तीसरी-Instar Drosophila Melanogaster के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र गतिविधि की Electrophysiological रिकॉर्डिंग

Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि Drosophila melanogaster केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उतरते विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम करने के लिए लागत कुशल और सुविधाजनक परीक्षण के औषधीय एजेंटों, तंत्रिका प्रोटीन के आनुवंशिक उत्परिवर्तनों, और/या बेरोज़गार शारीरिक रास्ते की भूमिका ।

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Swale, D. R., Gross, A. D., Coquerel, Q. R., Bloomquist, J. R. Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster . J. Vis. Exp. (141), e58375, doi:10.3791/58375 (2018).

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Abstract

वर्तमान में उपलब्ध कीटनाशकों के बहुमत तंत्रिका तंत्र और invertebrate तंत्रिका प्रोटीन के आनुवंशिक उत्परिवर्तनों लक्ष्य अक्सर बचके परिणाम उपज, अभी तक एक व्यक्ति की तंत्रिका तंत्र गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए मौजूदा तरीके पशु महंगाई और श्रमसाध्य है । यह चूषण इलेक्ट्रोड Drosophila melanogaster के तीसरे-instar लार्वा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की तैयारी, neuroactive एजेंटों के शारीरिक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक तंत्रीय प्रणाली है, विभिन्न तंत्रिका की शारीरिक भूमिका का निर्धारण सीएनएस गतिविधि के रास्ते, साथ ही आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभाव के लिए तंत्रिका समारोह । इस पूर्व vivo तैयारी केवल उदारवादी विदारक कौशल और electrophysiological विशेषज्ञता कीट न्यूरॉन गतिविधि की reproducible रिकॉर्डिंग उत्पन्न करने के लिए की आवश्यकता है. पेप्टाइड्स सहित रासायनिक संग्राहक की एक विस्तृत विविधता है, तो शारीरिक खारा के साथ समाधान में तंत्रिका तंत्र के लिए सीधे लागू किया जा सकता सीएनएस गतिविधि पर प्रभाव को मापने के लिए । इसके अलावा, आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों, जैसे GAL4/यूएएस प्रणाली, स्वतंत्र रूप से लागू किया जा सकता है या औषधीय एजेंटों के साथ मिलकर में विशिष्ट आयन चैनलों की भूमिका निर्धारित करने के लिए, ट्रांसपोर्टरों, या सन्धिपाद सीएनएस समारोह के लिए रिसेप्टर्स. इस संदर्भ में, यहां वर्णित परख कीटनाशक toxicologists, कीट physiologists, और विकास जीव के लिए महत्वपूर्ण ब्याज की है जिसके लिए D. melanogaster एक स्थापित मॉडल जीव है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को एक electrophysiological विधि का वर्णन करने के लिए मॉडल कीट, Drosophila melanogaster, जो वैज्ञानिक की विविधता के परीक्षण के लिए उपयोगी है में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के electrogenesis की माप सक्षम है Hypotheses.

Introduction

इस दृष्टिकोण का समग्र लक्ष्य के लिए शोधकर्ताओं को जल्दी से मॉडल कीट, Drosophila melanogasterमें केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के electrogenesis उपाय करने के लिए सक्षम है । इस विधि, विश्वसनीय जल्दी है, और लागत कुशल शारीरिक और विषाक्तता प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए सीएनएस जीवन के लिए आवश्यक है और इसलिए, शारीरिक उचित तंत्रिका समारोह के लिए महत्वपूर्ण रास्ते को समझने या तंत्रिका समारोह को संशोधित करने के प्रयास में बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है । सन्धिपाद सीएनएस के भीतर संकेत रास्ते के लक्षण वर्णन के कई रासायनिक वर्गों की खोज सक्षम किया गया है कि कीटनाशकों invertebrate तंत्रिका समारोह में बाधा उत्पन्न करने के लिए जबकि बंद लक्ष्य परिणामों को सीमित. इस प्रकार, कीड़ों के तंत्रिका गतिविधि को मापने की क्षमता कीट विषविज्ञान और फिजियोलॉजी के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण ब्याज की है के बाद से तंत्रिका तंत्र तैनात कीटनाशकों के बहुमत के लक्ष्य ऊतक1है । फिर भी, मौलिक और लागू कीट तंत्रिका तंत्र के बारे में ज्ञान की निरंतर वृद्धि उंनत neurophysiological तकनीक है कि व्यवहार्यता में सीमित है की आवश्यकता है, वर्तमान तकनीकों के बाद से श्रम गहन और एक उच्च व्यय की आवश्यकता है, कीट तंत्रिका कोशिका लाइनें सीमित हैं, और/या सबसे arthropods के केंद्रीय synapses के लिए सीमित पहुंच है । वर्तमान में, सबसे कीट तंत्रिका प्रोटीन के लक्षण वर्णन लक्ष्य की आवश्यकता है क्लोन और बाद में दवा की खोज और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए व्यक्त heterologously, के रूप में कीट आवक दिष्टकारी पोटेशियम चैनल के लिए वर्णित किया गया था2 , कीट ryanodine रिसेप्टर3, मच्छर वोल्टेज के प्रति संवेदनशील कश्मीर+ चैनल4, और दूसरों. heterologous अभिव्यक्ति और कम कार्यात्मक अभिव्यक्ति, Bloomquist और उनके लिए एक उपंयास विधि के रूप में धब् frugiperda (एस एफ21) कोशिकाओं में एक न्यूरॉन phenotype प्रेरित करने के उद्देश्य से सहयोगियों के लिए क्षमता के लिए आवश्यकता को कम करने के लिए कीटनाशक डिस्कवरी5,6. इन तरीकों को नए रसायन विज्ञान के विकास के लिए एक वैध दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, फिर भी वे अक्सर औषधीय एजेंटों के लक्षण वर्णन के लिए एक दुर्गम अड़चन बनाने के लिए, कीटनाशक प्रतिरोध के तंत्र की पहचान, और लक्षण वर्णन मौलिक शारीरिक सिद्धांतों की । यहां, हम एक पूर्व vivo विधि का वर्णन है कि एक मॉडल कीट है कि निंदनीय आनुवंशिकी है से विद्युत गतिविधि की रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है7,8,9 और तंत्रिका के ज्ञात अभिव्यक्ति पैटर्न 10परिसरों,11,12 तंत्रिका के स्तर पर प्रतिरोध तंत्र के लक्षण वर्णन सक्षम करने के लिए, नव विकसित दवाओं की कार्रवाई की विधा है, और अन्य विषाक्तता अध्ययन.

