonatal, em conjunto com a primeira mamada do colostro. Esta técnica permite o estudo do stress de insuficiência de nutrientes no cérebro como modulada por sinalização do enterócito.

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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Abstract

O objetivo do presente protocolo é isolar núcleos de cérebro ricas de receptores de ocitocina no cérebro neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro. A expressão de proteínas conhecidas para responder ao estresse metabólico foi medida em cérebro-núcleos isolados usando a mancha ocidental. Isso foi feito para avaliar se induzida por estresse metabólica insuficiência nutriente no corpo provocado estresse neuronal. Demonstramos anteriormente que a insuficiência de nutrientes em recém-nascidos provoca estresse metabólico no intestino. Além disso, a ocitocina colostro modula marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido antes e depois da primeira alimentação. Sinalização de marcadores de proteínas associadas com o estresse de retículo endoplasmático [ER acompanhante imunoglobulina proteína (BiP), 2A de fator de iniciação eucariótico tradução (eIF2a) e quinase da proteína quinase eIF2a R (p-PKR)], bem como dois sinalização de inflamação proteínas [fator nuclear-κB (NF-kB) e inibidor κB (IkB)], foram medidos em núcleos do cérebro recém-nascido [núcleo do trato solitário (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supraóptico (filho), córtex (CX), núcleos striatum (STR), e núcleo preóptica medial (MPO)] antes do primeiro feed (unprimed pelo colostro) e após o início da enfermagem (preparado pelo colostro). Expressão de BiP/GRP78 e p-eIF2a foram upregulated em unprimed e ativador em tecido NTS condicionado. NF-kB foi mantida (alta) no citoplasma CX, STR e MPO, Considerando que o NF-kB foi inferior e inalterado no NTS, PVN e filho em ambas as condições. O BiP coletiva e p-eIF2 achados são consistentes com uma resposta ao estresse. eIf2a foi fosforilada pela quinase dependente do dsRNA (p-PKR) no filho, CX, STR e MPO. No entanto, no NTS (e em menor medida no PVN), eIf2a foi fosforilada pela outra quinase, quinase de controle geral nonderepressible-2 (GCN2). Os mecanismos de estresse-modulando anteriormente observados em enterócitos do intestino recém-nascido parecem ser espelhado em algumas regiões do cérebro ricas OTR. A NTS e PVN podem utilizar um mecanismo de fosforilação diferente (sob deficiência nutricional) de outras regiões e ser refratário ao impacto da insuficiência de nutrientes. Coletivamente, estes dados sugerem que respostas do cérebro ao estresse de insuficiência de nutrientes são compensadas por sinalização de colostro-aprontadas enterócitos.

Introduction

Em contraste com a nossa compreensão do desenvolvimento inicial do cérebro ocorrendo ao longo dos dias-de-semanas pós-parto, relativamente pouco é conhecido sobre a miríade de dinâmicas alterações que ocorrem nas primeiras horas de vida em ratos. Um desafio-chave tem sido o pequeno tamanho do cérebro de ratos neonatal e um requisito para ferramentas de alta tecnologia isolar regiões cerebrais discretas ou células únicas. Estudos frequentemente avaliam gene transcrição e tradução não1,2, que não dá uma firme compreensão dos níveis funcionais de moléculas sinalizadoras ativados. Outros examinam a expressão usando a imuno-histoquímica para regiões do cérebro de referência, que não permite a quantificação da expressão níveis3. Nenhum estudo até à data, analisou a ativação da sinalização de caminhos associados com colostro primeiro dos ratos, alimentação em regiões distintas do cérebro, que requer rápido isolamento e sacrifício e medição da expressão da proteína e da fosforilação de proteínas usando Western a mancha. Enquanto o cérebro microdissection é executada em cérebros maiores e mais velhos, não identificamos uma referência realizando um soco não-simples-célula cerebral em um cérebro de P0. Este trabalho apresenta um protocolo para isolar regiões restritas do cérebro neonatal usando uma técnica relativamente baixa tecnologia ponche e um Western blotting, com para medir a expressão da proteína em amostras relativamente pequenas. Este protocolo pode ser apropriado para perguntas de pesquisa que exigem a avaliação da expressão da proteína e modificações borne-translational (EG., fosforilação) nas regiões relativamente restritas de cérebros pequenos de qualquer espécie, desde que o usuário pode identificar visualmente a região do cérebro de interesse com um atlas e Marcos identificáveis.

Esta técnica foi desenvolvida para entender as mudanças que ocorrem no cérebro como resultado de colostro primeiro o neonatal dos ratos, alimentação, que é rica em ocitocina (OT). OT tem sido conhecido por sua capacidade de estimular a contração uterina e de descida de leite. No entanto, OT agora é conhecido por tocar uma ampla gama de funções na regulação de muitas funções corporais e comportamentos4. Por exemplo, OT se opõe a estresse e inflamação em conjunto com comportamentos de filiação adaptativa5, retarda o esvaziamento gástrico e diminui o trânsito intestinal. Receptores de OT (OTR) foram identificados em neurônios entéricos e epitélio intestinal6,7,8. Os efeitos gastrointestinais do OT são particularmente importantes para a criança durante o período pós-natal. Por exemplo, o aleitamento materno está associado com a entrega de quantidades significativas de OT para o intestino neonatal9,10, e os dados mostram que o OTR é fortemente overexpressed em vilosidades duodenais durante o leite Leitão período8.

