Elektrofysiologiske optagelse af centralnervesystemet aktivitet af tredje-Instar Drosophila Melanogaster

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at registrere den faldende elektriske aktivitet i Drosophila melanogaster centralnervesystemet at muliggøre omkostningseffektive og praktisk afprøvning af farmakologiske midler, genetiske mutationer af neurale proteiner, og/eller rollen af uudforskede fysiologiske veje.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Swale, D. R., Gross, A. D., Coquerel, Q. R., Bloomquist, J. R. Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster . J. Vis. Exp. (141), e58375, doi:10.3791/58375 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fleste af de aktuelt tilgængelige insekticider målrette nervesystemet og genetiske mutationer af hvirvelløse neurale proteiner give oftentimes skadelige konsekvenser, men de nuværende metoder til registrering af nervesystemet aktivitet af en individuel dyret er dyre og besværlige. Denne suge elektrode forberedelse af tredje-instar larve centrale nervesystem af Drosophila melanogaster, er en tractable system for at teste de fysiologiske virkninger af neuroactive agenter, bestemmelse af forskellige neurale fysiologiske betydning veje til CNS aktivitet samt påvirkning af genetiske mutationer til neurale funktion. Denne ex vivo forberedelse kræver kun moderat dissekere dygtighed og elektrofysiologiske ekspertise til at generere reproducerbare optagelser af insekt neuronal aktivitet. En lang række kemiske modulatorer, herunder peptider, kan derefter anvendes direkte på nervesystemet i løsning med fysiologisk saltvand til at måle indflydelse på CNS aktivitet. Yderligere, genetiske teknologier, såsom ordningen for GAL4/UAS kan anvendes uafhængigt eller i tandem med farmakologiske agenter til at fastslå rollen specifikke Ionkanaler, transportører eller receptorer til leddyr CNS funktion. I denne forbindelse er assays beskrevet heri af væsentlig interesse for insekticid toksikologer, insekt fysiologer og udviklingsmæssige biologer, D. melanogaster er en etableret model organisme. Målet med denne protokol er at beskrive en elektrofysiologiske metode hen til muliggøre måling af electrogenesis af det centrale nervesystem i model insekt, Drosophila melanogaster, som er nyttig ved afprøvning af en mangfoldighed af videnskabelige hypoteser.

Introduction

Det overordnede mål med denne tilgang er at sætte forskerne hurtigt måle electrogenesis af det centrale nervesystem (CNS) i model insekt, Drosophila melanogaster. Denne metode er pålidelig, hurtig og omkostningseffektiv til at udføre fysiologiske og toksikologiske forsøg. CNS er afgørende for liv og derfor den kritiske fysiologiske veje for ordentlig neurale funktion har været undersøgt grundigt i et forsøg på at forstå eller ændre neurale funktion. Karakterisering af den signaling veje inden for leddyr CNS har aktiveret opdagelsen af flere kemiske klasser af insekticider, der forstyrrer hvirvelløse neurale funktion til at fremkalde dødelighed samtidig begrænse off target konsekvenser. Evnen til at måle den neurale aktivitet af insekter er således af væsentlig interesse for feltet insekt toksikologi og fysiologi nervesystemet er målvæv af fleste af indsat insekticider1. Alligevel fortsatte vækst af grundforskning og anvendt viden om insekt nervesystemet kræver avancerede neurofysiologiske teknikker, der er begrænset i gennemførlighed, da nuværende teknikker er arbejdsintensive og kræver en høj regning, insekt neurale cellelinjer er begrænset, og/eller der er begrænset adgang til de centrale synapser af de fleste leddyr. I øjeblikket, kræver karakterisering af de fleste insekt neurale proteiner det mål at blive klonet og heterologously gav udtryk for efterfølgende drug discovery og elektrofysiologiske optagelser, som blev beskrevet for insekt indad ensretter kalium kanaler2 , insekt ryanodine receptor3, myg spænding-følsomme K+ kanaler4, m.fl. For at dæmpe kravet om Heterolog ekspression og mulighederne for at lave funktionelle udtryk, Bloomquist og kolleger havde til formål at fremkalde en neuronal fænotype i kulturperler Spodoptera frugiperda (Sf21) celler som en roman metode for insekticid discovery5,6. Disse metoder giver en gyldig tilgang til udvikling af nye kemi, men de skaber ofte en uoverstigelig flaskehals for karakterisering af farmakologiske midler, at identificere mekanismer af insekticidresistens og karakterisering grundlæggende fysiologiske principper. Her, beskriver vi en ex vivo -metode, der muliggør registrering af elektrisk aktivitet fra en model insekt, der har plastisk genetik7,8,9 og kendte udtryk mønstre af neurale komplekser10,11,12 aktivere karakterisering af resistensmekanismer på niveau af nerven, virkningsmekanisme af nyudviklede narkotika og andre toksikologiske undersøgelser.