फल मक्खी, melanogaster, कीट तंत्रिका प्रणालियों या कार्रवाई की कीटनाशक तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक आम मॉडल जीव है और विषाक्तता13, औषधीय 14 के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल मॉडल जीव के रूप में स्थापित किया गया है ,15, neurophysiological16, और pathophysiological17,18,19,रीढ़ की20 प्रक्रियाएं हैं । D. melanogaster एक holometabolous कीट है जो प्रजनन प्रौढ़ अवस्था तक पहुंचने से पहले एक लार्वा और pupal अवस्था सहित पूर्ण कायापलट करता है । विकास की प्रक्रिया के दौरान, तंत्रिका तंत्र अलग जीवन चरणों में महत्वपूर्ण remodeling से गुजरती है, लेकिन लार्वा सीएनएस इस पद्धति का ध्यान केंद्रित किया जाएगा । पूरी तरह से विकसित लार्वा सीएनएस वक्ष और उदर खंडों कि जुड़े हुए है और ventral नाड़ीग्रंथि, जो दोहराया और लगभग समान neuromeric इकाइयों21,22की एक सरणी का प्रतिनिधित्व करता है फार्म के साथ सरल anatomically है । उतरते मोटर नसों गैंग्लिया के caudal अंत से शुरू और अंदर आना शरीर की दीवार की मांसपेशियों और लार्वा के आंत अंगों के लिए उतरना । चित्रा 1 लार्वा Drosophila सीएनएस के सकल एनाटॉमी का वर्णन करता है ।

Drosophila रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) embryogenesis के अंत में विकसित करता है और subperineurial glial कोशिकाओं (एसपीजी)21द्वारा बनाई गई है । एसपीजी कोशिकाओं के रूप में कई filopodia-प्रक्रियाओं है कि बाहर फैला के लिए एक निरंतर, बहुत सपाट, endothelial की तरह चादर कि पूरे Drosophila 23सीएनएस कवर की स्थापना की तरह । Drosophila BBB हड्डीवाला BBB के लिए समानताएं है, जो homeostasis में पोषक तत्वों और microenvironment के प्रवेश को नियंत्रित करने के द्वारा तंत्रिका xenobiotics के संरक्षण शामिल है21सीएनएस । यह विश्वसनीय तंत्रिका संचरण और समारोह के लिए एक शर्त है, अभी तक BBB द्वारा सीएनएस के संरक्षण सिंथेटिक दवाओं, सबसे पेप्टाइड्स के permeation को प्रतिबंधित करता है, और अन्य xenobiotics24,25, जो संभावित परिचय समस्याएँ जब छोटे-अणु ढा के निस्र्पक potencies. विधि एक सरल transection का उपयोग करता है इस बाधा को बाधित करने और केंद्रीय synapses के लिए तैयार औषधीय उपयोग प्रदान करते हैं ।
वर्णित पद्धति की सबसे बड़ी ताकत है सादगी, reproducibility, और अपेक्षाकृत उच्च प्रवाह क्षमता इस प्रणाली के लिए निहित । प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत मास्टर करने के लिए आसान है, सेटअप थोड़ा अंतरिक्ष की आवश्यकता है, और केवल एक प्रारंभिक वित्तीय इनपुट आवश्यक है जो reagent और उपभोग्य सामग्रियों के लिए कम है । इसके अलावा, वर्णित विधि पूरी तरह से घर मक्खी, Musca domestica26के केंद्रीय अवरोही तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए संशोधन योग्य है

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Protocol

1. उपकरण और सामग्री

  1. Drosophila सीएनएस के सक्शन इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग की आवश्यक घटक ( सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध) तैयार करें ।
    नोट: प्रयोग करने से पहले, यह Drosophila सीएनएस के विच्छेदन के लिए चैंबर का निर्माण और रिकॉर्डिंग के दौरान खारा में गैंग्लिया स्नान के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए आवश्यक है । चैंबर निर्माण की एक कदम दर कदम रूपरेखा नीचे प्रदान की गई है ।
  2. लार्वा चैंबर तैयार करते हैं ।
    1. एक गर्म थाली का उपयोग कर काले मोम पिघला ।
    2. 2-२.५ मिलीलीटर की एक अधिकतम मात्रा है कि एक चैंबर में पिघला मोम की 2 मिलीलीटर डालो ।
    3. मोम ठंडा और लगभग 2 एच के लिए कठोर चलो ।
    4. एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें कठोर मोम कि ५०० µ एल, जो लगभग ०.५ सेमी2 और लगभग ०.२५ सेमी की गहराई के एक सतह क्षेत्र है की एक मात्रा पकड़ जाएगा में एक छेद उत्कीर्ण ।

