제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

Neuroscience

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Summary

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

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Swale, D. R., Gross, A. D., Coquerel, Q. R., Bloomquist, J. R. Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster . J. Vis. Exp. (141), e58375, doi:10.3791/58375 (2018).

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Abstract

현재 사용할 수 있는 살충제의 대부분 신 경계 대상 고 무척 추 동물 신경 단백질의 유전자 변이 자주 해로운 결과, 아직 개인의 신경 활동을 기록에 대 한 현재 메서드 동물 비용과 힘 드는입니다. 이 흡입 초파리 melanogaster 의 제 3 탈피 애벌레 중앙 신경의 전극 준비는 neuroactive 에이전트, 다양 한 신경의 생리 적 역할을 결정의 생리 적 효과 테스트 하기 위한 세공 시스템 신경 기능을 유전자 변이의 영향으로 CNS 활동 경로 이 비보 전 준비 필요 생성 곤충 신경 활동의 재현 녹음 하만 보통을 electrophysiological 지식과 기술 해 부 합니다. 다양 한 화학 변조기, 펩 티 드를 포함 하 여 다음 CNS 활동에 영향을 측정 하기 위해 생리 식 염 수 솔루션의 신 경계에 직접 적용할 수 있습니다. GAL4/UAS 시스템 등 추가, 유전자 기술, 독립적으로 또는 특정 이온 채널, 전송기, 또는 arthropod CNS 기능 수용 체의 역할을 결정 하기 위해 약리 작용에 적용할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 여기에 설명 된 분석 실험 살충제 독물학, 곤충 생리학, 발달 생물학자는 D. melanogaster 설립된 모델 유기 체는 중요 한 관심입니다. 이 프로토콜의 목표는 다양 한 과학적 테스트를 위한 유용한 모델 곤충, 초파리 melanogaster에서 중앙 신경 시스템의 electrogenesis의 측정 수 있도록 electrophysiological 메서드를 설명 하는 가설입니다.

Introduction

이 방법의 전반적인 목표는 신속 하 게 모델 곤충, 초파리 melanogaster에서 중앙 신경 조직 (CNS)의 electrogenesis를 측정 하는 연구자 수 있도록입니다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는, 빠르고, 비용 효율적인 생리 및 독성에 관한 실험. 을 수행 하 CNS 신경 기능 이해 하거나 신경 기능을 수정 하기 위해에서 광범위 하 게 탐험 되어 대 한 삶과 중요 한 생리 적 경로 따라서,에 대 한 필수적입니다. Arthropod CNS 내의 신호 통로의 특성은 오프 대상 결과 제한 하는 동안 사망을 유발 하는 무척 추 동물 신경 기능을 방해 하는 살충제의 여러 화학 클래스의 검색을 활성화 하 고 있다. 따라서, 신 경계 이기 때문에 대상 조직 배포 된 살충제1의 대부분의 곤충 독성 학 그리고 생리학의 분야에 상당한 관심의 곤충의 신경 활동을 측정 하는 능력이 이다. 그러나, 곤충 신 경계에 관한 기본 지식과 적용된의 성장 필요 때문에 현재 기술 노동 집약 높은 비용을 요구 타당성에서 제한 된 고급 신경 생리학 기술을 계속 곤충 신경 세포는 제한, 및/또는 대부분 절지동물의 중앙 시 냅 스에 대 한 제한 된 액세스입니다. 현재, 대부분 곤충 신경 단백질의 특성 필요 해야 복제 및 heterologously에 대 한 표현 후속 약물 발견 및 electrophysiological 녹음, 곤충 안으로 정류기 칼륨 채널2 설명 했다 대상 , 곤충 ryanodine 수용 체3, 모기 전압에 민감한 K+ 채널4, 그리고 다른 사람. 분리 식에 대 한 요구와 낮은 기능 식에 대 한 가능성을 완화 하기 위해 Bloomquist와 동료에 신경 표현 형을 유도 하는 목적으로 경작 Spodoptera frugiperda (Sf21) 셀에 대 한 새로운 방법으로 살충제 발견5,6. 새로운 화학의 발전에 대 한 유효한 접근을 제공 하는 이러한 방법은 아직 그들은 자주 약리학 대리인, 살충제 저항, 및 특성의 메커니즘을 식별 특성에 대 한 극복 병목을 만들 기본적인 생리 적 원리. 여기, ex vivo 메서드는 전성 유전학7,,89 모델 곤충에서 전기 활동의 기록 및 신경의 알려진된 식 패턴 설명 단지10,,1112 신경, 새로 개발된 된 약물의 행동의 모드 및 기타 독성 학적 연구의 수준에서 저항 메커니즘의 특성을 사용 하도록.