Frugtflue, D. melanogaster, er en fælles model organisme for at definere insekt neurale systemer eller insekticid virkningsmekanisme og er blevet etableret som en velegnet model organisme for undersøgelse af toksikologiske13, farmakologiske14 ,15, neurofysiologiske16og patofysiologiske17,18,19,20 processer af hvirveldyr. D.melanogaster er en holometabolous insekt, der udfører komplet metamorfose, herunder en larve og puppe stadie før de når den reproduktive voksne fase. I hele den udviklingsmæssige proces, nervesystemet gennemgår betydelige remodellering på forskellige livsstadier, men larver CNS vil være i fokus i denne metode. Den fuldt udviklede larve CNS er anatomisk enkel med bryst- og abdominal-segmenter, der er smeltet og danne den ventrale ganglion, som repræsenterer en bred vifte af gentagne og næsten identiske neuromeric enheder21,22. Faldende motoriske nerver stammer fra den caudale årets subesophageal ganglier og ned for at innerverer kroppen væggen muskler og viscerale organer af larverne. Figur 1 beskriver brutto anatomi af den larve Drosophila CNS.

Drosophila blod - hjerne barrieren (BBB) udvikler sig i slutningen af embryogenese og er dannet af subperineurial glial celler (SPG)21. SPG celler danner talrige filopodia-lignende processer, der spredes ud til at etablere en sammenhængende, meget flad, endotel-lignende ark, der dækker det hele Drosophila CNS23. Drosophila BBB har ligheder med hvirveldyr BBB, som omfatter bevarelse homeostase af de neurale mikromiljø ved styring optagelse af næringsstoffer og fremmedstoffer i CNS21. Dette er en forudsætning for pålidelige neurale transmission og funktion, men beskyttelse af CNS af BBB begrænser gennemtrængning af syntetiske stoffer, de fleste peptider og andre fremmedstoffer24,25, som introducerer potentiale problemer når kendetegner kræfter af små-molekyle modulatorer. Metoden bruger en simpel transection til at afbryde denne barriere og give klar farmakologiske adgang til de centrale synapser.
Den største styrke af den beskrevne metode er enkelhed, reproducerbarhed og relativt høj overførselshastighed kapacitet iboende til dette system. Protokollen er relativt let at mestre, setup kræver lidt plads, og kun en indledende finansielle input er nødvendig som er reduceret til reagenser og hjælpematerialer. Yderligere, den beskrevne metode er helt ændres til at optage den centrale faldende nerve aktivitet af huset flue, Musca domestica26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. udstyr og materialer

  1. Forbered de nødvendige komponenter (opført i Tabel af materialer) Elektrofysiologi riggen til at udføre suge elektrode optagelser af Drosophila CNS.
    Bemærk: Før eksperimenter er det nødvendigt at konstruere kamre til dissektion af Drosophila CNS og skal bruges til badning ganglier i saltvand under optagelser. En trinvis oversigt over kammer konstruktion er angivet nedenfor.
  2. Forberede larve salen.
    1. Smelt den sorte voks med en varm tallerken.
    2. Hæld 2 mL af smeltet voks i et kammer, der har en maksimal volumen på 2-2,5 mL.
    3. Lad voks køle og hærde i ca 2 timer.
    4. Bruge et barberblad til at skære et hul i hærdet voks, der vil holde et volumen på 500 µL, som har et areal på ca. 0,5 cm2 og en dybde på ca. 0,25 cm.