2. उपकरण और सॉफ्टवेयर विंयास

नोट: extracellular रिकॉर्डिंग के सेटअप संक्षेप में नीचे वर्णित है ।

  1. विच्छेदन और रिकॉर्डिंग के लिए उपकरण तैयार करें ।
    1. फैराडे पिंजरे के अंदर ऊतक तैयारी, माइक्रोस्कोप, सक्शन इलेक्ट्रोड, micromanipulators, प्रकाश स्रोत की स्थिति शोर को कम करने और बाहरी बिजली के खेतों (चित्रा 2) को खत्म करने के लिए ।
    2. कनेक्ट (अधिमानतः मिलाप) जमीन और ढाल मगरमच्छ क्लिप है कि स्नान और microelectrode धारक, क्रमशः से जोड़ा जाएगा पर सकारात्मक तारों ।
      नोट: टांका और उजागर तारों शोर को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर किया जा सकता है ।
    3. जमीन और सकारात्मक तारों को एसी/डीसी विभेदक एम्पलीफायर के इनपुट 1 से कनेक्ट करें
    4. डाटा अधिग्रहण प्रणाली के एक संगीन Neill-Concelman (BNC) केबल से जोड़ने के द्वारा एसी/डीसी विभेदक एम्पलीफायर के लिए डेटा अधिग्रहण प्रणाली के चैनल 1 आउटपुट के लिए एम्पलीफायर के इनपुट 1 से कनेक्ट.
      नोट: यह डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और एम्पलीफायर के बीच एक 50/60 हर्ट्ज शोर eliminator को शामिल करने के लिए सिफारिश की है. एक BNC टी कनेक्टर के उपयोग की आवश्यकता है ।
    5. यदि वांछित, डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के इनपुट 1 के लिए ऑडियो मॉनिटर के इनपुट 1 को जोड़ने के द्वारा सेटअप में एक ऑडियो मॉनिटर शामिल हैं ।
    6. खारा के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और यह इलेक्ट्रोड धारक के दबाव बंदरगाह के लिए कनेक्ट.
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले सिरिंज के बीच मौजूद, एजी/AgCl गोली, और इलेक्ट्रोड खोलने.
  2. विच्छेदन और रिकॉर्डिंग के लिए सॉफ्टवेयर तैयार करें ।
    नोट: सॉफ्टवेयर सेटअप के लिए तरीकों की रूपरेखा की सामग्री है जो कच्चे बिजली के उत्पादन डिजिटलीकरण और डेटा में बदलने की आवृत्ति कील जाएगा तालिका में सूचीबद्ध अधिग्रहण/विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर आधारित है । हालांकि, अंय सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है और एकाधिक रिकॉर्डिंग कनवर्ज़न उपयोग किए जा सकते हैं ।
    1. प्राप्ति/विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें ।
    2. मुख्य उपकरण पट्टी से "सेटअप" पर क्लिक करें और "चैनल सेटिंग्स," जो एक संवाद बॉक्स खुल जाएगा का चयन करें ।
    3. तीन करने के लिए कुल चैनलों की संख्या कम करें ।
    4. चैनल 1 के लिए, १०० एमवी की एक श्रेणी का चयन करें ।
    5. चैनल 2 के लिए, "गणना" टैब पर क्लिक करें जो एक ड्रॉप-डाउन मेनू खोलेगा । चुनें "चक्रीय माप," जो एक दूसरा संवाद बॉक्स खुल जाएगा ।
    6. स्रोत के रूप में चैनल 1 का चयन करें । फिर ड्रॉप डाउन मेनू माप पर, घटनाओं पर इकाई स्पाइक का चयन करें । अंत में, पता लगाने सेटिंग्स क्षेत्र में, ड्रॉप डाउन मेनू से साधारण दहलीज का चयन करें.
    7. हर्ट्ज में व्यक्त की दर प्लॉट में विद्युत गतिविधि परिवर्तित करने के लिए, 3rd चैनल अंकगणित मोड में सेट किया जाना चाहिए: इनपुट विंडो पर, में टाइप करें "1000 * smoothsec (ch2, 2)" । फिर इकाइयों ड्रॉप डाउन मेनू हर्ट्ज के रूप में चयन करें ।
      नोट: सफल रिकॉर्डिंग एकाधिक अलग रिकॉर्डिंग setups के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन घटनाओं और सरल दहलीज पर "इकाई स्पाइक" संभावना सबसे आसान है, क्योंकि यह प्रत्येक व्यक्ति के लिए पृष्ठभूमि गतिविधि के ऊपर सीमा के समायोजन के लिए अनुमति देता है रिकॉर्डिंग. की सेटिंग के तहत रिकॉर्डिंग "कस्टम स्रोत इनपुट" पृष्ठभूमि गतिविधि संभालने डेटा की reproducibility वृद्धि रिकॉर्डिंग के बीच अलग नहीं है.
    8. मुख्य स्क्रीन पर लौटने के लिए संवाद बक्से बंद करें । y-अक्ष हर्ट्ज और समय में x-अक्ष में व्यक्त किया जाना चाहिए.