Experimentos in vitro usando uma linhagem de células do intestino têm demonstrado a nível celular, a ocitocina modula moléculas importantes na tensão sinalização via11,12 e desempenha um papel regulador na tradução das proteínas 12. estes estudos sugerem que componentes do leite, incluindo ocitocina exógena da mãe, são importantes na resposta unfolded da proteína em recém-nascidos para reduzir o estresse celular13.

Estudos in vivo e ex vivo demonstraram que o colostro OT modula os marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido. Enterócitos recém-nascido sofrem estresse celular substancial do seu lado luminal quando o intestino é exposto simultaneamente a microbiota da mãe no colostro14,15 e inúmeras proteínas, inclusive hormônios como OT9 , 10 , 16.

Os efeitos de OT no cérebro foram estudados17. No entanto, não foram estudados os mecanismos de sinalização OT demonstrados no intestino durante o período pós-natal do cérebro. Neste trabalho, um método para isolar núcleos cerebrais discretas no tronco cerebral neonatal rato e hipotálamo usando electroforese é usado para perfil de regiões isoladas do cérebro. O objectivo geral deste método é capturar o estado de sinalização em áreas do cérebro mais próximo possível ao nascimento, antes e após o primeiro leite Leitão, no tecido do cérebro com o índice mais baixo gliais/neuronal da pilha. A justificativa para o desenvolvimento desta técnica é que ela permite o isolamento rápido de regiões do cérebro microscópico, restrito em neonatais filhotes com uma coleção mais homogênea de neurônios para estudos ex vivo usando uma mancha ocidental automatizado metodologia, oferecendo resultados altamente consistentes em amostras relativamente pequenas dissecados. Uma lacuna de trabalhos anteriores inclui mais bruta dissecção (fatias de cérebro ou todo o cérebro) e mais velhos animais18,19. Os cérebros dos filhotes são incrivelmente dinâmicos, apresentando ondas de diferenciação glial após o nascimento. Para estudar alterações cerebrais influenciadas pela filhotes da primeira mamada, estudar núcleos neuronais restritos com dissecação reprodutível é necessário.

Alimentação de leite geralmente é analisada pelo seu impacto imunológico e nutricional na saúde ou gene expressão (por exemplo, em enterócitos20,21), Considerando que seu efeito sobre as áreas do cérebro durante o desenvolvimento do cérebro raramente é estudado. O efeito de trânsito leite no intestino na função cerebral foi analisado em referência ao intestino colecistocinina receptores vagais relé de núcleos do tronco cerebral, mas não a vias de sinalização intracelular22. Há uma vasta literatura sobre a vulnerabilidade do cérebro em desenvolvimento em recém-nascidos, a desnutrição das mães durante a gravidez23, mas os sinais de estresse e inflamação não são abordados. Importante, o método atual aproveita-se de um fenômeno em recém-nascidos de dia-zero rato que isola os estímulos de sangue-nascido colostro de relé vagal de estímulos viscerais. Este é o período de estresse chamados hipo-responsividade caracterizado por núcleo imaturo tractus solitarius (NTS)-circuito hipotálamo imediatamente após o nascimento24,,25 que restringe NTS, núcleo paraventricular (PVN), e núcleo supra-óptico (filho) sinaliza a estímulos de sangue-nascido.

Este método é útil para a análise de múltiplas vias de sinalização e relativamente restrito de células neuronais, desde que o tecido cerebral é colhido em dia-0 pós-natal em ratos, além de se as mães têm sido desafiadas ou não por qualquer tipo de tratamento durante a gravidez. Ninhadas podem ser analisadas para os efeitos do colostro versus pré-alimentação sinalização de alimentação. Ao comparar os sinais entre áreas do cérebro com pobres versus rendimento de proteína rica, esse método permite que no capilar determinação de proteína total das bandas polipeptídeo em capilares funcionam a paralelas imune-quantificação de antígenos da proteína. Esse método permite a comparação quantitativa, utilizando unidades arbitrárias, dos resultados obtidos pelo mesmo anticorpo sem curvas padrão quantitativos e por referência a proteína total por capilar. Comparar os resultados obtidos por diferentes anticorpos é possível apenas usando curvas padrão quantitativas.

Este método permitiu a avaliação de bidirecional sinalização ocorrendo entre o intestino e o cérebro e que pode afetar a função em ambos os órgãos,26. A associação entre a ingestão de oxitocina e comida, que tem sido extensivamente estudada em anos recentes27, suporta uma ligação entre a disponibilidade de nutrientes e aumento de ocitocina sinalização. Estes estudos também suportam o conceito de inverso essa energia os défices são acoplados com reduções na sinalização hipotalâmica ocitocina.

Uns estudos mais adiantados do efeito da OT na atividade cerebral demonstraram que inflamação induzida intestino suscitou cFos transcrição no hipotálamo córtex PVN, amígdala e piriform que era refratário a vagotomia28. No entanto, a infusão sistêmica de OT com secretina diminuiu a resposta de cFos do cérebro para a reação inflamatória provocada no intestino28. Isto sugere que o efeito de OT exógena foi realizado por rotas excepto relés vagais, possivelmente através de moléculas sinalizadoras transmitidas pelo sangue, realizadas através da área postrema6,29.

Neste estudo, as vias de sinalização celular stress que tenham observado anteriormente no intestino foram avaliadas no cérebro. A hipótese era de que componentes do leite podem proteger ou adiar o efeito da inflamação na permeabilidade do intestino para metabólitos microbianos e outros, e por sua vez, os efeitos sobre o funcionamento do cérebro. As diferenças claras antagônicas de IkB contra BiP sinalização encontrada nas vilosidades, antes e depois da escorva pelo colostro13, sugeriram que os cérebros de recém-nascidos, ainda no processo de desenvolvimento, podem sentir esses sinais do intestino induzida pelo colostro.