2. udstyr og softwarekonfiguration

Bemærk: Opsætning af ekstracellulære optagelsen er kort beskrevet nedenfor.

  1. Forberede udstyr til dissektion og optagelse.
    1. Placer væv forberedelse, mikroskop, suge elektrode, micromanipulators, lyskilde inde Faraday bur til at reducere støj og fjerne fremmede elektriske felter (figur 2).
    2. Tilslut (helst lodde) jorden og positive ledninger på afskærmet krokodillenæb, der vil være forbundet til bad og mikroelektrode indehaveren, henholdsvis.
      Bemærk: Loddes og udsatte ledninger kan dækkes med alufolie til at reducere støj.
    3. Tilslut jorden og positive ledninger til indgang 1 af AC/DC differential forstærker.
    4. Tilslut dataoptegningssystem til AC/DC differential forstærker ved at tilslutte en bajonet Neill-Concelman (BNC) kabel fra input 1 af dataoptegningssystem kanal 1 udgang til forstærker.
      Bemærk: Det anbefales at indarbejde en 50/60 Hz støj eliminator mellem data erhvervelse software og forstærkeren. Brugen af et BNC T-stik er påkrævet.
    5. Hvis det ønskes, omfatte en lyd monitor ind i setup ved at forbinde input 1 af den lyd monitor til indgang 1 data erhvervelse software.
    6. Fylde 10 mL sprøjte med saltvand og Tilslut det til pres-porten af elektrode indehaveren.
      Bemærk: Sikre, at der ingen luftbobler mellem sprøjten, Ag/AgCl pellet og elektrode åbning.
  2. Forberede softwaren til dissektion og optagelse.
    Bemærk: Omridset af metoder til software installation er baseret på erhvervelse/analyse programmel listet i Tabel af materialer , som vil digitalisere den rå elektriske output og konvertere data til spike frekvens. Men andre software kan bruges og flere optagelse konverteringer kan bruges.
    1. Åbn erhvervelse/analyse software.
    2. Klik på "setup" fra hovedværktøjslinjen, og vælg "Kanalindstillinger", som vil åbne en dialogboks.
    3. Reducere antallet af samlede kanaler til tre.
    4. Til kanal 1, markere en række 100 mV.
    5. Klik på fanen "beregning", som vil åbne en rullemenu for kanal 2. Vælg "cykliske målinger," som vil åbne en anden dialogboks.
    6. Vælg kanal 1 som kilde. Vælg derefter enhed spike på begivenheder på henlægge nede menu måling. Endelig, i området registrering af indstillinger fra drop down menuen vælge enkel tærskel.
    7. For at konvertere den elektriske aktivitet i en sats plot udtrykt i hertz, 3rd kanal skal angives i aritmetisk tilstand: input vinduet, Skriv i "1000*smoothsec(ch2,2)". Vælg derefter som enheder drop down menu hertz.
      Bemærk: Vellykket optagelser kan udføres med flere forskellige optagelse opsætninger, men "Enhed spike på begivenheder og enkel tærskel" er sandsynligvis den nemmeste, da det giver mulighed for justering af tærsklen ovenfor baggrund aktivitet for den enkelte optagelse. Optagelser under indstillingen af "Custom-kilde Input" øge reproducerbarhed af data under forudsætning af baggrund aktivitet ikke er anderledes mellem optagelser.
    8. Tæt dialogbokse til at vende tilbage til hovedskærmen. Y-aksen skal udtrykkes i Hz og x-aksen i tid.

3. dissekere og forberede den larve Drosophila CNS

Bemærk: Metoder til larve CNS dissektion er klart illustreret i Hafer og Schedl27, men disse tidligere udgivne metoder reducere længden af de faldende neuroner, der er vigtige for måling spike frekvens. Her, er en supplerende metode skitseret punktafgifter larve CNS, der opretholder lange, intakt faldende neuroner.