3. काटना और लार्वा Drosophila सीएनएस तैयार

नोट: लार्वा सीएनएस विच्छेदन के लिए तरीके स्पष्ट रूप से Hafer और Schedl27में सचित्र हैं, लेकिन इन पहले प्रकाशित तरीकों घटते न्यूरॉन्स की लंबाई कम है कि कील आवृत्ति को मापने के लिए महत्वपूर्ण हैं. यहाँ, एक अतिरिक्त विधि लार्वा सीएनएस लंबे, बरकरार घटते न्यूरॉन्स का कहना है कि आबकारी के लिए रेखांकित किया है.

  1. खारा तैयारी ।
    1. विच्छेदन और रिकॉर्डिंग खारा में निम्न करने के लिए mM28: १५७ NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, ४ २-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic एसिड (HEPES) तैयार; अनुमापन pH ते ७.२५.
  2. काटना लार्वा Drosophila सीएनएस ।
    1. की पहचान और एक भटक तीसरे instar Drosophila melanogaster संस्कृति शीशी और खारा (चित्रा 3ए) के २०० µ एल में जगह से निकालें ।
    2. समझ मुंह ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ हुक और संदंश (चित्र बी) की एक दूसरी जोड़ी के साथ कीड़ा के पेट समझ ।
      नोट: पेट के लिए बहुत अधिक दबाव लागू नहीं के रूप में इस कीड़ा की पतली cuticular परत के फाड़ में परिणाम कर सकते हैं ।
    3. धीरे सिर क्षेत्र से कीड़ा के caudal अंत अलग और कीड़ा (चित्रा 3सी) के आंत बेनकाब करने के लिए विभिन्न दिशाओं में मुंह हुक और पेट खींच ।
      नोट: सीएनएस को श्वासनली और पाचन तंत्र के साथ intertwined किया जाएगा । किसी भी ऊतक से दूर सीएनएस कटौती नहीं उतरते परिधीय नसों काटने को रोकने के लिए ।
    4. सीएनएस को पाचन तंत्र से बाहर छेड़ो और संदंश (फिगर 3d) के साथ श्वासनली ।
    5. यदि आवश्यक हो, मैंयुअल रूप से Vannas स्प्रिंग कैंची के साथ मस्तिष्क पालियों के लिए सीएनएस पीछे transecting द्वारा रक्त मस्तिष्क बाधा बाधित ।
      नोट: यह प्रयोग किया जा रहा रसायन के physiochemical गुणों के आधार पर करना चाहिए । चित्रा 4a में लाल रेखा का सुझाव दिया transection बिंदु और बरकरार अवरोही परिधीय तंत्रिका चित्र 4Bमें दिखाया चड्डी के साथ transected सीएनएस है । transected सीएनएस कदम 3.2.5 के पूरा होने के बाद प्रयोग के लिए तैयार है ।

