גבוהות בתוספת מבוך מבחן משולב עם וידאו מעקב תוכנה כדי לחקור את האפקט נוגד חרדה של תוספי תזונה קטוגנית אקסוגני

Behavior
 

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור שינויים ברמת החרדה של מודלים בעלי חיים מכרסם. מוגברות וגם מבוך במבחן (EPM), המשמש יחד עם וידאו מעקב תוכנה, מספק שיטה אמינה לתעד את ההשפעה של טיפולים שונים נוגד חרדה פוטנציאליים בתרחישים מעבדה פרה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

המטרה הכוללת של מחקר זה היא לתאר את המתודולוגיה של גבוה וגם מבחן מבוך (EPM) בשילוב עם תוכנת מעקב וידאו. מטרת השיטה היא לתעד את ההשפעה של טיפולים שונים נוגד חרדה אפשריות בדגמים מכרסמים מעבדה. הבדיקה EPM מבוסס על נטייה של המכרסמים לעבר מקומות אפלים מוגן, סגור והפחד unconditioned שטחים פתוחים הגולן ואת המוטיבציה שלהם אינטנסיבי מולדת לחקור סביבות הרומן. EPM המבחן הוא מבחן ההתנהגות בשימוש נרחב עבור חוקרים את התגובות נוגד חרדה או anxiogenic של מכרסמים מקבלים תרופות אשר ידוע כי הן משפיעות על התנהגות. תצפית הוכחת שיעור מופחת של הזמן שהושקע ידיים סגורות, שיעור מוגבר של הזמן שהושקע זרועות פתוחות מספר מופחת של ערכי על זרועותיו סגורות, מספר גבוה של ערכי לפתוח זרועות נמדדת במבחן EPM עשוי לשקף מופחת רמות החרדה. באמצעות שיטה זו, נבחנה השפעת תוספי קטון אקסוגני על התנהגות הקשורות לחרדה בחולדות ספראג Dawley (SPD). תוספי קטון אקסוגני ניזונים באופן כרוני לעכברושים 83 ימים או subchronically ובדוק בחריפות אורלית gavaged, מדי יום במשך 7 ימים לפני ביצוע את EPM. איסוף נתונים התנהגותיים מתבצעת באמצעות וידאו חכם מערכת מעקב על ידי משקיף עיוור בקצה של הטיפולים. עיקרי הממצאים מצביעים על כך הבדיקה EPM היא שיטה יעילה כדי לזהות את אפקט נוגד חרדה הנוצרות על-ידי תוספת קטון יכול להיחשב מדד רגיש כדי להעריך שינויים בהתנהגות חרדה הקשורים עם סמים - או מטבוליות מבוססי טיפולים.

Introduction

מטרת מאמר זה היא לתאר את המתודולוגיה של הבדיקה EPM בשילוב עם וידאו תוכנת מעקב כדי לעקוב אחר שינויים בהתנהגות הקשורות לחרדה וטיפולים חדשניים במודלים מכרסמים מעבדה. הבדיקה EPM היא שיטה פשוטה יחסית הערכה התנהגותית, אשר פותחה לחקירה לכמת את רמות החרדה התנהגות ותגובות חרדה של חולדות לאחר היישום של סמים טיפולים1. אכן, זה הוכח כי הבדיקה EPM היא assay התנהגותית בשימוש נרחב ויעיל, לחקירה של שינויים ברמות החרדה של מכרסמים1,2. תחולתה של הבדיקה EPM בחולדות (בעיקר חולדות ועכברים) מבוסס על שלהם נטייה לכיוון רווחים סגורה, חשוך (הגישה) של unconditioned פחד מגבהים פתוח רווחים / (הימנעות), שלהם רמה גבוהה של מוטיבציה מולדת לחקור את הרומן סביבות. כתוצאה מכך, הבדיקה EPM היא מתודולוגיה ומבוססת על סמך של גישה-הימנעות הקונפליקט2,3.

EPM זה בצורת פלוס מנגנון המורכב ארבע זרועות מוגבה, אשר תואר על ידי הנדלי, Mithani4 (איור 1), והיא מורכבת שתי זרועות מול פתוחים עם הסביבה (זרועות פתוחות), ואילו השניים סגור מול נשק (נשק סגור) הינם מצוידים עם קירות. לאחר הטיפול, אם מוגברת זמן שהית בזרועות פתוחות ו/או עלייה במספר ערכים היד פתוחה בהשוואה לשלוט בבעלי חיים (ללא טיפול) מזוהה ב- EPM, הדבר מציין של אפקט נוגד חרדה2,3. התגובה החזקה ביותר של הימנעות הוכח בדקות 5 הראשון לאחר ההתחלה (המיקום של העכברושים החיתוך של ארבע הזרועות של EPM) של assay EPM5; לכן, כל התנהגות לאחר טיפול נפוץ נרשם למשך 5 דקות על EPM. אמצעים נוספים של רמת החרדה, המספר של מטבלים ראש, האחוריים (אנכי עומדת של מכרסם על שתי רגליו האחוריות), boli צואה, כמו גם זרוע הכולל ערכים (פעילות מוטורית ספונטנית), בתנוחות שונות (מתיחה או קפוא), נרשמים על EPM2. לפיכך, מספר פרמטרים התנהגותית הידור לספק הערכה מקיפה של התנהגות הקשורות לחרדה.