과일 파리 D. melanogaster, 곤충의 신경 시스템 또는 행동의 살충제 메커니즘을 정의 하기 위한 일반적인 모델 유기 체 이며14 독물학13, 약리학의 연구에 대 한 적절 한 모델 생물으로 설립 되었습니다. ,15, 신경 생리학16및 척추 동물의 병 태 생리17,18,19,20 프로세스. D.melanogaster 는 완전 변 태, 애벌레 및 번데기 단계를 포함 하 여 생식 성인 무대에 도달 하기 전에 수행 하는 holometabolous 곤충. 발달 과정을 통해 신 경계 다른 생활 단계에서 중요 한 개장 겪 습 하지만 애벌레 CNS이이 방법론의 초점이 될 것입니다. 완전 개발된 애벌레 CNS와 융합 되 고 반복 하 고 거의 동일한 neuromeric 단위21,22의 배열을 나타내는 복 부 신경 절을 형성 하는 흉부와 복 부 세그먼트 해부학 간단 하다. 하강 하는 모터 신경 subesophageal 신경의 꼬리 끝에서 시작 하 고 몸 벽 근육과 내장 기관 애벌레의 자극 하. 그림 1 에서는 애벌레 초파리 CNS의 심한 해부학을 설명합니다.

Drosophila 혈액-뇌 장벽 (BBB) embryogenesis의 끝에 발전 하 고 subperineurial glial 세포 (SPG)21에 의해 형성 된다. SPG 셀 전체 초파리 CNS23를 포함 하는 연속, 단조로운, 내 피 같은 시트를 확립을 밖으로 확산 하는 수많은 filopodia 같은 프로세스를 형성 합니다. Drosophila BBB CNS21에 영양분과 xenobiotics의 항목을 조절 하 여 신경 microenvironment의 항상성 유지 포함 척추 BBB에 유사점이 있다. 이것은 신뢰할 수 있는 신경 전송 및 기능에 대 한 필수 아직 합성 마약, 대부분 펩 티 드, 그리고 다른 xenobiotics24,25, 소개 하는 잠재력의 침투를 제한 하는 BBB로 CNS의 보호 potencies 작은 분자 변조기를 특성화 하는 때 문제. 메서드를 사용 하 여 간단한 transection이이 장벽이 고 준비 약리 액세스 중앙 시 냅 스를 제공.
설명된 하는 방법론의 가장 큰 힘은 단순, 재현성, 및이 시스템에 내재 된 상대적으로 높은 처리 능력. 프로토콜은 상대적으로 마스터 하 게 쉬운, 설치 작은 공간을 필요로 하 고 초기 금융 입력만 필요는 시 약 및 소모품을 줄일 수 있다. 또한, 설명 방법은 완전히 집 파리, 파리 자리 부채26. 의 중앙 하강 신경 활동을 기록 하는 amendable

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Protocol

1. 장비 및 재료

  1. 전기 생리학 장비 초파리 CNS의 흡입 전극 녹음을 수행의 필수 구성 요소 ( 재료의 테이블에에서 나열 된)를 준비 합니다.
    참고: 이전에 실험, 필요는 초파리 CNS의 해 부에 대 한 챔버를 구성 하 고 녹음 동안 염 분에 중추를 입욕 하는 데 사용할. 챔버 건설의 단계별 개요는 아래 제공 됩니다.
  2. 애벌레 챔버를 준비 합니다.
    1. 뜨거운 접시를 사용 하 여 블랙 왁 스를 녹여.
    2. 최대 볼륨의 2-2.5 mL 챔버로 녹 인된 왁 스의 2 개 mL를 붓으십시오.
    3. 왁 스 쿨 하 고 약 2 시간에 대 한 강화.
    4. 면도날을 사용 하 여 약 0.5 c m2 의 표면적과 약 0.25 cm의 깊이 500 µ L의 볼륨을 개최 한다 강화 된 왁 스에 구멍을 개척.