4. Drosophila सीएनएस की Extracellular रिकॉर्डिंग ।

  1. रिकॉर्डिंग के लिए सीएनएस तैयार करें ।
    1. borosilicate ग्लास केशिकाओं से एक ग्लास पिपेट इलेक्ट्रोड 5-15 mΩ का एक प्रतिरोध करने के लिए खींचो ।
    2. मोम चैंबर है कि खारा के २०० µ एल में शामिल transected सीएनएस डालें । मगरमच्छ क्लिप के साथ एक अनजाना कीट पिन भूमि तार करने के लिए टांका दबाना और सर्किट को पूरा करने के लिए खारा में पिन डालें ।
    3. micromanipulators का प्रयोग, transected सीएनएस के caudal अंत करने के लिए इलेक्ट्रोड ओरिएंट. परिधीय तंत्रिका चड्डी से संपर्क करने से पहले अधिग्रहण/विश्लेषण सॉफ्टवेयर में दहलीज स्तर का समायोजन करके पृष्ठभूमि शोर की रिकॉर्डिंग को हटा दें ।
    4. सिरिंज पर मामूली नकारात्मक दबाव लागू करके सक्शन इलेक्ट्रोड में किसी भी सुविधाजनक परिधीय नसों ड्रा.
      नोट: आधारभूत फायरिंग आवृत्ति इलेक्ट्रोड में खींचा न्यूरॉन्स की संख्या से संबंधित है, जहां अधिक न्यूरॉन्स अक्सर इलेक्ट्रोड की वृद्धि प्रतिरोध में परिणाम.
  2. तंत्रिका गतिविधि उतरते सीएनएस के extracellular रिकॉर्डिंग शुरू करो ।
    1. डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर पर रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें और आधारभूत फायरिंग आवृत्ति की निगरानी । बेसलाइन फायरिंग दर डेटा एकत्रित करने से पहले 5 मिनट के लिए equilibrate करने के लिए फायरिंग दर की अनुमति दें ।
    2. तैयारी और रिकॉर्डिंग छोड़ें यदि नियंत्रण उपचार की गोलीबारी का पैटर्न एक फट पैटर्न के समान नहीं है कि चित्रा 5में दिखाया गया है ।
      नोट: फायरिंग की बदल पैटर्न केंद्रीय पैटर्न जनरेटर, जो तंत्रिका समारोह में परिवर्तन कर सकते हैं की असामान्य या अस्थिर गतिविधि का पता चलता है.
    3. 5 मिनट के बाद, जोड़ें २०० µ खारा के एल + वाहन के लिए चैंबर की कुल मात्रा लाने के लिए ४०० µ l रिकॉर्डिंग नियंत्रण फायरिंग दर शुरू करने के लिए.
    4. आधारभूत के बाद स्थापित किया गया है (3-5 मिनट), खारा के २०० µ एल को वापस लेने और खारा में प्रयोगात्मक एजेंट solubilized के २०० µ एल जोड़ें.
      नोट: Dimethyl sulfoxide (DMSO) lipophilic यौगिकों के लिए अनुशंसित विलायक है और ०.१% से अधिक नहीं होना चाहिए v /
    5. एक धारावाहिक तरीके से दवा सांद्रता लागू करें (उच्च सांद्रता के लिए कम) और रिकॉर्ड समय की एक चयन अवधि के लिए प्रत्येक एकाग्रता (जांच की रासायनिक गुणों पर आधारित जांचकर्ता द्वारा निर्धारित दवा29). दवा और अंतिम एकाग्रता शामिल है एक टिप्पणी सहित द्वारा अधिग्रहण/विश्लेषण सॉफ्टवेयर में दवा आवेदन के इस समय बिंदु लेबल ।
      नोट: सीएनएस के फायरिंग गतिविधि लगभग 10-20% द्वारा विच्छेदन के बाद 30-50 मिनट के बाद और इसलिए, उचित अनुपचारित नियंत्रण किया जाना चाहिए गिरावट आई है, और दवा उपचार इस समय अवधि से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  3. डेटा का विश्लेषण करें ।
    नोट: एकाधिक विश्लेषणों एकत्र डेटा पर किया जा सकता है, इस तरह के रूप में कार्रवाई संभावित फटने29, स्पाइक तरंग आयाम और समय पाठ्यक्रम में परिवर्तन, और निर्धारित मतलब स्पाइक आवृत्तियों ड्रग ट्रीटमेंट के बाद26,30 , 31 , ३२. सबसे आम के प्रभाव का निर्धारण है एक दवा समय की एक निर्धारित अवधि, जो नीचे वर्णित है पर मतलब स्पाइक आवृत्तियों के लिए है ।
    1. सारणीबद्ध ब्याज की पूरे क्षेत्र का चयन करके कील आवृत्तियों मतलब (यानी, दवा उपचार समय अवधि) और "Datapad" अधिग्रहण के मुख्य टूलबार पर स्थित के माध्यम से स्वचालित रूप से मतलब स्पाइक आवृत्तियों निर्धारित/ सॉफ्टवेयर.
    2. वाहन नियंत्रण (बेसलाइन) का मतलब स्पाइक आवृत्ति के लिए दवा उपचार के बाद सीएनएस का मतलब स्पाइक आवृत्ति का निर्धारण । सूत्र द्वारा दवा उपचार के बाद फायरिंग दर के प्रतिशत परिवर्तन की गणना: (इलाज आवृत्ति/आधारभूत आवृत्ति) × १०० ।
    3. मानक रेखांकन सॉफ्टवेयर के साथ एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करने के लिए प्रत्येक एकाग्रता के लिए नियंत्रण का मतलब स्पाइक आवृत्तियों या प्रतिशत फायरिंग का प्रयोग करें.
    4. समय अंक, सांद्रता, या नशीली दवाओं के उपचार के बीच महत्व को निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण (उदा., ख़राब t-परीक्षण) निष्पादित करें ।
      नोट: वहां पैदा करने और विश्लेषण एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता के लिए दो प्राथमिक तरीके हैं । पहली विधि व्यक्तिगत तैयारी के प्रति एक एकाग्रता है । यहां, एक एकाग्रता की कील दर प्रत्येक तैयारी के लिए आधारभूत स्पाइक दर को सामान्यीकृत है । लाभ कम कर रहे है छोटे रिकॉर्डिंग समय के कारण तैयारी के नीचे चला, जबकि नुकसान विच्छेदन समय बढ़ रहे हैं, क्योंकि इस विधि एकाग्रता के अनुसार 5-7 व्यक्तिगत सीएनएस तैयारियों से मिलकर होगा, और औसत डेटा पर बड़ा त्रुटि सलाखों सेट. दूसरी विधि व्यक्तिगत तैयारी प्रति एकाधिक सांद्रता है । यहां, 3-5 सांद्रता में से प्रत्येक के लिए स्पाइक दर एक ही आधारभूत कील दर को सामान्यीकृत कर रहे हैं । लाभ कम विच्छेदन समय और दवा सांद्रता के लिए दोहराने के बीच कम परिवर्तनशीलता है, जबकि नुकसान एक तेजी से अभिनय दवा और बाद में रासायनिक उपचार पर पिछले दवा एकाग्रता उपचार के अज्ञात प्रभाव की आवश्यकता है ।

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Representative Results

Drosophila केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से उत्पन्न होने वाले घटते परिधीय तंत्रिकाओं की सहज गतिविधि सुसंगत reproducibility के साथ extracellular सक्शन इलेक्ट्रोड का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है । आबकारी और transected Drosophila सीएनएस की सहज गतिविधि लगभग quiescent गतिविधि के करीब 1 एस के साथ गोलीबारी के 1-2 एस के साथ फटने की एक चक्रीय पैटर्न पैदा करता है । उदाहरण के लिए, सीएनएस के पास quiescent (1-2 हर्ट्ज) 0.5-1 एस के लिए, के बाद एक फट (100-400 हर्ट्ज) लगभग 1 एस के लिए, और फिर 0.5-1 s (चित्रा 5) के लिए एक निकट quiescent राज्य (1-2 हर्ट्ज) के लिए देता है । इस फायरिंग पैटर्न हर 2-3 एस दोहराया है । Drosophila सीएनएस पर्वतमाला के औसत स्पाइक निर्वहन आवृत्ति लगभग 20-50 हर्ट्ज से एक 3-5 मिनट की अवधि में, जब दहलीज बस आधारभूत शोर से ऊपर सेट है । बेसलाइन फायरिंग आवृत्ति इलेक्ट्रोड में तैयार परिधीय न्यूरॉन्स की संख्या और इलेक्ट्रोड छिद्र और ventral गैंग्लिया के बीच गठित सील करने के लिए संबंधित है. महत्वपूर्ण बात, ०.१% की एक अंतिम एकाग्रता पर रासायनिक विलायक DMSO के आवेदन Drosophila सीएनएस (आंकड़ा 5) के स्पाइक निर्वहन आवृत्ति में परिवर्तन नहीं करता है ।

यह electrophysiological तैयारी एक अच्छी तरह से विशेषता कीट तंत्रिका तंत्र की कील आवृत्ति पर विभिंन छोटे अणुओं के उत्तेजक या अवसाद के गुणों को चिह्नित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है । Propoxur, कीट एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ के एक ज्ञात अवरोधक (दर्द), एक neuroexcitant है और एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग (चित्रा Drosophila) में transected 5B सीएनएस के स्पाइक निर्वहन आवृत्ति वृद्धि हुई है । इसके विपरीत, गामा aminobutyric एसिड (गाबा), एक ज्ञात निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमीटर कीट गाबा-मध्यस्थता क्लोराइड चैनल पर अभिनय, एक neurodepressant है और एक एकाग्रता पर निर्भर तरीके से स्पाइक निर्वहन आवृत्ति कम (चित्रा 5C ). मतलब कील निर्वहन आवृत्तियों प्रत्येक एकाग्रता के लिए दर्ज की अवधि के पार निर्धारित करने के लिए एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र के निर्माण को सक्षम करने के लिए ५०% प्रभावी एकाग्रता (चुनाव आयोग५०) एक प्रतिक्रिया बटोरना निर्धारित कर सकते हैं । यहां, propoxur ३३८ एनएम (९५% विश्वास अंतराल (CI): 241-474; hillslope: १.८; r2: ०.७७) के एक चुनाव आयोग५० के एक एकाग्रता के साथ दिखाया गया है 1 µ एम नियंत्रण की ३००% गतिविधि पर Drosophila सीएनएस के अधिकतम उत्तेजना उत्पादन (चित्रा 5d)26। गाबा १.१ मिमी (९५% CI: 0.7-1.5; hillslope: १.५; आर2: ०.९५) के एक आईसी५० 5 मिमी (चित्रा 5E) पर अधिक से अधिक निषेध के साथ करने के लिए दिखाया गया है ।

अक्सर, तंत्रिका प्रणालियों की आणविक जांच कर रहे है शारीरिक या विषाक्तता उचित physiochemical गुण है कि रक्त मस्तिष्क बाधा के प्रवेश सक्षम की कमी के कारण परख में इस्तेमाल किया जा करने में सक्षम नहीं हैं । उदाहरण के लिए, monomeric tacrine एक शक्तिशाली (ca. २०० एनएम) कीट दर्द३३के अवरोध करनेवाला है, अभी तक बरकरार Drosophila सीएनएस के स्पाइक आवृत्ति (चित्रा 6A) बदल नहीं करता है । हालांकि, तंत्रिका lamella और मस्तिष्क पालियों के लिए transection पीछे के माध्यम से रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन १०० µ एम monomeric tacrine के लिए जोखिम के बाद Drosophila सीएनएस के स्पाइक आवृत्ति में एक के पास तत्काल वृद्धि में हुई ( चित्रा घमण्ड). इसी तरह का डेटा पहले30बताया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: थर्ड-instar Drosophila melanogaster से एक्साइज सीएनएस. तीर सीएनएस के विभिंन संरचनात्मक संरचनाओं कि लेबल के अनुरूप करने के लिए बिंदु । स्केल बार २५० µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