  1. Saltvand forberedelse.
    1. Forberede dissektion og optagelse saltvand til følgende i mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre (HEPES); titreres pH til 7,25.
  2. Dissekere den larve Drosophila CNS.
    1. Identificere og udtrække en omvandrende tredje-instar Drosophila melanogaster fra kultur hætteglas og plads til 200 µL af saltvand (figur 3A).
    2. Gribe mund kroge med et par fine pincet og forstå i maven af maddike med et andet par pincet (figur 3B).
      Bemærk: Gælde ikke for meget pres til maven, da dette kan resultere i rivning af det tynde cuticular lag af maddike.
    3. Træk forsigtigt munden kroge og maven i forskellige retninger for at adskille den caudale slutningen af maddike fra regionen hoved og udsætte indvolde af maddike (figur 3 c).
      Bemærk: CNS hænger sammen med luftrør og fordøjelseskanalen. Ikke skære CNS fra alle væv for at forhindre, at skære de faldende perifere nerver.
    4. Drille CNS ud af fordøjelseskanalen og luftrør med pincet (figur 3D).
    5. Hvis det er nødvendigt, forstyrre blod-hjerne barrieren af manuelt transecting CNS posteriort for den cerebrale kamre med markriyor foråret saks.
      Bemærk: Dette bør gøres baseret på lægemiddels egenskaber af den kemiske, der anvendes. Den røde linje i figur 4A er det foreslåede transection punkt og transected CNS med intakt faldende perifere nerve kufferter vist i figur 4B. Transected CNS er klar til eksperimenter efter afslutningen af trin 3.2.5.

4. ekstracellulære optagelse af Drosophila CNS.