2. 장비 및 소프트웨어 구성

참고: 세포 외 기록의 설치 아래 간략하게 설명 되어 있습니다.

  1. 해 부와 녹음 장비를 준비 합니다.
    1. 조직 준비, 현미경, 흡입 전극, micromanipulators, 소음을 줄이기 위해 외부 전기 분야 (그림 2)를 패러데이 새 장 안에 광원을 배치 합니다.
    2. 연결 (솔더 선호) 지상과 긍정적인 와이어에 차폐 된 악어 클립 목욕 및 microelectrode 홀더에 각각 연결 됩니다.
      참고: 납땜 및 노출 전선 노이즈를 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 덮여 수 있습니다.
    3. 지상과 긍정적인 와이어 입력 1 ac/DC 차동 증폭기. 의 연결
    4. 데이터 수집 시스템 을 앰프의 채널 1 출력 데이터 수집 시스템의 입력된 1에서 고정 닐-Concelman (BNC) 케이블을 연결 하 여 ac/DC 차동 증폭기에 연결할.
      참고: 데이터 수집 소프트웨어와 증폭기 사이 50/60 Hz 노이즈 제거 기를 통합 하기 위하여 추천 된다. BNC T-커넥터의 사용이 필요 합니다.
    5. 원하는 경우, 데이터 수집 소프트웨어의 1 입력 오디오 모니터의 입력된 1을 연결 하 여 설치 프로그램에 오디오 모니터를 포함 합니다.
    6. 식 염 수와 10 mL 주사기를 전극 홀더의 압력 포트에 연결.
      주: 아무 공기 방울 주사기, Ag/AgCl 펠 릿 및 전극 오프닝 사이 존재 확인.
  2. 해 부 및 기록을 위한 소프트웨어를 준비 합니다.
    참고: 소프트웨어 설치에 대 한 방법의 개요 원시 전기 출력을 디지털화 하 고 주파수 스파이크를 데이터 변환 재료의 테이블에 에서 나열 된 수집/분석 소프트웨어에 기반. 그러나, 다른 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 그리고 다중 녹음 변환을 사용할 수 있습니다.
    1. 수집/분석 소프트웨어를 엽니다.
    2. 주 도구 모음에서 "설정"에 클릭을 선택 "채널 설정" 대화 상자가 열립니다.
    3. 3 전체 채널의 수를 줄입니다.
    4. 100의 범위를 선택 하는 채널 1에 대 한 mV.
    5. 채널 2에 대 한 드롭 다운 메뉴를 열 것 이다 "계산" 탭 클릭. 선택 "순환 측정," 두 번째 대화 상자가 열립니다.
    6. 원본으로 채널 1을 선택 합니다. 드롭다운 메뉴 측정 단위 스파이크에서 이벤트를 선택 합니다. 마지막으로, 검색 설정 영역에서 드롭 다운 메뉴에서에서 선택 간단한 임계값.
    7. 에 변환 하려면 전기 활동 헤르츠 표현 속도 플롯, 3rd 채널 산술 모드로 설정 해야 합니다: 입력된 창에 "1000*smoothsec(ch2,2)"에 입력. 단위 메뉴 헤르츠 드롭다운으로 선택 합니다.
      참고: 성공적인 녹음 여러 다른 녹음 설정을 수행할 수 있습니다 하지만 "이벤트 및 간단한 임계값에서 단위 스파이크" 가능성이 가장 쉬운, 그것은 각 개인에 대 한 백그라운드 작업 위에 임계값의 조정에 대 한 수 있기 때문 녹음입니다. "사용자 정의-소스 입력"의 설정에서 녹음 하는 백그라운드 작업은 기록 사이 다른 가정 데이터의 재현성 증가.
    8. 메인 화면으로 돌아가려면 대화 상자를 닫습니다. Y 시간에 Hz와 x 축에 표현 되어야 합니다.

3. 해 부 고 애벌레 초파리 CNS 준비

참고: 애벌레 CNS 절 개 방법 Hafer 및 Schedl27, 명확 하 게 설명 되어 있지만 이러한 이전 게시 방법 스파이크 주파수를 측정 하기 위한 중요 한 하강 뉴런의 길이 줄일. 여기, 유지, 그대로 내림차순 뉴런 애벌레 CNS 소비 세를 추가 하는 방법 요약.