על מנת להגביר את תוקפו של התוצאות, מבחני התנהגות 2-3 משמשים יחד, כגון המבחן הבחירה בהירה-כהה, הבדיקה אינטראקציה חברתית, ואת הבדיקה EPM, כדי למדוד את רמות החרדה של בעלי חיים שונים מודלים6. וזמינותו EPM לבצע לבד על מכרסמים הוא גם שיטה מתאימה כדי לחקור את האפקט נוגד חרדה או anxiogenic של תרופות שונות7. הבדיקה EPM הוא רגיש לא רק מסוג בנזודיאזפינים anxiolytics (למשל, דיאזפאם)8, אבל גם, בין היתר, כדי תרכובות nucleosidergic peptidergic, מונואמין, חומצה אמינו (למשל, N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) אנטגוניסט AP7, אנטגוניסט חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) CNQX, מורפיום אגוניסט קולטני אופיואידים-ממוצע, NPY1 אנטגוניסט BIBP3226, חומר P, גרלין, אוקסיטוצין, אגוניסטים לקולטן סרוטונין, היריבים כגון 8-הו-DPAT, WAY-100635, betaxolol אנטגוניסט β1-adrenergic)9,10,11,12. כתוצאה מכך, וזמינותו EPM על מכרסמים היא שיטה מתאימה ורגיש כדי לחקור את ההשפעה של טיפולים שונים המשפיעים על אזורים במוח המעורבים אפקט נוגד חרדה (לדוגמא, האמיגדלה, ההיפוקמפוס ואזורי הלימבי) ו מנגנון פעולה (למשל, מערכת תכולה, GABAergic ו adenosinergic) בהפרות חרדה2. הסוכנים שנבדקו במחקרים אלה EPM כוללים תוספי קטון אקסוגני שמשנות המוח איתות בדרכים עדינות העשויות לחייב שיטה רגישה כדי לזהות שינויים התנהגותיים.

במאמר זה, אנו מתארים את המבחן EPM בשילוב עם וידאו מעקב תוכנה, אשר מסייע להפגת הטיה ניסיוני ואסטמה ומקילה על איסוף וניתוח של שינויים התנהגותיים בתגובה לטיפולים חדשניים נוגד חרדה.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים ומדידת פרוצדורות בוצעו בהתאם אוניברסיטת דרום פלורידה מוסדיים בעלי חיים טיפול, שימוש הוועדה (IACUC) להנחיות (פרוטוקול #0006R). כל המאמצים נעשו כדי להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים.

1. תכשירים

הערה: הפרוטוקול בדרך כלל דורשת חולדות מעבדה-bred או עכבר EPM בדיקה. עם זאת, בעלי חיים אחרים, כגון שרקנים, נבדקו גם על EPMs13. חשוב לשקול את חדות הצבעים בין החיות במבוך ואת הצבע מבוך כאשר באמצעות מעקב וידאו. הניגוד הוא פחות חשוב עבור חוקרים צופים בעלי חיים או באמצעות וידאו. ההגדרות של וידאו מעקב תוכנה צריך להיות מוגדר מסמך זה החיות הם שחור או לבן-מבוך או שחור או לבן. יכולות להתרחש בעיות עם הגדרות התצורה מבוך שקוף, אך מבוך אפור מט יכול להיות אופטימלי בשני צבעים מכרסמים.

  1. בחר חיות בשביל הניסוי, שוקל את הפוטנציאל להשפיע על גורמים, כגון מתח, סקס, מחזור ייחום, גיל, וכן משקל הגוף2.
  2. בהתבסס על הניסוי בודדים, לקבוע את מספר בעלי חיים לכל קבוצה עבור הבדיקה.
    הערה: גודל הקבוצה תהיה תלויה בגודל ההשפעה הצפויה עם הטיפול הבדיקה. כוח הניתוחים נעשים בדרך כלל לפני הניסוי מאותחלת כדי לקבוע את המספר המינימלי של נושאים כדי להיכלל נתון ההשתנות תגובות של חיה בכל פעילות נתונה, כמו גם את מספר קבוצות הניסוי/תנאים.
  3. תכנן את הניסוי (שבו שורה של בדיקות התנהגותיות שונות, כגון מבחן בשדה פתוח, EPM מבחן, מבחן חור פנסיון וכן מבחן השחייה הכריחו ישמש) בקפידה.
    הערה: טרום חשיפה של המכרסמים סביבת בדיקה הרומן (כגון מבחן בשדה פתוח) מיד לפני הבדיקות EPM עשוי לשנות את ההתנהגות של החיות על EPM1,2.
  4. בצורה דומה לפני הבחינה EPM. להתמודד עם כל בעלי החיים.
    הערה: זה הוכח כי גורמים שונים, יישום של תרופות (למשל, זריקות), מתח משלוח ודמי טיפול ניתן לשנות את התנהגות ותגובות התנהגותיות של מכרסמים על ה-EPM16. לפיכך, נחוצים habituation של חיות בית בעלי חיים (למשל, לאחר המשלוח, 1-2 שבועות לפני המבחן EPM), תנאים ניסיוני של הליכי הטיפול (למשל, gavaging). חשוב גם כי הטיפול של המכרסמים וניסיון כלשהו עם לחצים מוקדמת, במיוחד מיד לפני בדיקות, היא עקבית על-פני חיות וקבוצות טיפול.
  5. לנהל את לימודי התנהגות בעלי חיים ליליים, כגון חולדות ועכברים, באמצעות מחזור אור הפוך, כך ההערכה התנהגותית יכול להתבצע כאשר החיות נמצאים בשלב שלהם כהה, פעיל.
    הערה: את ההשפעות של תנאי מגורים שונים ואור מקצבים מחזור/היממה על התנהגות והשפעתם על תוצאות EPM היו הפגינו בעבר17, מאז הורמונים החיות מוסדרים על ידי מחזור אור.
  6. להשתמש את ניסויים באותו במהלך ההליכים ושאלו אותם כדי להימנע בושם או סבונים עם ריח חזק.
  7. תשאל את ניסויים לא כדי לדבר ליד החיה במהלך הניסוי או להזיז חפצים ליד הסביבה EPM.
    הערה: חשוב באופן קריטי הצופה הופך תנועות מינימליות, בלי רעש בעת איסוף נתונים התנהגותיים.
  8. לנקות את EPM כולו לאחר בכל ניסוי כדי למחוק את כל הריחות של חיות קודמות אשר עשויים להפריע חקר על-ידי החיה הבדיקה.
  9. (מומלץ) להתמודד עם בעלי החיים במשך מספר ימים לפני הבחינה EPM (כשהרמתי אותו בעדינות על ידי הגוף ולא שומר את זה בשביל דקה או שתיים) כדי להתאקלם אותם הנסיין.
  10. בעת הצבת החיות EPM, ודא להתמודד עם כל בעלי החיים באופן עקבי ולמקם כל מכרסם EPM באותה עמדה מול אותה זרוע (למשל, במרכז מול הזרוע פתוח מן הנסיין).