  1. Forberede optagelse CNS.
    1. Trække et glas pipette elektrode fra borsilikatglas kapillærer til en resistens af 5-15 MΩ.
    2. Indsæt transected CNS i voks kammer, som indeholder 200 µL af saltvand. Klemme en ubestrøget insekt pin med alligator klippet loddet til jordledningen og sæt stiften i saltvand til at fuldføre banen.
    3. Ved hjælp af micromanipulators, orient elektrode til caudale slutningen af transected CNS. Fjerne optagelse af baggrundsstøj ved at justere tærskelværdi i anskaffelse/analyse software før du kontakter de perifere nerve kufferter.
    4. Tegn enhver praktisk perifere nerver til at suge elektroden ved at anvende mindre negative pres på sprøjten.
      Bemærk: Den oprindelige affyring frekvens er korreleret til antallet af neuroner trukket ind i elektroden hvor flere neuroner oftentimes resultere i øget modstand af elektrode.
  2. Begynde ekstracellulære optagelse af CNS faldende nerve aktivitet.
    1. Starte optagelsen på data erhvervelse software og overvåge grundlinjen affyring frekvens. Tillad fyring sats til blandingen henstår i 5 min før indsamling baseline fyring sats data.
    2. Kassér forberedelse og optagelse, hvis mønster af affyring af kontrol behandling ikke er en bristende mønster ligner som vist i figur 5A.
      Bemærk: Ændrede mønster af fyring tyder på unormale eller ustabil aktivitet af centrale mønster generator, som kan ændre neurale funktion.
    3. Efter 5 min, tilsættes 200 µL af saltvand + køretøj til at bringe den samlede mængde af salen til 400 µL begynde optagelse kontrol fyring priser.
    4. Efter baseline har været etableret (3-5 min), trække 200 µL af saltvand og tilføje 200 µL af den eksperimentelle agent oploeses i saltvand.
      Bemærk: Dimethylsulfoxid (DMSO) er den anbefalede opløsningsmiddel for lipofile forbindelser og bør ikke overstige 0,1% v/v.
    5. Anvende stof koncentrationer i en seriel måde (lav til høj koncentration) og optage hver koncentration for en udvalgt periode (bestemmes af investigator baseret på de kemiske egenskaber af narkotika29). Mærke dette tidspunkt af lægemiddel ansøgning i anskaffelse/analyse software ved at inkludere en kommentar, der indeholder stoffet og den endelige koncentration.
      Bemærk: Brænding aktivitet af CNS vil falde med ca. 10-20% efter 30-50 min. efter dissektion og derfor passende ubehandlet kontrol bør udføres, og lægemiddelsbehandlinger bør ikke overstige denne tidsperiode.
  3. Analysere dataene.
    Bemærk: Flere analyser kan udføres på de indsamlede data, såsom ændringer i aktionspotentialet byger29, spike bølgeform amplitude og tidsforløb, og bestemme middelværdi spike frekvenser efter narkotika behandling26,30 , 31 , 32. den mest almindelige er at fastlægge den indflydelse, en drug har betyde spike frekvenser over en bestemt periode, som er beskrevet nedenfor.
    1. Tabulate gennemsnitlige spike frekvenser ved at vælge hele området af interesse (dvs. narkotikabehandling periode) og bestemme middelværdi spike frekvenser automatisk gennem "Datapad" placeret på hovedværktøjslinjen erhvervelse/analyse software.
    2. Bestemme den gennemsnitlige spike hyppigheden af CNS efter narkotikabehandling gennemsnitlige spike hyppigheden af kontrolelementet køretøjets (baseline). Beregn procentvise ændring af fyring sats efter behandling af formlen: (behandlet frekvens/Baseline frekvens) × 100.
    3. Brug de gennemsnitlige spike frekvenser eller procent affyring af kontrol for hver koncentration for at konstruere en koncentration respons kurven med standard graftegning software.
    4. Statistisk analyse (fx parrede t-test) til at bestemme betydning mellem tidspunkter, koncentrationer eller medicinsk behandling.
      Bemærk: Der er to primære metoder til at skabe og analysere koncentration-respons-kurver. Den første metode er en fusion per individuelle forberedelse. Her, er spike satsen for den enkelt koncentration normaliseret til baseline spike rate for hvert præparat. Fordelene er reduceret køre ned af forberedelse grund afkortet optagetid, mens faldgruberne er øget dissektion tid, fordi denne metode vil bestå af 5-7 individuelle CNS præparater pr. koncentration, og større fejllinjer på den gennemsnit data sæt. Den anden metode er flere koncentrationer pr. individuelle forberedelse. Her, spike sats for hvert af de 3-5 koncentrationer er normaliseret til samme baseline spike sats. Fordelene er mindre dissektion tid og mindre variation mellem replikater for drug koncentrationer, mens faldgruberne er kravet om en hurtigt virkende stof og ukendte virkninger af tidligere lægemiddelsbehandlinger koncentration på efterfølgende kemiske behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spontan aktivitet af de faldende perifere nerver udspringer Drosophila centralnervesystemet kan registreres ved hjælp af ekstracellulære suge elektroder med konsekvent reproducerbarhed. Spontan aktivitet af den skåret og transected Drosophila CNS producerer en cyklisk mønster af sprængfyldt med 1-2 s fyring med ca 1 s af nær inaktiv aktivitet. For eksempel, CNS er nær inaktiv (1-2 Hz) til 0,5-1 s, efterfulgt af et anfald (100-400 Hz) for ca 1 s, og derefter vender tilbage til en i nærheden af inaktiv tilstand (1-2 Hz) til 0,5-1 s (figur 5A). Denne affyring mønster der gentages hver 2-3 s. Den gennemsnitlige spike decharge hyppigheden af Drosophila CNS spænder fra ca 20-50 Hz i løbet af 3-5 min, når grænsen er sat lige over baseline støj. Baseline affyring frekvens er korreleret til antallet af perifere neuroner trukket ind i elektroden og segl dannet mellem elektrode blænde og de ventrale ganglier. Vigtigere, ændrer anvendelsen af de kemiske opløsningsmidlet DMSO i en endelig koncentration på 0,1% ikke spike decharge hyppigheden af Drosophila CNS (figur 5A).