  1. 염 분 준비입니다.
    1. 해 부 및 m m28에 다음에 염 분 녹음 준비: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES); 7.25 pH 적정
  2. CNS 애벌레 초파리 해 부.
    1. 식별 하 고 식 염 수 (그림 3A)의 200 µ L로 방황 3 탈피 초파리 melanogaster 문화 유리병 및 장소에서 추출.
    2. 미세 집게의 쌍을 가진 입 고리를 잡고 집게 (그림 3B)의 두 번째 쌍은 구 더 기의 복 부를 파악.
      참고:이 구 더 기의 cuticular 박막의 끊어지고 발생할 수 있는 복 부에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.
    3. 부드럽게 당겨 입 후크 및 복 부 머리 지역에서 구 더 기의 꼬리 끝을 분리 하 고 구 더 기 (그림 3C)의 내장을 노출 하는 서로 다른 방향으로.
      참고: CNS 됩니다 될 고리로 기관지 및 소화 관. 하강 주변 신경 절단을 방지 하기 위해 어떤 조직에서 CNS를 잘라 하지 마십시오.
    4. 집게 (그림 3D)와 소화 기관에서 CNS를 애타게.
    5. 필요한 경우 수동으로 욕실이 봄이 위 CNS 뇌 돌출부에 후부를 transecting 하 여 혈액 두뇌 방 벽을 방해.
      참고:이 행해져야 한다 사용 되 고 화학의 physiochemical 속성에 따라. 그림 4A 에 빨간색 라인 제안된 transection 포인트 이며 그림 4B에서 표시 된 그대로 내림차순 주변 신경 줄기와 transected CNS. Transected CNS 3.2.5 단계의 완료 후 실험에 대 한 준비가 되어있습니다.

4. 세포 외 기록 초파리 CNS의.

  1. 녹음에 대 한 CNS를 준비 합니다.
    1. 5-15 m ω 저항에 붕 규 산 유리 모 세관에서 유리 피 펫 전극 당겨.
    2. 염 분의 200 µ L을 포함 하는 왁 스 챔버에 transected CNS를 삽입 합니다. 접지 와이어를 납땜 하는 악어 클립 uncoated 곤충 핀을 클램프 하 고 회로 완료 하려면 식 염 수에 핀을 삽입 합니다.
    3. micromanipulators을 사용 하 여, 동양 transected CNS의 꼬리 끝에 전극. 주변 신경 줄기를 문의 하기 전에 수집/분석 소프트웨어에서 임계값을 조정 하 여 기록의 배경 잡음을 제거 합니다.
    4. 주사기에 약간의 부정적인 압력을 적용 하 여 흡입 전극에 어떤 편리한 주변 신경을 그립니다.
      참고: 주파수를 발사 초기에 더 신경 자주 발생할 증가 저항 전극의 전극으로 당겨 뉴런의 수에 상관 된다.
  2. CNS 하강 하는 신경 활동의 extracellular 녹음을 시작 합니다.
    1. 데이터 수집 소프트웨어에 녹음을 시작 하 고 주파수를 발사 하는 기준선을 모니터링 합니다. 초기 발사 속도 데이터를 수집 하기 전에 5 분 동안 equilibrate를 발사 속도 허용 합니다.
    2. 없으면 제어 치료의 발사의 패턴 그림 5A에 표시 된 것과 유사한 붕괴 패턴 준비 및 녹음을 삭제 합니다.
      참고: 변경된 패턴 발사의 신경 기능을 변경할 수 있는 중앙 패턴 발생기의 비정상적 이거나 불안정 한 활동을 제안 합니다.
    3. 5 분 후 식 염 수 + 챔버의 총 볼륨 녹음 제어 속도 발사 하려면 400 µ L을가지고 차량 200 µ L를 추가 합니다.
    4. 기준선 설립된 (3-5 분) 후 식 염 수의 200 µ L를 철회 하 고 염 분에서 solubilized 실험 에이전트의 200 µ L를 추가 합니다.
      참고: 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 질 성 화합물에 대 한 권장된 용 매 이며 0.1% v/v를 초과 해서는 안됩니다.
    5. 직렬 방식 (높은 농도 낮은) 약물 농도 적용 하 고 각 농도 (약29의 화학적 특성에 따라 조사에 의해 결정) 선택 기간에 대 한 기록. 약물과 최종 농도 포함 하는 코멘트를 포함 하 여이 시간 포인트 획득/분석 소프트웨어에서 약물 응용 프로그램의 레이블을 지정 합니다.
      참고: CNS의 활동을 발사 거절 됩니다 약 10-20%로 30 ~ 50 분 후 해 부 후 따라서 적절 한 치료 컨트롤 실행 되어야 한다, 그리고 약물 치료는이 기간을 초과 하지 않아야 합니다.
  3. 데이터를 분석 합니다.
    참고: 여러 분석 활동 전위 버스트29, 스파이크 파형 진폭 및 시간 코스, 그리고 약물 치료26,30 후 평균 스파이크 주파수 결정의 변화와 같은 수집 된 데이터에 수행할 수 있습니다. , 31 , 32. 가장 일반적인 마약 아래 설명 하는 시간의 지정된 된 기간 동안 평균 스파이크 주파수는 영향 결정 이다.
    1. (즉, 약물 치료 기간)의 전체 영역을 선택 하 여 평균 스파이크 주파수 평면 및 자동으로 수집/분석의 주요 도구 모음에 있는 "Datapad" 통해 의미 스파이크 주파수 결정 소프트웨어입니다.
    2. 차량 제어 (초기)의 평균 스파이크 주파수에 약물 치료 후 CNS의 평균 스파이크 주파수를 결정 합니다. 수식으로 약물 치료 후 속도 발사 비율 변경 계산: (주파수/기준 주파수 처리) × 100.
    3. 각 농도 대 한 제어의 평균 스파이크 주파수 또는 퍼센트 발사를 사용 하 여 그래프 소프트웨어 표준 농도 응답 곡선을 건설 하기 위하여.
    4. 통계 분석을 수행 (예: 짝이 없는 t-테스트) 의미 시간 포인트, 농도, 또는 약물 치료를 결정 하.
      참고: 생성 농도 응답 곡선을 분석 하기 위한 두 가지 기본 방법이 있습니다. 첫 번째 방법은 개별 준비 당 한 농도 이다. 여기, 단일 농도의 스파이크 속도 각 준비에 대 한 초기 스파이크 속도 정규화 됩니다. 혜택 감소 때문에 준비의 아래로 실행 기록 시간 단축, 함정 증가 하는 동안 해 부 시간이 있기 때문에이 방법의 농도, 당 5-7 개별 CNS 준비 구성 됩니다 및 평균된 데이터에 더 큰 오류 막대 설정 합니다. 두 번째 방법은 개별 준비 당 여러 농도입니다. 여기, 각각 3-5 농도의 스파이크 속도 같은 초기 스파이크 속도 정규화 됩니다. 장점은 적은 해 부 시간 고 함정 후속 화학 치료에 이전 약물 농도 처리의 빠른 행동 약물 및 알 수 없는 영향의 요구는 더 적은 가변성 사이 약물 농도 대 한 복제 합니다.

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Representative Results

일관 된 재현성 extracellular 흡입 전극을 사용 하 여 초파리 중추 신 경계에서에서 발생 하는 하강 주변 신경의 자발적인 활동을 기록할 수 있습니다. 삭제 및 transected 초파리 CNS의 자발적인 활동 생산 발사의 약 1 1-2 s와 붕괴의 주기적 패턴 무부하 활동 근처의 s. 예를 들어 CNS는 무부하 (1 ~ 2 Hz) 0.5-1 근처 뒤 약 1 s, 그리고 근처 무부하 상태 (1 ~ 2 Hz) 다음 반환에 대 한 버스트 (100-400 Hz)에 0.5-1 s s (그림 5A). 이 발사 패턴 반복은 모든 2-3 s. CNS는 초파리 의 평균 스파이크 방전 주파수 임계값 기준 잡음 위에 설정 된 경우 3-5 분 동안 약 20 ~ 50 Hz에서 범위. 발사 주파수 기준 전극에 주변 신경 및 전극 구멍 그리고 복 부 신경 사이 형성 하는 인감의 수에 상관 된다. 중요 한 것은, 0.1%의 최종 농도에 화학 용 매 DMSO의 응용 프로그램 (그림 5A) 초파리 CNS의 스파이크 방전 주파수를 변경 하지 않습니다.