2. יישום של תוספי מזון קטון אקסוגני

  1. מודדים את משקל הגוף של בעלי החיים לפני התחלת טיפול כדי לקבוע את חישוב המינון לטיפול (למשל, intragastric gavage).
  2. להכיר את החיות בשיטה intragastric gavage (תקופת הסתגלות) באמצעות מים על ידי gavage על 5 d לפני תוספי קטון (דיאטה צ'או ותנאי מכרסמים רגיל [SD] + מים gavage; למשל, 2.5 גרם/ק"ג משקל גוף של מים/יום). אל תכלול את השימוש בעל חיים זה אינו מתאים לשיטת intragastric gavage.
  3. לאחר תקופת הסתגלות, להאכיל את בעלי החיים באופן כרוני על 83 יח ועל subchronically d 7 עם SD ו- gavage מדי יום עם מים או (למשל, משקל הגוף 5 g/kg/day; קבוצת הביקורת: n = 8), קטון תוספי תזונה כמו אסתר קטון (קה; 1, 3 - diester butanediol-acetoacetate; למשל, משקל הגוף 5 g/kg/day; n = 8), מלח קטון (KS. נה+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] במלחים מינרליים; למשל, משקל הגוף 5 g/kg/day; n = 8), או KS + שרשרת בינונית טריגליצריד (יחס 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    הערה: בעלי החיים שקיבלו intragastric gavage נבדקו על ה EPM 1 h לאחר הטיפול. חולדות נמאס עם תקן האוכל מכרסמים, gavaged במים (למעט קטון תוספי) שימש קבוצות שליטה.

3.. חרדת Assay

  1. המנגנון EPM
    1. להשתמש את המנגנון זהה לרוחב מחקר לתקנן את התוצאות. EPM היא מנגנון בצורת פלוס, אשר מורכב של ארבע זרועות (למשל, הזרועות עשוי להיות רחב 10 ס מ ו 50 ס מ): שתי זרועות מול נפתחים, השניים סגור מול הזרועות הינם מצוידים עם קירות גבוהים (למשל, 30 ס מ). המנגנון הוא גבוה מעל הרצפה (למשל, 55 ס מ)2.
      הערה: הפרמטרים שנמצאים בשימוש הנפוץ ביותר הן הזמן המצטבר בזרועות פתוחות, את מספר הערכים לזרועותיו פתוח; עם זאת, הזמן בילה ב מרכז והידיים סגור, מספר הערכים לתוך מרכז והידיים סגור נמדדים, כמו גם המרחק נסע בכל אזור.
    2. להאיר EPM באמצעות תאורה עקיפים (קרי, ישיר האור מקור לכיוון התקרה במקום ישירות מאירה את המנגנון EPM) ולוודא כל ארבע זרועות מוארים באופן דומה (ללא צללים, ראה איור 2).
      הערה: שינויים ברמת האור משנה את אופן הפעולה של המכרסמים ב EPM. לכן, תאורה דומה נדרש חיות ניסוי רצופים וימים (למשל, 2,800 לומן בחדר)2.
  2. מערכת מעקב וידאו
    הערה: השתמש וידאו מערכת עם ממשק המחשב, מצלמת וידאו של אוסף נתונים, אשר באופן אוטומטי תאסוף נתונים התנהגותיים (חולדות המעקבאיור 3). עבור וידאו מעקב מערכת, מגוון רחב של מצלמות אנלוגיות רגיל או מקורות תמונה על-ידי המשתמש (מצלמות אינפרא-אדום, מצלמת וידאו, מצלמה USB תואם-WIA, מצלמות רשת,etc.) יכול לשמש. בעת ניתוח הווידאו המוקלט, תוכנת מעקב תנועה תומך בכל תבניות וידאו נפוצים, כגון .avi, .vob, wmv, .asf, .mov, .qt, במקרים רבים, .mpeg, .mp4, .3gp, ו-. mkv. אם הווידאו יעשה לא השמעת כראוי, זה עשוי לדרוש codec ספציפיים; תבניות וידאו נוספים נתמכים אם רכיב ה-codec המתאים מותקן במערכת. תוכנת מעקב תנועה יכול לשמש גם כדי לנתח קטעי וידאו שנרכשו בעבר תהליך תמונות ממקורות שונים, כגון מקליטי DVD/HD, קבצי וידאו דיגיטלי (.avi, .divx, .mpeg,etc.), מצלמות רשת, מצלמות DV, והוא תואם-WIA התקני הדמיה.
    1. הגדרת המערכת
      1. חבר את מפתח ההתקנה של תוכנת מעקב תנועה ליציאת USB 2.0 ולהפעיל את כלי ההתקנה.
      2. לתקן את המצלמה מעל אזור ניסיוני ולהבטיח כי זה יישאר משותק למשך של הניסוי.
      3. להגדיר התנסות חדשה במערכת תוכנת מעקב תנועה באמצעות את ספר ההדרכה. בחר חדש הניסוי. לחץ פעמיים על הסמל של הפרוטוקול הניסוי החדש צריך לעקוב אחר (איור 3, 1 קובץ משלים).
      4. להזין פרטי תווית לתאר הניסוי בתיבת הדו-שיח פרטי הניסוי .
      5. לציין את המקור של רצפי וידאו כדי לעבד.
      6. להגדיר את כלל טרנספורמציה מדידה המרחקים הנכון. תהליך הכיול מאפשר לתוכנה למעקב אחר תנועת להתבשר הממדים בפועל של האזור ניסיוני על מנת להשיג ערכי אמין עבור מרחקים ומהירויות.
      7. לקבוע את מחוזות מעניינים (אזורי) באזור העבודה.
      8. כוונן את הפרמטרים של תהליך האיתור.
        1. על מנת התוכנה מעקב אחר תנועה לאתר במדויק את המיקום של החיה בתמונה, יש להגדיר כמה התאמות זיהוי.
        2. תהליך מעקב מחייב תמונה ברורה, contrasted היטב באמצעות התאמה בסדר בהירות כללית והפרמטרים ניגוד במקטע הבהירות והחדות של הפאנל הגדרות לזיהוי . במידת הצורך, לשנות הגדרות אלה את התמונה כולה או לאזורים המוגדרים על-ידי המשתמש.
      9. מכניסים חולדה כל הזירה כדי לבדוק את תהליך הזיהוי.
      10. לחץ על לחצן התחל בדיקה כדי לוודא אם בתהליך האיתור לזהות את הנושא בצורה נכונה. לאשר שהזיהוי מופעל על ידי הופעתו של נקודה על המסך. תהליך הכיול צריך להיעשות לפני תחילת הבחינה.
      11. זיהוי נחשבת מאושרת כאשר הנקודה השחורה רק המוצג בנגן הוא החיה במעקב. מעקב אחר הקו האדום צריך לעקוב מקרוב אחר displacements כל החיה. מעקב ראוי הוא אישר גם עם פתק לבן המפרט את מספר בעלי חיים, המתאים הציון מבוסס על העקירה. אם כזה של זיהוי לא מתקבל, להתאים את הפרמטרים ' סף ' ארוזיות עבור מיטוב הזיהוי ומעקב אחר התהליך.
      12. כוונן את הפרמטרים ' סף ' סחף כדי לקבל תמונה חדה יותר ונטול רעש מבחן.
      13. אם הנתיב מעקב מזוהה כהלכה, לחץ על לחצן בדיקת הפסק (איור 4). אם התאמות אלה עומדים לשמש עבור כל קובץ ניסיוני חדש, לחץ על לחצן שמור כ- default . לחץ על הלחצן קבל כדי לשמור את ההגדרות החדשות של זיהוי.
      14. הגדר את תנאי הזמן של הניסויים.
      15. אם פרוטוקול הניסוי דורש תהליך רכישת מסלול להתחיל במקביל שהנושא ימוקם באזור ניסיוני, זה אפשרי להגדיר את יחידת מרחוק שמגיע עם התוכנה או להשתמש עכבר אלחוטי.
        הערה: אפשרות זו מספקת את האפשרות של שליטה מרחוק את ההתחלה ואת העצירה.
    2. כיוונון של הנושאים במערכת
      1. ניהול מסד נתונים של הנושא ניסויים. כדי ליצור מסד נתונים של נושאים ניסיוני, הזן את מנהל מסד הנתונים נושאים על-ידי לחיצה על לחצן נושאים בשורת ניסויים המסייע .
      2. לחץ על + כפתור כדי להוסיף בנושאים חדשים במסד הנתונים.
      3. עם האפשרות נושא אחד כבר מסומנת, הזן הקוד של הנושא.
      4. למלא את שאר המידע של הנושא במקטע מאפייני נושא .
      5. לחץ על לחצן צור כדי להוסיף את הנושא החדש.
      6. הגדר את תוכנית ניסויים. השתמש במתזמן כדי להגדיר את השלבים השונים, הפעלות, ניסויים, נושאים מתוכננות להתבצע בתוך פרוייקט ניסיוני. המשפט תיבחר באופן אוטומטי כמו "את המשפט הבא" להוציא אותו להורג. מאפיין זה מוצג קרצייה ירוק בצד שמאל של השם במשפט.
    3. נתוני הרכישה על ידי הקלטה בו זמנית של מעקב
      הערה: כשבוחרים מקור תמונה חיה, בחלונית ' נגן ' מספק מודול של הקלטה מוטבע בקלות לכידת וידאו מגיע מהמצלמה שנבחרו.
      1. להכין תוכנת מעקב תנועה והקפאה (כיול, הגדרת אזור, איתור הגדרות, הגדרות זמן, מתזמן).
      2. פתיחת החלונית ' ייבוא נתונים '.
      3. . תתחיל להקליט הוידאו של הניסוי מבלי החיה על ידי לחיצה על לחצן התחל הקלטה זמינים לתוכנה
      4. מקם את החיה לאזור ניסיוני.
      5. התחל את תהליך רכישת נתונים על ידי לחיצה על לחצן התחל בלוח הבקרה זמן . תהליך מעקב יבוצע בו זמנית עם תהליך ההקלטה. לפי הצורך, שואל הנסיין כדי לרשום באופן ידני, המשתנים התנהגותיים כגון האחוריים, ראש מטבלים, פולס (איור 5).
      6. לאסוף את הנתונים EPM באופן ידני, כמו גם על ידי משקיף עיוור (נפרד ממשרד EPM עם וילון) בחדר הבדיקה.
      7. מחכים לסוף של מעקב-תהליך ההקלטה או לחץ על לחצן עצור על זמן הבקרה.
      8. הסר את החיה מן האזור ניסיוני. לעצור את תהליך הקלטת וידיאו על ידי לחיצה על לחצן עצור זמין על השחקן תוכנת מעקב תנועה.
      9. להכין את האזור ניסיוני החיה הבאה על ידי שטיפה וייבוש זה. חזור על מחזור שוב.
    4. ניתוח נתונים
      1. כדי לגשת בכלי ניתוח , לחץ על לחצן ניתוח בבר המסייע של ניסויים .
      2. כדי להפיק דו חות ניתוח של משפטי גמור, בחר את המבחנים כדי לנתח. להגדיר ולבחור את דו ח הניתוח. הגדר את מרווחי הזמן כדי להיות מנותח. ליצור ולסקור את הדוחות. לייצא את התוצאות תבניות הגיליון האלקטרוני או תמונה (איור 6).
  3. EPM לשקילת רמות החרדה
    1. לבצע את הניסויים EPM בתנאים nonstress (בחדר מואר באור עמום ושקט) לאחר gavage דרך הפה.
      הערה: ודא כי הניסויים מופעלים לפי מרווח זמן קרוב (למשל, בין 1200-1400) מאחר שעון ביולוגי יכול להשפיע על ההתנהגות של המכרסמים ה EPM15,17. הימנע תנועות מיותרות, רעש במהלך הניסוי.
    2. לפני תחילת הבחינה, ודא כי EPM ניקו, מיובשים, הוידאו מערכת המעקב הוא מוכן לשימוש.
    3. העברת החולדות בכלוב שלהם הביתה לחדר ניסיוני 30 דקות לפני תחילת הניסוי.
    4. המקום חולדה בנקודת החיתוך של ארבע הזרועות של EPM, מול הזרוע פתוח מול של הנסיין.
    5. להפעיל את הווידאו תוכנת מעקב, כמו גם לרשום ידנית את אופן הפעולה של החיה, למשך 5 דקות.
    6. אם החיה תיפול על EPM, תרים אותו ומניחים אותו בחזרה באותה הנקודה של EPM מאיפה זה נפל. אל תכלול את הנתונים ההתנהגותי של חיה זו הניתוח.
      הערה: רעש חזק או תנועה של עלול לשתק/הקפאת החיות על זרועות פתוחות. אם רעש חזק שמע במהלך הניסוי, הכללת את הנתונים ההתנהגותי של החיה שעברו את הניסוי באותו הרגע מניתוח.
    7. בסוף הבדיקה 5 דקות, לעצור את הוידאו תוכנת מעקב ולהסיר את החיה EPM. למקם אותו בחזרה לכלוב שלה הביתה.
    8. לפני החיה/הניסוי הבאה, לנקות את EPM עם חומר ניקוי חיטוי (למשל, Quatricide) ואחריו מי ברז. יבש את המנגנון עם מגבות נייר.

4. ניתוח של הנתונים שנאספו על ידי מערכת מעקב וידאו

  1. בהתבסס על נתוני ההקלטות, לנתח את כמות הזמן המושקע בזרועות פתוחות, בזרועות סגור; המספר של רישומים שנעשו על הזרועות פתוח, סגור זרועות, ו לאזור מרכז; ההשהיה כניסה אל זרועותיו סגורות; המרחק נסע בזרועות פתוחות, זרועות סגור, ולא באזור המרכז.
    הערה: החיה נחשבת באזור כאשר המרכז של הגוף המיסה היא באזור הזה.
  2. לקבוע ההשפעה של טיפולים על התנהגות באמצעות של ניתוח השונות (ANOVA) עם הבדל משמעותי לפחות פישר (LSD) מבחן השוואות מרובות של הבדיקה/Tukey.

Representative Results

הניסוי הנוכחי בוחן את ההשערה כי תוספי קטון אקסוגני מנוהל או כרוני (האכיל 83 ימים) או subchronically (gavaged בעל פה במשך 7 ימים) יש אפקט נוגד חרדה על (חולדות ספראג-Dawley (SPD) זכר בן חודש שני 250-350 גר'). ממשל כרונית כללה תוספי קטון הבאים: אסתר קטון במינון נמוך (אייק; 1, 3-butanediol-acetoacetate diester, ~ 10 גרם/ק"ג/יום, אייק), אסתר במינון גבוה קטון (HKE; ~ 25 גרם/ק"ג/יום, HKE), בטא-hydroxybutyrate-מינרליים מלח (הקמב ה-S; ~ 25 גרם / ק ג/יום, KS), ואת שרשרת הקמב ה-S + בינוני טריגליצריד (MCT; ~ 25 גרם/ק"ג/יום, KSMCT). לניסויים subchronic, שימשו קבוצות הטיפול הבאות: קה, KS, ו KSMCT (5 g/ק"ג/יום). הקבוצות שליטה כלל SD או SD עם מים gavage (בקרה). כל הנתונים היו מיוצגים בתור הממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). התוצאות היו נחשבים משמעותיים כאשר p < 0.05. המשמעות נקבע על ידי חד-כיווני אנובה עם בדיקת ה-LSD של פישר.

לאחר האכלה כרונית, חולדות בקבוצה KSMCT בילה זמן משמעותי יותר בזרועות פתוחות (p = 0.0094) לעומת קבוצת הביקורת. הזמן המושקע של הזרועות סגור היה באופן משמעותי פחות קבוצות אייק, KS ו- KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 ו- 0.0019, בהתאמה), בעוד הקבוצה KS בילה זמן רב יותר באופן משמעותי במרכז (p = 0.0239) בהשוואה (קבוצה שליטה (SD) איור 7 א) 18.

חולדות בקבוצות KS ו KSMCT נסע מרחקים ארוכים משמעותית בזרועות פתוחות (p = 0.036 ו- 0.0165), בעוד העכברושים בקבוצות אייק, KS ו- KSMCT הראו באופן משמעותי פחות מרחק נסע בזרועות סגור (p = 0.0252, 0.00041, ו 0.0032, בהתאמה), בהשוואה קבוצת הביקורת (SD), (איור 7 ב). כאשר לעומת קבוצת הביקורת, הקבוצות KS ו KSMCT היה המרחק גדול באזור המרכז (p = 0.0206 ו- 0.0482, בהתאמה), בעוד קבוצת KSMCT, ההשהיה עד לכניסה הראשונה הזרועות סגור היה גדול משמעותית לאחר האכלה כרונית (p = 0.0038)18 (איור 7C).

הזמן המושקע בזרועות פתוחות היה גדול יותר אצל קבוצת קה (p = 0.0281) לאחר 7 ימים של gavage שבעל-פה, בעוד קבוצות קה, KS ו- KSMCT, הזמן בילה במרכז ירד (p = 0.0005, < 0.0001, ו = 0.023, בהתאמה), בהשוואה ריבועים l קבוצה (איור 8A)18. קבוצות קה ו- KS, מספר הערכים על הזרועות סגור היה נמוך באופן משמעותי (p = 0.0436 ו- 0.0234, בהתאמה) לאחר 7 ימים של המינהל (איור 8 ב'), בעוד העכברושים KS הקבוצה גם נכנס למרכז פחות תכופות (p = 0.0193), בהשוואה קבוצת הביקורת (SD).

Figure 1
איור 1: גבוהות, בנוסף מבוך (EPM) המשמשות לבדיקת חולדות. כל זרוע 10 ס"מ, 50 ס מ, עם שתי זרועות מול פתח עם קצה מוגבה. השניים סגור מול הזרועות הינם מצוידים עם קירות 30 ס מגבוהה. 55 ס"מ. גובה המסלול מן הרצפה הוא אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: דוגמאות ישירה ותאורה עקיפים. להבטיח שמקור האור הוא הצביע לכיוון התקרה, בעוד האור הישיר מעל אזור ניסיוני חסומה. חשוב להשתמש העקיפים אור במהלך EPM ניסויים על מנת להאיר באופן דומה כל ארבע זרועות ללא צללים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הבר עוזר ניסויים של תוכנת מעקב תנועה- זה נועד כדי לספק גישה הפעולות העיקריות. הלחצנים תואמות הפעילות במסגרת תהליך אופייני ניסויים, ואילו רק את הפעילויות המותר כיום פעילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: המסלול הנושא מסומן בקו אדום בעקבות התנועה של החיה. על-ידי התאמת את הסף, הרקע הניתנות להפחתה עד רק החיה זוהה מסומנים על ידי קו אדום. המסלול עוקב מרכז המסה של הנושא, הקואורדינטות המיקום הנוכחי מסומנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: גבוהות וגם מבוך (EPM) עם עכבר ספראג Dawley (SPD) בגובה פתח דוגמה הסידור ניסיוני הוא הפגין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: מסלול התנועה המצטבר של החיה במהלך משפט. במסגרת ניתוח הנתונים, ניתן להציג את מסלול שנאספו עקבות הנושא באזור מעקב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: תגובות התנהגותיות של חולדות SPD ב EPM 83 ימים של האכלה כרונית של תוספת קטון אקסוגני. אלה לוחות הצג תוצאות נציג שנאספו על ידי EPM של מערכת התנועה-מעקב18. (א) הקבוצה KSMCT בילה אחוז גדול יותר של זמן בזרועות פתוחות, ואילו אייק, KS, ובילה KSMCT קבוצות פחות זמן בידיים סגור, לעומת קבוצת הביקורת (SD). קבוצות (B) ה KS ו KSMCT נסע מרחק גדול יותר בזרועות פתוחות, ואילו אייק, KS, ונסע KSMCT קבוצות פחות מרחק הזרועות סגור, מציג להפחית חרדה לעומת הפקד קבוצה (SD). (ג) KSMCT הקבוצה נכנסו הזרועות סגורה מאוחר יותר, המציין חרדה מופחתת בהשוואה הפקד קבוצה (SD). קיצורים: SD = תקן האוכל מכרסמים + מים (25 גרם/ק"ג משקל גוף (b.w.) של מים/יום); אייק = SD + אייק (1, 3-butanediol-acetoacetate diester, b.w./day 10 גרם/ק"ג); HKE = SD + HKE (b.w./day 25 גרם/ק"ג); KS = SD + מלח בטא-hydroxybutyrate-מינרליים (הקמב ה-S; b.w./day 25 גרם/ק"ג); KSMCT = SD + שרשרת הקמב ה-S + בינוני טריגליצריד (MCT; b.w./day 25 גרם/ק"ג); SPD = חולדה ספראג-Dawley; EPM = גבוה ובנוסף מבוך (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001; * * * p < 0.0001). איור זה השתנה מ ארי ואח. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: תגובות התנהגותיות של SPD חולדות לאחר 7 ימים של gavage אוראלי של תוספת קטון אקסוגני. התוצאות נציג נאספו באמצעות EPM הבדיקה, באמצעות מערכת תוכנה למעקב אחר תנועת18. (א) קבוצת קה בילה אחוז גדול יותר של זמן בזרועות פתוחות, ואילו הקי, KS, ובילה KSMCT קבוצות פחות זמן במרכז (לעומת קבוצת הביקורת [SD]), שמעיד להפחית חרדה. (B) בהשוואה הפקד קבוצה (SD), פחות ערכי אותרו בזרועות סגור של חולדות בקבוצות קה ו- KS. קיצורים: SD = תקן האוכל מכרסמים + מים (b.w. 5 g/kg של מים/יום); KE = SD + קטון אסתר (1, 3-butanediol-acetoacetate diester, b.w./day 5 g/kg); KS = SD + מלח בטא-hydroxybutyrate-מינרליים (הקמב ה-S; b.w./day 5 g/kg); KSMCT = SD + הקמב ה-S + MCT (b.w./day 5 g/kg); SPD = חולדה ספראג-Dawley; EPM = גבוה ובנוסף מבוך (* p < 0.05; * * * p < 0.001; * * * p < 0.0001). איור זה השתנה מ ארי ואח. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