Dette elektrofysiologiske præparat indeholder en metode til at karakterisere de excitatoriske eller depressivt egenskaber af forskellige små molekyler på spike hyppigheden af en vel karakteriseret insekt neurale system. Propoxur, en kendt hæmmer af insekt acetylcholinesterase (AChE), er en neuroexcitant og øget spike decharge hyppigheden af de transected Drosophila CNS i en koncentration-afhængige måde (figur 5B). Tværtimod, gamma - aminosmørsyre (GABA), en kendt hæmmende neurotransmitter handler på insekt GABA-medieret klorid-kanal, er en neurodepressant og reduceret spike decharge frekvens i en koncentration-afhængige måde (figur 5 c ). : Spike udledning frekvenser kan bestemmes på tværs af den registrerede tidsperiode for hver koncentration at muliggøre opførelsen af en koncentration responskurve til at bestemme den 50% effektiv koncentration (EF50) til at fremkalde en reaktion. Her, propoxur er vist at have en EF50 af 338 nM (95% konfidensinterval (CI): 241-474; hillslope: 1,8; r2: 0,77) med en koncentration på 1 µM producerer maksimal excitation af Drosophila CNS på 300% aktivitet af kontrol (figur 5 D)26. GABA er vist at have en IC50 af 1,1 mM (95% CI: 0,7-1,5; hillslope: 1,5; r2: 0,95) med maksimal hæmning på 5 mM (figur 5E).

Oftentimes, er Molekylær sonder af neurale systemer ikke i stand til at blive anvendt i fysiologiske eller toksikologiske assays på grund af deres mangel på ordentlig lægemiddels egenskaber, der aktiverer gennemtrængning af blod-hjerne barrieren. For eksempel, monomere Tacrin er en potent (ca. 200 nM) hæmmer af insekt AChE33, endnu ikke ændre spike hyppigheden af de intakte Drosophila CNS (figur 6A). Dog resulterede afbrydelse af den neurale lamel og blod-hjerne barrieren gennem transection posteriort for de cerebrale lapper i en i nærheden af øjeblikkelig stigning i spike hyppigheden af Drosophila CNS efter udsættelse for 100 µM monomere Tacrin ( Figur 6B). Lignende data har været tidligere beskrevne30.

Figure 1
Figur 1: skåret ud CNS fra tredje-instar Drosophila melanogaster. Pilene peger på forskellige anatomiske strukturer af CNS, der svarer til etiketterne. Skalalinjen repræsenterer 250 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Elektrofysiologi setup, som bruges til at udføre ekstracellulære optagelser. (A) Faraday bur; (B) vibrationer tabel; (C) dissekere mikroskop; (D) AC/DC differential forstærker; (E) lyd monitor; (F) støj eliminator; (G) dataoptegningssystem; (H) computer kører lab diagram pro software; (I) fiberoptisk kabel med ekstern belysning kilde; (J) micromanipulator; (K) mikroelektrode indehaveren med pres port med glas elektrode og forberedelse voks parabol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: metode til udtagelse CNS fra tredje-instar maddiker. (A) intakt maddike neddykket i 200 µL af saltvand. Pilen angiver munden kroge, der bruges til adskillelse af kroppen væggen. (B) to par pincet er placeret på midten af maddike og på munden kroge at begynde adskillelse af kroppen væggen. (C) kroppen væggen er adskilt af lille og kontinuerlig pressionsmiddel til at eksponere indvolde. (D) CNS er klart synlig (hvid pil) og er undertiden forbundet med organerne. Skalalinjen repræsenterer 1000 µm, 750 µm, 500 µm og 200 µm for paneler A, B, C og D, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: afbrydelse af blod-hjerne barrieren af transecting CNS. (A) intakt CNS med faldende nerver klart synlige enden halefinne af de ventrale ganglier. Den røde linje angiver placeringen af transecting CNS for at forstyrre BBB. (B) A transected CNS med caudale slutningen af de ventrale ganglier stadig udsætter længe faldende neuroner. De ventrale ganglier kan kasseres. Skalalinjen repræsenterer 200 µm for begge paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: neurofysiologiske optagelser fra CNS af tredje-instar larver af D. melanogaster. Repræsentative nerve decharge spor før og efter udsættelse for (A) DMSO, (B) propoxur og (C) GABA. Indledende fyring frekvenser i pigge/s (Hz) for hvert forsøg er givet til venstre for hvert spor. Koncentration-respons kurver for propoxur (D) og GABA (E) til CNS nerve udledning af D. melanogaster larver fra replikerede optagelser (n = 3-5 koncentrationer pr. kurve, med hver koncentration replikeret mindst 5 gange). Pile repræsenterer drug application. Datapunkter udgør gennemsnitlig procent stigning i baseline fyring sats og fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Når fejllinjer er fraværende, er det fordi de er mindre end størrelsen på symbolet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: øget penetration af Tacrin i nervesystemet efter transection af CNS. Repræsentative optagelser af (A) intakt og (B) transected larve CNS udsat for monomere Tacrin, som blev anvendt på pilen. Indledende fyring frekvenser i pigge/s (Hz) for hvert forsøg er givet til venstre for hvert spor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oplysninger i den tilhørende video og tekst har givet vigtige trin for at registrere aktivitet og spike decharge hyppigheden af Drosophila CNS ex vivo. Dissektion effektivitet er det mest kritiske aspekt af metoden for korte eller par faldende neuroner vil mindske den oprindelige fyring sats, som vil resultere i store afvigelser mellem replikater. Men når dissektion teknik har været behersket, de indsamlede data med denne analyse er meget reproducerbare og ændres til en bred vifte af discipliner. En ændring af den beskrevne metode er medtagelsen af en automatiseret overfloden system, der vil forhindre at skulle manuelt afpipetteres saltvand og kemiske løsninger i CNS kammer. Optagelse af overfloden system vil reducere forstyrrelser af CNS under optagelser, som lejlighedsvis forekommer under anvendelse af stoffer med manuel pipetter.