이 electrophysiological 준비 잘 특징이 곤충 신경 시스템의 스파이크 주파수에 다양 한 작은 분자의 흥분 성의 또는 depressant 속성을 특성화 하는 방법을 제공 합니다. Propoxur, 곤충 acetylcholinesterase (통증)의 알려진된 억제제는 neuroexcitant 이며 농도 의존 방식 (그림 5B) transected 초파리 CNS의 스파이크 방전 주파수를 증가 했다. 그와 반대로, 감마-aminobutyric 산 (GABA), 알려진된 억제 신경 전달 물질 곤충 GABA 중재 염화 물 채널에 따라 행동 한 neurodepressant 이며 농도 의존 방식 (그림 5C 스파이크 방전 주파수를 감소 ). 주파수 응답을 유도 50% 효과적인 농도 (EC50)를 결정 하 농도 응답 곡선의 건설 있도록 각 농도 대 한 기록된 기간에 걸쳐 결정 될 수 있다 스파이크 방전을 의미 합니다. 여기, propoxur 338의 EC50 표시 됩니다 nM (95% 신뢰 구간 (CI): 241-474, hillslope: 1.8; r2: 0.77)는 초파리 CNS 제어 (그림의 300% 활동에서의 최대한 자극을 생산 하는 1 µ M의 농도와 5 D)26. GABA는 1.1 m m의 IC50 표시 됩니다 (95 %CI: 0.7-1.5; hillslope: 1.5; r2: 0.95) 5mm (그림 5E)에 최대한 억제와 함께.

때때로, 신경 시스템의 분자 프로브 혈액 두뇌 방 벽의 침투를 활성화 하는 적절 한 physiochemical 속성의 그들의 부족으로 인해 생리 적 또는 독물학 분석 실험에서 사용 될 수 없습니다. 예를 들면, 단위체 tacrine 이다는 강력한 곤충 통33, (ca. 200 nM) 억제제 아직 그대로 초파리 CNS (그림 6A)의 스파이크 주파수를 변경 하지 않습니다. 그러나, 신경 멜 라와 transection 후부 대뇌 돌출부를 통해 혈액 두뇌 방 벽의 파괴 귀착되 었 다 초파리 CNS의 스파이크 주파수 근처 즉각적인 증가 100 µ M 단위체 tacrine ( 에 노출 된 후 그림 6B). 유사한 데이터는 앞에서 설명한30되었습니다.