באופן כללי, כמה נפוץ בדיקות, כמו המבחן בהירה-כהה בחירה במבחן אינטראקציה חברתית, הבדיקה EPM, משמשים כדי למדוד את רמת החרדה במודלים של בעלי חיים שונים. אולם, וזמינותו EPM לבד היא שיטה מתאימה לחקור, למשל, השפעת קטון אקסוגני תוספי תזונה של מכרסמים חרדה רמות18,20.

היתרון העיקרי של השיטה EPM הוא זה מסתמך על נטייה אינסטינקטיבית של המכרסמים לעבר מקומות חשוך, סגור, בנוסף הפחד גבהים unconditioned והימנעות שטחים פתוחים. מצד שני, שיטות אחרות ששימשו ללמוד התנהגות חרדה מבוססים על התגובות התנהגותית לגירויים מסוימים רעילים, כגון הלם חשמלי, מניעת מזון/מים, רעשים, חשיפה טורף ריח3. בדיקות אלה בדרך כלל תוצאה של תגובה מותנה, בעוד EPM גם מייצג חלופה יותר אנושי. יתר על כן, EPM יכולה להיות כלי שימושי כדי ללמוד את מעורבותם של אזורי מוח שונים (למשל, אזורים הלימבי, ההיפוקמפוס) ולפי המנגנון הבסיסי (למשל, גאבא, גלוטמט, סרוטונין, אדנוזין) של חרדה התנהגות2.

בשעת החלת הטיפולים די לחוץ עבור בעלי החיים (למשל, gavage דרך הפה), זה חשוב כי כל בעלי החיים מטופלים באופן זהה, על ידי אותו אדם, במיוחד כאשר הערכת פוטנציאל, עדין נוגד חרדה אפקטים. במידת האפשר, המבוא של המתחם/הסמים במי שתייה או דרך טעים 'לטפל' עשוי להיות שיטה מועדפת. כדי להבטיח כי אותה כמות ניתנת על כל בעל חיים, gavage אוראלי יכול לשמש. בהתבסס על המאפיינים פרמוקוקינטיים של המתחם, זה בדרך כלל רצוי לבדוק את החיות-EPM בתוך שעה אחת לאחר gavaging. בעת בחירת נושאים ניסיוני, חשוב לשקול שלהם זן, סקס, מחזור ייחום, גיל, וכן משקל הגוף, על-פי יעדי ולבדוק חומרים2. בעניין גיל, בעת תכנון לימודי EPM ופרשנות של נתונים, זה חשוב שיש לקחת בחשבון כי האחוז של הזרוע פתוח ערכי מגדילה באופן ליניארי עם גיל21 ואת השינויים זיקנה בהתנהגות EPM הם זן ספציפי22.

כאשר עורכים מבחן EPM, ישנם בעיות פוטנציאליות אשר צריכים להיות מופנית. לפעמים צריך חיות לא ייכללו הניתוח בשל נטיות חריג חשוד טעות (למשל, החיה לעולם לא עוזב את האזור שבו עליו הונח, כמעט נופל את המנגנון, תוסח על ידי רעש או אירוע מחוץ המנגנון). סיבוכים נוספים עם EPM הבדיקות עשויים לכלול טיפולים אשר לגרום הרגעה או היפראקטיביות כי סוגי אפקטים אלה צריך להיות המוערך באמצעות EPM פרמטרים.