Denne elektrofysiologiske metode udnytter nytten af forberedelse til indbygning i stof/insekticid discovery forskning. Dette præparat er endvidere indstillet til klasseværelse for demonstration af grundlæggende begreber i neurofysiologi. Metoden kræver relativt beskedne finansielle investeringer og minimal forberedelse og samtidig giver en robust og stabil optagelse, der kan anvendes til at illustrere påvirkning af stoffer til funktionen af flyve CNS. For eksempel, er den finansielle byrde af optagelse riggen en indledende omkostninger på ca $10.000 USD med mindre efterfølgende omkostninger (f.eks. saltvand salte, flyve koloni vedligeholdelse, osv.). Yderligere, den tid, det tager fra CNS forberedelse til første indspilning er ca 10 min. Selvom Drosophila er nemme at vedligeholde i kultur i et laboratorium eller klasseværelset, skal det bemærkes, at denne suge elektrode assay kan også udføres ved hjælp af CNS flue, Musca domesticaog sandsynligvis også andre muscoid flyve larver , så godt. Status for skadedyr af Musca domestica til husdyr antyder dette assay kunne være af stor nytte hen til forskning programmer, der sigter til at karakterisere neuronal følsomheden af fluer fra forskellige befolkningsgrupper eller for at bestemme styrken af nyligt udviklet neurotoxicants til eventuel kontrol af skadedyrsangreb.

Ud over kendetegner styrken af narkotika, kan dette præparat bruges til at karakterisere indflydelse af genetiske mutationer og manipulation på aktiviteten i nervesystemet, Drosophila . Tidligere arbejde har vist, at CNS-specifikke knockdown gen kodning indad ensretter kalium (Kir) kanal øget baseline CNS affyring frekvens af ca 2-fold sammenlignet for at styre fluer31. Disse data blev kombineret med farmakologiske data til i sidste ende spekulere fysiologiske rolle Kir kanaler tjene til Drosophila nervesystemet funktion.

Selv om denne teknik er en kraftfuld assay at teste forskellige toksikologiske og fysiologiske hypoteser, begrænsninger til analysen eksisterer og skal tages i betragtning. For eksempel, de data, der genereres via suge elektrode optagelser sjældent give afgørende bevis for den nøjagtige virkningsmekanisme af et lægemiddel eller præcise fysiologiske rolle for en ion-kanal og skal undersøges i tandem med flere celle-baserede målinger, som patch klemme Elektrofysiologi. En yderligere begrænsning til denne metode er, at de forskellige receptorer og ion-kanal undertyper ikke påvirker CNS spike sats på samme måde. Det er derfor muligt, at en graduering af en bestemt receptor eller ion-kanal subtype ikke kan væsentligt påvirke spike sats af skåret CNS, men kan faktisk have en afgørende effekt på samlede nervesystemet funktion og/eller integration af signaler.