Marcadores de proteína sinalização utilizados em experiências anteriores do intestino que estão associadas com o estresse de retículo endoplasmático foram medidos. Eles incluem o acompanhante ER BiP, eIF2a de fator de iniciação de tradução (que serve como uma resposta de estresse do integrador30), eIF2a quinase p-PKR e duas proteínas de sinalização de inflamação (NF-kB e seu inibidor, IkB).

Foram escolhidas seis regiões do cérebro com base na sua capacidade em adultos secretam ou responder a OT. O NTS, localizado a medula superior, é o primeiro relé da entrada visceral e recebe sinalização direta de neurônios sensoriais vagais no intestino31 e possivelmente sangue-nascido citocinas, toxinas e hormônios através da área adjacente-postrema32. O PVN, núcleo supra-óptico (filho), núcleos striatum (STR), córtex cerebral (CX) e núcleo preóptica medial (MPO) recebem sinalização do intestino através da NTS.

Os resultados mostraram que a resposta ao estresse celular durante o período pós-natal imediato antes da escorva de colostro e imediatamente após a primeira mamada é diferente no NTS comparado ao PVN e filho. Sinalização em CX, STR e MPO diferiam do PVN e filho, também. As distintas funções protectoras das OT mostrado anteriormente para modular o estresse celular e inflamação no intestino são provavelmente sentiu por algumas áreas do cérebro. Coletivamente, os dados indicam que a nível celular, durante as primeiras horas após o nascimento, o cérebro responde ao estresse metabólico associado com insuficiência de nutrientes. Os dados também mostram que a extensão e a direção dos efeitos modulando o colostro alimentar dependem da região e que em algumas regiões, espelho efeitos OT mostrados anteriormente no intestino.

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Protocol

Este estudo foi aprovado pelo cuidado de Animal institucional e comissões de uso na Universidade de Columbia e o Instituto de Psiquiatria de Nova York estado.

1. tecido preparação

  1. Ordem cronometrado de ratos grávidos de fornecedor.
  2. Siga cronometrado de ratos grávidos observando seus abdomens crescentes nas semanas após a sua chegada e posteriormente procurando por filhotes na data prevista de entrega inspecionando a gaiola cada 2h até entrega começa.
  3. Remover os filhotes com uma mão enluvada pelo seu rabo antes de sua primeira alimentação para filhotes unprimed (sem barriga branca leite é aparente ao exibir o abdômen) ou a primeira mamada para filhotes aprontadas (no ponto em que um estômago branco será visível no seu abdómen) conforme descrito no timeli ne (Figura S1).
    Nota: O primeiro sinal de colostro é denominado como primer o filhote; assim, um filhote é unprimed até o primeiro feed, após o qual eles são aprontadas de colostro.
  4. Rapidamente decapitar o filhote sem anestesia, com uma tesoura afiada, limpeza cirúrgica.
  5. Remova o cérebro por um corte a pele para baixo da linha média e superfície superior do crânio ao nariz. Em seguida, usando a pinça, separando cuidadosamente afastado o osso para expor o cérebro (figura 1A) e localizar o bregma, marcando-o com uma caneta como as placas ósseas são removidas (figura 1B).
  6. Coloque rapidamente o cérebro inteiro em um molde de cérebro polimetacrilato metacrilato em temperatura ambiente por coronal corte à temperatura ambiente (Figura 1).
  7. Sem demora, fazer 500 milímetros de espessura fatias usando uma lâmina de barbear a fresca. Deite as fatias rostrais caudal em uma placa de Petri para manter a orientação das seções (Figura 2).
  8. Rapidamente adicionar artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26mm NaHCO3, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O) sem glicose e incubar as fatias para 60 min a 28-30 ° C, mexendo constantemente em um agitador orbital metabolicamente e diferencialmente desafiar a unprimed contra tecidos colostro-preparado.
  9. Identifica os núcleos do cérebro que são necessárias para um soco usando um cérebro atlas33 e Marcos anatómicos na seção de tecido. Coloque esta fatia com os núcleos de interesse em uma placa de Petri e movê-lo para o microscópio de dissecação.
  10. Uma vez visualizado, rapidamente um soco 4 de 6 núcleos diferentes usando uma ferramenta de retirada do dielétrico, selecionando o tamanho melhor bater o núcleo em questão e consistentemente entre as amostras (Figura 2).
    Nota: A fatia restante do cérebro agora terá um buraco onde o tecido cerebral era removido. Neste estudo, nós extirpado os seguintes núcleos usando o abaixo as coordenadas. Tudo anterior/posterior (A / P) coordenadas são de Bregma (exceto NTS, que é com referência a Calamus Scriptorius). Todas as coordenadas (D/V) de dorsal/ventral são da superfície do córtex (exceto NTS, que é a partir da superfície da medula). As coordenadas a seguintes incluem A / P, medial/lateral (M/L) e D/V em mm: 1) núcleo do trato solitário (NTS, A / P, 0.4 a 0.8; L, ± 0,2; D/V, 0.3 (da superfície da medula), 2) núcleo paraventricular (PVN,-0.8; ± 0,2; 0), 3) núcleo supraóptico (filho,-1.1; ± 1,4; 4.3), 4) córtex (CX, área do córtex parcial 1, -2.8; ± 1,5; 0,6), 5) núcleos striatum (STR,-0.0; ± 1,6; 1,8) e 6) medial após núcleo (MPO,-0.6; ± 0,2; 4.2).
  11. Mergulhe rapidamente os núcleos perfurados em 0,06 mL de tampão de extração de proteína gelada, contendo inibidores de protease e inibidores da fosfatase durante 60 minutos (ver passo 2.3).