Figure 1
그림 1: 3-탈피에서 CNS Excised 초파리 melanogaster. 화살표 라벨에 해당 하는 CNS의 다양 한 해 부 구조를 가리킵니다. 눈금 막대 나타냅니다 250 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 세포 외 녹음을 수행 하는 데 사용 되는 전기 생리학 설치. (A) 패러데이 케이지; (B) 진동 테이블; (C) 해 부 현미경; (D) / 차동 증폭기; (E) 오디오 모니터; (F) 잡음 제거 기; (G) 데이터 수집 시스템; (H) 컴퓨터 실행 랩 차트 프로 소프트웨어; (I) fiberoptic 케이블 외부 조명 소스; (J) micromanipulator; (K) microelectrode 홀더 유리 전극과 준비 왁 스 요리와 함께 압력 포트와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 3-탈피 구 더 기에서 CNS를 절 개 하는 방법. (A) 그대로 구 더 기 염 분의 200 µ L에 빠져들. 화살표 입 걸 체 벽의 분리에 사용 되는 나타냅니다. (B) 두 쌍 집게의 몸 벽의 분리를 하려면 입 걸이에 구 더 기의 한가운데에 배치 됩니다. (C) 체 벽은 노출 된 내장을 약간 하 고 지속적인 압력을 적용 하 여 분리 된다. (D) CNS 명확 하 게 보이는 (흰색 화살표) 이며, 때때로 내장으로 얽혀 있습니다. 눈금 막대 1000 µ m, 750 µ m, 500 µ m, 및 A, B, C 및 D, 패널에 대 한 200 µ m를 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: CNS transecting 여 혈액 뇌 장벽의 붕괴. (A) 하강 하는 신경의 복 부 신경 꼬리 끝에 명확 하 게 볼 수와 함께 그대로 CNS. 빨간색 선은 BBB 방해 CNS transecting의 위치를 나타냅니다. (B)는 여전히 긴 하강 신경 노출 복 부 신경의 꼬리 끝으로 CNS transected. 복 부 신경 삭제 될 수 있습니다. 눈금 막대는 200 µ m을 두 패널을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: D. melanogaster의 제 3 탈피 애벌레의 CNS에서 신경 생리학 녹음. 대표적인 신경 방전 흔적 전과 (A) DMSO에 노출 된 후, (B) propoxur, 그리고 (C) GABA. 스파이크/s (Hz) 각 실험에 대 한 초기 발사 주파수는 각 추적의 왼쪽에 게 주어 집니다. 농도-응답 곡선 propoxur에 대 한 (D) 와 GABA (E) D. melanogaster 애벌레의 CNS 신경 방전에 복제 된 녹음에서 (n = 5 번 이상 복제 하는 각 농도 곡선, 당 3-5 농도). 화살표는 약물 응용 프로그램의 포인트를 나타냅니다. 데이터 요소 평균 % 증가 속도 발사 하는 기준선의 나타내고 오차 막대를 나타내는 표준 편차. 오차 막대는 결 석, 그것은 상징의 크기 보다 작은 있기 때문 에입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: transection CNS의 후 신 경계에 tacrine의 침투를 증가 했다. 그대로 (A) (B) 의 대표 녹음 transected 애벌레 CNS 화살표에 적용 된 단위체 tacrine에 노출. 스파이크/s (Hz) 각 실험에 대 한 초기 발사 주파수는 각 추적의 왼쪽에 게 주어 집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

관련된 비디오에 세부 사항을 제공 하 고 활동 및 스파이크를 기록 하기 위해 주요 단계 방전 주파수 비보 전 초파리 CNS의 텍스트를 제공. 해 부 효능은 짧은 또는 몇 하강 신경 초기 발사 속도 큰 차이 복제를 줄일 것입니다 때문에 방법의 가장 중요 한 측면 이다. 그러나, 일단 절 개 기술을 마스터 되었습니다,이 분석 결과와 수집 된 데이터는 매우 재현 가능 하 고 다양 한 분야에 대 한 amendable. 설명된 방법에 한 수정 필요가 수동으로 염 분 및 화학 솔루션 CNS 챔버로 플라스틱을 막을 것 이다 자동화 된 대량 시스템의 포함 이다. 풍부 시스템의 포함 가끔 수동 펫 약물의 응용 프로그램 동안 발생 하는 녹음 하는 동안 CNS의 소요를 줄일 것입니다.

이 electrophysiological 메서드 약/살충제 검색 연구 위한 준비의 유틸리티를 이용 한다. 또한,이 준비는 의무가 신경 생리학의 기본 개념의 데모에 대 한 교실 이다. 메서드를 해야 상대적으로 겸손 한 금융 투자와의 함수에 대 한 약물의 영향을 설명 하기 위해 사용할 수 있는 강력 하 고 안정적인 녹음을 제공 하면서 최소한의 준비 시간 비행 CNS. 예를 들어, 녹음 장비의 부담 사소한 후속 비용 (예: 염 분 소금, 비행 식민지 유지 보수, )과 초기 비용의 약 10000 달러 이다. 또한, CNS 준비에서 첫 녹음에 필요한 시간은 약 10 분입니다. 초파리 는 실험실 또는 교실 문화에서 유지 하기 쉽고, 주목 해야 한다는이 흡입 전극 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 집 파리, 파리 자리 부채, 그리고 아마 다른 muscoid 비행 거리 애벌레의 CNS를 사용 하 여 또한. 파리 자리 부채 의 가축에 해충 상태 수 연구에 중요 한 유틸리티의 프로그램 또는 다른 인구에서 파리의 신경 감도 특성의 힘을 새로 결정을 목표로 개발이 분석 결과 나왔다 침입의 궁극적인 제어를 위한 neurotoxicants입니다.

약물의 효능을 특성화, 뿐만 아니라이 준비 유전자 변이 초파리 신경 시스템의 활동에 조작의 영향을 특성을 사용할 수 있습니다. 이전 작업 유전자 인코딩 안으로 정류기 칼륨 (키 르) 채널 증가 하 여 초기 CNS 발사 주파수 약 2-fold 파리31제어에 비해 그 CNS 관련 최저를 보이고 있다. 이러한 데이터는 궁극적으로 생리 적인 역할 키 르 채널 역할 초파리 신 경계 기능을 추측 약리 데이터와 결합 했다.

이 기술은 다양 한 독성 학적 그리고 생리 적 가설을 테스트 하는 강력한 분석 결과 나타내지만, 한계 분석 결과를 존재 하 고 고려 되어야 한다. 예를 들어, 거의 흡입 전극 녹음을 통해 생성 된 데이터는 이온 채널에 대 한 약물 또는 정확한 생리 적인 역할의 행동의 정확한 모드에 대 한 결정적인 증거를 제공 하 고 셀 기반 측정, 직렬 식에와 같은 공부 되어야 한다 패치 클램프 전기 생리학. 이 메서드는 추가 제한은 다양 한 수용 체 및 이온 채널 특수형을 좌우 하지 않는다 CNS 스파이크 속도 동일한 방식에서입니다. 따라서, 특정 수용 체 또는 이온 채널 하위의 변조 크게 삭제 CNS의 스파이크 속도 영향을 주지 않을 수 있습니다 하지만 실제로 총 신 경계 기능 신호 통합에 중요 한 영향을 미칠 수 가능 하다.

흡입 전극 기록을 통해 수집 된 데이터 품질 개념 증명 데이터 제공 고 전압 클램프를 통해 유효성을 검사할 수 있는 행동의 메커니즘에 관한 가설을 생성 하는 연구를 허용 한계 존재 전기 생리학, 생화학 분석, 또는 추가적인 약물 테스트를 통해. 예를 들어 후자 수행한 방충제, N, N-Diethyl-3-methylbenzamide (DEET), 모기에 독성의 기계 장치를 설명 하기 위해에서 곤충 CNS에에서 octopaminergic 시스템을 억제 했다 가설을 테스트 하 고 26파리. DEET 집 파리 CNS 활동의 neuroexcitant 표시 되었다 고 해는 신경 근육 학 교차로 및 glutamatergic 시스템, 각각26에서 갖는 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 변경. 이러한 데이터는 이전 제안된34DEET 해 억제를 통해 독성을 유발 가능성이 아니 었 제안 했다. Phentolamine에 노출 후 CNS의 방전 주파수를 녹음, 알려진된 octopamine 적이 보였다 DEET 중재 neuroexcitation의 완전 한 억제 하지만 DEET는 더 중요 한 증거를 제공 하는 propoxur의 그 아마 통26보다 octopaminergic 시스템에 영향을 미치는. 이러한 게시 된 데이터 집합의 가설과 실험 조건이이 방법으로 조사 될 수 있는 다양 한 강조 표시 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 해 부와 초파리 는 그림에 표시 된 CNS의 이미지에 대 한 양 루이 첸을 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila melanogaster (strain OR) Bloomington Drosophila Stock Center 2376
Vibration isolation table Kinetic Systems 9200 series
Faraday Cage Kinetic Systems N/A
Dissecting Microscope on a Boom Nikon SMZ800N Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier ADInstruments AM3000H The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor ADInstruments AM3300
Hum Bug Noise Eliminator A-M Systems 726300
Data Acquisition System (PowerLab) ADInstruments PL3504 Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software ADInstruments N/A - Online Download
Fiber Optic Lights Edmund Optics 89-740 Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator World Precision Instruments M325
Microelectrode Holder World Precision Instruments MEH715 Different models are acceptable
BNC cables World Precision Instruments multiple based on size
Glass Capillaries World Precision Instruments PG52151-4
Microelectrode Puller Sutter Instruments P-1000 Also can use Narashige PC-100
Black Wax Carolina Biological Supply 974228
Non-coated insect pins, size #2 Bioquip 1208S2
Fince Forceps Fine Science Tools 11254-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03

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