Figure 2
चित्र 2: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटअप extracellular रिकॉर्डिंग करने के लिए उपयोग किया जाता है । (क) फैराडे पिंजरे; (ख) कंपन सारणी; (ग) विदारक माइक्रोस्कोप; (घ) एसी/डीसी विभेदक एम्पलीफायर; (ङ) ऑडियो मॉनीटर; (च) रव eliminator; (छ) डाटा अधिग्रहण प्रणाली; (H) कंप्यूटर प्रयोगशाला चार्ट प्रो सॉफ्टवेयर चल रहा है; (I) बाहरी रोशनी स्रोत के साथ fiberoptic केबल; (ञ) micromanipulator; (कश्मीर) ग्लास इलेक्ट्रोड और तैयारी मोम पकवान के साथ दबाव बंदरगाह के साथ microelectrode धारक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: तृतीय-instar maggots से सीएनएस को एक्साइज करने के लिए विधि । (क) अक्षुण्ण कीड़ा में जलमग्न २०० µ l का खारा. तीर मुंह हुक है कि शरीर की दीवार की जुदाई के लिए उपयोग किया जाता है इंगित करता है । (ख) संदंश के दो जोड़े कीड़ा के बीच में रखा जाता है और मुंह पर शरीर की दीवार की जुदाई शुरू हुक । (ग) शरीर की दीवार आंत को बेनकाब करने के लिए मामूली और निरंतर दबाव लागू करने से अलग है । (घ) सीएनएस स्पष्ट रूप से दृश्यमान है (सफ़ेद तीर) और कभी-कभार आंत के साथ intertwined है । स्केल बार १००० µm, ७५० µm, ५०० µm, और २०० µm पैनलों A, B, C, और D, के लिए क्रमशः का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सीएनएस transecting द्वारा रक्त मस्तिष्क बाधा के व्यवधान । (एक) ventral गैंग्लिया के caudal अंत में स्पष्ट रूप से दिखाई नसों उतरते के साथ बरकरार सीएनएस । लाल रेखा BBB को बाधित करने के लिए सीएनएस को transecting का स्थान इंगित करती है । (ख) ventral गैंग्लिया के caudal अंत के साथ एक transected सीएनएस अभी भी लंबे उतरते ंयूरॉंस को उजागर । ventral गैंग्लिया को छोड दिया जा सकता है । स्केल बार दोनों पैनलों के लिए २०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: डी. melanogaster के तीसरे instar लार्वा के सीएनएस से Neurophysiological रिकॉर्डिंग प्रतिनिधि तंत्रिका निर्वहन से पहले और जोखिम के बाद निशान (क) DMSO, (ख) propoxur, और (ग) गाबा । प्रत्येक प्रयोग के लिए (हर्ट्ज) spikes में प्रारंभिक गोलीबारी आवृत्तियों प्रत्येक ट्रेस के बाईं ओर दिया जाता है. एकाग्रता-propoxur के लिए प्रतिक्रिया घटता (डी) और गाबा (ई) से melanogaster लार्वा के सीएनएस तंत्रिका निर्वहन करने के लिए प्रतिरूपित रिकॉर्डिंग (n = 3-5 सांद्रता प्रति वक्र, प्रत्येक एकाग्रता के साथ कम से कम 5 बार दोहराया). तीर दवा आवेदन के बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं । डेटा बिंदुओं का प्रतिनिधित्व आधारभूत गोलीबारी दर और त्रुटि पट्टियों का मतलब प्रतिशत वृद्धि मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । जब त्रुटि पट्टियां अनुपस्थित होती हैं, तो वह प्रतीक के आकार से छोटी होती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: सीएनएस के transection के बाद तंत्रिका तंत्र में tacrine की पैठ बढ़ी. (क) बरकरार है और (ख) transected लार्वा सीएनएस monomeric tacrine, जो तीर पर लागू किया गया था उजागर की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग । प्रत्येक प्रयोग के लिए (हर्ट्ज) spikes में प्रारंभिक गोलीबारी आवृत्तियों प्रत्येक ट्रेस के बाईं ओर दिया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

संबंधित वीडियो और पाठ में उपलब्ध कराए गए विवरण Drosophila सीएनएस पूर्व विवोकी गतिविधि और स्पाइक निर्वहन आवृत्ति रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रदान की है । विच्छेदन प्रभावकारिता विधि का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है क्योंकि कम या कुछ उतरते न्यूरॉन्स दोहराने के बीच बड़े विचरण में परिणाम होगा कि आधारभूत गोलीबारी दर कम हो जाएगा. हालांकि, एक बार विच्छेदन तकनीक में महारत हासिल कर ली गई है, इस परख के साथ एकत्र आंकड़ों अत्यधिक reproducible और विषयों की एक विस्तृत विविधता के लिए संशोधन कर रहे हैं । वर्णित विधि के लिए एक संशोधन एक स्वचालित फले सिस्टम है कि मैंयुअल रूप से सीएनएस चैंबर में खारा और रासायनिक समाधान पिपेट की आवश्यकता को रोकने जाएगा का समावेश है । फ्यूजन प्रणाली के शामिल किए जाने रिकॉर्डिंग के दौरान सीएनएस की गड़बड़ी कम हो जाएगी, जो कभी कभार मैनुअल पिपेट के साथ दवाओं के आवेदन के दौरान होते हैं ।

यह electrophysiological विधि दवा/कीटनाशक डिस्कवरी अनुसंधान में शामिल करने के लिए तैयारी की उपयोगिता का दोहन । इसके अलावा, इस तैयारी neurophysiology में मौलिक अवधारणाओं के प्रदर्शन के लिए कक्षा के लिए उत्तरदाई है । विधि अपेक्षाकृत मामूली वित्तीय निवेश और ंयूनतम तैयारी समय की आवश्यकता है, जबकि एक मजबूत और स्थिर रिकॉर्डिंग है कि करने के लिए उड़ान सीएनएस के समारोह के लिए दवाओं के प्रभाव को वर्णन नियोजित किया जा सकता है प्रदान करते हैं । उदाहरण के लिए, रिकॉर्डिंग रिग का वित्तीय बोझ लगभग $१०,००० अमरीकी डालर की एक प्रारंभिक लागत के साथ मामूली बाद की लागत (जैसे, खारा लवण, फ्लाई कॉलोनी रखरखाव, आदि) है । इसके अलावा, पहली रिकॉर्डिंग के लिए सीएनएस तैयारी से समय की जरूरत लगभग 10 मिनट है । हालांकि Drosophila एक प्रयोगशाला या कक्षा के भीतर संस्कृति में बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस सक्शन इलेक्ट्रोड परख भी रहवास के सीएनएस का उपयोग किया जा सकता है, Musca domestica, और शायद अन्य muscoid मक्खी लार्वा , के रूप में अच्छी तरह से । पशुओं के लिए Musca domestica की कीट स्थिति पता चलता है इस परख के लिए विभिंन आबादियों से मक्खियों के ंयूरॉन संवेदनशीलता को चिह्नित करने या नव विकसित की शक्ति का निर्धारण करने के लिए लक्ष्य कार्यक्रम अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपयोगिता का हो सकता है संक्रमण के अंतिम नियंत्रण के लिए neurotoxicants ।

दवाओं की शक्ति निस्र्पक के अलावा, इस तैयारी Drosophila तंत्रिका तंत्र की गतिविधि पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और हेरफेर के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पिछले काम से पता चला है कि सीएनएस-विशिष्ट पछाड़ना जीन एन्कोडिंग की आवक दिष्टकारी पोटेशियम (कीर) चैनल द्वारा आधारभूत सीएनएस फायरिंग आवृत्ति लगभग 2 गुना बढ़ जाती है जब नियंत्रण की तुलना में31मक्खियों. इन आंकड़ों को औषधीय डेटा के साथ संयुक्त अंततः शारीरिक भूमिका की कल्पना कीर चैनलों को Drosophila तंत्रिका तंत्र समारोह की सेवा कर रहे थे ।

हालांकि इस तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है एक शक्तिशाली परख विविध विषाक्तता और शारीरिक परिकल्पनाओं, परख करने के लिए सीमाओं का परीक्षण करने के लिए मौजूद है और विचार किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, सक्शन इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के माध्यम से उत्पन्न डेटा शायद ही कभी एक आयन चैनल के लिए एक दवा या सटीक शारीरिक भूमिका की कार्रवाई की सटीक मोड के लिए निर्णायक सबूत प्रदान करते हैं और इस तरह के रूप में अधिक सेल आधारित माप के साथ मिलकर अध्ययन किया जाना चाहिए पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी । इस विधि के लिए एक अतिरिक्त सीमा है कि विभिंन रिसेप्टर्स और आयन चैनल उप प्रकार एक समान तरीके से सीएनएस स्पाइक दर को प्रभावित नहीं करते । इसलिए, यह संभव है कि एक मॉडुलन के एक विशिष्ट रिसेप्टर या आयन-चैनल उपप्रकार काफी नहीं कर सकते हैं प्रभाव के स्पाइक दर पर एक्साइज सीएनएस, लेकिन वास्तव में हो सकता है एक महत्वपूर्ण प्रभाव पर कुल तंत्रिका तंत्र समारोह और/

हालांकि सीमाएं मौजूद हैं, चूषण इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के माध्यम से एकत्र डेटा गुणवत्ता सबूत की अवधारणा डेटा प्रदान करते हैं और शोधकर्ताओं ने वोल्टेज के माध्यम से मान्य किया जा सकता है कि कार्रवाई के तंत्र के बारे में परिकल्पनाओं उत्पन्न करने के लिए अनुमति-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, जैव रासायनिक विश्लेषण, या अतिरिक्त औषधीय परीक्षण के माध्यम से । उदाहरण के लिए, बाद की परिकल्पना है कि कीट से बचाने वाली क्रीम, एन, एनDiethyl-3-methylbenzamide (दीत), एक के लिए मच्छरों को विषाक्तता के तंत्र का वर्णन करने के प्रयास में कीट सीएनएस में octopaminergic प्रणाली बाधा था परीक्षण किया गया और 26मक्खियों । दीत को रहवास सीएनएस गतिविधि का neuroexcitant दिखाया गया था और postsynaptic जंक्शन पर पैदा हुई उत्तेजक neuromuscular क्षमता को भी बदल दिया गया था, जो क्रमशः कोलीनर्जिक और glutamatergic सिस्टम हैं। इन आंकड़ों का सुझाव दिया है कि दीत कोलीनर्जिक निषेध के माध्यम से विषाक्तता पैदा करने की संभावना नहीं थी, के रूप में पहले३४का सुझाव दिया था । phentolamine, एक ज्ञात octopamine प्रतिपक्षी के लिए जोखिम के बाद सीएनएस फ्लाई के निर्वहन आवृत्ति रिकॉर्डिंग, दीत मध्यस्थता neuroexcitation की एक पूरी संकोच दिखाया, लेकिन नहीं है कि propoxur, जो महत्वपूर्ण सबूत है कि दीत अधिक था प्रदान की octopaminergic प्रणाली प्रभावित होने की संभावना से छापी26. इन प्रकाशित डेटा सेट इस विधि के साथ जांच की जा सकती है कि परिकल्पनाओं और प्रायोगिक शर्तों की विविधता पर प्रकाश डाला ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम विच्छेदन और Drosophila सीएनएस के आंकड़े में दिखाया छवियों के लिए सुश्री रुई चेन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila melanogaster (strain OR) Bloomington Drosophila Stock Center 2376
Vibration isolation table Kinetic Systems 9200 series
Faraday Cage Kinetic Systems N/A
Dissecting Microscope on a Boom Nikon SMZ800N Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier ADInstruments AM3000H The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor ADInstruments AM3300
Hum Bug Noise Eliminator A-M Systems 726300
Data Acquisition System (PowerLab) ADInstruments PL3504 Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software ADInstruments N/A - Online Download
Fiber Optic Lights Edmund Optics 89-740 Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator World Precision Instruments M325
Microelectrode Holder World Precision Instruments MEH715 Different models are acceptable
BNC cables World Precision Instruments multiple based on size
Glass Capillaries World Precision Instruments PG52151-4
Microelectrode Puller Sutter Instruments P-1000 Also can use Narashige PC-100
Black Wax Carolina Biological Supply 974228
Non-coated insect pins, size #2 Bioquip 1208S2
Fince Forceps Fine Science Tools 11254-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03

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References

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