低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

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Developmental Biology

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Summary

このプロトコルでは、心臓前駆細胞の内皮への分化技術について説明します。特に、血清濃度と細胞播種密度が内皮細胞の分化に及ぼす影響について焦点を当てています。

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Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

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Abstract

心臓前駆細胞 (CPCs) 外傷後心臓再生治療の可能性があります。大人の哺乳類の心臓で本質的な単価が極端に乏しいが拡張クリック単価は細胞治療の役に立つかもしれない。使用するための前提条件は、制御された方法で定義され、効率的なプロトコルを使用して様々 な心臓系統に分化する能力です。さらに、体外の拡大、患者から分離されたクリック単価または臨床病モデル疾患のメカニズムの調査のため有益な研究ツールを提供するかもしれない。

現在の研究では、クリック単価を識別するために異なるマーカーを使用します。しかし、それらのすべてはいくつかの臨床研究の橋渡しの影響を制限する人間で表現されます。標準化された拡張と細胞療法の目的のためのクリック単価のプライミングの分離技術とマーカーの発現に関係なく適用される微分のプロトコルになります。ここで述べる低ウシ胎児血清 (FBS) 濃度と低細胞密度条件下でクリック単価のプライミング マウスおよびラットのクリック単価の 2 つの異なる集団を使用してクリック単価の内皮への分化を促進、そのラミニンはよりことを示す次のプロトコルの下でこの目的のためフィブロネクチンより適当な基板: FBS、クリック単価をにおけるラミニンのシードの率を維持するサプリメントを含む培地で 2-3 日培養後と 3.5% < 60% 合流と培養政府短期証券 (0.1%) の内皮への分化培地で分化する前に 20-24 時間低濃度サプリメント自由な媒体。クリック単価は異種集団なので血清濃度とインキュベーション時間はそれぞれクリック単価個体の特性に応じて調整する必要があります。これを考慮し技術は同様にクリック単価の他のタイプに適用できる可能性とそれぞれ疾患モデルから分離されたクリック単価を使用する場合、どのようには病気によって影響と分化のメカニズムを検討する有用な方法を提供しています。

Introduction

最近の研究は大人の哺乳類心臓1,2,3居住者心臓前駆細胞 (クリック単価) の存在をサポートし、単価後心臓傷害4,細胞療法の有用な源になりうる5します。 さらに、拡張クリック単価が薬剤スクリーニングの有益なモデルを提供する、67モデルのまれな心筋症患者やそれぞれの病気から分離したときの疾病のメカニズムの調査研究。

成人の心臓から分離されたクリック単価が幹細胞/前駆細胞特性1,2,3,8を所有している彼らは、多能性、クローン、自己複製の能力を持っているとします。ただし、単価の異なる表面マーカー プロファイルを含む、たとえば、c キット、Sca 1、および他を展示または別の分離テクニック (表 1) によって取得の多くの異なる (サブ) 集団があります。いくつかの文化および分化のプロトコルが確立された1,2,8,9,1011,12をされています。 13,14,15,16,17,18。これらのプロトコルは、主に対して、成長因子と血清量、培養の目的に応じて調整して、結果と分化効率を含む成果の違いにつながることができる変化します。

マーカーに基づく分離技術:

クリック単価は、特異的表面マーカー式1,2,8,9,1011,12,13 に基づいて分離することができます。、14,15,16,17,18。以前の研究では、c キットと Sca 1 に常駐単価1,11,14,19,20を分離する最高のマーカーをかもしれないことを示唆しています。これらのマーカーのどれもが本当にクリック単価の特定、別のマーカーの組み合わせが通常適用されます。たとえば、クリック単価は、c キット21の低レベルを表現するのに対し c キットはまた22マスト細胞、血管内皮細胞23、および造血幹細胞/前駆細胞24を含む他の細胞型で表されます。その他の問題は、いないすべてのマーカーがすべての種の間で表されること事実です。これは、Sca 1、マウスではなく、人間25を表現するためのケースです。したがって、分離マーカーに依存しないプロトコルを使用した臨床試験やひと試料を用いた研究の観点から有利であるかもしれません。

マーカーに依存しない分離手法:

表面マーカー式の主に独立系であるが、これは、特定のマーカー陽性の亜分画の連続選択が (表 1を参照してください) を必要に応じてに洗練、CPC 分離のいくつかの主要な技法があります。(1) サイドの人口 (SP) 技術はもともと造血幹細胞による流出 DNA 色素ヘキスト 3334226機能 ATP 結合カセット (ABC) トランスポーター27の原始的な人口で特徴づけられています。心臓 SP 細胞は異なるグループによって分離されさまざまなレポート2,8,13,14のいくつかのマイナーな違いを使用してマーカーを表現する報告します。(2) コロニー形成線維芽細胞 (CFU Fs) もともと上で定義されたベース間葉系間質細胞 (MSC)-表現のような。コロニー形成を誘導するために料理に分離 MSCs を培養しています。このような MSC のような CFU Fs のコロニー形成は大人の心から分離できるので、心臓系統15に区別することができます。(組織生検から育つセルのクラスターから得られる単一のセルまたは28,29,30,31を外植体 3) 丹治派生セル (CDC)。主に CD105 最近示された+/CD90 cardiomyogenic と再生の潜在的な32-/c-kit-細胞画分を展示します。

ここで、マウスから隔離された SP クリック単価を使用して、クリック単価ラット、マウス SP 単価33の以前の研究に基づく内皮細胞系列の効率的な誘導プロトコルを提供します。プロトコルには、特定文化適応と拡張法細胞密度に対して、媒体、及び基板の血清量が含まれています。それはマウス SP 単価だけでなく、適用することができますが、内皮コミットのクリック単価を増幅するから運命のスイッチを誘発する目的のためのクリック単価の種類は、これらの細胞やその機構の in vitro研究用の移植の観点からします。

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Protocol

細胞分離目的でマウスの使用スイスの動物保護法とケアと実験動物の使用のためのガイドに従ってされ、スイスのカントン当局によって承認されました。

注: Sca 1+/CD31 の分離-マウスの心臓から SP 単価本質的として行われていたいくつかの変更と前述の34 。材料および使用試薬、材料表を参照してください。すべての実験マウスから分離した心臓の SP クリック単価が増幅、継代、および細胞ラインのような方法で使用されます。7-20 の通路は、この研究に使われました。

1. ティッシュの準備

注: マウスを使用してすべての実験遂行されなければならないガイドラインや規制によると。このプロトコルは、4 個のマウスを使用します。直径 100 mm 培養皿は P100 と呼ばれ、直径 60 mm は、培養皿のプロトコルの次の部分の P60 として記述されます。

  1. 200 mg/kg のペントバルビ タールを各マウスに腹腔内注入 (i. p.)、それは完全に摘心をつま先への応答を確認することによって麻酔まで待ちます。
  2. 70% エタノールで胸を拭いてください。皮膚や胸壁を胸腔内を公開するハサミでカットします。
  3. ピンセットで中心を持ち上げ、はさみを使用してベースでカットします。冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (P100 あたり 3 〜 5 心) または P60 あたり 1 ~ 2 心の 25 mL (P60 の 5 mL) と P100 の心を置きます。
  4. 虫歯 (図 1 a) から血を取り出すに鉗子で心臓をポンプします。
  5. 洗浄用冷 PBS の 25 mL (P60 の 5 mL) と P100 の心を置きます。小さなはさみを使用して心房を削除します。2 つの縦の部分に心をカットし、氷冷 PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60) でもう一度洗いましょう。
  6. 25 mL (P60 の 5 mL) の冷 PBS と新しい P100 に作品を転送します。小さいはさみ (図 1 b) を使用してより小さな部分に部分をカットします。1 mg/mL コラゲナーゼ ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) で希釈した B のドロップを追加し、剃刀 (図 1) で徹底的に小片をミンチします。

2. 消化

  1. 1.6 のステップから皿に 1 mg/mL のコラゲナーゼ B 溶液の 10 mL (P60 の 2.5 mL) を追加します。
  2. コラゲナーゼ B 液 (約 30 °) の傾斜でみじん切りにした中心部分を入れて P100 (または P60) 37 ° C の定温器 (図 1)。
  3. みじん切りにした心最大 30 分の小品を孵化させなさい繰り返しにすべて 10 分パスツール ピペットを孵化 (図 1E) の間にそれらを渡すことによって均質化します。
    注: 手順 1.3 の合計のインキュベーションの 30 分を超えないようにすることが重要です。

3. ろ過

  1. 2% を添加した冷たい HBSS の 10 mL (P60 の 5 mL) を追加みじん切りと均質化の中心部分に FBS。
    注: HBSS 2 %fbs 渇きコラゲナーゼ B を添加しました。
  2. 未消化の組織と 470 × gで遠心する部屋の温度 (RT) (図 1 階、黄色フィルター) で 5 分間を削除する 100 μ m のフィルターを通しての心の部分をフィルターします。
  3. 上澄みを廃棄し、赤血球細胞換散バッファーの 5 mL (P60 の 3 mL) でペレットを再懸濁します時折揺れ氷の上で 5 分のペレットを孵化させなさい。
  4. (溶解反応を停止) する PBS の 10 mL (P60 の 5 mL) を追加し、残存心筋細胞 (図 1 f、青のフィルター) を含むより大きい細胞を除外する 40 μ m のフィルターを通してサンプルをフィルターします。
  5. (ブレーキ無) 常温 5 分 470 x gでチューブを遠心します。上澄みを廃棄し、10% を含む DMEM の 1 mL にペレットを再懸濁します FBS。
  6. 診断と因数のセルをカウントします。10% を含む DMEM に細胞を再懸濁します FBS、1 x 106セル/mL の最終的な細胞濃度を目指してします。
    注: 約 5 × 106心筋細胞と赤血球減らさセルをマウスあたり推定できます。
  7. 2 つの管 (図 2) にセルを配布:管 A、ヘキスト 33342 染色ベラパミル; 1.5 mL を追加チューブ Bのヘキスト 33342 染色 18.5 mL を追加し、染色やフローサイトメトリーによる (手順 4.1 と 4.2) 心臓 SP セルを並べ替えるに進みます。

4. フローサイトメトリーによる心臓 SP 細胞の並べ替え

注: ベラパミルは、多剤耐性 (MDR) ABC トランスポーターの活性をブロックすることによってヘキスト流出を抑制します。Hoechst 33342 は DNA 結合色素細胞内 DNA 量と相関するそれとして細胞周期を検出する使用できます。ヘキスト 33342 押し出しセル両方放出チャネルのヘキストの低い部分に表示 (450 nm、ヘキスト ブルー; 650 nm、ヘキスト ・赤)、ヘキスト-保持「主な人口」、その名前「側人口」を与えての脇は、。SP 細胞性前駆細胞で濃縮され、(MDR1 と ABCG2) などの多剤耐性の ABC トランスポーターの高発現を示します。Hoechst 33342 はプロトコルの次の部分のヘキストとして書き込まれます。理想的な結果を得るのための光に敏感な材料を保護するために重要です。

  1. ベラパミルの有無でヘキスト染色
    1. 携帯ソリューション (83.3 μ M の最終的な集中) とベラパミルとヘキスト (最終濃度 5 μ g/106セル) を追加します。チューブ A、ベラパミルとヘキスト; を使用します。チューブ B、ヘキストをのみ使用します。90 分 (37 ° C) で水浴の孵化し、チューブ 20 分毎に (図 1) を元に戻します。
    2. 破棄した上清で 5 分間 470 x gでチューブを遠心し、HBSS (1 x 10 の6セル/mL) でペレットを再懸濁します。
    3. 単一の染色、ネガティブ コントロールチューブ B (図 2) からの分注 1.5 mL を取る: (i) かに (FITC)-共役アンチ-Sca-1;(ii) アロフィコシアニン (APC)-共役アンチ CD31;(iii) nonstained 細胞 (マイナス コントロール)。
      注: アイソタイプ コントロールを使用ここで隔離のプロトコルを設定するため。
    4. 遠心分離機と RT で 5 分間 470 x gで単一染色およびネガティブ コントロール因数のヘキストとベラパミルを洗浄するため。
    5. 上澄みを廃棄し、管 A及び (iii) HBSS の 250 μ L のネガティブ コントロールのペレットを再懸濁します並べ替えまで暗闇の中で氷の上にそれらを保ちます。
    6. 再懸濁しますチューブ Bのペレット HBSS の 200 μ L と (i、ii) ペレット HBSS の 100 μ L の単一染色因数。FITC 結合抗-Sca-1 (0.6 μ g/107セル) と APC 共役アンチ CD31 (0.25 μ g/107セル) を追加します。氷の上で 30 分間ペレットを孵化させなさい、時から暗闇の中でそれらを振る。
    7. チューブに HBSS の 2 mL を追加します。室温 5 分 470 x gでチューブを遠心分離します。
    8. 上澄みを廃棄し、HBSS の上として遠心 1 ml すべてペレットを再懸濁します。培養上清を捨てます。HBSS の 200 μ L で単一染色因数のペレットを再懸濁します。HBSS (20 × 10 の6セル/mL) にチューブ Bのペレットを再懸濁します。
    9. 氷のサンプルを維持し、選別までの光から保護します。
  2. フローサイトメトリーによる並べ替え
    1. 滅菌 1.5 mL 500 μ L 2% を含む HBSS のチューブを並べ替えを準備政府短期証券。
    2. 死んだ細胞を除外する 10 分間氷の上 7 aminoactinomycin D (7 AAD) (0.15 μ g/106細胞) の細胞を染色します。
    3. 次の設定を使用して心臓の SP を並べ替える: 350 nm (紫外線) 励起を使用してヘキストをエキサイト 450/50 nm バンドパス フィルター (ヘキスト ・青) と 670/30 nm バンドパス フィルター (ヘキスト ・ レッド)、蛍光性の放出を収集し、ノズル径は 100 μ m との圧力を使用15 psi。
    4. 分析のため並べ替えのサンプル 5 x 105イベントとネガティブ コントロール、ベラパミルの制御、およびシングル染色の 1 x 10 の5イベントを記録のサンプル。
      注意: SP は約 0.5% - 心臓 2% (図 1 H) であるが、研究所および隔離集団の間で変わる。Sca 1+/CD31-の割合は約 1% の合計心臓 SP (図 1I) の 11% が研究所と分離株の間に異なる場合があります。Sca 1+/CD31- SP クリック単価は、SP - プロトコルの次の部分のクリック単価として書き込まれます。

5. 培養分離 SP 単価

注: 3 つの異なる種類のメディアは、このプロトコルで使用されました。(Noseda) によると中の 1 として呼ばれます8中 2 と中 3 はその組成に関する材料の表に記載されています。

  1. 媒体を使用する前に 1 に 37 ° C をウォーム アップし、4 ° C に冷却4 ° C および 470 x g 6 分で並べ替えのチューブを遠心し、中 1 の細胞を再懸濁します。
  2. 中 1 の 4 ml ガス透過性 P60 皿の上のセルを置きます。セルが 70-80% の合流点に達するまでは、媒体ごとの 3 d を変更します。
    注: ステップ 5.2 は約 2-3 週間かかります。

6. 拡張と SP クリック単価の分化

  1. 細胞培養
    1. 3 x 105 8 T75 フラスコで培地 1 mL SP クリック単価の文化.
    2. SP クリック単価を 5% CO2と 37 ° C で 70-80% の合流点、媒体ごとの 2-3 d を変更するまでインキュベートします。
      注: セルの数は、使用単価の種類、倍加時間とセル サイズに従って修正されるべき。
  2. SP のクリック単価の成長と異なる血清濃度下での生存率
    1. 文化の SP-クリック単価 8 ml 中 1 の T75 フラスコ 2 3 d。慎重に培地を吸引し、暖かい (37 ° C) HBSS の 5 mL で軽くすすいでください。
    2. 5 ml のトリプシン-EDTA のセル インキュベーターで 5 分のセルを扱うトリプシン処理を停止する中 1 の 5 mL を追加し、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。
    3. 470 x g室温に 5 分で細胞を遠心分離します。
    4. 中 1 中 2 (リネージュ誘導培地) やプレート 2.5 x 105 SP-クリック単価の異なる血清を含む培地 3 ml P60 料理に細胞を再懸濁します。
    5. 中 1 か中 2 で養殖の 2 d の後ステップ 6.2.4 15 mL チューブに死んだ細胞のコレクションのための皿から媒体を収集します。
    6. 6.2.2 の手順と付着性のセルを trypsinize し、ステップ 6.2.5 15 mL のチューブに細胞懸濁液を収集します。840 x g室温に 5 分で細胞を遠心分離します。
    7. 上清を吸引し、1 mL 中 1 か中 2 のセルをカウントするを追加します。SP-クリック単価トリパン ブルー (0.4%) とカウント トリパン ブルー陽性 (死んだ) とトリパン ブルー陰性 (実行可能な) 細胞を染色します。
      注: セル実行可能性 (ステップ 6.2.7) は総細胞数との相対トリパン ブルー負のセル数として与えられます。
  3. 内皮への分化の誘導
    1. ラミニン (LN), フィブロネクチン (FN) の 10 μ G/ml (6 ウェル) 培養プレートをプレコートします。
      1. LN または FN の 10 μ G/ml F12 媒体 (または PBS) を含む基板の解決を確認します。基質溶液 2 mL を各ウェルに加えます。37 ° C で 30 分間プレートを維持します。
      2. プレートから洗浄液を吸引し、それを使用してまで各ウェルに 2 mL の PBS を追加します。
    2. ステップ 6.1.2 から細胞から培地を吸引、優しく暖かい (37 ° C) HBSS の 5 mL で洗浄し、細胞のインキュベーターで 5 分トリプシン-EDTA の 5 mL とそれらを扱う、トリプシン処理を停止する中 1 の 5 mL を追加し、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送します。
    3. 470 x g吸引した上清を 5 分で細胞を遠心し、細胞数の中 2 を追加します。
    4. シード 8 × 104セルあたり 3 ml 中 2 のコーティング プレートによく 3 培地 3 mL に 20-24 変更媒体のための 37 ° C で保管してください。
      注: 低血清を含む培地を使用してお勧め-サプリメントなし -最初の 20-24 時間。使用を推奨します < 60% セル合流 (すなわち、ステップ 6.3.4 のセル数はセルのサイズと成長率に応じて調整する)。
    5. 21 d 細胞の培養、培地ごとの 3 d を変更します。
    6. フォンヴィレブランドなど血管内皮マーカーとそれらの汚損によって分化した細胞の内皮細胞の性質を確認因子 (vWF) と実行する蛍光顕微鏡。
      1. 1 ml の PBS のセルを洗浄し、右で 2 分間 3.7% ホルムアルデヒドのセルを修復します。
      2. 0.1% トリトン X ddH2O (または PBS) で 30 分でセルを permeabilize し、ブロックは、室温 1 時間 10% ヤギ血清
      3. 抗 von Willebrand 因子抗体 (1: 100) 4 ° C で 48 時間で細胞をインキュベートします。
      4. 3 セルを洗って 10 分たびに 1 mL の PBS、x。暗闇の中で常温に 1 時間は、Alexa Fluor 546 ヤギ抗うさぎ二次抗体 (1: 500) とそれらを孵化させなさい。
      5. 洗って再び 3 倍、10 分の 1 ml の PBS の。暗闇の中で常温の 5 分の 4'6-diamidino-2-phenylindole、塩酸 (DAPI; 1: 500) と細胞核を染色します。
      6. 洗浄セル 3 x、5 分ごとに、1 ml の PBS の。セルをマウントし、4 ° C で保存
        注: 手順 6.1 と 6.3 の培養条件 (基板、媒体、補足的な試薬、FBS 濃度) は図 3のとおりです。
  4. 管形成アッセイ
    1. 基底膜マトリックス (例えばマトリゲル、今後マトリックスと呼ばれる) を準備板。
      1. 4 ° C で行列を一晩解凍します。
      2. 氷の上のマトリックスの 100 μ L で 96 ウェル プレートをコートします。
        注: マトリックス内のすべての泡を避けるために重要です。プレートはマトリックスの jellification を避けるために氷の上にコーティングする必要があります。
      3. 30 分の 37 ° C でプレートを維持します。
    2. (ステップ 6.3.5 の完了) 後細胞から培地を吸引、優しくリンス暖かい (37 ° C) HBSS、5 mL の細胞と細胞のインキュベーターで 5 分トリプシン-EDTA とそれらを扱います。トリプシン処理を停止し、15 mL チューブに細胞懸濁液を転送中 3 を追加します。
    3. 470 x g吸引した上清を 5 分で細胞を遠心分離機、優しく中 3 のピペット 1 mL を追加します。
    4. セルの集計の場合は、35 μ m の細胞ストレーナー付けセルを抽出します。
    5. セルをカウントでマトリックス コートもそれぞれで中 3 の 100 μ L の 4 x 103セルに 2 x 103をシードします。37 ° c 16 h のため細胞のインキュベーターでプレートを維持します。
    6. 2 倍の倍率に明視野顕微鏡で写真を撮る。
      注: 場合、不完全な trypsinization トリプシン-EDTA を最大 7-8 分の露光時間を長引かせます。

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Representative Results

マウスのクリック単価 SP 分離:

本研究ではラット単価から結果を変更およびアクセス許可 (図 8)33で以前のレポートから追加に対し SP 表現型によると分離されたマウスのクリック単価を使用しました。