זה חשוב לחשוף חיות במבחן EPM רק פעם אחת כי ירד פעילות בזרועות פתוחות וזה הזמן הכולל ירידה בילה על הרציף המרכזי היו הוכיח את השני (חשיפה חוזרת ונשנית) של מכרסמים לעומת החשיפה הראשונה ב EPM 14,15. לכן, החשיפה יחיד של מכרסמים המבחן EPM מומלץ מאוד. עם זאת, אם יש מינימום של שלושה שבועות בין החשיפה הראשונה והשניה EPM, קביעת EPM מועברת לחדר אחר (סביבה שונה), בעלי החיים עלול תיחקר על-ידי EPM הבדיקה יותר מפעם אחת2.

EPM זמין בחומרים שונים, גדלים (למשל, עכבר או חולדה), צבעים, אשר צריך לקחת בחשבון בעת בחירת ללמוד נושאים. חשוב לזכור כי ריחות השאיר על-ידי החיה הקודם על המנגנון עשוי לשנות את אופן הפעולה של החיה עוקבות. לכן, אנו ממליצים באמצעות EPM של גרם של חומר זה קל נקי, כגון זכוכית אקרילית (לא שקוף), אשר לא שומרים על ריחות לאחר הרחצה. הימנע EPM מכשיר עשוי עץ. רצוי, השתמש בצבע מט שונה מהצבע של החיות נבדק על EPM (למשל, שחור אם חיות לבן נבדקים). יותר טוב הניגוד בין החיה של המתחם, כן ייטב הגילוי של החיה ואמינות גבוהה יותר ודיוק של התוצאות מתקבל (מרחק מכוסה, מהירות, מעקב). המנגנון EPM עשוי חומר אפור מט שימושיים עם חיות לבן, שחור, לבן ושחור.

יתרון נוסף של מערכת מעקב וידאו הוא בנוסף EPM, שהיא מציעה דרך גמישה וקלה להגדיר את זה עם מגוון רחב של בדיקות התנהגותית, מבוך מים, בשדה פתוח, מבוכים-זרוע/ת פלוס/רדיאלי, המקום העדפה, נאלץ שחייה , וזנב בדיקות ההשעיה.

לסיכום, מטרת מאמר זה היא לתאר את המבחן EPM משתמשים בה בשילוב עם תוכנת מעקב וידאו לאיסוף וניתוח שינויים התנהגותיים בתגובה לטיפולים חדשניים נוגד חרדה. היישומים האפשריים של EPM כוללים את prescreening של סוכנים תרופתי החדשה שפותחה לטיפול בהפרעות הקשורות לחרדה. בנוסף הסוכנים נוגד חרדה ו anxiogenic, אפקט התנהגותי של הורמונים שונים ותרופות של התעללות יכולים גם לחקור את האירוע. גם יכול להיות העריכו את ההשפעה של הזדקנות, חשיפה לחצים שונים. מחקר זה הגיע למסקנה כי כאשר נלקחים ינקטו פעולות, השימוש EPM הוכיחה להיות שיטה רגישה כדי להעריך שינויים התנהגותיים הקשורים קטון תוספי18,20.

Disclosures

D'Agostino, D.P., Kesl, ס', ארנולד, יצירות פ ושיטות להפקת גבוהות ומתמשכת Ketosis. # פטנט בינלאומית PCT/US2014/031237. אוניברסיטת דרום פלורידה.

. ארי, ג, D'Agostino, D.P., תוספי תזונה קטון אקסוגני להפחתת התנהגות הקשורות לחרדה. פטנט זמני #62289749. אוניברסיטת דרום פלורידה.

דומיניק פ D'Agostino Csilla ארי לבעלים השותפים של חברת LLC טכנולוגיות קטון בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד.

האינטרסים הללו יש כבר שנסקרו ומנוהל על ידי האוניברסיטה מדיניותה גופים מוסדיים, בודדים ניגוד עניינים. כל המחברים מצהירים כי ישנם נוספים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך על-ידי N000141310062 גרנט הריסות 6143113500 # GLUT1D מענק קרן (לדומיניק פ D'Agostino), על ידי הלאומית לפיתוח סוכנות של הונגריה (תחת גרנט מס TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; כדי Zsolt Kovács) על ידי המחלקה של ותיקי בענייני (מארק Kindy). המחברים רוצים להודות Quest תזונה LLC לתמיכה מחקר שוטף בנושא זה (כדי Csilla ארי).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14, (3), 149-167 (1985).
  2. Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2, (2), 322-328 (2007).
  3. Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
  4. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327, (1), 1-5 (1984).
  5. Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48, (4), 254-260 (1955).
  6. Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144, (1-2), 211-226 (2003).
  7. Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116, (3), 2127-2133 (1995).
  8. Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127, (1), 19-24 (1996).
  9. Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136, (4), 311-319 (1998).
  10. Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (6), 1399-1419 (2008).
  11. Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
  12. Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
  13. Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110, (4), 490-496 (1993).
  14. Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54, (4), 749-752 (1993).
  15. Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132, (2), 135-143 (2002).
  16. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463, (1-3), 163-175 (2003).
  17. Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29, (8), 1193-1205 (2005).
  18. Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
  19. D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304, (10), R829-R836 (2013).
  20. Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
  21. Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52, (8), 731-739 (2010).
  22. Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85, (5), 621-628 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics