낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

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Developmental Biology

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Summary

이 프로토콜 심장 조상 세포는 내 피 분화 기법을 설명합니다. 그것은 특히 혈 청 농도 셀 시드 밀도 미치는 내 피 분화 가능성에 초점을 맞추고.

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Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

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Abstract

심장 조상 세포 (Cpc)는 부상 후 심장 재생을 위한 치료 잠재력을 할 수 있습니다. 성인 포유류 심장에서 본질적인 Cpc는 매우 부족 하지만 확장 된 Cpc 세포 치료에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그들의 사용에 대 한 전제 조건 정의 하 고 효율적인 프로토콜을 사용 하 여 다양 한 심장 계보에 제어 방식으로 차별 하는 그들의 능력 이다. 또한, 생체 외에서 확장에 따라 Cpc 환자 로부터 격리 또는 임상 질병 모델 질병 메커니즘의 조사에 대 한 유익한 연구 도구를 제공할 수 있습니다.

현재 연구는 Cpc를 식별 하기 위해 다른 마커를 사용 합니다. 그러나, 그들의 모든 인간, 일부 임상 연구의 변환에 미치는 영향을 제한 하 표현 됩니다. 격리 기술과 마커 식에 관계 없이 적용 가능한 차별화 프로토콜 표준화 된 확장 및 세포 치료 목적에 대 한 Cpc의 애 벌 칠 수 있게 됩니다. 여기 우리가 낮은 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 농도 낮은 세포 밀도 조건에서 Cpc의 못쓰게 Cpc. 마우스와 쥐 Cpc의 두 개의 서로 다른 모집단을 사용 하 여 내 피 분화를 용이 하 게, 우리는 더 그 laminin 표시 설명 fibronectin 다음 프로토콜에서이 목적을 위해 보다 적합 한 기판: 3.5%와 보충을 포함 하 여 매체에 2-3 일을 유지 multipotency 위한 배양 후 FBS, Cpc에서 laminin에 시드는 < 60% 합류에 교양 및 보충-무료 내 피 분화 매체에 차별화 하기 전에 20-24 시간 동안 FBS (0.1%)의 낮은 농도와 매체. Cpc는 유형이 다른 인구 때문에, 혈 청 농도 및 부 화 시간 각각 CPC 부분 모집단의 속성에 따라 조정 될 필요가 있습니다. 고려, 기술 뿐만 아니라 Cpc의 다른 종류에 적용할 수 있는 그리고 잠재력과 차별화 하 고 어떻게 영향을 받는지 질병에 의해 각각 질병 모델에서 격리 하는 Cpc를 사용할 때의 메커니즘을 조사 하는 유용한 방법을 제공 합니다.

Introduction

최근 연구 결과 성인 포유류 심장1,2,3, 주민 심장 조상 세포 (Cpc)의 존재를 지원 하 고 Cpc 심장 상해4, 후 세포 치료에 대 한 유용한 소스 될 수 있습니다. 5. 또한, 확장 된 Cpc 마약 검사에 대 한 유익한 모델을 제공할 수 있습니다 및 각 질병 또는 드문 cardiomyopathies 가진 환자에서 분리 될 때 질병 메커니즘의 조사 모델6,7.

성인 심장에서 고립 된 Cpc 소유 줄기/시 조 세포 특성1,2,,38 은 multipotent, clonogenic, 자기 갱신에 대 한 능력. 그러나, Cpc 전시 다른 표면 표식 프로필을 포함 하 여, 예를 들어, c-키트, Sca-1, 그리고 다른 사람, 또는 다른 절연 기술 (표 1)에 의해 검색의 많은 다른 (하위) 인구 있다. 여러 문화와 차별화 프로토콜 되었습니다 설립된1,2,,89,10,11,12, 13,,1415,,1617,18. 이러한 프로토콜은 성장 인자 및 혈 청 콘텐츠를 하는 경작의 목적에 따라 조정 결과 및 결과, 차별화 효율성 등에서 차이를 낼 수 있는 관하여 주로 다.

마커 기반 격리 기법:

Cpc는 특정 표면 마커 식1,2,,89,10,11,12,13 에 따라 격리 된 수 있습니다. 14,15,,1617,18. 이전 연구는 c-kit 및 Sca-1 주민 Cpc1,,1114,,1920을 최고의 마커를 있을 수 있습니다 제안 합니다. 이러한 마커 중 누구도 진정으로 Cpc에 대 한 특정 있기 때문에, 다른 표시의 조합 일반적으로 적용 됩니다. 예를 들어 c-키트21의 저급을 표현 하는 Cpc, 반면 c-키트는 또한 돛대 세포22,23, 내 피 세포 및 조 혈 줄기/뿌리 셀24를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 표현 됩니다. 추가적인 문제는 사실 이다 모든 마커는 모든 종에 걸쳐 표현 됩니다. 이것은 인간의25에 마우스만을 표현 하는 Sca 1에 대 한 경우입니다. 따라서, 격리 표식의 독립적인 프로토콜을 사용 하 여 임상 시험 및 연구 인간의 샘플을 사용 하 여 보기 유리할 수 있습니다.

마커-독립 절연 기술:

몇 가지 주요 기술 CPC 격리는 주로 표면 마커 식의 독립 하지만 ( 표 1참조)을 필요에 따라 특정 마커-긍정적인 subfractions의 연속 선택에 의해 정제 수는 있다. (1) 측 인구 (SP) 기술은 원래 ATP 묶는 카세트 (ABC) 운송업 자27여 경과 DNA 염료 Hoechst 3334226 수에 따라 조 혈 줄기 세포의 기본 인구 특징 되었습니다. 심장 SP 세포를 다른 그룹에 의해 분리 하 고 표현 하는 다양 한 보고서2,8,,1314사이의 작은 차이와 마커를 보고 되었습니다. (2) 콜로 니 형성 단위 fibroblast 세포 (CFU-Fs) 원래에 정의 된 따라 mesenchymal stromal 세포 (MSC)-형 같은. 격리 된 MSCs 식민지 형성을 유도 하는 요리에 교양. MSC 같은 CFU Fs 식민지 형성 등 성인 심장에서 고립 될 수 있다 고 심장 계보15로 분화 할 수 있다. (3) Cardiosphere-파생 셀 (CDC) 조직 생 검에서 성장 하는 셀의 클러스터에서 파생 하는 단 세포 또는 explants28,29,,3031. 최근에 주로 CD105 보였다+/CD90-/c-kit- 셀 분수 cardiomyogenic 및 재생 잠재적인32전시.

여기, 우리 쥐 Cpc 및 마우스 SP Cpc33이전의 연구에 따라 내 피 혈통의 효율적인 유도 프로토콜 제공 SP-Cpc 쥐에서 격리를 사용 하 여. 프로토콜에는 문화에 특정 적응 및 셀 밀도 관하여 확장 기술, 매체, 그리고 기판의 혈 청 내용 포함 되어 있습니다. 그것은 마우스 SP Cpc에 뿐만 아니라 적용할 수 있습니다 하지만 내 피 커밋된 CPC에는 증폭에서 운명 스위치를 유도 하는 목적에 대 한 Cpc의 종류, 이식이 세포 또는 기계적 생체 외에서 연구에 대 한 그들의 사용의 보기.

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Protocol

셀 격리 목적을 위해 마우스를 사용 하 여 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드 스위스 동물 보호 법률에 따라 되었고 스위스 Cantonal 권위에 의해 승인 되었다.

참고: 격리 Sca-1+/CD31- SP-Cpc 마우스 마음에서 본질적으로 이루어졌다 앞에서 설명한34 약간 수정으로. 재료 및 시 약 사용에 대 한 재료의 표를참조 하십시오. 모든 실험에 대 한 심장 SP-Cpc 쥐에서 분리 증폭, passaged, 되었고 셀 라인 같은 방식에서으로 사용. 구절 7-20이이 연구를 위해 사용 되었다.

1. 조직 준비

참고: 마우스를 사용 하 여 모든 실험 한다 실시 지침 및 규정. 이 프로토콜은 4 개의 마우스를 사용합니다. 직경에서 100 m m는 배양 배지는 P100으로 설명 하 고 지름에서 60 mm 문화 접시는 프로토콜의 다음 부분에 대 한 p 60으로 설명 하 고 있다.

  1. Intraperitoneally 각 마우스 pentobarbital의 200 mg/kg을 주사 (i.p.) 완벽 하 게 곤란 하 게 발가락에 그것의 응답을 확인 하 여 마 취 될 때까지 기다립니다.
  2. 70% 에탄올과 가슴을 닦아. 흉 강 폭로 위 피부와 흉 벽을 잘라.
  3. 집게와 마음을 들어올리고가 위를 사용 하 여 기초에 그것을 잘라 합니다. 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (P100 당 3 ~ 5 마음) 또는 P60 당 1 ~ 2 심 혼의 25 mL P60 (5 mL)와 P100에 마음을 넣어.
  4. 충 치 (그림 1A)에서 피를 분출 하는 집게와 심장 펌프.
  5. 세척에 대 한 차가운 PBS의 25 mL P60 (5 mL)와 P100에 마음을 넣어. Atria 작은 위를 사용 하 여 제거 합니다. 심장 두 경도 조각으로 잘라 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60)에 다시 그들을 세척.
  6. 차가운 PBS의 25 mL P60 (5 mL)와 함께 새로운 P100 조각을 전송. 작은 위 (그림 1B)를 사용 하 여 작은 조각으로 조각을 잘라. 1 mg/mL 콜라 B 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)에 희석 한 방울을 추가 하 고 철저 하 게 멸 균 면도날 (그림 1C)와 작은 조각을 말하다.

2입니다. 소화

  1. 단계 1.6에서에서 1mg/mL 콜라 B 솔루션의 접시 10 mL (P60 2.5 mL)을 추가 합니다.
  2. 포함 하는 기울어진 (약 30 °)에서 다진된 마음 조각 콜라 B 솔루션 P100 (P60) 37 ° C 배양 기 (그림 1D)에.
  3. 최대 30 분;에 대 한 다진된 마음 조각 품 어 균질 하 여 반복적으로 그들 파스퇴르 피 펫 마다 10 분 동안 부 화 (그림 1E).
    참고: 인큐베이션 단계 1.3에 대 한 총 30 분을 초과 하지 중요 하다.

3입니다. 여과

  1. 10 mL (5 mL P60) 차가운 HBSS 보충 2%의 추가 FBS 다진 고 무 균 심장 조각에.
    참고: HBSS 보충 2 %FBS 냉각 콜라와 B 활동.
  2. 100 µ m 필터 제거 소화 되지 않은 조직 및 상 온 (RT) (그림 1 층, 노란색 필터)에서 5 분 동안 470 x g 에서 원심 분리기를 통해 심장 조각 필터링.
  3. 삭제는 상쾌한 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 5 mL (P60 3 mL)에 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 가끔 떨고와 5 분 동안 펠 릿을 품 어.
  4. (세포 반응을 중지)을 PBS의 10 mL (5 mL P60) 추가 샘플 잔여 cardiomyocytes (그림 1 층, 블루 필터)를 포함 하 여 더 큰 셀을 제외 하는 40 µ m 필터를 통해 필터링.
  5. 470 x g (브레이크) 없이 RT 5 분에 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 10%를 포함 한 DMEM의 1 mL에 펠 릿을 resuspend FBS.
  6. hemocytometer와 약 수의 셀을 계산 합니다. DMEM 10% 포함 된 셀을 resuspend FBS, 1 x 106 셀/mL의 최종 셀 농도.
    참고: 약 5 x 106 cardiomyocyte 적혈구 고갈 세포 수 수 추정 마우스 당.
  7. 2 개의 튜브 (그림 2)로 셀 배포: 튜브 A, 추가 Hoechst 33342 얼룩 verapamil;와 1.5 l 관 B, Hoechst 33342 얼룩 18.5 l을 추가 하 고 얼룩을 cytometry (4.1 및 4.2 단계) 심장 SP 셀 정렬 진행.

4. 심장 SP Cytometry 셀의 정렬

참고: Verapamil multidrug 저항 (MDR) ABC 운송업 자 활동을 차단 하 여 Hoechst 경과 억제. Hoechst 33342 DNA 콘텐츠와 연관으로 세포 주기를 감지 하 살아있는 세포에서 사용 될 수 있는 DNA 바인딩 염료 이다. Hoechst 33342 압출 셀 Hoechst 낮은 부분의 두 방출 채널에 표시 (450 nm, Hoechst 블루; 650 nm, Hoechst 레드), 즉, 옆으로 Hoechst-유지의 "주요 인구를", 그들에 게 그들의 이름 "쪽 인구"를 주는. SP 셀 조상 속성에 포함 된 셀에서 농축 하 고 multidrug 저항 ABC 운송업 자 (MDR1, ABCG2) 등의 높은 식 표시. Hoechst 33342 Hoechst 프로토콜의 다음 부분에 대 한로 기록 됩니다. 그것은 이상적인 결과 대 한 감광 재료를 보호 해야 합니다.

  1. 존재와 부재의 verapamil Hoechst와 얼룩
    1. (83.3 μ M의 최종 농도)와 verapamil, Hoechst (5 µ g/106 세포의 최종 농도)와 셀 솔루션에 추가 합니다. 튜브 A, Verapamil 및 Hoechst; 사용 관 B, Hoechst만 사용 합니다. 90 분 (37 ° C)에서 물 욕조에 incubate 고 튜브 마다 20 분 (그림 1G) 복귀.
    2. 470 x g 실시간 삭제는 상쾌한에 5 분에 튜브 원심 고 각 펠 릿 HBSS (1 x 106 셀/mL)에서 resuspend.
    3. 단일 stainings 및 튜브 B (그림 2)에서 부정적인 제어를 위한 aliquot 1.5 mL를가지고: (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-활용 된 안티-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-안티-CD31;를 활용 (iii) nonstained 셀 (부정적인 제어).
      참고: Isotype 컨트롤 격리 프로토콜 설정에 대 한 여기에 사용 됩니다.
    4. 원심 관 A와 B와 RT에 5 분 동안 470 x g 에서 단일 얼룩 및 부정적인 제어 aliquots Hoechst, verapamil 밖으로 세척에 대 한.
    5. 삭제는 상쾌한 고 튜브 A 및 (iii) HBSS의 250 µ L에 부정적인 컨트롤의 펠 릿 resuspend 정렬까지 어둠 속에서 얼음에 그들을 유지.
    6. HBSS의 100 µ L에서 단일 얼룩 aliquots HBSS의 200 µ L에 (i, ii)의 펠 릿 관 B의 펠 릿을 resuspend. FITC 활용 된 안티-Sca-1 (0.6 µ g/107 셀)와 APC 활용 된 안티-CD31 (0.25 µ g/107 셀) 추가 합니다. 얼음에 30 분 동안 펠 릿을 품 어 하 고 어둠 속에서 그들을 때때로 흔들어.
    7. 튜브를 HBSS의 2 개 mL를 추가 합니다. 실시간에서 5 분 동안 470 x g 에서 튜브 원심
    8. 삭제는 상쾌한 고 HBSS 및 이상으로 원심 분리기의 1 mL와 함께 모든 알갱이 resuspend. supernatants 삭제 합니다. HBSS의 200 µ L에서 단일 얼룩 aliquots의 펠 릿을 resuspend. HBSS (20 x 106 셀/mL)에서 관 B의 펠 릿을 resuspend.
    9. 얼음에 샘플을 유지 하 고 정렬까지 빛 으로부터 보호.
  2. Cytometry로 정렬
    1. 살 균 1.5 mL 튜브 HBSS 포함 하 여 2%의 500 µ L 정렬 준비 FBS.
    2. 죽은 세포를 제외 하려면 10 분 동안 얼음에 7 aminoactinomycin d (7-AAD) (0.15 µ g/106 셀) 셀 얼룩.
    3. 다음 설정을 사용 하 여 심장 SP 정렬: Hoechst 350 nm (UV) 여기를 사용 하 여 자극, 450/50 nm 대역 통과 필터 (Hoechst 블루)와 670/30 nm 대역 통과 필터 (Hoechst 레드), 형광 방출 수집 및 100 µ m의 노즐 크기의 압력을 사용 하 여 15 psi입니다.
    4. 분석을 위해 기록 5 x 105 정렬 샘플에 대 한 1 x 105 이벤트와 부정적인 제어, verapamil 제어 및 단일 얼룩에 대 한 샘플.
      참고: 심장 SP는 약 0.5%-2% (그림 1 H) 하지만 수 있습니다 실험실과 분리 사이 다. Sca-1+/CD31- 분수는 약 1%-11%의 총 심장 SP (그림 1I) 하지만 실험실과 분리 사이 다를 수 있습니다. Sca-1+/CD31- SP Cpc는 SP-프로토콜의 다음 부분에 대 한 Cpc로 작성 됩니다.

5. 기본 문화 격리 된 SP-Cpc의

참고: 미디어의 세 가지는이 프로토콜에 사용 되었다. 그들은 이라고 합니다 매체 1 (에 따르면 Noseda 외.) 8, 보통 2, 중간 3는 그들의 구성에 관한 자료의 테이블에 에서 설명 된.

  1. 매체를 사용 하기 전에 1 37 ° C 따뜻하고 진정 4 ° c 원심 분리기 4 ° C와 470 x g 6 분에 대 한 정렬 튜브 원심 및 매체 1에서 셀 resuspend.
  2. 4 매체 1 mL와 가스 침투성 P60 접시에 셀을 넣어. 셀에는 70%-80% 합류에 도달 했습니다 때까지 매체 마다 3 d를 변경 합니다.
    참고: 단계 5.2 약 2-3 주를 걸릴 수 있습니다.

6. 확장 및 SP Cpc의 차별화

  1. 세포 배양
    1. 3 x 105 SP-Cpc T75 플라스 크에 중간 1 8 mL에 문화.
    2. 70%-80% 합류, 변화는 매체 마다 2-3 d까지 5% CO2 와 37 ° C에서 SP-Cpc를 품 어.
      참고: 셀 번호 Cpc 사용의 유형, 배 시간 및 셀 크기에 따라 수정 해야 합니다.
  2. SP-클릭 당 성장과 다른 혈 청 농도에서 생존
    1. 문화-Cpc SP 매체 1의 8 mL와 T75 플라스 크에 2-3 d. 신중 하 게 매체를 발음 하 고 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 부드럽게 씻어.
    2. 셀 셀 인큐베이터에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA의 5 mL을 취급, 트립 신 활동 중지 중 1의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
    3. 470 x g 실시간에 5 분 동안에 세포를 원심
    4. 매체 1 또는 매체 2 (혈통 유도 매체) 및 플레이트 2.5 x 105 SP-Cpc 다른 혈 청 농도 포함 하는 매체의 3 mL와 P60 요리에 셀 resuspend
    5. 매체 1 또는 보통 2 배양의 2 d 후 15 mL 튜브에 죽은 세포의 컬렉션에 대 한 단계 6.2.4의 접시에서 매체를 수집 합니다.
    6. 6.2.2 단계 에서처럼 부착 셀 trypsinize 고 단계 6.2.5의 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 840 x g 실시간에 5 분 동안에 세포를 원심
    7. 발음은 상쾌한 고 셀 카운팅을 위한 매체 1 또는 보통 2의 1 mL를 추가 합니다. SP-Cpc trypan 파랑 (0.4%)와 수 trypan 블루 양성 (죽은) 및 trypan 블루 제외 (가능한) 세포 얼룩.
      참고: 셀 생존 (6.2.7 단계) 총 휴대폰 번호에 관하여 trypan 블루 제외 휴대폰 번호도 제공 됩니다.
  3. 내 피 분화의 유도
    1. 10 µ g/mL laminin (LN) 또는 fibronectin (FN)와 (6-잘) 문화 접시 precoat
      1. 10 µ g/mL LN 또는 FN의 F12 매체 (또는 PBS)를 포함 하는 기판 솔루션을 확인 합니다. 각 우물에 기판 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 접시를 유지
      2. 접시에서 솔루션을 발음 하 고 추가 2 mL PBS의 각 잘까지 그것을 사용 하 여.
    2. 단계의 6.1.2 세포에서 매체를 발음 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 씻, 셀 인큐베이터에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA의 5 mL와 함께 그들을 치료, 추가 5 mL 매체 1 트립 신 활동을 중지 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
    3. 470 x g 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 고 셀 카운팅을 위한 매체 2를 추가 합니다.
    4. 씨앗 8 x 104 셀 당 보통 2의 3 mL와 코팅된 접시에 잘 고 매체 3의 3 mL를 20-24 h. 변화는 매체에 대 한 37 ° C에서 유지.
      참고: 것이 좋습니다 낮은 혈 청 농도 포함 하는 매체를 사용 하 여-보충 없이-첫 번째 20-24 h에 대 한. 사용 하는 것이 좋습니다 < 60% 셀 합류 (, 단계 6.3.4의 셀 번호 셀 크기와 성장 속도 따라 조정 될 수 있다).
    5. 21 d 셀 문화 고 매체 마다 3 d를 변경 합니다.
    6. 폰 Willebrand 같은 내 피 표시와 함께 그들을 착 색 하 여 차별화 된 세포의 내 피 자연 확인 인자 (vWF) 및 공연 형광 현미경 검사 법.
      1. 1 mL의 PBS로 세포 세척 하 고 실시간에 2 분 3.7% 포름알데히드에 셀 수정
      2. 30 분 동안 ddH2O (PBS)에 0.1% 트리톤 X 세포를 permeabilize 및 실시간에서 1 시간에 대 한 10% 염소 혈 청으로 차단
      3. 안티 폰 Willebrand 인자 항 체 (1: 100) 4 ° C에서 48 h에 대 한 셀을 품 어
      4. 3 셀을 씻고 10 분 때마다 PBS의 1 mL x. 어둠 속에서 RT에 1 시간에 대 한 알 렉 사 Fluor 546 염소 안티 토끼 이차 항 체 (1: 500)와 그들을 품 어.
      5. 각각 10 분 동안 세척 다시 3 x 1 mL의 PBS와 함께. 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1: 500)와 세포 핵을 얼룩.
      6. 3 세포를 씻어 각, 5 분 x 1 mL의 PBS와 함께. 셀을 탑재 하 고 4 ° C에서 저장
        참고: 단계 6.1 및 6.3 자란 조건 (기판, 매체, 추가 시 약 및 FBS 농도)는 그림 3에 설명 되어 있습니다.
  4. 관 형성 분석 결과
    1. 준비 하는 지하실 멤브레인 매트릭스 (예를 들어, 이제 매트릭스 라고 Matrigel) 접시.
      1. 밤새 4 ° C에서 매트릭스를 녹여.
      2. 코트와 얼음에 매트릭스의 100 µ L 96 잘 접시.
        참고: 행렬에서 모든 거품을 피하기 위해 중요 하다. 판은 매트릭스의 jellification을 피하기 위해 얼음에 코팅 해야 한다.
      3. 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 유지 합니다.
    2. (단계 6.3.5 완료) 후 세포에서 매체를 발음, 부드럽게 따뜻한 (37 ° C) HBSS의 5 mL로 세포를 헹 구 고 트립 신-EDTA 셀 인큐베이터에서 5 분 그들을 치료. 트립 신 활동을 중지 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 매체 3를 추가 합니다.
    3. 470 x g 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심, 부드럽게 매체 3 및 피펫으로 1 mL를 추가 합니다.
    4. 35 µ m 셀 스 트레이너와 셀 필터링 하 여 셀을 집계 하는 경우.
    5. 셀을 계산 하 고 2 x 103 4 x 103 셀에 각 매트릭스-잘 코팅 매체 3의 100 µ L 씨. 16 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 유지.
    6. 2 배 확대에 밝은 분야 현미경 사진을 가져가 라.
      참고: 불완전 한 trypsinization 경우 7-8 분의 최대 트립 신-EDTA에 노출 시간을 연장 됩니다.

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Representative Results

마우스 SP-클릭 당 절연:

이 연구에서 우리는 마우스 Cpc 반면 쥐 Cpc에서 결과 수정 및 권한 (그림 8)33와 이전 보고서에서 추가 SP 형에 따라 격리를 사용 합니다.

다른 혈 청 농도 높고 낮은 세포 밀도에서 세포 증식:

우리의 이전 연구가 보여주었다 심장 혈통 마커 mRNA 표현 단계를 경작 하는 첫 번째 24 시간에서 변경. 세포 외 매트릭스 내 피 분화35를 포함 한 세포 운명 결정에 영향을 미치는 알려져 있다. Cpc의 내 피 혈통 헌신의 촉진에 대 한 적당 한 조건 탐험, 우리 사용 FN LN (모두 10 µ g/mL) 6 잘 플레이트에 (성장 지역: 9.6 c m2/잘)이이 연구에서. 세포 주기, 세포 운명 결정 밀접 하 게 연결 되어 있기 때문에 우리는 세포 죽음의 부재에서 낮은 세포 확산 속도 전시 하는 조건을 찾고, 같은 조건 분화 세포 증식에서 전환을 반영 될 수 있습니다. 우리는, 따라서, 다음과 같은 조건 적용 하 고 셀 확산 속도 비교: 세포 밀도, 높은 (80%-90%) confluency 및 낮은 (< 60%) confluency, 그리고 혈 청 농도, 일반 문화 조건에 대 한 (이 3.5% 공부 FBS) 및 낮은 혈 청 조건 (≤ %FBS)입니다. 첫째, 우리는 낮은 세포 밀도 조건 테스트. 세포 생존 능력 및 3.5%로 낮은 세포 밀도에 확산의 중요 한 차이가 있었다 LN와 FN, FBS 0.1% 낮은 세포 밀도 FBS 세포 죽음 ( 에에서 증가 하지만 FN에 비해 LN에 감소 세포 증식을 보여준 반면 그림 4). 대조적으로, 조건 하에서 높은 세포 밀도, 혈 청 농도 3.5%와 0.1%의 보여주었다 차이가 세포 증식과 세포 죽음 (그림 5) 두 개의 기판 사이.

이 결과 0.1% 혈 청으로 LN에 낮은 세포 밀도 CPC 생존 능력을 영향을 주지 않고 확산 감소를 나타냅니다.

내 피 분화 매체에서 셀 형태로 변경:

셀 모양에 변화 될 특정 변경으로 적당 한 문화 조건 표시기를 관찰 될 수 있다 초기에는 내 피 문화에 나타납니다 의미와 기본 메커니즘을 이해 하는 연구 더 요구, 비록 차별화 성공 (그림 6) 될 것 이다. 내 피 분화 매체에서 7-14 d 내 그림 6, 흰 점선된 동그라미와 같이 성공적인 문화 큰 되었고 형태학에 있는 다른 셀에 다른 셀을 포함. 흥미롭게도,이 세포 분화 단계의 끝으로 사라졌다 고 또한 낮은 숫자와 나중 시간 시점에 LN 및 FN. 반면 우리 더이 세포 특성화 하지 않았다 고밀도 문화에 등장,이 프로토콜 제안 추적 셀 모양까지 하루 14 주위 모든 2-3 d. 이러한 셀 표시, 시드 셀의 수를 감소 한다.

관 형성 분석 결과와 내 피 능력의 평가:

관 형성 분석 결과 차별화 된 셀의 튜브 대형 용량을 측정 하 여 Cpc의 내 피 분화의 효율성을 평가 하는 유용한 기술입니다. 우리는, 따라서, 설명 된 조건에 따라 분화 하는 세포 관 형성 분석 결과 수행. 흥미롭게도, 성공 관 형성은 지속적으로 표시 셀 낮은 밀도에서 도금 선에 분화 하 여 관 형성은 주로 고밀도 (그림 7A)에 LN에 도금 하는 셀에 실패 하는 반면. 마찬가지로, 관 형성 되지 않았습니다 주로 셀 셀 밀도 관계 없이 FN에 경작에 비록 때때로 낮은 밀도에서 FN에 분화 하는 세포 형성 세포 조건에 따라 기초 튜브 (예를 들어, 격리 및 통로 수, 그림 7B). 확인 하려면 셀의 내 피 자연, 셀 coverslips에 도금 기술된 프로토콜에 따라 분화 되었고 vWF에 대 한 스테인드. 다시, vWF 식 더 균질 이었고 Cpc에서 발음 더 FN (그림 ℃D)에 비해 LN에 분화. 그림 8 여기 쥐 Cpc 동일한 프로토콜을 사용 하 여 이전 연구 수행 관 형성 분석 결과에서 결과 설명33보여줍니다. 이러한 결과 관 형성 FN 낮은 세포 밀도 조건 및 낮은 혈 청으로 도금 하는 경우에 비해 LN에 분화 하는 세포에 더 효율적입니다 (0.1 %FBS) 내 피 분화 매체에 차별화 하기 전에 20-24 h에 대 한. 이 결과 다양 한 셀 형식에 대 한 유용 하 고 종족의 독립이 프로토콜을 수 있는 것이 좋습니다.

Figure 1
그림 1: 특정 격리의 일러스트를 cardiomyocyte 고갈 세포 현 탁 액에서 절연된 마우스 마음 및 대표적인 흐름 심장 sp.의 cytometry 해독 단계 (A)이이 패널 표시를 통해 심장 구멍에서 잔여 혈액의 방출 작은 집게를 사용 하 여 적용 하는 약간의 압력을 반복 합니다. (B)이이 패널 작은 위를 사용 하 여 작은 조각으로 절단 마음을 보여줍니다. (C)이이 패널의 면도날을 사용 하 여 심장 조각 닦지 보여줍니다. (D)이이 패널 37 ° c.에 기울어진된 판에 콜라 B와 다진된 마음의 외피를 보여줍니다. (E)이이 패널 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부 화 단계에서 다진된 마음 균질을 보여줍니다. (F)이이 패널 (노란색) 100 µ m 필터와 소화 되지 않은 조직 잔류물의 제거를 위한 (블루) 40 µ m 필터 cardiomyocytes 통해 소화 조직의 필터링을 보여줍니다. (G)이이 패널 50 mL 원뿔 튜브 cardiomyocyte 고갈 세포 현 탁 액을 포함 하 고 가벼운 보호 Hoechst의 추가 후에 대 한 주석 호 일에 포장의 부드러운 반전을 표시 됩니다. (H)이이 패널에서는 대표적인 흐름 cytometry 판독 Hoechst 얼룩 세포의 존재와 부재 ABC 운송업 자 억제제 verapamil는 sp. ()이이 패널 표시 SP의 대표 점 플롯의 식별에 대 한의 CD31 및 Sca-1 양성 Sca-1+/CD31의 식별에 따라 셀- subfraction. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 심장 SP 정렬로 이어지는 샘플 준비의 도식 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 내 피 혈통 유도 및 차별화에 대 한 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 마우스 SP-CPC 확산 때 LN 및 FN. 다른 혈 청 농도에서 낮은 세포 밀도에서 도금 (A B) 이러한 패널 하루 2에 셀 번호를 표시합니다. (C , D) 이러한 패널 하루 2에서 생존 능력을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM); 뜻의 표시 됩니다. N = 5; 다른 구절; 학생의 t p < 0.05-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 마우스 SP-CPC 확산 때 LN 및 FN. 다른 혈 청 농도에서 높은 세포 밀도에서 도금 (A B) 이러한 패널 하루 2에 셀 번호를 표시합니다. (C D)이이 패널 하루 2에서 생존 능력을 보여줍니다. 데이터 평균 ± SEM; 표시 됩니다. N = 5; 다른 구절입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 14 그리고 17 차별화 과정에서 형태 셀. 이 그림과 밝은 필드 (BF) 마우스 SP Cpc의 이미지 (낮은) 낮은 또는 높은 (높은) 셀 밀도 LN 또는 FN 코팅 요리에 시드와 매체 3 14 또는 17 디 화이트에 대 한 다음 20 h에 대 한 매체 2 파선된 서클 라운드 모양의 셀 재치를 포함 하는 영역 표시 더 큰 셀 크기 h입니다. 영상 밝은 분야 현미경 검사 법으로 수행 되었다. 확대 = 2 X; 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 형성과 vWF SP-Cpc LN 및 FN.의 내 피 분화 후 얼룩 튜브 (A B) 이러한 패널 표시 튜브 형성. (C , D) 이러한 패널 표시 vWF 얼룩. 셀 요리의 LN 또는 FN 코팅 낮은 또는 높은 세포 밀도 매체 2 20 h 10 µ g/mL에 시드, 21 d, 매체 3 순이 고 트립 신으로 수확 되었고 지하실 멤브레인 매트릭스에 시드. 모든 그림 16 h 후 찍은 사진. 밝은 분야 현미경 검사 법 및 확대는 이미징 수행한 = 2 X 패널 AB에 대 한. 형광 현미경 검사 법 및 확대는 이미징 수행 = 10 X 패널 CD. AC 패널 표시 LN 코팅 요리. BD 패널 표시 FN 코팅 요리. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 쥐 Cpc의 내 피 분화 후 대형 튜브. 쥐 Cpc의 LN 또는 FN 코팅 20 h, 매체 3, 또 다른 21 d에 의해 그리고 다음 트립 신으로 수확에 대 한 0.1 %FBS 포함 된 F12 매체와 10 µ g/mL에서 낮은 세포 밀도에 시드 했다. 96 잘 접시에 지하실 멤브레인 매트릭스에 4 x 104 의 세포는 중간 3의 100 μ에 시드 했다. 영상 밝은 분야 현미경 검사 법으로 수행 되었다. 확대 = 2 X; 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림은 이전 연구33에 따라 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

절연, 탐지 마커 참조
인간, 쥐, 마우스 c-키트+/Lin-, c-키트+/CD45-, c-키트+/CD45-/CD31- 벨트 라미, 셀 2003; Bolli, 바소 2011; 엘리슨, 셀 2013; 스미스, Nat Protoc 2014; Vicinanza, 세포 죽음 다 2017
잡종 개 -, 플러스: MDR1 c 키트++ 또는 Sca-1+ 맺고, PNAS 2005
마우스 Sca-1+ 아, PNAS 2003
마우스 사이드 인구, 플러스: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ Hierlihy, FEBS Lett 2002; 마틴, 데 브 Biol 2004 년; Pfister, Circ 입술 2005 년; Noseda, Nat Commun 2015
마우스 콜로 니 형성 단위-섬유, 플러스: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ Pelekanos, 줄기 세포 해상도 2012
마우스, 쥐, 인간 Isl-1+ *, 플러스: CD31-, c-키트-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ Laugwitz, 자연 2005; 부, 자연 2009
* 제도-1는 성인 심장 안에 배아 또는 태아 심근에서 발견 된다.

표 1: 격리 기술 그리고 심장 조상 세포의 표식.

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Discussion

이 프로토콜의 장점:

이 프로토콜에는 Cpc의 내 피 분화 기술을 제공합니다. 우리는 낮은 혈 청 농도 낮은 세포 밀도 내 피 분화, 그것에 의하여 LN 판명 FN이이 조건 하에서 보다 더 적합 한 기판의 효율을 높일 수 발견. 우리가 사용 하는 Cpc의 두 가지 유형: 쥐 Cpc, 셀 라인 같은 방식으로, 및 마우스 SP Cpc에 사용 했다, 분리 하 고 확장 했다. 특히, 프로토콜 모두에 적용 되는 Cpc. 현재의 기술을 분리 하 고 확장 기본 Cpc 유전자 변형된 마우스 및 전 임상 질병 모델에서 뿐만 아니라 인간28,36에서 과학자를 허용. 이 프로토콜을 사용 하 여 격리 된 Cpc에 뿐만 아니라 질병 메커니즘의 수사 뿐만 아니라 소설 치료 대상의 탐험에 도움이 수 있습니다.

Cpc는 현재 임상 테스트 대 한 세포 치료4,5, 그것에 의하여 세포 생체 외에서 증폭 후 환자 및 이식된 등 으로부터 격리 됩니다. 이와 관련, 여기에 제시 된 프로토콜 식별 전략 이식 전에 같은 Cpc의 감 별 법 잠재력 향상을 도울 수 있었다. 그러나, 세포 치료는 여전히 낮은 보존, 생존, 및 engraftment 이식된 세포의 제한 된 효능에서 겪고 있다. 기계적 생체 외에서 연구 또는 그 적응이이 프로토콜에 따라 분화 과정에서 운전 하는 분자 메커니즘을 더 잘 이해에 기여할 잠재력을가지고 특히, 메커니즘 관련 셀 밀도 기판, 및 성장 요인. 이러한 연구에서 검색 하는 새로운 지식은 궁극적으로 셀 프로그래밍에 사용 하 고 부상 후 차별화 하 상주 Cpc 영향을 직접 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜의 한계:

격리 된 기본 Cpc는 같은 마커 기술과 동일한 격리를 사용 하는 경우에 셀 크기 및 셀 성장 율에 따라 격리, 다른 고기를 표시 유형이 다른 인구. 따라서, 다음 세 가지 사항을 정의 해야: 이상적인 혈 청 농도 셀 크기, (2) 숫자 (1) 셀 시드 (< 0.5%), 그리고 (3) 매우 낮은 혈 청 농도와 첫 번째 단계 (혈통의 유도)에 대 한 보육 시간. 여기, 우리가 셀 밀도 따라 분화 효율에 차이 보여줍니다. 그러나, 우리는 낮은 혈 청에 비해 비록 (0.1 %FBS) 문화 혈 청 농도 (3.5 %FBS), 우리는 내 다른 농도 검사 하지 않았다는 < 0.5 %FBS 범위. 또한, 사용 하는 격리 표식 및 종에 따라 리니지 약속의 유도의 효율성은 달라질 수 있습니다. 따라서, 프로토콜은 각 세포 유형에 최적화 되어야 합니다.

약리학 및 유전자 억제/유도 기법이 프로토콜 질병 메커니즘을 검토를 위해 사용 될 수의 대신 유전자 변형 또는 질병 동물 모델. 이 경우에 프로토콜 재설계 되어야 한다: 낮은 혈 청 포함 된 매체와 치료 하기 전에 셀 특정 시 약 또는 유전적 도구로 취급 됩니다. 결과적으로, 세포 nontreated 셀 보다 더 취약 있을 수 있습니다. 첫 번째 단계에서 낮은 혈 청을 사용 하 여이 프로토콜에 핵심 이다. 따라서, 혈 부족에서 생존 능력을 유지 하면서 셀 확산을 둔화에 대 한 허용 하는 첫 단계에 대 한 혈 청 농도 및 부 화 시간 주의 유효성 검사 여부이 프로토콜 수 성공 여부에 중대 하다.

요약:

요약, 동물 모델에서 격리 된 Cpc 심장 질환과 재생 연구에 대 한 유용한 도구를 제공합니다. 확장에 따라 인간의 Cpc 수 있습니다 또한 직접 사용할 세포 치료. 우리, 여기, 효율적인 내 피 혈통 유도 대 한 프로토콜을 제공 하 고 Cpc의 세포 밀도 및 혈 청 농도의 주의 적응에 따라. 이 프로토콜의 장점은 Cpc와의 연구 및 다른 소설 심장 재생 도구의 설립을 위한 기초에 기여할 잠재력의 다른 유형에 그것의 적용.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 실험 및 생물의 약 학과 (DBM), 대학 및 대학 병원 바젤 Flow Cytometry 시설에서 직원 도움이 그녀의 지원에 대 한 베라 로렌스를 감사합니다. 이 작품은 숙박에 트랙 프로그램에 바젤의 대학에서 (Michika 모치즈키) 지원 되었다. 가브리엘라 M. Kuster 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 310030_156953)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL
Thrombin 0.0005 U/mL All necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit All necessary components included in the kit

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References

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