2. extração da proteína

  1. Prepare a solução de extração de proteínas usando o kit de lise de proteínas (Tabela de materiais) no dia antes da entrega do filhote esperado.
  2. Degelo (no gelo) a solução aquosa de congelados (-20 ° C) dos inibidores de protease e fosfatase do kit de tampão de Lise e coloque a solução de DMSO dos inibidores de proteases/fosfatases e lise no gelo.
  3. Adicione 1,85 mL de tampão de Lise em um tubo de 15ml limpa e gelada. Em seguida, adicione 0,1 mL de solução aquosa de inibidores e 0,05 mL de inibidores de DMSO-dissolvido. Finalmente, cap e brevemente o tubo de vórtice e mantê-lo a-20 ° C até o uso.
  4. Rotule 24 tubos microcentrifuga limpo (0,5 mL cada uma) para o processo de Lise. Designados 12 tubos por cérebro para o grupo colostro-unprimed (U) [6 esquerda (L) e 6 núcleos de cérebro direito (R)] e o rótulo de acordo com a sigla de núcleos, lateral e condição (ex., NTS-L-U, NTS-R-U, etc.). Rotule o segundo grupo de 12 tubos para as amostras preparadas de colostro.
  5. Rotule dois conjuntos adicionais de tubos como feito no passo 2.4 para os extratos de banco de proteína (usando tubos de 1,5 mL Eppendorf-estilo) e para o primeiro conjunto de preparação de amostra (usando tubos de 0,5 mL). Manter estes tubos em duas separadas, etiquetadas congelamento caixas (cada um projetado para 100 tubos). Uma caixa será usada para as amostras unprimed e outro para as amostras condicionadas.
  6. Descongelar a solução de Lise no gelo, no dia em que os filhotes são entregues e ao mesmo tempo incubando fatias de cérebro em ACSF, alíquota 0,06 mL de solução de Lise para os tubos de procedimento de lise (da etapa 2.4) e adicionar socos de núcleos e incubar no gelo por 60 min.
  7. Centrifugue os núcleos lisados incubados por 30 min em uma centrífuga mini refrigerada a 14000 rpm (10.000 x g) e Aspire cuidadosamente com 0,055 mL do sobrenadante com uma pipeta corretamente ajustada. Transferir o sobrenadante para os tubos de estoque do pre-cooled 1,5 mL (da etapa 2.5) e colocá-los no gelo. Antes de congelar (a-20 ° C) os tubos de estoque de proteína, transferir 0,012 mL do sobrenadante para os tubos de pre-refrigeração de 0,5 mL para a preparação de amostra a primeira (da etapa 2.5) e deixá-los no gelo.

3. amostra preparação para medição de proteína no capilar

  1. Usar um kit e preparar os reagentes para a separação de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 0,003 mL de reagente de mestre-mistura para cada uma das 12 amostras no 0,5 mL rotulados tubos (da etapa 2.5) no gelo que contêm 0,012 mL dos extratos de proteína.
  2. Ligar o bloco de aquecimento para 95 ° C e adicionar 0,004 mL do reagente preparado no passo 3.1 para uma escada de (MW) de peso molecular biotinilado em um tubo com 0,016 mL de água desionizada. Para desnaturar a escada e amostras, colocar o tubo da escada e as 12 amostras dos extratos de proteína unprimed no calor bloqueiam a 95 ° C por 5 min e armazená-los em 4 ° C até o uso.
  3. Repita as etapas de 2.0 para 3.2, de extração de proteínas para a preparação da amostra, para os núcleos de um soco de colostro-aprontadas ratos.

4. eletroforese preparação

  1. Descongelar a biotina rotulagem reagente (armazenado no congelador profundo no-80 oC) no banco e preparar o kit de deteção de proteínas no gelo a 4 ° C, seguindo as instruções do fabricante.
  2. Misturar 0,15 mL de luminol com 0,15 mL de peróxido e carregar 0,01 mL em 25 poços (linha E, poços 1-25) da placa para a máquina automatizada ocidental. Carregar 0,008 mL de Streptavidin HRP do kit em poços D1 para D25
  3. Carrega a 0,01 mL de solução diluente de anticorpo em poços C1 C25 e B1.
  4. Gire a 24 amostras de proteínas e tubos escada brevemente (2-3 segundos) em um minicentrifuge ao pool de água evaporada em baixo das capas do tubo.
  5. Carrega 0,003 mL de 12 amostras unprimed em poços A2 A13, 0,003 mL de 12 amostras de colostro-aprontadas para poços A14 a A25 e 0,005 mL da escada no poço A1 biotinilado.
  6. Deixe a linha F vazio e carregar 0,45 mL de tampão de lavagem em cada um dos 5 compartimentos em cada uma das 3 linhas abaixo da linha F. tampa da placa com a tampa de plástico para evitar a evaporação durante os demais procedimentos.
  7. Brevemente o vórtice a biotina descongelada rotulagem reagente e adicionar 0,15 mL do reagente para seu tubo designado; em seguida adicionar-lhe 0,15 mL de agente de reconstituição da proteína total e misturá-los a homogeneidade.
  8. Remova a tampa da placa e carregar 0,01 mL de agentes 1 e 2 em poços B2 para B25. Cobrir a placa e centrifuga-lo durante 10 minutos a 1.000 g de x para remover quaisquer bolhas de ar das várias soluções. Use um prato vazio na centrífuga para equilíbrio.

5. eletroforese

  1. Enquanto a placa está girando, abra um arquivo executado no computador ocidental automatizado conectado à máquina indicando na página de menu suspenso "arquivo" para executar um ensaio de proteínas totais e o respectivo local, clicando em.
  2. Anote as amostras por bem no computador. Em seguida, retirar a placa da retire centrifugador a tampa e cuidadosamente retire a tampa de alumínio dos compartimentos de solução de separação.
  3. Coloque a placa no instrumento ocidental automatizado, retire a tampa da caixa de cartucho capilar, insira o cartucho no seu lugar designado e feche a porta.
  4. Clique no botão "Executar" e quando solicitado com o tipo de ensaio ("proteína total"), digite o nome das amostras (por exemplo, "unprimed 2-13 e colostro-aprontadas 14-25"). Clique em "Okey" e quando solicitado pela data de execução ativada e número de identificação do arquivo de execução, anote o tempo quando a corrida termina.
  5. No final da corrida (170 min após o início), abra a porta do aparelho, remova o cartucho capilar e descartá-lo para a eliminação de objectos cortantes. Descarte a placa em dispor a matéria biológica.
  6. Clique no ícone de curvas de separação na página de análise do arquivo de execução e verificar que todas as amostras têm executado corretamente e estão mostrando várias curvas de proteína em todos os vasos capilares.

6. análise de proteínas de sinalização

  1. Em um tubo rotulado 1,5 mL, adicionar 0,003 mL de coelho anti Anticorpos fosfo-eIF2a (p-eIF2a) e suspendê-lo em 0,3 mL (diluição 1: 100) no diluente do kit apropriado deteção de anticorpo. Em seguida, mantê-lo no gelo.
  2. Rotular um tubo de luminol e adicionar 0,15 mL de luminol e 0,15 mL de peróxido deste kit de módulo de deteção e dispense 0,01 mL em poços E1 para E25 de um fresco e automatizado prato ocidental.
  3. Dispense a 0,01 mL a secundária anti anticorpo de coelho em poços D2 para D25 e adicionar 0,01 mL de streptavidin HRP do kit para bem D1.
  4. Dispense a 0,01 mL do anticorpo primário (da etapa 6.1) em poços C2 para C25 e adicionar 0,01 mL de solução 2 diluente anticorpo poços C1 e B1 para B25.
  5. Deixe em branco os poços da linha F e preencher 0,45 mL de tampão de lavagem em 5 compartimentos de 3 linhas abaixo da linha F.
  6. Brevemente, girar as amostras refrigeradas para 3 s e adicionar 0,003 mL de cada amostra com a linha A na mesma ordem que eles foram adicionados para o ensaio de proteínas totais, a partir de A2 para A25. Adicione 0,005 mL da escada MW biotinilado bem A1 e cobrir a placa.
  7. Centrifugue a placa como feito na etapa 4.8. Enquanto a placa está girando, abrir (no computador e software automatizado de Western-associado), um novo arquivo executado e indicar na página de "Arquivo" para executar um ensaio de tamanho molecular clicando o respectivo ponto de dropdown.
  8. Na página de teste, digite os nomes do amostra cada capilar e, em seguida, digite o nome do anticorpo primário o spot alocado e o anticorpo secundário de antiabaixo coelho dela.
  9. No final da centrifugação, repita etapas 5.3 – 5.5, exceto o nome dado ao arquivo de execução desta vez deveria ser "p-eIF2a na unprimed 2 – 13 e 14 – 25 colostro-preparado".
  10. Após a separação de electroforese, verifique o arquivo de execução para picos de imune-reatividade de antígenos em tamanhos de 40 – 43 kDa. Onde MW de picos deste tamanho estão faltando, botão direito do mouse abaixo da curva e indicar dentro da lista suspensa para adicionar MW para o pico, o que garante que o tamanho e quantidade arbitrária abaixo da curva são gravados.

7. tratamento dos resultados

  1. Abrir um arquivo de planilha para proteína total executado em ocidental automatizado execute arquivo e fornecer um número de identificação.
  2. Abra o arquivo de execução do ensaio da proteína total na página de análise em modo de curva e marcar todos os picos em capilares individuais. Em seguida, copiar e colá-los para a planilha e soma as áreas sob a curva de todos os picos registrados no capilar inteiro.
  3. Em uma coluna separada, organize a quantidade total de proteína para cada coluna com números capilares, nomes dos núcleos do cérebro respectivos e os números de identificação dos arquivos de execução.
  4. Abrir uma planilha para o antígeno de p-eIF2a e em uma única coluna, gravar a área sob a curva de cada capilar lado a lado com seu respectivo número de capilar, o nome do núcleo do cérebro e o número de identificação do arquivo de execução.
  5. Copie a coluna de proteínas totais (paralelo com as quantidades de curva de p-eIF2a) em uma terceira planilha e calcular p-rácios de proteínas eIF2a:total em uma terceira coluna.
  6. Coletar resultados dos passos 4 a 6 para cada núcleo do cérebro, organizá-los em grupos de núcleos e gerar um gráfico de barras.

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Representative Results

As bandas representativas da imunorreatividade em relação à proteína total mostram que existem núcleos de cérebro com muito baixa proteína colhido. Isso requer o uso da técnica automatizada de Western blot, que é altamente sensível em comparação com o borrão ocidental canônico. Esta abordagem pode ser executada com fortyfold menos proteína por capilar em comparação com o por-lane em borrões ocidentais.

Efeitos diferenciais de escorva de colostro em níveis de BiP em núcleos do cérebro

Secções coronais do cérebro de rato foram colhidas antes do colostro primeiro alimentação (unprimed) e após a primeira alimentação (carregado). As amostras foram fraccionadas por eletroforese capilar (na WES), e proteínas foram quantificadas usando o kit para coloração de proteínas totais no capilar (ver protocolo). Adicional fracionamento capilar imune sobre o Western automatizado fornecido identificação dos antígenos proteínas respectivos. Na Figura 3A, expressão de proteínas de BiP representativa é mostrado no painel superior, com a proteína total correspondente mostrada abaixo. BiP é uma proteína de acompanhante de ER. Na Figura 3B, immunoreactivities quantificados são apresentados por gráficos de barra em relação a proteína total correspondente.

Dentro as amostras de tecido unprimed, BiP níveis no NTS foram significativamente mais alto em comparação com todas as outras regiões (p < 0,05, n = 4 núcleos). Preparação do tecido do intestino com colostro teve um efeito oposto no NTS, em comparação com BiP aumento em outras regiões, em relação ao tecido unprimed (Figura 3B). Escorva diminuiu BiP no NTS (Figura 3B) e não teve nenhum efeito no PVN e SOPT. Escorva aumentou BiP em CX, STR e MPO em relação ao tecido unprimed. Este dados implica que BiP níveis nos vários núcleos testado cérebro respondem de forma diferente a escorva do intestino e que lá não ainda qualquer demonstrada-conversas cruzadas entre os diversos núcleos testado.

Efeitos diferenciais de escorva de colostro em níveis ElF2a e p-elF2a em núcleos do cérebro

Amostras de tecido do cérebro foram preparadas, analisadas e quantificadas conforme mostrado na Figura 3A e 3B. Como com níveis de BiP (Figura 3B), elF2a e p-elF2a foram elevados níveis no NTS na condição de unprimed em relação a outros núcleos (Figura 4B e 4C). Como demonstrado, com níveis de BiP, a resposta na NTS para escorva do tecido do intestino com colostro foi oposta à em outros núcleos. Níveis de elF2a e de p-elF2a na NTS foram reduzidos em relação ao tecido unprimed. Em todos os outros núcleos testados, escorva níveis aumentados em elF2a e p-elF2a em relação ao tecido unprimed (Figura 4B e 4C).

Fosforilação de elF2a pela quinase GCN2 no NTS e PVN depois de escorva de colostro

Amostras de tecido do cérebro foram preparadas, analisadas e quantificadas conforme mostrado na Figura 3. Escorva falecido p-PKR no PVN (χ2 p = 0,025), ao contrário de todas as outras regiões onde foi aumentado. Ao contrário do p-elF2a resultados (Figura 4), os níveis de p-PKR eram baixas em amostras unprimed em relação a amostras condicionadas em NTS (Figura 5A). A fosforilação de elF2a geralmente é catalisada por sua cinase PKR em resposta ao vírus34 e por OT no intestino, como demonstrado anteriormente11. No entanto, pelo facto dos níveis de p-PKR muito baixos em unprimed contra aprontada NTS (em relação a outros núcleos, Figura 5A) fortemente sugere que outra quinase deve ser envolvida em pressões elF2a (Figura 4). Conformemente, os níveis de GCN2 foram testados no NTS e PVN porque também é uma conhecido quinase de elF2a35. Níveis de p-GCN2 (formulário ativo) foram maiores nas amostras unprimed em comparação com amostras condicionadas na NTS PVN (Figura 5B) e GCN2 (forma inativa), em comparação com p-GCN2, manifestou-se inversamente no PVN (Figura 5). pGCN2 no NTS (Figura 5) foi expresso inversamente para pPKR (Figura 5A) em unprimed e aprontada NTS. No tecido aprontado, p-eIF2a foi consideravelmente menor no NTS do que em outras regiões do cérebro [PVN (p < 0,01), filho (p < 0,01), CX (p < 0,01) e MPO (p = 0,02)]. Isto indica que pGCN2, ao invés de pPKR, foi responsável por eIF2 inibição na NTS.

Escorva de colostro inibe o NF-kB na CX, STR e MPO

A figura 6A mostra que o IkB níveis foram significativamente maiores no filho unprimed amostras de vs carregados de amostras. Níveis de IkB no filho, CX, STR e MPO direcionados mais alto na mesma direção. Na Figura 6, níveis de NF-kB na CX, STR e MPO foram significativamente maiores no preparado contra o tecido unprimed. No entanto, foram significativamente menores níveis de NF-kB no tecido NTS condicionado, que sugere que o colostro tem um efeito anti-inflamatório distinto nesta região do cérebro. Citosólico NF-kB foi maior (retidas) em amostras NTS unprimed, Considerando que seu inibidor IkB era baixo e inalterada em amostras condicionadas. Isto sugere que um mecanismo de anti-inflamatórios distinto é regulando NF-kB na NTS. Este efeito de stress insuficiência de nutrientes é consistente com resultados atuais que o estresse marcadores BiP e p-eIF2a são regulados pela presença de escorva de colostro (figuras 3 e 4, respectivamente), também mostrado na anterior BiP e p-elF2a resultados10. A razão para a resposta distinta do IkB e NF-kB no NTS comparado com CX, STR e MPO ainda não é totalmente compreendida. No entanto, é consistente com a observação de que o NTS, que retransmite os sinais do intestino para o cérebro, podem desempenhar um papel crucial em responder com exclusividade e oposta contra outras regiões do cérebro em comparação a inflamação periférica36. Níveis de IkB na CX, STR e MPO estavam baixo (figura 6A), em comparação com níveis elevados de NF-kB nas mesmas áreas (Figura 6). Enquanto esta conclusão aparentemente contradiz a premissa que o IkB é vinculativo e retenção de VHC no citosol, cálculo diferentes dos dados que combina e compara amostras tudo ferradas em CX, STR e MPO usando programas de análise de regressão que NF-kB altamente se correlaciona com o IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Figura 1: dissecado o cérebro de rato neonatal. (A) o cérebro dissecado é mostrado com ossos removidos rostral bregma. (B), o cérebro é mostrado depois que uma linha foi sorteada no bregma, após o qual as placas ósseas restantes foram removidas. (C) o cérebro é mostrado em um molde de cérebro polimetacrilato metacrilato antes de ser cortado com uma lâmina de barbear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: cérebro fatias organizadas da rostrais caudal com socos (círculos vermelhos). Abreviaturas: CX: córtex, no lobo parietal; MPO: área preóptica medial; NTS: solitários de tractus núcleo; PVN: núcleo paraventricular; FILHO: núcleo supra-óptico; e STR: corpo estriado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: resposta de BiP/GRP78 no NTS é invertida ao de outros núcleos. (A) expressão de proteína representante BiP no painel superior em relação a proteína total apresentado no painel abaixo. Note que a densidade de proteína total em vários capilares são heterogêneos, e estes são usados para igualar a respectiva expressão BiP por proteína no painel b. (B) mostrado é o BiP significa em relação à proteína total em núcleos de cérebro de amostras unprimed ( azul) contra amostras preparadas de colostro (marrons). Asteriscos das respectivas cores designar diferenças significativas (p < 0,05, n = 4 núcleos) entre BiP no NTS contra BiP nos outros núcleos. Expressão de BiP em unprimed contra amostras condicionadas em NTS são significativamente invertido para aqueles em STR (χ2 p = 0,028, n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: eIF2a ativos e inativos (p-eIF2a) resposta a escorva de colostro versus unprimed amostras no NTS invertido ao de outros núcleos. (A) representante eIF2a p-eIF2a proteína expressões e são mostrados nos painéis superiores. As pistas de proteínas totais são apresentadas no painel inferior. (B) mostrado é a eIF2a média de 4 amostras, expressado em relação à proteína total (do painel inferior A) em núcleos de cérebro de amostras unprimed (azuis) contra amostras preparadas de colostro (marrons) e (C) a forma inativa de eIF2a (p-eIF2a). Asteriscos das respectivas cores designar diferenças significativas (p < 0,05, n = 4 núcleos) entre ambas as formas de eIF2a no NTS contra respectivos níveis nos outros núcleos. Expressão de eIF2a ativo em unprimed contra amostras condicionadas em NTS são significativamente invertido para aqueles na CX, STR e MPO (χ2 p < 0,05 contra todos os três núcleos, n = 4). Barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: NTS expressa eIF2a quinase p-GCN2, de acordo com o nível de p-eIF2 e inversamente ao nível p-PKR. (A) o nível de p-PKR (dsRNA registrados quinase de eIF2a) é expressa em unprimed contra o colostro-aprontadas NTS inversamente para 1) o nível de p-PKR no PVN (χ2 p = 0,025) e 2) seu esperado alvo substrato eIF2a após sua fosforilação (para p-eIF2a, Figura 2). Note que o padrão de p-PKR no filho, CX, STR e MPO de unprimed contra amostras de colostro-ferrado se encaixa os respectivos padrões de p-eIF2a da Figura 2. (B) ativado eIF2a quinase (p-GCN2) em unprimed contra aprontada NTS amostras segue um padrão semelhante de p-eIF2a expressão da Figura 2 e um padrão inverso de pPRK expressão da Figura 3A2 p = 0,028). C = níveis médios de GCN2 inativos. Barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: expressão citoplasmática de NF-kB e IkB em núcleos de cérebro de amostras de intestino unprimed e colostro-aprontadas. (A) média citoplasmática expressão de IkB em relação à proteína total (do painel C) em núcleos do cérebro indicado. (B) representativas bandas citoplasmáticas de IkB proteína são apresentadas no painel superior e densidade de proteínas totais nas respectivas faixas de rodagem no painel inferior. (C) média citoplasmática expressão de NF-kB em relação à proteína total (do painel D) em núcleos do cérebro indicado. (D) bandas citoplasmáticas representante das bandas de NF-kB são apresentadas no painel superior e densidade total de proteínas citoplasmáticas nas respectivas faixas de rodagem no painel inferior. Asteriscos coloridos designar diferenças significativas entre as amostras indicadas (p < 0,05, n = 4). Note que os níveis citoplasmáticos de NF-kB maiores no colostro-aprontadas CX, STR e MPO do que nos núcleos hipotalâmicas NTS, PVN e filho em desacordo com os níveis do inibidor do NF-kB (IkB). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: esquemático comparando a hipótese de OT sinalização nas regiões de intestino e cérebro colostro-aprontadas. OT de colostro (A) em enterócitos ativa seu receptor através da interação direta com o OTR, reduzindo a inflamação através do aumento IkB sinalizando a jusante. Tradução de proteína é inibida pelo aumento p-PKR, que diminui a atividade elF2a através de fosforilação. Homeostase é restaurada através de aumento BiP gene expressão13,37. (B) neural ou circulatório OT ativa seu receptor nas regiões do cérebro, CS, STR e MPO ácido inflamação e proteína Tradução via as mesmas moléculas como o intestino (Veja o painel A). (C) os hipotéticos efeitos de escorva de colostro na região do cérebro NTS são distintos e oposto daqueles em painéis A e B. GCN2, que é sensível ao suprimento de aminoácidos, aumenta a tradução tanto eIF2a e proteína. Ao mesmo tempo, baixos níveis de IkB permitam NF-kB entre o núcleo e induz a inflamação. Observe que o BiP age da mesma forma para restaurar a homeostase no intestino e no NTS no cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary Figure
Complementar Figura 1: diagrama esquemático mostrando a linha do tempo do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Uma técnica para microdissection Discrete, núcleos de cérebro OTR-ricos em cérebro de ratos neonatal é apresentado neste trabalho. É bem reconhecido que os neurônios são altamente especializados, mesmo dentro de núcleos bem caracterizados no cérebro. Esta abordagem altamente reprodutível para isolar núcleos específicos de OTR ricos permite que o teste de hipótese robusto. Usando a mancha ocidental automatizado, a consistência e a reprodutibilidade dos resultados foram melhoradas. Uma limitação dessa técnica permanecendo a variabilidade de soco de cérebro modesto; Esta técnica representa um avanço sobre célula única, todo o cérebro ou abordagens de fatia do cérebro. Abordagens de célula única são complicadas, fornecendo tiros snap muito limitado. Usando o cérebro todo, todos os resultados podem ser diluídos se o efeito é restrito a uma região do cérebro ou subtipo neuronal. Abordagens de fatia cerebral sem microdissection podem apresentar profunda variabilidade nos resultados dentro de meras mícrons em uma fatia, que é especialmente problemático para o hipotálamo neste estudo, devido ao agrupamento apertado de núcleos distintos. Usando um soco padronizado e o auxílio de um microscópio, a variabilidade em medidas de proteína foi reduzida.

Existem várias etapas críticas no âmbito do presente protocolo. Estes incluem aderência para o momento da colheita do tecido com relação a primeira alimentação, usando um volume mínimo de proteína solução tampão, incubação de fatias de cérebro em ACSF assim moleculares inibidores ou estimulantes podem ser utilizados e usando um sensível dispositivo imune-eletroforético. Possíveis modificações incluem a escolha dos reagentes para a incubação e a duração da incubação e estender o tempo de fome unprimed para comparar o cérebro às vezes equivalentes. Limitações importantes incluem a presença de algumas células não-neuronais (mesmo durante este período neonatal muito cedo) e um número limitado de amostras que podem ser preparados a partir de uma ninhada de recém-nascidos em um dia. Além disso, esta abordagem é completamente dependente quando os filhotes nascem. No que diz respeito a métodos existentes, expressão do gene no cérebro nessa idade é normalmente e mais convenientemente avaliado a nível transcricional. No entanto, para análise de sinalização da pilha, a abordagem de proteomic executada por equipamentos de instalação de núcleo é mais cara do que a área de trabalho instrumentos automatizados. O método de borrão ocidental convencional requer muito mais proteínas, leva vários dias para ser concluída e envolve várias etapas de manipulação por pessoal técnico. Esta abordagem automatizada requer 0,8 µ g proteína por capilar, uma vez carregado dentro do instrumento, todas as etapas são executadas sem humanos mãos interferência e leva 2 h e 50 min para completar a corrida. Esta técnica pode ser usada para estudar o desenvolvimento do cérebro pós-natal imediato em ratos e ampla gama de modelos do rato geneticamente manipulado.

Usando esta técnica, os efeitos de OT a nível celular, especificamente no período crítico entre o nascimento e alimentação, foram investigados o OTR màxima é expressa no epitélio8. Os efeitos de modulação da OT na célula sinalização moléculas nas células do intestino, tanto em uma célula linha37 e vivo em13, foram demonstrados anteriormente. No presente estudo, os efeitos observados em células do intestino foram avaliados em regiões do cérebro ricas em OTR. A expressão de BiP/GRP78 e p-eIF2a era upregulated em unprimed (consistente com uma resposta esperada ao estresse) e ativador em aprontada tecido NTS (consistente com uma resposta atenuada ao stress), Considerando que o NF-kB foi elevado e estável em ambas as condições 38. expressões de BiP e NF-kB eram o mesmo nas outras regiões testadas em condições unprimed e condicionadas. eIf2a foi fosforilada pela quinase dependente do dsRNA (pPKR) no filho, CX, STR e MPO. No entanto, no NTS e em menor medida no PVN, eIf2a foi fosforilada pela outra quinase, quinase de controle geral nonderepressible-2 (GCN2). Um esquemático mostrando a hipótese de diferenças de sinalização no cérebro e intestino, provocado pela exposição do colostro é apresentado na Figura 7.

Isto faz da técnica de microdissection possível testar hipóteses relacionadas ao impacto do colostro primeiro alimenta estresse sinalização em núcleos de OTR ricos discretos no cérebro neonatal. Estes dados sugerem que os mecanismos de modulação estresse observados anteriormente no intestino recém-nascido enterócitos são espelhados em regiões específicas do cérebro ricas em OTR, conforme mostrado pelo aumento de retenção citosólica do VHC (PVN, filho CX, STR e MPO). Os resultados também indicam que a NTS e PVN utilizam um mecanismo de fosforilação diferente das outras regiões que podem ser refratários ao impacto da insuficiência de nutrientes. Coletivamente, os dados indicam que sinalização celular no cérebro associados com insuficiência de nutrientes e hormonal durante as primeiras horas de nascimento seguir é semelhante a sinalização no intestino nas mesmas condições da pilha. Este dados suporta a importância do leite materno, no momento do nascimento para modulação do estresse no intestino e o cérebro. Estes resultados ressaltam a necessidade de maior exploração do impacto do colostro na função cerebral.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Manon Ranger e Alexandra Schulz por sua assistência na elaboração deste protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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