इमेजिंग सेल सांस म्यूकोसा में संपर्क के दौरान इंफ्लूएंजा वायरस के संक्रमण का उपयोग कर दो-फोटॉन Intravital माइक्रोस्कोपी

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Immunology and Infection

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Summary

इस अध्ययन में, हम दो फोटॉन intravital इमेजिंग और सेल संपर्क murine सांस म्यूकोसा में संक्रमण के बाद इंफ्लूएंजा वायरस के साथ प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । इस प्रोटोकॉल श्वसन संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा कोशिका गतिशीलता का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक हो जाएगा ।

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Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

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Abstract

vivo में सेल-सेल या सेल-रोगज़नक़ इंटरेक्शन का विश्लेषण संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गतिशीलता को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । दो-फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी (2P-IVM), जबकि छवि अधिग्रहण के दौरान उत्पन्न photobleaching को कम करने, जीवित पशुओं में गहरी ऊतक में सेल बातचीत के अवलोकन की अनुमति देता है । तारीख करने के लिए, लसीकावत् और गैर लसीकावत् अंगों के 2P-IVM के लिए विभिन्न मॉडलों का वर्णन किया गया है । हालांकि, श्वसन अंगों की इमेजिंग पशु के श्वास चक्र से जुड़े आंदोलन के कारण एक चुनौती बनी हुई है ।

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए vivo प्रतिरक्षा सेल बातचीत में श्वासनली चूहों इंफ्लूएंजा वायरस 2P-IVM का उपयोग कर से संक्रमित के साथ में कल्पना । इस प्रयोजन के लिए, हम एक कस्टम इमेजिंग मंच है, जो शल्य जोखिम और श्वासनली के इंटुबैषेण, श्लैष्मिक उपकला में न्यूट्रोफिल और वृक्ष कोशिकाओं (डीसी) के गतिशील छवियों के अधिग्रहण के बाद शामिल थे विकसित की है । इसके अतिरिक्त, हम श्वासनली में इंफ्लूएंजा intranasal संक्रमण और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन करने की जरूरत कदम विस्तृत । अंत में, हम न्युट्रोफिल और डीसी गतिशीलता के रूप में अच्छी तरह से एक फिल्म के पाठ्यक्रम के दौरान उनके बातचीत का विश्लेषण किया । इस प्रोटोकॉल स्थिर और उज्ज्वल 4d सेल के आकलन के लिए आवश्यक छवियों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है श्वासनली में सेल बातचीत ।

Introduction

दो-फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी (2P-IVM) सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के रीयल टाइम इमेजिंग के लिए एक प्रभावी तकनीक है क्योंकि वे अपने प्राकृतिक वातावरण1में होते हैं । इस विधि का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह एक अधिक से अधिक नमूना गहराई पर सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है (५०० µm 1 मिमी) अन्य पारंपरिक इमेजिंग तकनीक2के साथ तुलना में. एक ही समय में, दो कम ऊर्जा दो फोटॉन लेजर द्वारा उत्पंन फोटॉनों के उपयोग के ऊतक तस्वीर-आम तौर पर छवि अधिग्रहण प्रक्रिया2के साथ जुड़े नुकसान को कम कर देती है । पिछले दशक के दौरान, 2P-IVM कई विषयों3,4,5में सेल सेल बातचीत के विभिंन प्रकार के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । इन अध्ययनों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हो गया है, जो अन्य कोशिकाओं और पर्यावरण द्वारा उत्पन्न संकेतों के बाद उनके उच्च गतिशीलता और प्रमुख संपर्कों के गठन की विशेषता है । 2P-IVM भी रोगज़नक़ और6मेजबान के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । दरअसल, यह पहले से दिखाया गया है कि कुछ रोगजनकों प्रकार और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संपर्कों की अवधि में परिवर्तन कर सकते हैं, बाधा, एक परिणाम के रूप में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया7.

airway म्यूकोसा पहली साइट है जिसमें हवाई रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8उत्पंन होता है । इसलिए, vivo में रोगज़नक़ के विश्लेषण-इस ऊतक में मेजबान बातचीत संक्रमण के दौरान मेजबान रक्षा तंत्र की दीक्षा को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, 2P-एयरवेज के IVM मुख्य रूप से पशु, जो छवि अधिग्रहण की प्रक्रिया समझौता के श्वास चक्र द्वारा उत्पादित कलाकृतियों के कारण चुनौती दे रहा है । हाल ही में, इमेजिंग murine श्वासनली9,10,11,12 और फेफड़ों के लिए विभिन्न सर्जिकल मॉडल बताए गए हैं13,14,15, 16. सांस 2P-IVM मॉडल एक उत्कृष्ट सेट अप का प्रतिनिधित्व करने के लिए ऊपरी एयरवेज में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रारंभिक चरण कल्पना, जबकि फेफड़ों alveoli 2P-IVM मॉडल और संक्रमण के देर से चरण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं । विकसित फेफड़ों के मॉडल हवा से भरा alveoli, जो लेजर के ऑप्टिकल प्रवेश सीमित है और vivo इमेजिंग 17 में के लिए दुर्गम intrapulmonary एयरवेज की श्लैष्मिक परत बनाने की उपस्थिति के साथ जुड़े एक सीमा मौजूद . इसके विपरीत, श्वासनली की संरचना, एक सतत उपकला द्वारा गठित, छवि अधिग्रहण की सुविधा.

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि इंफ्लूएंजा संक्रमण, पशुओं की शल्य तैयारी, और श्वासनली के 2P-IVM प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदम का एक विस्तृत विवरण शामिल मौजूद है । इसके अलावा, हम एक विशिष्ट प्रयोगात्मक सेट-अप न्यूट्रोफिल और वृक्ष कोशिकाओं (DC), दो प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार है कि इंफ्लूएंजा वायरस18,19 के खिलाफ रक्षा तंत्र के मध्यस्थों के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा के दृश्य के लिए वर्णन . अंत में, हम एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए न्युट्रोफिल-डीसी बातचीत का विश्लेषण । इन संपर्कों को डीसी सक्रियण और, बाद में, रोगज़नक़ों20के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है ।

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Protocol

चूहों को शामिल सभी पशु प्रक्रियाओं स्विस संघीय पशु चिकित्सा कार्यालय के दिशा निर्देशों और पशु प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया स्थानीय पशुचिकित्सा अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. CD11c-YFP चूहों की इंफ्लूएंजा संक्रमण

  1. प्रयोगशालीय
    नोट: माउस के अनुकूलित तनाव इंफ्लूएंजा A/पर्टो रीको/8/34 H1N1 (PR8) निषेचित अंडे में उगाया जाता था, शुद्ध और titrated के रूप में पहले21वर्णित है । सभी संक्रमित पशुओं या जैविक नमूनों को शामिल कदम जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) 2 शर्तों के अनुसार एक सुरक्षा कैबिनेट के तहत किए गए ।
    1. एक ७०% इथेनॉल समाधान से पहले और बाद में संक्रमण की प्रक्रिया के साथ सुरक्षा कैबिनेट साफ ।
    2. इस प्रक्रिया के दौरान उत्पादित सभी अपशिष्ट पदार्थों को त्यागें जो उचित है जो सुरक्षा दिशानिर्देश (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf) के बाद । autoclavable डिब्बे और ७०% इथेनॉल समाधान या चिकित्सा विसंक्रमित से भरा प्लास्टिक बैग में दूषित तरल पदार्थ में ठोस अपशिष्ट त्यागें ।
  2. इंफ्लूएंजा intranasal संक्रमण
    नोट: B6. तटरक्षक टीजी (Itgax-वीनस) 1Mnz/जे (CD11c-YFP)22 पर एक C57BL/6J पृष्ठभूमि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया । चूहों विशिष्ट रोगजनक में अनुसंधान के लिए संस्थान में नि: शुल्क सुविधा में बनाए रखा गया था ।
    1. पिंजरे के प्रति अधिकतम 5 आयु-और सेक्स-मिलान (छह से आठ सप्ताह की उम्र वाले) CD11c-YFP चूहों को रखें । संक्रमण प्रक्रिया से पहले आवास शर्तों के लिए चूहों acclimation के लिए कम से कम दो दिन के लिए प्रतीक्षा करें ।
    2. PR8 स्टॉक को ठंडा करना और इसी कमजोर पड़ने के लिए कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड (पंजाब) के बिना संशोधित ठंड 1x Dulbecco का उपयोग कर के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए तैयार करने के लिए २०० पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU) में 30 µ l वायरस कमजोर पड़ने पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर ।
      नोट: इंफ्लूएंजा वायरस के हर बैच के अनुमापन इसके उपयोग से पहले के लिए एक सटीक संक्रमण खुराक सुनिश्चित करने की सिफारिश की है ।
    3. ketamine (१०० मिलीग्राम/किग्रा) की एक खुराक सुई और xylazine (10 मिलीग्राम/intraperitoneally (आईएफसआई) एक 26 जी सुई 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर ।
    4. माउस पूरी तरह से anesthetized है जब तक रुको (दोनों लेकन और पेडल वापसी पलटा का पूरा नुकसान). गहरी संज्ञाहरण एक इष्टतम संक्रमण के लिए आवश्यक है, के बाद से नहीं पूरी तरह से anesthetized चूहों निगल या वायरस इनोक्युलम को निष्कासित करेगा, संक्रमण खुराक में बदलाव के लिए अग्रणी.
    5. anesthetized माउस को किसी लापरवाह स्थिति में रखें । वायरस इनोक्युलम के 15 µ l को लीजिए । जगह पिपेट टिप माउस के पास छोड़ दिया नाक और ड्रॉप द्वारा वायरल इनोक्युलम ड्रॉप बांटना । बूंदों के रूप में साँस लेना चाहिए, उन्हें सीधे नाक गुहा के अंदर पिपेट नहीं है ।
    6. रुको 2-5 मिनट और सही नाक में वायरस इनोक्युलम के शेष 15 µ एल युक्त पिपेट टिप जगह है ।
      नोट: घुटन से बचने के लिए, लगभग 20 एस अंतराल में छोटे आकार के बूंदें बांटें ।
    7. जांच करें कि माउस को सही ढंग से सांस लेने और पार्श्व decubitusमें एक पिंजरे में जगह है । मॉनिटर माउस श्वास और संज्ञाहरण वसूली (प्रेरण के बाद लगभग ६० मिनट) ।
      नोट: यह एक ही समय में 1 से अधिक माउस को संक्रमित करने के लिए संभव है । इस मामले में, एक अनुक्रम में सभी चूहों की बाईं नाक में वायरल इनोक्युलम प्रशासन, 2 के लिए रुको-5 मिनट और फिर सही नाक में वायरस प्रशासन । व्यक्तियों के बीच परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, एक ही समय में कोई 3 से अधिक चूहों को संक्रमित ।
    8. पशु स्वास्थ्य की स्थिति और वजन घटाने दैनिक मॉनिटर ।
    9. Euthanize मानव समापन बिंदु प्राधिकारी दिशानिर्देश द्वारा निर्धारित के अनुसार चूहों । इच्छामृत्यु विधि पशु प्रयोग अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया जाना है और स्थानीय नैतिक नियमों का संमान करना चाहिए । दो-फोटॉन प्रयोगों के बाद, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के बाद ketamine/xylazine की अधिक मात्रा के प्रशासन द्वारा चूहों euthanize । सभी अंय प्रयोगों में, इच्छामृत्यु के लिए एक विधि के रूप में सह2 साँस लेना का उपयोग करें ।
      नोट: संक्रमित श्वासनली, ५०% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID50) परख या वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) परख के वायरल titers उपाय के रूप में पहले23वर्णित किया जा सकता है ।
  3. प्रवाह cytometry द्वारा श्वासनली में न्युट्रोफिल भर्ती का मूल्यांकन
    नोट: प्रोटोकॉल का यह भाग वैकल्पिक है । यह सांस म्यूकोसा में न्युट्रोफिल भर्ती इंफ्लूएंजा संक्रमण के बाद का मूल्यांकन करना है ।
    1. Euthanize संक्रमित और संक्रमित नियंत्रण चूहों दिन में 3 के बाद संक्रमण (p.i.) सह द्वारा2 साँस लेना.
      नोट: आदेश में सांस क्षति को रोकने के लिए, euthanize पशुओं के लिए ग्रीवा विस्थापन का उपयोग करने से बचें । साथ ही, रक् न्यूट्रोफिल से संदूषण से बचने के लिए euthanized चूहों के छिड़काव की सलाह दी जाती है ।
    2. ७०% इथेनॉल समाधान के साथ माउस गर्दन स्प्रे और एक त्वचा ठोड़ी को छाती से सर्जिकल कैंची का उपयोग चीरा प्रदर्शन करते हैं ।
    3. संदंश का उपयोग कर लार ग्रंथियों अलग और श्वासनली का पर्दाफाश ।
    4. संदंश और कैंची का प्रयोग कर श्वासनली के आसपास की मांसपेशियों को काटना ।
      नोट: प्रक्रिया के दौरान श्वासनली आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है के बाद से यह चरण सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए ।
    5. संदंश के साथ श्वासनली पकड़ो और ध्यान से विच्छेदन द्वारा घेघा अलग ।
    6. संदंश के साथ श्वासनली के intrathoracic भाग धारण, एक बनाने के पेड़ की शुरुआत में एक चीरा । फिर गला से अलग श्वासनली और ध्यान से किसी भी पेशियां छोड़ दिया ।
    7. RPMI १६४० + HEPES मध्यम (RPMI) वाली बर्फ पर एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में अंग रखें ।
    8. श्वासनली पाचन के लिए एंजाइम मिश्रण तैयार करें, जिसमें ०.२६ इकाइयों/collagenase (मैं और द्वितीय) और ०.२ मिलीग्राम/एमएल DNase मैं RPMI ।
    9. एक 6-well प्लेट में एंजाइम मिश्रण की 1 मिलीलीटर युक्त में विच्छेदित श्वासनली रखें ।
    10. संदंश और कैंची की मदद से अंग को छोटे टुकड़ों में काट लें । इस चरण के दौरान बर्फ पर प्लेट रखें ।
    11. ४५ मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । इस समय के दौरान, थाली हर 15 मिनट हिला ।
    12. FACS वाशिंग बफर के 1 मिलीलीटर (2 मिमी EDTA और 2% गर्मी-निष्क्रिय फिल्टर-निष्फल भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) में पंजाबियों जोड़कर एंजाइम पाचन बंद करो ।
    13. एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ समाधान resuspend ऊतक के आंशिक रूप से अपच टुकड़े को असंबद्ध करने में मदद करने के लिए ।
    14. एक ४० µm छलनी के माध्यम से सामग्री पारित करके एक और अच्छी तरह से समाधान स्थानांतरण । फिर, धीरे एक 2 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर का उपयोग छलनी के शीर्ष पर फंसे अंग के शेष टुकड़े तोड़ ।
      नोट: छलनी पर श्वासनली के आंशिक रूप से अपच टुकड़े मुंहतोड़ प्रवाह cytometric विश्लेषण के दौरान कोशिकाओं की एक इष्टतम संख्या प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।
    15. अच्छी तरह से धोने और FACS धोने बफर के साथ छलनी और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब बर्फ पर रखा में निलंबन स्थानांतरण ।
    16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १६६ x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और १०० µ l में कक्षों को resuspend FACS की धुलाई बफ़र ।
    17. प्रवाह cytometry के लिए एंटीबॉडी सतह धुंधला के साथ आगे बढ़ें । संक्षेप में, ब्लॉक एफसी अलग कोशिकाओं के रिसेप्टर्स CD16 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर/ सही ढंग से न्यूट्रोफिल की पहचान करने के लिए, प्रवाह cytometry पैनल निंनलिखित एंटीबॉडी शामिल होना चाहिए: αLy6G, αCD11b, αCD45, के रूप में अच्छी तरह से एक व्यवहार्यता डाई मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ।
    18. एक प्रवाह cytometer पर नमूनों की पूरी सामग्री को चलाने और डेटा का विश्लेषण ।
      1. प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक इष्टतम संख्या प्राप्त करने के लिए, एक गति से अधिक नहीं ३,००० घटनाओं/ इससे अधिग्रहण के दौरान बहिष्कृत की गई घटनाओं की संख्या में कमी आएगी । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, यह २,०००,००० प्रति श्वासनली कक्षों की 1 करने के लिए प्राप्त करने के लिए संभव होना चाहिए ।

2. अलगाव और न्यूट्रोफिल के इंजेक्शन

नोट: इस प्रक्रिया में, b 6.129 (ICR)-टीजी (सीएजी-ECFP) CK6Nagy/जे चूहों (CK6-ECFP)24का उपयोग किया गया । इन जानवरों मानव β-actin प्रवर्तक के तहत सभी प्रकार के सेल में । वैकल्पिक रूप से, यह भी C57BL/6J चूहों का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को अलग और उन्हें २.६ चरण में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार दाग करने के लिए संभव है । शुद्धि और न्यूट्रोफिल के हेरफेर उनके सक्रियण स्थिति में वृद्धि हो सकती है, संभवतः उनके प्रवासी और कार्यात्मक गुणों में फेरबदल ।

  1. सह2 साँस लेना द्वारा पशु Euthanize ।
  2. दोनों femurs और tibias निकालें और धीरे उंहें संदंश का उपयोग कर साफ ।
  3. कट हड्डी epiphyses और एक 1 मिलीलीटर बाँझ ठंड पंजाबियों से भरा सिरिंज का उपयोग कर अस्थि मज्जा फ्लश, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में बर्फ पर रखा.
  4. एक 18 जी सुई के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक ४० माइक्रोन छलनी के साथ सेल निलंबन फिल्टर । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ११० x g पर पंजाबियों के साथ एक बार धो लें और ठंडे पंजाब के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें ।
  5. 10x पंजाबियों में १००% Percoll 9:1 पतला और Percoll ७२%, ६४% और ५२% 1x पंजाबियों का उपयोग कर के ढाल समाधान तैयार करते हैं । ध्यान से एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में तीन ढाल में से प्रत्येक की परत 2 मिलीलीटर, सबसे केंद्रित एक से शुरू ।
    1. ध्यान से जोड़ें ढाल के शीर्ष पर अस्थि मज्जा सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर और गति और ब्रेक के बिना कमरे के तापमान (आरटी) में 30 मिनट के लिए १,१०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. ध्यान से ६४% और ७२% के बीच अंतरफलक पर बैंड को हटा दें और यह 5 मिनट के लिए २०० एक्स जी में एक बार धो ठंडे पंजाबियों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर । पंजाब के १०० μL की मात्रा में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें और उन्हें बर्फ पर रखें । न्यूट्रोफिल की शुद्धता ९०% से अधिक होने की उम्मीद है ।
  7. वैकल्पिक रूप से, एक सेल प्रसार किट के साथ लेबल न्यूट्रोफिल निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर । 1 मिलीलीटर की एक मात्रा में 10 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल निलंबन करने के लिए डाई जोड़ें, 30 मिनट के लिए ३७ ° c और धो (१६६ x g, 5 मिनट) में मशीन ।
  8. एक hemocytometer का उपयोग कर सेल एकाग्रता का अनुमान है और नसों में 5 एक्स 106 कोशिकाओं १०० μL की एक अधिकतम मात्रा में पहले संक्रमित CD11c-YFP+ एक 26 ग्राम सुई 1 मिलीलीटर सिरिंज, इमेजिंग से पहले 12 ज का उपयोग कर चूहों में इंजेक्शन.

3. इमेजिंग के लिए माउस की तैयारी

  1. संज्ञाहरण
    1. Anesthetize संक्रमित CD11c-YFP+ चूहों पर दिन में 3 p.i. चरण 1.2.3 के अनुसार ।
    2. एक बार चूहों गहरी anesthetized हैं, संज्ञाहरण फिर से खुराक के लिए एक कैथेटर तैयार करते हैं ।
      1. संदंश का उपयोग कर एक सिरिंज से एक 30 जी सुई निकालें.
      2. पीई-10 चिकित्सा सिलिकॉन टयूबिंग के एक 20 सेमी टुकड़ा करने के लिए सुई डालें ।
      3. ट्यूब के दूसरी तरफ ketamine/xylazine मिश्रण से भरा एक 30 ग्राम सुई सिरिंज डालें ।
      4. ट्यूब के अंदर की हवा निकाल दें ।
    3. स्वचालित वेंटिलेशन (आंकड़ा 1ai) बनाए रखने के लिए एक ऑक्सीजन insufflating मशीन से एक ट्यूब से जुड़ा एक 20 ग्राम कैथेटर तैयार करें । यह ०.२ मिलीलीटर की एक ज्वार की मात्रा के साथ प्रति मिनट १३० बीट्स (b.p.m.) के एक सांस अनुपात पर सेट एक १००% ऑक्सीजन गैस की आपूर्ति का उपयोग कर ।
  2. सर्जरी के लिए माउस तैयार
    1. एक गर्म थाली या सर्जरी के सभी समय के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म शल्य पीठ पर एक विशिष्ट अनुकूलित सर्जिकल बोर्ड (चित्रा 1aद्वितीय-iii) पर माउस रखें ।
    2. एक बिजली के रेजर का उपयोग कर माउस की गर्दन से बाल दाढ़ी और एक लोमनाशक क्रीम (आंकड़ा 1bमैं) ।
    3. माउस को प्लास्टिक के माउस पोजिशनल (चित्रा 1aद्वितीय-ए) के ऊपर रखें, एनिमल हेड को पोजिशनल (figure 1bii) के बाहर रखते हुए एक ऐसा कोण बनाएं जो श्वासनली के इंटुबैषेण की सुविधा देता हो ।
    4. ठीक forelimbs, पंजे, और सर्जिकल टेप के साथ पूंछ, एक विटामिन एक समृद्ध जेल के साथ माउस आंखें गीला और माउस गर्दन (आंकड़ा 1bद्वितीय) को संक्रमित ।
  3. सर्जरी
    1. ठीक से autoclaved आइटम, अर्थात्, कैंची, microsurgical कैंची, और संदंश तैयार करें ।
    2. गर्दन के लंबे औसत दर्जे का अक्ष पर एक छोटा सा चीरा प्रदर्शन, लगभग 1 सेमी लंबे, ऊपरी छाती और mandible के निचले बिंदु (आंकड़ा 1biii) के माध्यम से गुजर लाइन के बीच के बीच क्षेत्र में ।
    3. बाद में त्वचा पैच और लार ग्रंथियों हटो और श्वासनली, मांसपेशियों द्वारा कवर कल्पना । फिर, काटना सांस मांसपेशियों को ध्यान से संदंश (आंकड़ा 1biii) का उपयोग कर ।
    4. एक कैथेटर के साथ माउस Intubate और कृत्रिम वेंटिलेशन (चित्रा 1biv) शुरू करते हैं ।
      नोट: कैथेटर एक बाहरी प्लास्टिक हिस्सा है, जो सांस म्यूकोसा की रक्षा करता है, और एक भीतरी लोहे की सुई से बना है । सुई की उपस्थिति का विस्तार और श्वासनली को स्थिर करने और अपनी प्रदर्शनी को विनियमित करने के लिए आदर्श समाधान का प्रतिनिधित्व करता है । कैथेटर के माध्यम से कृत्रिम वेंटिलेशन माउस के उचित साँस लेने की गारंटी देगा ।
    5. तुरंत माउस श्वास पर नजर रखने के लिए कृत्रिम वेंटिलेशन शुरू करते हैं ।
    6. कैथेटर की ऊंचाई और एक सर्जिकल हुक (आंकड़ा 1bv) शल्य चिकित्सा बोर्ड पर विशिष्ट रॉड से जुड़े (आंकड़ा 1aii-b) का उपयोग कर को ठीक करें । ठोड़ी की एक ही ऊंचाई पर श्वासनली बेनकाब ।
    7. पेट्रोलियम जेली के साथ श्वासनली घेरना और पूर्व के कुछ बूंदें-गरम पंजाबियों के साथ कवर करने के लिए अंग (आंकड़ा 1bछठी) के लिए उचित जलयोजन गारंटी ।
    8. माउंट तैयारी के शीर्ष पर coverslip । इस कदम के लिए, एक धातु धारक पर गोंद एक coverslip (चित्रा 1bसातवीं), जो XYZ अनुवादक (चित्रा 1aद्वितीय-सी) के लिए खराब हो जाएगा । coverslip को सर्जिकल तैयारी के शीर्ष पर रखने के लिए XYZ अनुवादक को समायोजित करें ।
    9. संज्ञाहरण intraperitoneally के प्रशासन के लिए कैथेटर प्लेस (आंकड़ा 1bआठवीं) ।
    10. ketamine/xylazine मिश्रण हर 30 मिनट की प्रारंभिक खुराक के ५०% इंजेक्षन ।
      नोट: पुनः खुराक ५०% से 25% करने के लिए प्रारंभिक ketamine/xylazine मिश्रण के एक सुरक्षित और वैध वैकल्पिक25है । हालांकि, के बाद से इस प्रोटोकॉल टर्मिनल और पशु के एक सख्त स्थिरीकरण पूरी प्रक्रिया के दौरान की आवश्यकता है, संज्ञाहरण के एक गहरी शल्य चिकित्सा विमान को बनाए रखने के लिए उच्च खुराकों का उपयोग करें ।

4. में Vivo समय चूक इमेजिंग

नोट: छवि अधिग्रहण एक ईमानदार दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ प्रदर्शन किया था, दो तिवारी के साथ सुसज्जित: एसए पराबैंगनीकिरण, तापमान नियंत्रित मशीन चैंबर, और एक 25X/ना १.१ जल विसर्जन उद्देश्य । photomultipliers (पीएमटी) छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया या तो संकर डिटेक्टरों या उच्च संवेदनशीलता GaAsP थे ।

  1. माइक्रोस्कोप मशीन कक्ष के अंदर anesthetized माउस के साथ सर्जिकल बोर्ड प्लेस (पूर्व-37 पर गरम-38 डिग्री सेल्सियस) और coverslip पर पानी की एक बूंद जोड़ें ।
  2. केंद्र और सांस ऊतक पर ध्यान लगाएं ।
  3. स्कैनिंग आवृत्ति सेट करने के लिए ८०० हर्ट्ज, ५२० x ५२० पिक्सेल के साथ, देखने के एक क्षेत्र ४४० x ४४० माइक्रोन2 और पंक्ति औसत 1.
    1. धुन ती: ८३० एनएम के लिए Sa लेजर १५० मेगावाट के स्रोत पर एक संकेत शक्ति के साथ, कोलेजन से दूसरी सुरीले पीढ़ी (एसएचजी) को उत्तेजित करने के लिए । दूसरी ती धुन: स्रोत पर ९४ मेगावाट के साथ ९२० एनएम में Sa लेजर, दोनों को उत्तेजित और YFP ।
    2. सेट अप एक साथ उत्तेजना के साथ 3d और डीकॉक अधिग्रहण मोड
      नोट: photobleaching और phototoxicity को कम करने के लिए संभव के रूप में लेजर शक्तियों को रखें ।
  4. रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति गैर-स्कैन मोड में दो चैनलों का उपयोग कर, एक मास्टर dichroic दर्पण के साथ ५६० एनएम पर । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सेट अप में, एक दूसरे dichroic दर्पण ४९५ एनएम पर संकेत चैनल 2 (उत्सर्जन फ़िल्टर 525/50) (चित्रा 2a) से अलग चैनल 1 (उत्सर्जन फिल्टर 475/50) को विभाजित । इस विंयास पहले चैनल में कोलेजन से स्वसहायता समूहों प्रकाश एकत्र करता है, जबकि दोनों चैनलों 1 और 2 में एकत्र की है और YFP केवल 2 चैनल में एकत्र की है ।
  5. एक सीमा Z अक्ष के साथ ५० माइक्रोन परिभाषित, 3 माइक्रोन (voxel आकार ०.८६ माइक्रोन x 3 माइक्रोन) के एक कदम आकार के साथ । रिकार्ड छवियों को 30 मिनट की कुल अवधि के लिए हर 30 एस ।
  6. यदि वांछित, एकाधिक क्षेत्रों प्राप्त । अधिक अधिग्रहण चलाने से पहले, महत्वपूर्ण संकेत की जांच करें और कैथेटर के माध्यम से संज्ञाहरण सुई लेना अगर जरूरत (चरण 3.3.10 देखें) ।
  7. इमेजिंग प्रक्रिया के अंत में, ketamine के माध्यम से माउस euthanize/xylazine ओवरडोज के बाद ग्रीवा अव्यवस्था ।

5. छवि प्रसंस्करण और न्युट्रोफिल के मात्रात्मक विश्लेषण-डीसी गतिशीलता और बातचीत

नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक विशेष इमेजिंग सॉफ्टवेयर सूक्ष्म डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

  1. के बाद 4d छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, फ़ाइलें (डेटा और मेटाडाटा) एक कार्य केंद्र पर पर्याप्त गणना संसाधनों के साथ स्थानांतरण (सुझाव दिया ंयूनतम सिस्टम आवश्यकताओं: ३२ जीबी रैम, तेजी से ठोस राज्य ड्राइव, हाल ही में सीपीयू, समर्पित GPU पर आधारित एक व्यापक समानांतर वास्तुकला) ।
  2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में फ़ाइलें खोलें ।
  3. वीडियो चलाएं और सुनिश्चित करें कि ब्याज की कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे है और है कि इमेजिंग कलाकृतियों अनुपस्थित रहे हैं ।
    नोट: यह अंत करने के लिए, सत्यापित करें कि नमूना और चमक भिन्नता के दोनों आंदोलन पर्याप्त रूप से सीमित हैं । दरअसल, इन स्वत: विश्लेषण के लिए चुनौतियों का प्रतिनिधित्व26। आसंन फ्रेम के बीच नमूना के आंदोलन अत्यधिक है, तो एक निश्चित संदर्भ के रूप में स्वसहायता चैनल उदाहरण के लिए उपयोग, एक बहाव सुधार विधि लागू होते हैं । इससे नमूने की आवाजाही के बजाय कोशिकाओं के मूवमेंट को बेहतर उपाय करने की अनुमति मिलती है । इसके अतिरिक्त, चमकदार पृष्ठभूमि या मलबे की उपस्थिति में, एक चयन पैरामीटर के रूप में मात्रा का उपयोग कर पुनर्निर्माण सतहों छंटाई ।
  4. एक सह स्थानीयकरण, और कोलेजन (स्वसहायता) के बीच संकेत अलग करने के क्रम में, के लिए विशिष्ट यह अंत करने के लिए, एक गेटिंग बहुभुज (चित्रा बी. ए.) निरूपित करता है कि केवल voxels एक सकारात्मक तीव्रता दोनों ग्रीन चैनल में और ब्लू चैनल में चुनता है ।
    नोट: यह प्रक्रिया माइक्रोस्कोप और कोशिकाओं के धुंधला के फिल्टर सेट के अनुसार भिन्न हो सकती है । यह हरे और नीले दोनों चैनलों में पर्याप्त तीव्रता के साथ केवल voxels का चयन करके प्राप्त किया जा सकता है । उपलब्ध उपकरणों के बीच, "coloc" कार्यक्षमता स्वचालित रूप से तीव्रता थ्रेसहोल्ड पर आधारित colocalization चैनल की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, मशीन लर्निंग पर आधारित तरीकों का एक विशेषज्ञ27के पर्यवेक्षण के साथ इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. का पता लगाने और उचित सह स्थानीयकरण चैनल पर स्वत: सतह पुनर्निर्माण और ट्रैकिंग (सतह उपकरण) का उपयोग कर, एक प्रकार का
    नोट: अंतिम ट्रैकिंग त्रुटियों और एक निर्धारित सीमा से कम अवधि के साथ पटरियों के अपवर्जन के मैनुअल उपचारात्मक (यानी, १५० s) की आवश्यकता हो सकती है.
  6. CD11c-YFP+ कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एक सह-स्थानीयकरण चैनल उत्पंन, क्रम में और YFP संकेतों को अलग करने के लिए । यह अंत करने के लिए, एक गेटिंग बहुभुज (चित्रा 2 बीद्वितीय) है कि केवल ग्रीन चैनल में एक सकारात्मक तीव्रता लेकिन नीले चैनल में एक कम तीव्रता वाले voxels का चयन करता है निरूपित ।
    नोट: प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ चैनल से संकेत दिखा रहा है 1, चैनल 2, के लिए सह स्थानीयकरण चैनल, YFP के लिए सह स्थानीयकरण चैनल, और सभी चैनलों के संयोजन चित्रा 2 बीiiiमें पाया जा सकता है.
  7. CD11c-YFP+ कोशिकाओं की सतह का पुनर्निर्माण और समय (सतह उपकरण) पर उनकी स्थिति को ट्रैक ।
    नोट: इस चरण के लिए अंतिम ट्रैकिंग त्रुटियों की मैंयुअल सुधार की आवश्यकता नहीं है । दरअसल, डीसी के जटिल spatio-लौकिक गतिशीलता के कारण, 2P-IVM डेटा से उनके सटीक सतह के पुनर्निर्माण एक चुनौतीपूर्ण कार्य है कि उपलब्ध फॉल्ट सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है । कारण है कि इस कार्य को चुनौती देने के बीच, पतली दखलंदाजी और चमक विविधताओं कुछ छवि प्रसंस्करण तकनीक के उपयोग के लिए अनुमति नहीं है, ऐसे चिकनी फिल्टर या स्थिर थ्रेसहोल्ड के रूप में । इसके अलावा, डीसी के एक नेटवर्क में, यह केवल 2P-IVM डेटा में उनकी उपस्थिति पर आधारित एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए मुश्किल है. इन कारणों के लिए, बजाय सॉफ्टवेयर मापदंडों ट्यूनिंग द्वारा एक सटीक विभाजन का प्रयास करने के लिए, हम डीसी की गैर सटीक सतहों को फिर से संगठित करने का प्रस्ताव । फिर, ५.८ में वर्णित के रूप में मजबूत मैट्रिक्स के माध्यम से संभावित त्रुटियों को संभाल ।
  8. कक्ष माइग्रेशन को मापने ।
    1. दोनों + और CD11c-YFP+ कोशिकाओं के लिए शास्त्रीय प्रवासन उपायों निर्यात करें । इन के बीच, "ट्रैक गति मतलब" कोशिकाओं की औसत प्रवासी वेग इंगित करता है, जबकि "ट्रैक सीधे" कोशिकाओं की दिशात्मकता इंगित करता है. इन उपायों इमेजिंग सॉफ्टवेयर से एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है ।
    2. निर्यात स्प्रेडशीट फ़ाइलों में, "सही ट्रैक सीधे गणना" (भी सही अनुपात के रूप में संदर्भित) दोनों के लिए और CD11c-YFP+ कोशिकाओं है, जो "ट्रैक सीधे" के रूप में परिभाषित किया गया है के वर्ग जड़ से गुणा "ट्रैक अवधि" वीडियो अवधि के वर्ग जड़ से विभाजित है । यह उपाय ट्रैकिंग त्रुटियों से उदाहरण के लिए प्रारंभिक,28छोटे पटरियों की उपस्थिति में "ट्रैक सीधे" से अधिक मजबूत है.
      नोट: केवल इसी लम्बाई के वीडियो की तुलना इस उपाय से की जा सकती है.
  9. सेल इंटरेक्शन को मापने ।
    1. यदि उनकी दूरी (निकटतम voxels) थ्रेशोल्ड (यानी, 2 माइक्रोन) से कम या बराबर है, तो किसी CD11c+ कक्ष और एक-YFP+ कक्ष के बीच संपर्क निर्धारित करें ।
      नोट: यह थ्रेशोल्ड पर्याप्त रूप से केवल एक संपर्क का पता लगाने के लिए सख्त होना चाहिए जब कक्ष बंद निकटता में हैं । हालांकि, हम इस थ्रेशोल्ड को 0 से अधिक रखने के लिए प्रोत्साहित करते हैं, आदर्श रूप से n बार voxel त्रिज्या (n > 2) से बड़ा है, क्योंकि बॉर्डर स्मूथिंग कक्षों के पुनर्निर्माण को वास्तविक कक्ष आकार से छोटा बना सकता है ।
    2. संख्या और के बीच संपर्क की अवधि गिनती+ और CD11c-YFP+ कोशिकाओं । इमेजिंग सॉफ्टवेयर में इस उदाहरण के लिए एक "चुंबन और भागो में प्लग" निष्पादित द्वारा किया जा सकता है इन उपायों के आंकड़े टैब से एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है ।
  10. एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में पहले से गणना की माप आयात, भूखंडों उत्पन्न और सांख्यिकीय परीक्षण करते हैं.

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Representative Results

इस काम में, हम vivo में अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन गतिशीलता और murine श्वासनली (चित्रा 3ए) में इंफ्लूएंजा संक्रमण के दौरान न्यूट्रोफिल और डीसी के बीच बातचीत । इस प्रयोजन के लिए, हम अलग -थलग-न्यूट्रोफिल (९२% शुद्धता; चित्र बी) CK6-ECFP चूहों से और हम adoptively उन्हें एक CD11c-YFP माउस इंफ्लूएंजा से संक्रमित में स्थानांतरित कर दिया । उसके बाद, हम 3 दिन में श्वासनली के 2P-IVM प्रदर्शन किया p.i. इस समय बिंदु पर हम संक्रमित क्षेत्र में न्यूट्रोफिल की एक स्पष्ट भर्ती मनाया, के रूप में प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 3सी) द्वारा दिखाया गया है । 2P-IVM प्रोटोकॉल एक विशिष्ट शल्य चिकित्सा बोर्ड के उपयोग की आवश्यकता है और एक ऑक्सीजन आपूर्तिकर्ता के लिए कुतर (आंकड़ा 1a) । श्वासनली में डाला एक प्रवेशनी के माध्यम से ऑक्सीजन की आपूर्ति पशु सांस लेने में मदद की, श्वासनली की प्रदर्शनी की सुविधा, और अंग (चित्र 1b) श्वास के साथ जुड़े आंदोलन को नियंत्रित किया । इस प्रयोगात्मक सेट अप के बाद, हम 30 मिनट (चित्रा 3 डी, फिल्म 1) की अवधि के दौरान संक्रमित श्वासनली में vivo में स्थिर 4d छवियों का अधिग्रहण किया.

विशेष इमेजिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से अधिग्रहीत 4d छवियों के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के प्रवास के उपाय और न्यूट्रोफिल और डीसी के spatio-लौकिक गतिशीलता यों को मापने की अनुमति दी । सेल गतिशीलता के बारे में, हम डीसी के आंदोलन और भर्ती न्यूट्रोफिल, जो उत्तरार्द्ध (चित्र 4a) की तुलना में काफी तेज गति से पता चला के बीच महत्वपूर्ण मतभेद मनाया । यह परिणाम न्यूट्रोफिल के गतिशील प्रकृति की पुष्टि करता है, पहले एक chemoattractant स्रोत29की ओर पलायन करने में सक्षम अत्यधिक गतिशील कोशिकाओं के रूप में वर्णित. दिशात्मकता के बारे में, हम डीसी के जटिल आकृति विज्ञान की कमी हुई अवधि और मापा दिशात्मक व्यवहार (चित्रा 4B) की वृद्धि हुई विचरण के साथ पटरियों का उत्पादन किया है, जो सेल ट्रैकिंग में लगातार त्रुटियों झुकेंगे कि निष्कर्ष निकाला. इस कारण से, हम ट्रैक अवधि पर विचार करके दिशात्मकता को मापने के लिए सक्षम है कि एक मजबूत मीट्रिक की गणना. इस मीट्रिक का उपयोग करके, हमने न्यूट्रोफिल बनाम डीसी (फिगर 4c) के डायरेक्शन में एक महत्वपूर्ण अंतर मनाया.

इसके अतिरिक्त, न्यूट्रोफिल और डीसी के बीच की दूरी की गणना का पता लगाने के लिए और समय के साथ अपने संपर्कों का विश्लेषण करने की अनुमति दी । इस प्रयोगात्मक मॉडल में, हम कुछ न्यूट्रोफिल है कि डीसी और दूसरों के साथ कई संक्षिप्त संपर्क का गठन किया है कि छवि अवधि (चित्रा 4d) के दौरान किसी भी संपर्क फार्म नहीं मनाया । इसके अलावा, समय पर न्यूट्रोफिल और डीसी के बीच की दूरी की औसत प्रवृत्ति का अध्ययन हमें अध्ययन किया कोशिकाओं (चित्रा 4E) के समग्र स्थिति का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी है, जबकि विशिष्ट कोशिकाओं में प्रवृत्ति की जांच की अनुमति के लिए विशेषताएं प्रत्येक एकल-कक्ष (चित्रा 4F, मूवी 2) का व्यवहार ।

Figure 1
चित्र 1: murine श्वासनली के 2P-IVM के लिए उपकरण और चरण । (एअर इंडिया) स्वचालित वेंटिलेशन के आरोप में पोर्टेबल जानवर संज्ञाहरण प्रणाली एक पंप है कि माउस को ऑक्सीजन की आपूर्ति करने के लिए जुड़ा हुआ है । फ्रंट व्यू (Aii) और साइड व्यू (Aiii) कस्टम मेड सर्जिकल बोर्ड का इस्तेमाल सांस मॉडल के लिए किया गया है । बोर्ड एक प्लास्टिक माउस स्थानीय (Aii-a), एक जंगम क्लैंप (Aii-बी), और एक ठीक स्वरित्र XYZ अनुवादक (Aii-सी) पकड़ के लिए एक छड़ी के साथ एक धातु के मंच से बना है । () सांस सर्जिकल मॉडल के अनुक्रमिक कदम: (द्वि) सर्जिकल क्षेत्र के बाल हटाने, (बीि) सर्जिकल बोर्ड में anesthetized माउस की स्थिति, (Biii) श्वासनली के सर्जिकल प्रदर्शनी, (Biv ) कृत्रिम वेंटिलेशन के साथ एक कैथेटर के साथ इंटुबैषेण, (बी. ए.) कैथेटर का निर्धारण, (Bvi) श्वासनली के लिए पंजाबियों के अलावा, (Bvii) coverslip के बढ़ते, और (Bviii) एक कैथेटर की नियुक्ति संज्ञाहरण के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:2P-IVM के दौरान फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने । () माइक्रोस्कोप का पता लगाने फिल्टर सेट अप और इसी चैनल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । Dichroic ५६० एनएम पर दर्पण लाल/सुदूर लाल उत्सर्जन से नीले/ अतिरिक्त dichroic ४९५ एनएम पर दर्पण आगे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के विभिंन उपक्षेत्रों को पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । चैनल 1 एक हाइब्रिड डिटेक्टर (उत्सर्जन फ़िल्टर 475/50) कार्यरत है, जबकि चैनल 2 उच्च संवेदनशीलता GaAsP PMT (उत्सर्जन फ़िल्टर 525/50) का उपयोग करता है. () 2P संकेतों के प्रतिनिधि कैटरिंग डॉट भूखंड (द्वि) और YFP (बीि) fluorophores से आने वाले सिग्नल की पहचान के लिए colocalization चैनलों की पीढ़ी के लिए गेटिंग कार्यनीति दर्शाते हैं. (Biii) प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ 1 चैनल से विशिष्ट संकेतों दिखा रहा है (1 Ch, डार्क ब्लू), 2 चैनल (2 ch, ग्रीन), (हल्के नीले रंग) के लिए सह स्थानीयकरण चैनल, YFP के लिए सह स्थानीयकरण चैनल (पीला), और सभी चैनलों के संयोजन (ch 1 + ch 2 + YFP) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक इंफ्लूएंजा संक्रमित श्वासनली में न्यूट्रोफिल और डीसी के Intravital 4d इमेजिंग । (A) प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध बाह्यरेखा. () प्रतिनिधि प्रवाह cytometric एक कोशिका निलंबन murine ढाल विधि का उपयोग Percoll अस्थि मज्जा से पृथक में कुल CD45 + कोशिकाओं के संबंध में न्यूट्रोफिल का प्रतिशत दिखा scatterplot । () प्रतिनिधि प्रवाह cytometric scatterplots संक्रमित चूहों से tracheas में न्यूट्रोफिल की आवृत्ति में वृद्धि दिखा रहा है 3 दिन में इंफ्लूएंजा वायरस से संक्रमित चूहों की तुलना में p.i. () (बाएं पैनल) एक murine की संरचनात्मक छवि छवि अधिग्रहण के लिए चयनित क्षेत्र दिखा श्वासनली । (दायां फलक) प्रतिनिधि 3 दिन में अपने पटरियों के साथ एक साथ न्यूट्रोफिल (हल्का नीला) और डीसी (पीले) की सतह पुनर्निर्माण दिखा रहा है एक 2P-IVM micrograph के 3 डी प्रक्षेपण-4 p.i. स्वसहायता संकेत गहरे नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्रा 4: न्युट्रोफिल और डीसी प्रवासन और संपर्क गतिशीलता में इंफ्लूएंजा संक्रमित श्वासनली के लक्षण वर्णन । प्रतिनिधि भूखंडों ट्रैक गति दिखा () मतलब है, ट्रैक (), और सही ट्रैक सीधे (सी), के रूप में Beltman और सहयोगियों द्वारा परिभाषित (२००९)28, श्वासनली में न्यूट्रोफिल और डीसी के साथ 3 p.i. दिन पर इंफ्लूएंजा वायरस । सही ट्रैक सीधे माप ट्रैकिंग त्रुटियों के लिए मजबूती दर्शाती है । () 2d हिस्टोग्राम डीसी के साथ संपर्क की उनकी संख्या और मतलब संपर्क अवधि के अनुसार न्युट्रोफिल की आवृत्ति दिखा । () फिल्म की अवधि के दौरान निकटतम डीसी को न्यूट्रोफिल की औसत दूरी. () (बाएं) समय में निकटतम डीसी के लिए एक प्रतिनिधि न्युट्रोफिल की दूरी का विश्लेषण । डॉटेड लाल रेखा दूरी थ्रेशोल्ड पर विचार करने के लिए कि किसी न्युट्रोफिल एक DC के साथ कोई संपर्क स्थापित इंगित करता है । (राइट i-iii) माइक्रोग्राफ एक डीसी (पीला) की ओर एक न्युट्रोफिल (हल्का नीला) के प्रवास का प्रतिनिधित्व अलग समय अंक पर हासिल की । सेल पटरियों एक बहुरंगी रेखा के रूप में दिखाया गया है कि नीले रंग से लाल करने के लिए समय का प्रतिनिधित्व बदलता है । fibrillary कोलेजन से स्वसहायता संकेत गहरे नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार = ५० µm । सभी आंकड़ों में प्रस्तुत आंकड़ों में कम से तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । परिणाम वेल्च के परीक्षण द्वारा मतलब ± एसडी. सांख्यिकी के रूप में दिया जाता है । एन एस पी > 0.05; p < 0.0001 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
फिल्म 1: न्यूट्रोफिल और डीसी श्वासनली में गतिशीलता इंफ्लूएंजा संक्रमण के दौरान । 30 मिनट की चूक 3 डी न्यूट्रोफिल (हल्का नीला) और डीसी (पीला) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोलेजन नेटवर्क (डार्क ब्लू) श्वासनली के संबंध में उनके संबंधित पटरियों के बीच संपर्क गतिशीलता दिखा छवि । प्रतिनिधि न्युट्रोफिल-डीसी बातचीत सफेद तीर द्वारा संकेत दिया जाता है । सेल पटरियों एक बहुरंगी रेखा के रूप में दिखाया गया है कि नीले रंग से लाल करने के लिए समय का प्रतिनिधित्व बदलता है । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
2 फिल्म: प्रतिनिधि अल्पकालिक न्युट्रोफिल-डीसी श्वासनली में बातचीत इंफ्लूएंजा संक्रमण के दौरान । 30 मिनट की चूक 3 डी छवि एक न्युट्रोफिल (हल्का नीला) और एक डीसी (पीले) और उनके संबंधित पटरियों के बीच एक प्रतिनिधि बातचीत दिखा । सेल पटरियों एक बहुरंगी रेखा के रूप में दिखाया गया है कि नीले रंग से लाल करने के लिए समय का प्रतिनिधित्व बदलता है । कोलेजन से संकेत स्वसहायता गहरे नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार = 10 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यह काम 4d छवियों की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत adoptively हस्तांतरित न्यूट्रोफिल के प्रवासन और डीसी के साथ उनके बातचीत माउस श्वासनली में एक इंफ्लूएंजा संक्रमण के दौरान दिखा । वर्णित 2P-IVM मॉडल एयरवेज में संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा कोशिका गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक हो जाएगा ।

हाल ही में, एयरवेज में सेल गतिशीलता के दृश्य पर आधारित कई मॉडलों को विकसित किया गया है9,10,11,12,13,14,15 ,16. हालांकि, vivo इमेजिंग में फेफड़ों अभी भी चुनौतीपूर्ण है, इस अंग की शारीरिक स्थिति और तकनीकी कठिनाइयों को ध्यान में रखते हुए आंदोलन को कम करने के लिए श्वास चक्र30. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, कुछ लेखकों ने छाती13,14में शल्य चिकित्सा की जरूरत है, जो एक कस्टम निर्मित परिपत्र चूषण चैंबर के उपयोग का प्रस्ताव किया है । हालांकि, इस प्रक्रिया के एक आक्रामक हस्तक्षेप है कि परिणामों से समझौता सकता है, विशेष रूप से उन अध्ययनों कि भड़काऊ प्रतिक्रिया की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है की आवश्यकता है । इसके अलावा, फेफड़ों के सर्जिकल मॉडल प्रकाश अपवर्तन alveoli17में हवा से उत्पंन के कारण गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए एक सीमा मौजूद । इसके विपरीत, विभिन्न सांस मॉडल हाल ही में airway उपकला में सेल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है. इस अंग की इमेजिंग फेफड़ों की तुलना में स्पष्ट लाभ प्रस्तुत करता है, ऐसे अपेक्षाकृत सरल सर्जरी का पर्दाफाश करने और अंग स्थिर करने के लिए आवश्यक के रूप में, साथ ही सांस उपकला के लिए उच्च पहुँच. प्रस्तावित सांस मॉडल भी ऐसे इंफ्लूएंजा वायरस के रूप में airway रोगजनकों के खिलाफ प्रतिक्रिया की दीक्षा की जांच करने के लिए प्रासंगिक है, के बाद से श्वासनली वायरल प्रतिकृति के एक इंफ्लूएंजा8संक्रमण के दौरान पहली साइटों में से एक है ।

दिलचस्प है, एक अध्ययन एक वैकल्पिक इंटुबैषेण इमेजिंग के लिए नि: शुल्क विधि दिखा श्वासनली हाल ही में12प्रकाशित किया गया है । इस विधि एक कम सूजन की विशेषता है और जहां उपकला कोशिकाओं के mucociliarity समारोह संरक्षित किया जा करने की जरूरत है अध्ययनों में स्पष्ट लाभ से पता चलता है. हालांकि, इस विधि की गारंटी नहीं है पर्याप्त स्थिरता और उज्जवल संकेतों के अधिग्रहण के लिए सेल सेल संपर्कों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक कुछ µm की एक श्रेणी में । इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रस्तुत विधि अंग के बेहतर स्थिरीकरण प्रदान करता है इंटुबैषेण के लिए धंयवाद, और अंग और coverslip12के बीच कम दूरी का एक परिणाम के रूप में मजबूत प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने की अनुमति देता है ।

पूरा करने के दौरान ऊतक स्थिरीकरण vivo 2P-IVM छवि अधिग्रहण इष्टतम डेटा उत्पन्न करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है. प्रस्तुत विधि की स्थिरता के लिए योगदान है कि कुछ महत्वपूर्ण उपाय शामिल हैं: एक उपयुक्त माउस संज्ञाहरण; एक सही माउस इंटुबैषेण; और श्वासनली की एक शल्य प्रदर्शनी है कि coverslip द्वारा अंग के लिए एक आसान पहुँच की अनुमति देता है । साथ ही, इमेजिंग कक्षों की सही संख्या (आदर्श रूप से 30 कक्षों को देखने के प्रति फ़ील्ड) प्राप्त परिणामों को मजबूत करेगा । कोशिकाओं की इष्टतम संख्या की भर्ती वायरल संक्रमण खुराक पर काफी हद तक निर्भर करेगा, जो वायरल इनोक्युलम के उचित प्रशासन से बहुत प्रभावित है ।

प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण कदम श्वासनली की शल्य प्रदर्शनी है । सर्जरी के दौरान अंग को हुई क्षति को न्यूनतम करने के लिए विभिन्न उपाय अपनाए जा सकते हैं । उदाहरण के लिए, श्वासनली सीधे शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ छुआ नहीं होना चाहिए । इसके बजाय, यह केवल आसपास के ऊतकों (त्वचा, लार ग्रंथियों, और मांसपेशियों) हेर-फेर द्वारा उजागर किया जाना चाहिए । यदि कड़ाई से आवश्यक हो, श्वासनली unsharpen मदों का उपयोग कर संभाला जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, रक्त वाहिका क्षति से बचने के लिए प्रयास किया जाना चाहिए । अंत में, अंग निर्जलीकरण को रोकने के लिए, यह भी यह पंजाबियों के साथ तुरंत सर्जरी के बाद कवर महत्वपूर्ण है ।

सांस म्यूकोसा में प्रतिरक्षा कोशिका बातचीत के दृश्य के लिए पहले वर्णित तरीकों पर इस पद्धति के अद्वितीय लाभ के बावजूद, इस मॉडल के उपयोग के कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है । जैसा कि ऊपर वर्णित है, सांस सर्जरी के साथ जुड़े सूजन की उपस्थिति एक खामी का प्रतिनिधित्व जब प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन हो सकता है । इस सीमा को दूर करने के लिए, यह प्रक्रिया की दीक्षा से पहले विरोधी भड़काऊ दवाओं के प्रशासन के लिए संभव है । इस मॉडल की एक और सीमा एक मजबूत autofluorescence एयरवेज, जो मुख्य रूप से निवासी कोशिकाओं और बलगम परत द्वारा उत्पंन होता है में मौजूदा संकेत की उपस्थिति से संबंधित है । इस गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति कलाकृतियों है कि विश्लेषण में बाधा हो सकती है बनाता है । इसके अलावा, ट्रैक के भ्रामक गणना पैरामीटर जब विभिन्न अवधियों के सेल पटरियों की तुलना और कम अवधि26की पटरियों परिचय त्रुटियों ट्रैकिंग जब उत्पन्न किया जा सकता है. इस समस्या को दूर करने के लिए, हम ट्रैक सीधे सही करने के लिए एक दंड गुणांक लागू किया । इस तरह के सुधार के परिणाम28में मिस ट्रैकिंग के प्रभाव को कम करने का इरादा है ।

2P का एक महत्वपूर्ण पहलू-IVM प्रयोगों के लिए फिर से चूहों कि सर्जरी और इमेजिंग आया है का उपयोग करने की संभावना है. vivo इमेजिंग प्रोटोकॉल में यहां वर्णित पशु इच्छामृत्यु या अंग संग्रह की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार की संभावना को ठीक करने और फिर से अंय प्रक्रियाओं के लिए सर्जरी के बाद चूहों का उपयोग छोड़ रहा है । एक ही माउस का प्रयोग, उदाहरण के लिए, अलग समय अंक पर श्वासनली इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए नाटकीय रूप से कुल एक प्रयोग में जरूरत जानवरों की संख्या में कमी, पशु कमी सिद्धांत का समर्थन कर सकता है । इसके अलावा, यह भी अंतर व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है । हालांकि, पशु वसूली और पुनः उपयोग पशु कल्याण मानकों कि उचित एनाल्जेसिक दवाओं और वसूली समय के दौरान पशुओं के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन भी शामिल पालन करना चाहिए । इन सभी प्रक्रियाओं पशु प्रयोग प्रोटोकॉल में शामिल किया जाना चाहिए और स्थानीय पशुचिकित्सा अधिकारियों द्वारा अनुमोदित ।

वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से अंय प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, अलगाव और (फ्लोरोसेंट या सना हुआ) रोगज़नक़-विशिष्ट टी कोशिकाओं के इंजेक्शन टी सेल सक्रियकरण गतिशीलता31 के साथ ही सांस डीसी जैसे अंय कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसी तरह, रक्त या लसीका वाहिकाओं के दृश्य संक्रमण के दौरान सांस ऊतक में भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इसके अलावा, 2P-श्वासनली के IVM भी अंय हवाई रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसलिए, ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट हवाई रोगजनकों के उपयोग, इस तरह के स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया३२के रूप में, नए प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ अपने संबंधों का अध्ययन करने के अवसर पैदा करेगा । हालांकि यह प्रक्रिया संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता को मापने पर केंद्रित है, यह भी कैंसर, अस्थमा, या घाव भरने सहित विभिंन क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्विस नेशनल फाउंडेशन (SNF) अनुदान (१७६१२४, १४५०३८, और १४८१८३), यूरोपीय आयोग मैरी क्यूरी पुनर्एकीकरण अनुदान (६१२७४२), और D.U.P. (2013/124) के लिए एक अनुदान के लिए SystemsX.ch द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4 °C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3x 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20 G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20 °C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20 °C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20 °C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20 °C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

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References

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