Selv om begrænsninger findes, data indsamlet gennem suge elektrode optagelser levere kvalitet proof-of-concept data og giver forskere til at generere hypoteser om virkningsmekanismer der kan valideres gennem spænding-klemme Elektrofysiologi, biokemiske analyser, eller gennem yderligere farmakologiske undersøgelser. For eksempel, den sidstnævnte blev udført for at teste hypotesen at insektmiddel, N, N- diethyletheren-3-methylbenzamide (DEET), var hæmme octopaminergic system i insekt CNS i et forsøg på at beskrive mekanismen af toksicitet for myg og flyver26. DEET var vist sig at være en neuroexcitant flue CNS aktivitet og også ændret evoked excitatoriske postsynaptiske potentiale på den neuromuskulære junction, som er kolinerge og glutamatergic systemer, henholdsvis26. Disse data foreslog at DEET ikke var sandsynligt at fremkalde toksicitet gennem kolinerge hæmning, som var tidligere foreslåede34. Optagelse decharge hyppigheden af flyve CNS efter eksponering for phentolamine, en kendt octopamine antagonist, viste en fuldstændig hæmning af DEET-medieret neuroexcitation, men ikke for propoxur, som ydes betydelige beviser at DEET var mere sandsynligvis påvirker octopaminergic systemet end AChE26. Disse offentliggjorte datasæt fremhæve forskellige hypoteser og forsøgsbetingelser, som kan undersøges med denne metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Ms. Rui Chen for dissektion og billeder af Drosophila CNS vist i figurerne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila melanogaster (strain OR) Bloomington Drosophila Stock Center 2376
Vibration isolation table Kinetic Systems 9200 series
Faraday Cage Kinetic Systems N/A
Dissecting Microscope on a Boom Nikon SMZ800N Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier ADInstruments AM3000H The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor ADInstruments AM3300
Hum Bug Noise Eliminator A-M Systems 726300
Data Acquisition System (PowerLab) ADInstruments PL3504 Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software ADInstruments N/A - Online Download
Fiber Optic Lights Edmund Optics 89-740 Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator World Precision Instruments M325
Microelectrode Holder World Precision Instruments MEH715 Different models are acceptable
BNC cables World Precision Instruments multiple based on size
Glass Capillaries World Precision Instruments PG52151-4
Microelectrode Puller Sutter Instruments P-1000 Also can use Narashige PC-100
Black Wax Carolina Biological Supply 974228
Non-coated insect pins, size #2 Bioquip 1208S2
Fince Forceps Fine Science Tools 11254-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
  2. Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
  3. Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
  4. Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).
  5. Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90, (3), 131-139 (2015).
  6. Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
  7. Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39, (6), 715-720 (2007).
  8. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, (1-2), 1-15 (2002).
  9. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, (3), 176-188 (2002).
  10. Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64, (5), 515-519 (2012).
  11. Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16, (1), 65-80 (2017).
  12. Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7, (5), 584-595 (2007).
  13. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13, (7), e1006907 (2017).
  14. Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491, (2-3), 207-208 (2004).
  15. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63, (2), 411-436 (2011).
  16. Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26, (35), 8943-8954 (2006).
  17. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, (22), 8024-8029 (2005).
  18. Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283, (36), 24972-24981 (2008).
  19. Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176, (6), 831-841 (2007).
  20. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7, (11), 1075-1080 (2000).
  21. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  22. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, (44), 15870-15883 (2011).
  23. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6, (2), 232-243 (2017).
  24. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7, (1), 41-53 (2006).
  25. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9, (9), 901-910 (2008).
  26. Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9, (8), e103713 (2014).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
  28. Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5, (1), 45-50 (2003).
  29. Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19, (1), 17-25 (1992).
  30. Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83, (4), 180-194 (2013).
  31. Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8, (1), 1617 (2018).
  32. Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8, (1), 2 (2016).
  33. Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106, (3), 85-92 (2013).
  34. Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics