低血清条件下心脏祖细胞内皮分化的诱导作用

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Developmental Biology

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Summary

该方案描述了一种用于心脏祖细胞的内皮分化技术。它特别关注血清浓度和细胞播种密度如何影响内皮分化潜力。

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Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

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Abstract

心脏祖细胞 (cpc) 可能具有损伤后心脏再生的治疗潜力。在成年哺乳动物的心脏, 内在的 cpc 是极其稀缺的, 但扩大的 cpc 可能是有用的细胞治疗。它们使用的一个先决条件是它们能够使用定义和有效的协议以可控的方式区分到各种心脏谱系中。此外, 在体外扩张后, 从患者或临床前疾病模型中分离出的 cpc 可为疾病机制的调查提供富有成效的研究工具。

目前的研究使用不同的标记来识别 cpc。然而, 并不是所有的研究都是在人类身上表达的, 这限制了一些临床前研究的转化影响。无论隔离技术和标记表达如何, 都适用的差异化协议将允许为细胞治疗目的对 cpc 进行标准化扩展和启动。本文描述了在低胎牛血清 (fbs) 浓度和低细胞密度条件下对 cpc 的启动有利于 cpc 的内皮分化. 利用小鼠和大鼠 cpc 的两个不同亚群, 我们表明, 层压蛋白是一种更重要的根据以下协议, 为此目的, 适合基材比纤维连接蛋白: 在培养基中培养 2-3天, 包括维持多效能力的补充剂和3.5% 的 fbs 后, 在层压蛋白上播种 lt;60% 的融合, 并培养在内皮分化培养基分化前20-24小时内, 低浓度 fbs (0.1%) 的无补充培养基。由于 cpc 是异质性人群, 因此可能需要根据各自 cpc 亚群的特性调整血清浓度和培养时间。考虑到这一点, 该技术也可以应用于其他类型的 cpc, 并提供了一个有用的方法来调查的潜力和机制的分化, 以及他们如何受到疾病的影响时, 使用从各自的疾病模型隔离的 cpc。

Introduction

最近的研究支持在成年哺乳动物心脏1,2,3 和 cpc 中存在的常驻心脏祖细胞 (cpc) 可以成为心脏损伤4后细胞治疗的有用来源.5. 此外, 扩大的 cpc 可为药物筛查和调查疾病机制提供一个富有成效的模式, 如果与罕见的心肌病患者或各自的疾病模型6,7分离。

从成人心脏中分离出的 cpc 具有干细胞细胞1238, 因为它们是多能、克隆性的, 具有自我更新的能力。然而, 有许多不同的 (子) cpc 群表现出不同的表面标记特征, 例如, 包括 c-kit、sca-1 等, 或通过不同的隔离技术检索 (表 1)。已经制定了若干文化和差异化协议 1,2,8, 9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18。这些协议在生长因子和血清含量方面的差异主要不同, 这些因素根据培养的目的进行调整, 并可能导致结果和结果的差异, 包括分化效率。

基于标记的隔离技术:

cpc 可以根据特定的表面标记表达式1289101112 13进行隔离,14,15,16,17,18。先前的研究表明, c-kit 和 sca-1 可能是分离居民cpc 1,11,14,19,20的最佳标记。因为这些标记都不是 cpc 的特定标记, 所以通常会应用不同标记的组合。例如, cpc表达的 c-kit 21 含量较低, 而 c-kit 也被其他细胞类型表达, 包括肥大细胞22、内皮细胞23和造血干细胞/祖细胞24。另一个问题是, 并非所有标记都在所有物种中表达。sca-1 的情况就是如此, 它在老鼠身上表达, 但在人类25中不表达。因此, 在临床试验和使用人体样本的研究中, 使用独立于隔离标记的协议可能是有利的。

与标记无关的隔离技术:

cpc 隔离有几种主要技术, 它们主要独立于曲面标记表达式, 但可以根据需要通过连续选择特定标记正亚分来细化 (另见表 1)。(1) 侧群 (sp) 技术最初的特征是原始的造血干细胞群体, 其基础是通过 atp 结合盒 (abc) 载体27排出 dna 染料 hoechst 3334226 的能力.心脏 sp 细胞已被不同的组分离, 并报告表达了各种标记与一些小差异的报告2,8,13, 14。(2) 成集细胞成纤维细胞 (cfu-f) 最初是根据间充质间质细胞 (msc) 样表型定义的。分离的骨髓间充质干细胞在菜肴上培养, 以诱导菌落的形成。这种形成细胞分裂的 msc 样 cfu-f 可以从成人心脏中分离, 并能够分化为心脏谱系15。(3) 心细胞衍生细胞 (cdc) 是由组织活检或外植体 28293031产生的细胞簇衍生的单个细胞。最近发现, cd105+/cd90/ct-kit-细胞部分表现出心肌和再生电位32.

在这里, 我们使用从小鼠身上分离出的 sp-cpc, 根据之前对大鼠 cpc 和小鼠 sp-cpc33的研究, 提供了一种有效诱导内皮谱系的协议。该协议在细胞密度、培养基血清含量和底物方面对培养和扩张技术进行了具体调整。它不仅适用于小鼠 sp-cpc, 也适用于不同类型的 cpc, 目的是诱导命运从放大到内皮承诺的 cpc, 无论是为了移植这些细胞还是用于机械体外研究。

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Protocol

将小鼠用于细胞隔离, 符合《实验动物护理和使用指南》和《瑞士动物保护法》, 并得到瑞士州当局的批准。

注: 从鼠标心脏中分离 sca-1+/ cd31-sp-cpc 基本上是按照前面所述的34进行的, 但做了一些修改。有关所使用的材料和试剂, 请参阅材料表。在所有实验中, 从小鼠身上分离出的心脏 sp-cpc 都被扩增、传代, 并以类似细胞系的方式使用。这项研究使用了7-20 通道。

1. 组织制备

注: 所有使用小鼠的实验都必须按照指南和规定进行。此协议使用四只鼠标。直径为100毫米的培养板被描述为 p100, 直径60毫米的培养板被描述为协议以下部分的 p60。

  1. 向每只老鼠注射 200 mgg/kg 的五巴比妥腹腔内 (即), 并通过检查其对脚趾挤压的反应, 等待完全麻醉。
  2. 用70% 的乙醇擦拭胸部。用剪刀割伤皮肤和胸壁, 露出胸腔。
  3. 用钳子抬起心脏, 用剪刀将心脏切割在底座上。将心脏放入 p100 与25毫升 (5 毫升为 p60) 的冷磷酸盐缓冲盐水 (pbs) (3 至5心脏每 p100 或1至2心脏每 p60)。
  4. 用钳子泵心脏将血液从腔中排出 (图 1a)。
  5. 将心脏放入 p100, 其中25毫升 (p60 为5毫升) 的冷 pbs 用于清洗。用小剪刀取下心房。将心脏切成两片纵向, 然后在冰凉的 pbs 中再次清洗 (25 ml/p100, 5 ml/p60)。
  6. 将这些部件转移到新的 p100 与25毫升 (5 毫升为 p60) 的冷 pbs。用小剪刀把碎片切成小块 (图 1b)。在汉克平衡盐溶液 (hbss) 中加入一滴稀释的 1 mgml 胶原酶 b, 用无菌剃须刀片彻底切碎小块 (图 1c)。

2. 消化

  1. 从步骤1.6 中, 在盘中加入 1 mgml 胶原酶 b 溶液的 10 ml (2.5 ml 为 p60)。
  2. 将含有碎心脏碎片的胶原酶 b 溶液放入37°c 孵化器 (图 1d) 中倾斜 (约 30°) p100 (p60)。
  3. 将碎心块孵化最多 30分钟;在孵育过程中, 每隔10分钟反复通过巴斯德移液器进行同质化 (图 1e)。
    注: 步骤1.3 的孵化时间总共不超过30分钟是很重要的。

3. 过滤

  1. 加入10毫升 (p60 为 p60), 并在碎和均质的心脏块中添加2% 的 fbs。
    注: hbss 补充了 2% fbs 淬火胶原酶 b 活性。
  2. 通过100微米滤镜过滤心脏碎片, 以 470 x的速度去除未消化的组织和离心机, 在室温下 5分钟 (rt) (图 1f, 黄色过滤器)。
  3. 丢弃上清液, 在红细胞裂解缓冲液5毫升 (3 毫升为 p60) 中重新悬浮颗粒, 孵育颗粒 5分钟, 偶尔在冰上晃动。
  4. 加入10毫升 (p60 为 p60 5 ml) (以停止裂解反应), 并通过40μm 过滤器过滤样品, 以排除较大的细胞, 包括残留的心肌细胞 (图 1f, 蓝色过滤器)。
  5. 在 rt (不刹车) 以 470 x g离心管5分钟。丢弃上清液, 在 dmem 1 毫升中重新悬浮颗粒, 包括10% 的 fbs。
  6. 用血细胞计数一下外壁中的细胞。用 dmem (包括 10% fbs) 对细胞进行再利用, 最终细胞浓度为 1 x 106细胞。
    注: 大约每只老鼠可估计 5 x 10 6 血症和红细胞耗尽细胞。
  7. 将细胞分布到两个管中 (图 2): 在a 管中, 添加 1.5 ml, 用于 hoechst 33342 染色, 用维拉帕米染色;在b 管中, 添加18.5 毫升的 hoechst 33342 染色, 并通过流式细胞仪进行染色和排序 (步骤4.1 和 4.2) 心 sp 细胞。

4. 流式细胞仪对心脏 sp 细胞进行分类

注: 维拉帕米通过阻断多药耐药 (mdr) abc 转运体活性来抑制 hoechst 流出物。hoechst 33342 是一种 dna 结合染料, 可用于活细胞检测细胞周期, 因为它与 dna 含量相关。hoechst-33342 挤出细胞出现在两个排放通道的 hoechst 低部分 (450 nm, hoechst blue; 650 nm, hoechst 红色) 中, 即除了保留 hoechst 的 "主要种群" 之外, 使它们得名 "侧面人口"。sp 细胞在具有祖细胞特性的细胞中得到丰富, 并显示出高耐药的 abc 转运体 (如 mdr1 和 abcg2) 的表达。hoechst 33342 是作为 hoechst 编写的协议的以下部分。保护感光材料以获得理想的效果是非常重要的。

  1. 在维拉帕米的存在和不存在下与霍奇被盯上
    1. 在细胞溶液中加入维拉帕米 (最终浓度为83.3 微米) 和 hoechst (最终浓度为 5μg/106细胞)。对于a 管,使用维拉帕米尔和霍奇特;对于b 管,仅使用 hoechst。在水浴中 (37°c) 中孵化 90分钟, 每20分钟恢复一次管道 (图 1g)。
    2. 在 rt 以 470 x克离心管 5分钟, 丢弃上清液, 并在 hbss 中重新悬浮每个颗粒 (1 x10 6 cellsl)。
    3. b 管 ( 图 2) 中选择 1.5 ml 脂肪和负控制: (i) 荧光素异硫氰酸酯 (fitc)-共轭抗 sca-1;(二) 同种异体茶碱 (apc)-共轭抗 cd31;(iii) 非染色细胞 (阴性对照)。
      注: 此处使用等值线控件来设置隔离协议。
    4. 离心管 a 和 b 和单染色和负控制的脂肪在 470 x5分钟在 rt 清洗 hoechst 和维拉帕米。
    5. 丢弃上清液, 重新悬浮管a和 (iii) hbss 250μl 的负控制, 并将其放在黑暗中的冰上, 直到分类。
    6. 在200μl 的 hbss 中重新选择b 管的颗粒和 (i, ii) 在 100μl hbss 中的单染色脂肪颗粒中的颗粒。加入 fitc 共轭抗 sca-1 (0.6μg/107 细胞) 和 apc 共轭反 cd31 (0.25 微克/107 细胞)。在冰上孵化颗粒 30分钟, 并在黑暗中不时摇晃。
    7. 在试管中加入2毫升的 hbss。在 rt 以 470 x离心管5分钟。
    8. 丢弃上清液, 并重新悬浮所有颗粒与1毫升的 hbss 和离心机如上。丢弃上清液。在200μl 的 hbss 中重新选择单染色脂肪的颗粒。在 hbss 中对 b 管颗粒进行再利用 (20 x10 6 细胞)。
    9. 将样品放在冰上, 从光线到分类都要保护。
  2. 流式细胞术中的排序
    1. 制备无菌 1.5 ml 分选管, 含500μl 的 hbss, 包括2% 的 fbs。
    2. 在冰上用 7-氨基放线菌素 d (7-aad) (0.15μg/106细胞) 将细胞染色 10分钟, 以排除死亡细胞。
    3. 使用以下设置对心脏 sp 进行排序: 使用350纳米 (uv) 激励激发 hoechst, 使用450纳米带通滤波器 (hoechst blue) 和 670/30 纳米带通滤波器 (hoechst 红) 收集荧光发射, 并使用100微米大小的喷嘴尺寸和压力15 psi。
    4. 为进行分析, 记录分选样本的 5 x10 5个事件和负对照、维拉帕米尔控制和单染色样本的 1 x10 5个事件。
      注: 心脏 sp 约为 0.5%-2% (图 1h), 但实验室和分离体之间可能有所不同。sca-1+/cd31-分数约为心脏 sp 总数的 1%-11% (图 1 i), 但实验室和分离物之间可能有所不同。sca-1+/cd31-sp-cpc 被编写为 sp-cpc, 用于协议的以下部分.

5. 孤立的 sp-cpc 的初级培养

注: 本协议中使用了三种不同类型的介质。它们被称为中等 1 (根据 noseda等人的说法)8、中2和中 3, 并在材料表中描述了它们的组成。

  1. 在使用前将介质加热1至 37°c, 并将离心机冷却至4°c。在4°c 和 470 x 克条件下离心分选管 6分钟, 并在介质1中重新悬浮电池。
  2. 将细胞放在具有4毫升中等1的透气 p60 盘上。每3d 更换一次培养基, 直到细胞达到 70%-80% 的融合。
    注: 步骤5.2 可能需要大约2-3周。

6. sp-cpc 的扩展和分化

  1. 细胞培养
    1. 培养 3 x 10 5 sp-cpc 在8毫升中等1在 t75 烧瓶。
    2. 在37°c 下, 以5% 的 co2 培养至 70%-80%的融合, 每 2-3 d 更换一次培养基。
      注: 应根据所使用的 cpc 类型、加倍时间和单元格大小修改单元格编号。
  2. 不同血清浓度下的 sp-cpc 生长和生存能力
    1. 在 t75 烧瓶中培养 2-3 d 的 sp-cpc, 其中8毫升为1。小心吸气培养基, 用5毫升的温热 (37°c) hbss 轻轻冲洗。
    2. 在细胞孵化器中使用5毫升的胰蛋白酶 edta 治疗细胞 5分钟, 加入5毫升的培养基1以阻止胰蛋白酶活性, 并将细胞悬浮液转移到15毫升的试管中。
    3. 在 rt 以 470 x离心细胞5分钟。
    4. 在含有不同血清浓度的 p60 菜肴上, 对中1或中 2 (谱系诱导培养基) 和片 2.5x 10 5 sp-cpc 中的细胞进行再利用。
    5. 从步骤6.2.4 的盘子中收集培养基, 将死细胞收集到一个15毫升的管中, 在培养基1或中2中培养 2 d。
    6. 在步骤中6.2.2 胰蛋白酶化粘附细胞, 并将细胞悬浮液收集到步进6.2.5 的15毫升管中。在 rt 以 840 x g 离心细胞5分钟。
    7. 吸收上清液, 加入1毫升的中1或中2进行细胞计数。染色 sp-cpc 与色氨酸蓝 (0.4%) 和计数色氨酸蓝阳性 (死) 和色氨酸蓝阴性 (可行) 细胞。
      注: 细胞活力 (步骤 6.2.7) 是作为色蓝负数相对于总细胞数给出的。
  3. 内皮分化的诱导
    1. 前孔 (6 井) 培养板, 含有10μgml 的层压蛋白 (ln) 或纤维连接蛋白 (fn)。
      1. 用 f12 介质 (或 pbs) 制作含有10μg/ml 的 ln 或 fn 的基板溶液。在每口井中加入2毫升的基板溶液。在37°c 下保持板材30分钟。
      2. 从板材中吸收溶液, 并在每口井中添加2毫升的 pbs, 直到使用为止。
    2. 从6.1.2 的步骤中从细胞中吸血培养基, 用5毫升的温热 (37°c) hbss 轻轻冲洗, 在细胞孵化器中用5毫升的胰蛋白酶-edta 对其进行5分钟的治疗, 加入5毫升培养基1以阻止胰蛋白酶活性, 并将细胞悬浮液转移到15毫升管中。
    3. 在 rt 以 470 x的速度离心细胞 5分钟, 将上清液吸走, 并添加培养基2进行细胞计数。
    4. 种子 8 x 10 4 细胞每口井在涂层板上与3毫升的中等2 , 并保持在 37°c 20-24 h. 将中等3的培养基改为3毫升。
      注: 我们建议在前20-24小时使用含有低血清浓度的培养基, 且不含补充剂。我们建议使用 & lt;60% 细胞融合 (, 步进6.3.4 的细胞数量必须根据细胞大小和生长速度进行调整)。
    5. 培养细胞 21 d, 每 3 d 改变一次培养基。
    6. 用 vonwillebrand 因子 (vwf) 等内皮标记物染色并进行荧光显微镜检查, 以验证分化细胞的内皮特性。
      1. 用1毫升的 pbs 清洗细胞, 并在 rt 将细胞固定在3.7% 的甲醛中2分钟。
      2. 在 ddh2o (或 pbs) 中使用 0.1% triton x 使细胞敏化 30分钟, 并在 rt 用10% 的山羊血清将其阻止1小时。
      3. 在4°c 条件下, 用抗冯·威利布兰德因子抗体 (1:100) 培养细胞48小时
      4. 用1毫升的 pbs 清洗细胞 3倍, 每次10分钟。在黑暗中用亚历克莎?福陆 (1:500) 山羊抗兔二级抗体 (1:500) 在 rt 中培养1小时。
      5. 再次清洗 3倍, 每次 10分钟, 用1毫升的 pbs。用 4 ' 6-二胺-2-苯林多内酯, 盐酸 (dapi; 1:500) 在黑暗中在 rt 中染色细胞细胞核5分钟。
      6. 用1毫升的 pbs 清洗细胞 3倍, 每个细胞5分钟。将电池安装并存放在4°c
        注: 步骤6.1 和6.3 的培养条件 (基板、介质、补充试剂和 fbs 浓度) 如图 3所示。
  4. 管形成试验
    1. 准备一个基底膜基质 (例如, matrigel, 以下称为矩阵) 板。
      1. 在4°c 下连夜解冻矩阵。
      2. 在冰上涂上96孔板, 在冰上涂上100μl 的基体。
        注: 避免矩阵中的任何气泡是很重要的。板材必须涂在冰上, 以避免基体的果冻化。
      3. 将板材保持在 37°c 30分钟。
    2. 从细胞中吸气培养基 (步骤6.3.5 完成后), 用5毫升的温水 (37°c) hbss 轻轻冲洗细胞, 并在细胞孵化器中用胰蛋白酶-edta 对其进行5分钟的治疗。加入培养基3以停止胰蛋白酶活性, 并将细胞悬浮液转移到15毫升管中。
    3. 在 rt 以 470 x离心细胞 5分钟, 将上清液吸升, 加入1毫升的中 3, 轻轻地将移液器离心。
    4. 如果细胞被聚合, 则使用35μm 的单元过滤器对细胞进行筛选。
    5. 在每个基质包覆的井中计数每个基质包覆井中100μl 中等3中的细胞和种子 2 x 10 3 至4 x 10 3 细胞。将板保持在37°c 的细胞孵化器中16小时。
    6. 用2倍放大倍率的明亮场显微镜拍照。
      注: 在不完全胰蛋白酶的情况下, 将胰蛋白酶-edta 的暴露时间延长至最多7-8分钟。

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Representative Results

鼠标 sp-pc 隔离:

在这项研究中, 我们使用了根据 sp 表型分离的小鼠 cpc, 而大鼠 cpc 的结果被修改和添加从以前的报告与许可 (图 8)33

高、低细胞密度和不同血清浓度下的细胞增殖:

我们先前的研究表明, 心脏谱系标记物的 mrna 表达在前24小时培养步骤中发生了变化。众所周知, 细胞外基质影响细胞命运的决定, 包括内皮分化 35.为了探索促进 cpc 内皮谱系承诺的合适条件, 本研究在6孔板上使用了 fn 和 ln (均为 10μg/ml) (生长面积: 9.6 厘米2/井)。由于细胞周期和细胞命运决定是密切相关的, 我们正在寻求在没有细胞死亡的情况下表现出低细胞增殖率的条件, 因为这种情况可能反映了从细胞增殖到分化的过渡。因此, 我们采用了以下条件, 并比较了细胞增殖率: 细胞密度高 (80%-90%) 融合和低 (lt;60%) 融合, 以及血清浓度、正常培养条件 (本研究为 3.5% fbs) 和低血清(≤0.1% fbs)。首先, 我们测试了低细胞密度条件。ln 和 fn 在 fbs 为3.5% 的低细胞密度下, 细胞活力和增殖无显著差异, 而 fbs 为0.1% 的低细胞密度显示, 与 fn 相比, ln 细胞增殖减少, 但细胞死亡没有增加 (图 4)。相反, 在高细胞密度条件下, 血清浓度均为3.5% 和 0.1%, 这两个底物之间的细胞增殖和细胞死亡没有差异 (图 5)。

这些结果表明, 低细胞密度的 ln 与0.1% 的血清减少增殖, 而不影响 cpc 的活力。

内皮分化培养基中细胞形态的变化:

虽然需要进一步的研究来了解其意义和潜在的机制, 但细胞形态的变化似乎是适当培养条件的一个指标, 因为在培养物中, 在培养中, 早期就可以观察到具体的变化, 在培养中, 内皮差异化将是成功的 (图 6)。如图 6中的白色虚线圆圈所示, 在内皮分化培养基中的7-14d 内, 成功的培养物中含有的细胞在形态上与其他细胞的形态更大、不同。有趣的是, 这些细胞在分化阶段快结束时消失, 在 ln 和 fn 的高密度培养中也会出现更低的数量和后期的时间点。每2-3 日跟踪一次细胞形状, 直到第14天左右。如果没有出现这样的细胞, 则应减少播种的细胞数量。

管组法评价血管内皮能力:

管形成法是通过测量分化细胞的管形成能力来评价 cpc 内皮分化效率的一种有用的技术。因此, 我们执行了根据所述条件分化的细胞的管形成试验。有趣的是, 成功的管形成一直表现在低密度的细胞和在 ln 上分化的细胞, 而在高密度的 ln 上镀膜的细胞中, 管的形成大多失败 (图 7a)。同样, 在 fn 上培养的细胞中, 无论细胞密度如何, 在 fn 上培养的细胞大多是不成功的, 尽管在 fn 上低密度分化的细胞有时会形成基本的管, 这取决于细胞条件 (例如, 分离和/或通道号,图 7b)。为了确认细胞的内皮特性, 根据所描述的协议对涂在盖板上的细胞进行了分化, 并对其进行了 vwf 染色。与 fn 相比, vwf 表达在 ln 上的分化 cpc 中更加均匀和明显 (图 7c, d)。图 8显示了在与这里所述的相同协议下使用大鼠 cpc 进行的以前的研究所做的管形成分析的结果。结果表明, 在低细胞密度条件下, 在 ln 上分化的细胞与 fn 相比, 在内皮分化培养基中, 在分化前20-24小时内, 在 ln 上分化的细胞中, 管的形成效率更高。这些结果表明, 该协议可用于各种细胞类型, 不受物种的影响。

Figure 1
图 1: 说明从分离的小鼠心脏获得心肌细胞耗尽细胞悬浮液的具体隔离步骤, 以及心脏 sp 的代表性流式细胞仪读数.(a) 该面板显示通过使用小钳子反复施加轻微压力从心脏腔排出残余血液。(b) 这个面板显示用小剪刀把心脏切割成小块。(c) 此面板显示使用剃须刀片切碎的心脏碎片。(d) 这个面板显示在37°c 倾斜的板中, 用胶原酶 b 孵化碎心。(e) 该面板显示在孵化步骤中使用巴斯德移液器将碎心均质化。(f) 该面板显示通过100μm 过滤器 (黄色) 和40μm 过滤器 (蓝色) 过滤被消化的组织, 以去除未消化的组织残留物和心肌细胞。(g) 该面板显示了一个50毫升的锥形管, 其中含有心肌细胞耗尽细胞悬浮液和包裹在锡箔的温和逆转后, 添加 hoechst。(h) 该面板显示了在 abc 转运体抑制剂维拉帕米存在和不存在的情况下对接触染色细胞进行有代表性的流式细胞术读数, 以识别 sp.细胞根据 cd31 和 sca-1 阳性鉴定 sca-1+/cd31-子分数。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 导致心脏 sp 分类的样品制备原理图概述.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 内皮谱系诱导和分化协议.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 在不同血清浓度下, 在 ln 和 fn 上, 在低细胞密度下电镀时, 小鼠 sp-cpc 增殖.(ab)这些面板显示第2天的单元格编号。(cd)这些面板显示了第二天的可行性。数据显示为均值±的均值 (sem) 的标准误差;n = 5;不同的段落;* p < 0. 5 通过学生的t测试。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 在不同血清浓度下, 在 ln 和 fn 上, 在高细胞密度下电镀时, 小鼠 sp-cpc 增殖.(ab)这些面板显示第2天的单元格编号。(cd) 这些面板显示了第2天的可行性。数据显示为平均± sem;n = 5;不同的段落。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 分化过程中14岁和17d 的细胞形态.此图显示了在 ln 或 fn 涂层盘上播种的小鼠 sp-cpc 的明亮场 (bf) 图像, 这些菜体密度较低 (低) 或较高 (高), 中等2为 20小时, 其次是14或 17 d. 白色虚线圆圈标记含有圆形细胞的区域h 更大的细胞大小。用明亮的场显微镜进行成像。放大倍率 = 2倍;刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 7
图 7: sp-cpc 内皮分化后的肿瘤形成和 vwf 染色.(ab)这些面板显示了管的形成。(cd)这些面板显示 vwf 染色。细胞在 ln 或 fn 包衣培养皿上播种, 细胞密度低或高, 中等2为 20小时, 中等3为 21 d, 然后用胰蛋白酶收获, 并在基底膜基质上播种。所有照片都是在 1 6时以后拍的。用明亮的显微镜进行成像, a 和b面板的放大倍率 = 2倍. 用荧光显微镜进行成像, c 和d面板的放大倍率 = 10倍. 面板 a 和c显示 ln 涂层的菜肴。面板 bd 显示fnd 涂层菜肴。刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 大鼠 cpc 内皮分化后的管形成.大鼠 cpc 在 ln 或 fn 包衣菜肴10μgml 或 fn-bc 包衣菜肴上播种, 含有0.1% 的 fbs 培养基, 为 20小时, 然后在培养基3中再播种 21 d, 然后用胰蛋白酶收获。在96孔板的基底膜基质上, 在培养基3的100μl 中播种 4 x 10 4个细胞.用明亮的场显微镜进行成像。放大倍率 = 2倍;刻度杆 = 50μm。这一数字是根据以前的一项研究33修改的。请点击这里查看此图的较大版本.

物种 隔离、检测标记 参考
人, 老鼠, 老鼠 c-kit+/lin-, c-kit+/cd45-, c-kit+/cd45-/cd31- beltrami, 细胞, 2003年;bolli, lancet 2011;ellison, cell 2013;smith, nat protoc, 2014年;vicinanza, 细胞死亡差异2017
蒙古狗 -,加: c-kit+, mdr1+或 sca-1+ 林克, pnas 2005
鼠标 sc-1+ 哦, pnas 2003
鼠标 侧面群, 加上: abcg2+, sca-1+/cd31-, sca-1+/pdgfra+ hierlihy, febs lett, 2002年;martin, dev biol, 2004年;pfister, circ es 2005;Noseda, nat commun 2015
鼠标 形成单位成纤维细胞的群体, 加上: cd45-, cd31-, sca-1+, pdgfra+ pelekanos, 干细胞 es 2012
老鼠, 老鼠, 人 isl-1+ *, 加上: c-kit-, c-kit-,sca-1-, gata4+, nkx2.5+ Laugwitz, 《自然》 2005年;bu, 自然2009
* is-1 存在于胚胎或胎儿心肌中, 而不是在成人心脏中。

表 1: 心脏祖细胞的分离技术和标记。

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Discussion

本协议的优点:

该方案提供了一种 cpc 的内皮分化技术。我们发现, 低血清浓度和低细胞密度可以提高内皮分化的效率, 从而在这些条件下, ln 被证明是比 fn 更合适的底物。我们使用了两种不同类型的 cpc: 以类似细胞的方式使用的大鼠 cpc 和被隔离和扩展的小鼠 sp-cpc。值得注意的是, 该协议适用于这两种 cpc, 目前的技术使科学家能够从转基因小鼠和临床前疾病模型以及人类28,36中分离和扩大初级 cpc。在孤立的 cpc 上使用该方案, 不仅有助于疾病机制的研究, 而且有助于探索新的治疗靶点。

cpc 目前正在进行细胞治疗 4,5的临床试验,通过这种试验, 细胞从患者身上分离并在体外扩增后移植回来。在这方面, 这里介绍的议定书可以帮助确定战略, 以提高这种 cpc 在移植前的分化潜力。然而, 细胞治疗仍然受到有限的疗效, 由于低保留, 生存, 和移植细胞的植入。基于该协议或其适应性的体外力学研究有可能有助于更好地了解推动分化过程的分子机制, 特别是与细胞密度有关的机制、基板和生长因子。从这些研究中获得的新知识最终可用于细胞重新编程, 并应用于直接影响住院 cpc 在损伤后的鉴别。

本协议的限制:

隔离的初级 cpc 是异质人群, 根据隔离程度的不同, 即使使用相同的标记和相同的隔离技术, 它们在细胞大小和细胞生长速率方面也表现出不同的表型。因此, 需要确定以下三点: (1) 根据细胞大小的细胞播种数, (2) 理想的血清浓度 (lt;0.5%), (3) 血清浓度非常低的第一步 (引系) 的孵化时间。在这里, 我们显示了不同的细胞密度的分化效率的差异。然而, 尽管我们比较了低血清 (0.1% fbs)培养血清浓度 (3.5% fbs), 但我们没有检查 & lt;0.5 fbs 范围内的其他浓度。此外, 根据所使用的隔离标记和物种, 诱导血统承诺的效率可能会有所不同。因此, 应针对每个单元类型优化协议。

药物和遗传抑制/诱导技术可用于使用该方案检查疾病机制, 而不是转基因或疾病动物模型。在这种情况下, 应重新设计协议: 在使用含有低血清的介质治疗之前, 将使用特定的试剂或遗传工具对细胞进行治疗。因此, 这些细胞可能比未经处理的细胞更容易受到伤害。在第一步使用低血清是本方案的关键。因此, 仔细验证血清浓度和孵化时间的第一步, 以便减缓细胞增殖, 同时保持血清缺乏活力, 这对于该协议能否成功至关重要。

总结:

总之, 从动物模型中分离出的 cpc 为心脏病和再生研究提供了宝贵的工具。扩张后, 人类 cpc 也可直接用于细胞治疗。在这里, 我们提供了一个基于仔细适应细胞密度和血清浓度的 cpc 高效内皮系诱导和分化的协议。该协议的优点是它适用于不同类型的 cpc, 并有可能为研究和/或建立其他新的心脏再生工具提供基础。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢 vera lorenz 在实验期间提供的有益支持, 并感谢来自巴塞尔大学和大学医院的流式细胞术设施的工作人员。这项工作得到了巴塞尔大学 (到 michika mochizuki) 的 "固定轨道" 项目的支持。gabriela m. kuster 得到瑞士国家科学基金会赠款的支持 (赠款编号 310030 _ 156953)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL
Thrombin 0.0005 U/mL All necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit All necessary components included in the kit

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References

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  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530, (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107, (2), 255 (2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
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