細胞増殖の血清濃度と高、低細胞密度の下で:

私たちの以前の研究は、心臓系統のマーカーの発現が養殖のステップ最初の 24 時間以内に変更されたことを示した。細胞外マトリックス内皮への分化35を含む、細胞運命の決定に影響を与えることが知られています。クリック単価の内皮細胞系列の責任の円滑化に適した条件を探索する 6 ウェル プレートで FN と LN (両方 10 μ G/ml) を使用私たち (成長分野: 9.6 cm2/ウェル) 本研究で。細胞周期と細胞の運命決定は密接にリンクしているため細胞死の不在で低細胞増殖率を示す条件を求めているなどの条件は細胞増殖から分化への移行を反映可能性があります。我々 は、したがって、次の条件を適用し、細胞増殖率を比較: 細胞密度、(80%-90%) 高密度、低 (< 60%) 合流と血清濃度は、通常の培養条件 (この研究 3.5 %fbs) および低血清条件 (0.1 %fbs)。まず、低細胞密度条件をテストしました。3.5% の低細胞密度における増殖と細胞生存率の有意差がない LN と FN の FBS 0.1% と低細胞密度 FBS LN 細胞死 (の増加はありませんが、FN と比較して減少し細胞増殖を示したに対し図 4)。対照的に、高い細胞密度条件下で血清濃度 3.5% と 0.1% を示さなかった違い細胞増殖と細胞死 (図 5) の 2 枚の基板間。

0.1% 血清と LN 低細胞密度が CPC 生存率に影響を与えることがなく増殖を減少させることが示唆されました。

内皮への分化中細胞の形の変化:

意義と基になるメカニズムを理解するための研究をさらに必要とする、細胞の形の変化が表れる特定の変更として適切な培養条件の指標で観察できる早い段階で血管内皮の文化差別化は成功した (図 6) をするつもりです。内皮への分化培地で 7-14 d 内図 6、白破線の円で示すように、成功した文化に大きなされ、他の細胞への形態の違い、細胞が含まれています。興味深いことに、これらの細胞は、分化段階の終わりに向かって姿を消したし、また低い数字で LN と FN. 一方我々 はさらにこれらの細胞を特徴付けるかない高密度培養後の時点で登場、この議定書が示しています。14 日目頃までには、すべて 2-3 d の細胞の形を追跡します。そのような細胞が表示されない場合は、播種された細胞の数を下げる必要があります。

管形成アッセイと血管内皮機能の評価:

管形成アッセイは、分化した細胞の管の形成能力を測定することによりクリック単価の内皮への分化の効率を評価する役に立つ手法です。我々 は、したがって、説明されている条件に従って分化した細胞と管形成アッセイを実行しました。興味深いことに、管形成は主細胞高密度 (図 7 a) LN のメッキに失敗したに対し成功管形成が一貫して低密度でメッキし、LN に区別される細胞によって示されました。同様に、管形成できなかった主細胞の密度に関係なく FN の無血清培養細胞で時々 低密度で FN の分化した細胞形式ですが初歩的なチューブ ・ セルの状態によって (例えば、分離および/または通路番号、図 7 b)。内皮細胞の性質を確認するには、細胞 coverslips にメッキされた記述のプロトコルに従って区別し、vWF の染色しました。もう一度、vWF 式より均一な FN (図 7d) と比較して LN の区別よりクリック単価で顕著。管形成アッセイとしてここに同じプロトコルの下でラットのクリック単価を使った過去の研究の実行からの結果説明33図 8に示します。管形成の低血清と低細胞密度条件下でのめっき時の FN と比較して LN に分化した細胞はより効率的なこれらの結果を表示 (0.1 %fbs) 内皮細胞分化培地の分化の前に 20-24 時間。このプロトコルは様々 な細胞のタイプに便利と種の独立したかもしれないことが示唆されました。

Figure 1
図 1: 心臓 SP フローサイトメトリー リードアウト マウス単離の心と代表的な流れから心筋細胞枯渇細胞懸濁液を取得する手順を特定の分離のイラスト(A) このパネルを介して心腔から残留血液の駆出を繰り返す小さな鉗子を使用して適用されたわずかな圧力を示しています。(B) このパネルは、小さなはさみを使用して小さな断片に心のカットを示しています。(C) このパネルは、かみそりの刃を使用して心臓の部分のミンチを示しています。(D) このパネルは、37 ° C で傾斜平板コラゲナーゼ B とみじん切りにした心のインキュベーション(E) このパネルは、インキュベーション段階パスツール ピペットを使用してみじん切りにした心の均質化を示しています。(F) このパネルは、100 μ m のフィルター (黄色) と未消化の組織残留物を除去するため (青) 40 μ m フィルターと心筋細胞を介して消化組織のフィルタ リングを示しています。(G) このパネルは 50 mL の円錐管心筋細胞枯渇細胞懸濁液を含むし、ヘキストの付加の後の軽い保護のスズ箔にラップの穏やかな反転を示しています。(H) このパネルはこのパネルは、SP の代表的なドット プロットを示しています () SP の識別のため ABC トランスポーター阻害剤ベラパミルの有無でヘキスト染色性細胞のフローサイトメトリー読み出し代表フローを示しますCD31 と Sca 1 陽性 Sca 1+/CD31 の同定によると細胞画分-この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 心臓 SP 並べ替えに至るまでサンプル準備の概要この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 内皮細胞系列の誘導と分化のためのプロトコルこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: マウス SP のクリック単価増殖 LN と FN. 血清濃度下低細胞密度でメッキと(AB)これらのパネルは、2 日目で携帯電話番号を表示します。(CD)これらのパネルは、2 日目で生存率を示しています。データは平均 ± として (SEM); 平均値の標準誤差が表示されます。N = 5;別の通路;p < 0.05 学生のt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: マウス SP のクリック単価増殖 LN と FN. 血清濃度条件下高細胞密度でメッキと(AB)これらのパネルは、2 日目で携帯電話番号を表示します。(CD)、これらのパネルは、2 日目で生存率を表示します。データは平均 ± として示されている SEM;N = 5;別の通路。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 14 と 17 分化過程 d 形態のセルします。この図は、マウス SP クリック単価の画像は低 (低) や高 (高) セル密度と LN または FN コーティング皿にシードし、続いて中 3 14 や 17 d ホワイト 20 h の中 2 の破線の円マーク円形細胞のウィットを含む領域に明るいフィールド (BF) を示していますh より大きなセル サイズ。明視野顕微鏡とイメージングを行った。倍率 = 2 X;スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: チューブの形成と vWF LN と FN. SP 単価の内皮への分化後染色(AB)これらのパネルは、管形成を示します。(CD)これらのパネルは、vWF の染色を示します。セルが LN または FN コーティング低または高細胞密度と中 2 の料理 20 h の 10 μ G/ml でシード、21 d 中 3 に続くトリプシン収穫し、基底膜マトリックスでシードします。すべての写真は、16 時間後に撮影されました。明視野顕微鏡倍率とイメージングを行ったパネルABの 2 X を =。倍率蛍光顕微鏡とイメージングの実行 = 10 X CDのパネル。パネルACは表示 LN コーティング料理です。BDのパネルは、FN コーティング料理を表示します。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: ラットのクリック単価の内皮への分化後の形成を管します。ラットのクリック単価は、20 h、中 3 で別 21 d に続いて、トリプシン、収穫の 0.1 %f12 の FBS を含む培地での料理の LN または FN コーティング 10 μ G/ml の低細胞密度で播種しました。96 ウェル プレートに基底膜マトリックスに 100 μ L の中 3 で 4 x 10 の4セルを播種されました。明視野顕微鏡とイメージングを行った。倍率 = 2 X;スケールバー = 50 μ m。この図は、以前の研究33に基づいて変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

分離、検出マーカー 参照
ヒト、ラット、マウス c キット+/Lin-、c キット+/CD45-、c キット+/CD45-/CD31- ベルトラミ、セル 2003;本里、ランセット 2011 年;エリソン氏は、セル 2013;スミス、Nat プロトコル 2014;Vicinanza、細胞死が異なる 2017
雑種犬 -プラス: c-キット+、MDR1+または Sca-1+ リンケ、PNAS 2005
マウス Sca 1+ ああ、PNAS 2003
マウス 側の人口、プラス: Abcg2+、Sca 1+/CD31-、Sca 1+/PDGFRa+ Hierlihy、日本内分泌学会 2002 年;マーティン、Dev 生物 2004;フィスター、Circ Res 2005 年;Noseda, Nat 通 2015
マウス コロニー形成単位芽プラス: CD45-、CD31-、Sca 1+、PDGFRa+ Pelekanos、幹細胞解像度 2012
マウス、ラット、ヒト Isl-1+ *、プラス: CD31-、c キット-、Sca-1-、Gata4+Nkx2.5+ Laugwitz、自然の 2005 年;Bu、2009 年
* Isl-1 は、成人の心臓ではなく、胚・胎児心筋で発見されます。

表 1: 分離の手法と心臓前駆細胞のマーカー。

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Discussion

このプロトコルの利点:

このプロトコルは、クリック単価の内皮への分化技術を提供します。低血清濃度と細胞密度が低いが LN がこれらの条件の下で FN よりもより適切な基質をあることを証明という内皮への分化の効率を改善できるとわかった。クリック単価の 2 つのタイプを使いました: ラット分離され拡大した単価を細胞ラインのような方法とマウス SP クリック単価で使用されました。特に、プロトコルが両方の種類に該当する単価。 現在の技術は分離し、遺伝子改変マウス、前臨床の疾患モデルおよび人間28,36からプライマリ クリック単価を展開する科学者を許可します。分離のクリック単価にこのプロトコルを使用してだけでなく疾患のメカニズム解明に新たな治療標的の探索にも役に立つかもしれません。

単価細胞療法45細胞は体外増幅後移植前後の患者から隔離されるという臨床試験中です。この点では、ここで提示されたプロトコルは、移植前にこのような単価の微分の潜在性を強化するための戦略を識別を助けることができます。ただし、細胞療法はまだ低保持、生存、および移植細胞の生着のための限られた有効性から低下します。このプロトコルまたは適応そのに基づいて機構の in vitro研究の分化プロセス駆動の分子機構の理解に貢献する可能性がある細胞密度に関連する、特定のメカニズム、基板、および成長因子。このような研究から取得した新しい知識は最終的に細胞リプログラミング用、直接外傷後を区別するために居住者のクリック単価に影響を与える適用可能性があります。

このプロトコルの制限:

分離の主なクリック単価は同じマーカーと同一の分離手法を用いた場合にもセルのサイズとセル成長率に応じて、分離に関して異なった表現型を示す異種個体集団です。したがって、次の 3 つのポイントを定義する必要: セル サイズ、(2) によると理想的な血清濃度の数字 (1) 細胞播種 (< 0.5%)、および最初のステップ (系列の誘導) と非常に低い血中濃度 (3) インキュベーション時間。細胞密度によって分化効率の違いを紹介します。ただし、低血清を比較したが (0.1 %fbs) 文化血中濃度 (3.5 %fbs)、我々 は内にあるその他の濃度を調査しませんでした、< 0.5 %fbs 範囲。さらに、使用される分離マーカー、種によって分化系列決定の誘導の効率は異なります。したがって、セル タイプごとにプロトコルを最適化する必要があります。

薬理学的および遺伝的抑制/誘導手法をこのプロトコルで疾患のメカニズムを検査するため使用できますの代わりに遺伝子組み換えや疾患動物モデル。この場合、プロトコルを再設計する必要があります: 低血清含有培地で治療前に細胞を投与して特定の試薬や遺伝学的ツールとなります。結果として、細胞は未処理細胞よりも脆弱かもしれない。低血清を使用して最初の手順では、このプロトコルでは重要なポイントです。したがって、このプロトコルが成功をすることができるかどうかどうかに血清欠乏下での生存率を維持しながら細胞の増殖を遅くを許可する最初のステップの血清濃度と潜伏期間の慎重な検証が欠かせません。

概要:

要約すると、動物モデルから分離されたクリック単価は心臓病と再生の研究のための貴重なツールを提供します。拡張、時に人間の単価も直接使えます細胞治療。我々 は、ここでは、効率的な内皮細胞系列誘導プロトコルを提供、クリック単価の分化細胞密度と血清中濃度の慎重な適応に基づきます。このプロトコルの利点は、クリック単価とその潜在的な貢献の研究および/または他の新しい心臓再生ツールの確立のための基礎の種類への適用性です。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者実験と生物医学部 (DBM)、大学、バーゼル大学病院から流れ Cytometry 施設からスタッフの中には彼女の役に立つサポート ベラ ローレンツをありがちましょう。この作品は、滞在のトラック プログラム バーゼル大学から (享香望月) によって支えられました。ガブリエラ m. 型は、スイスの全米科学財団 (許可番号 310030_156953) からの助成金によってサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL
Thrombin 0.0005 U/mL All necessary components included in the kit
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit All necessary components included in the kit

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References

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