높은 플러스 미로 테스트 Exogenous Ketogenic 보충의 완화 효과 조사 하는 소프트웨어를 추적 하는 비디오와 함께

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Summary

여기, 우리는 조사 설치류 동물 모델의 불안 수준에서 변경 하는 프로토콜을 제시. 높은 플러스 미로 (EPM) 테스트, 추적 소프트웨어, 비디오와 함께 사용 전 임상 실험실 시나리오에서 다양 한 잠재적인 완화 치료의 효과를 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다.

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Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

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Abstract

이 연구의 전반적인 목표는 상승의 방법론을 설명 하는 소프트웨어를 추적 하는 비디오와 함께에서 미로 (EPM) 테스트 플러스. 메서드의 목적은 실험실 쥐 모델에 다양 한 잠재적인 완화 치료의 효과 문서화 하는 것입니다. EPM 테스트 보호, 밀폐 된 어두운 공간과 열린 공간 및 높이, 그리고 소설 환경 탐험 그들의 타고 난 강한 동기 부여의 무조건된 두려움으로 설치류의 proclivity를 기반으로 합니다. EPM 테스트 동작에 영향을 미칠 것으로 알려진 약물을 주어진 설치류의 완화 또는 anxiogenic 응답을 조사에 대 한 널리 사용된 행동 테스트가입니다. 닫힌된 팔, 팔, 닫힌 무기 항목의 감소 된 수 그리고 EPM 테스트에 의해 측정 하는 팔을 열고 항목의 높은 수에 소요 된 시간 증가 비율에 시간의 감소 비율을 보여주는 관측 감소 반영 될 수 있습니다. 불안 수준입니다. 이 메서드를 사용 하 여 불안 관련 행동에 외 인 케 톤 보충의 효과 Sprague Dawley (SPD) 쥐에서 테스트 됩니다. 외 인 케 톤 보충은 만성 또는 subchronically 83 일 동안 쥐에 고 심하게 구두 gavaged EPM을 수행 하기 전에 7 일 동안 매일 테스트. 행동 데이터 수집 수행 됩니다 스마트 비디오 추적 시스템을 사용 하 여 치료의 끝에 멀게 관찰자. 주요 연구 결과 나타냅니다 EPM 테스트 케 톤 보충 유도 완화 효과 검출 하는 효과적인 방법 이며, 약물 또는 대사 기반 요법과 관련 된 불안 행동의 변화를 평가 하는 중요 한 측정 이라고 여겨질 수 있다.

Introduction

이 기사의 목적은 불안 관련 행동의 변화 및 실험실 쥐 모델에서 새로운 치료 모니터링 하기 위해 추적 소프트웨어 비디오와의 조합에서 EPM 테스트 방법론을 설명 하는 것입니다. EPM 테스트 약물 치료1적용 후 불안 행동 수준 및 쥐의 불안 반응 측정의 조사를 위해 개발 된 상대적으로 간단한 행동 평가 방법 이다. 실제로, 그것은 EPM 테스트의 설치류1,2의 불안 수준 변화 조사에 대 한 널리 사용 되 고 효과적인 행동 분석은 입증 되었습니다. 동봉, 어두운 공간 (접근)으로 그들의 경향의 오픈 공간 / (회피), 무조건된 공포와 탐험 소설 타고 난 동기 부여의 그들의 높은 수준의 기반으로 하는 설치류 동물 (주로 쥐 및 쥐)에서 EPM 테스트의 적용 환경입니다. 따라서, EPM 테스트 접근-회피 갈등2,3에 따라 확고 방법론입니다.

EPM는 더하기 모양의 기구 이다 높은 팔, 구성 된 Handley 및 Mithani4 (그림 1)에 의해 기술 되었다 하 고 2 개의 반대 팔을 폐쇄 하는 반면 환경 (들고)에 열려 있는 2 개의 반대 팔의 구성 (닫힌된 팔) 벽을 갖추고 있습니다. 치료 후, 증가 시간에 두 팔을 벌려 보냈다 경우 오픈 팔 항목 (치료) 동물을 통제에 비해 증가 수는 EPM에서 검색 되 면이 완화 효과2,3나타냅니다. 가장 강력한 회피 응답 EPM 분석 결과5;의 시작 (EPM의 4 개의 팔의 교차점에 쥐의 배치) 후 첫 번째 5 분에서 입증 되었습니다. 따라서, 치료 후 어떤 행동 든 지 일반적으로 EPM에 5 분에 대 한 기록 됩니다. 불안 수준의 추가 조치, 헤드 딥, 투우사 (세로 서 2 개의 뒷 다리에 쥐의), 지저분한 boli 뿐만 아니라 총 팔 수가 항목 (자발적인 모터 활동)와 다른 자세 스트레칭 (냉동), 또한 기록 될 수 있습니다. EPM2. 따라서, 불안 관련 행동의 포괄적인 평가 제공 하기 위해 여러 행동 매개 변수를 컴파일할 수 있습니다.

위해서는 결과의 유효성을 높이고, 2 ~ 3 행동 분석 실험 일반적으로 함께 사용 됩니다, 빛-어둠 선택 시험, 사회적 상호 작용 시험, 등 그리고 다른 동물의 불안 수준을 측정 하기 위해 EPM 테스트 모델6. 설치류에서 혼자 수행 EPM 분석 결과 다른 마약7의 완화 또는 anxiogenic 효과 조사 하는 적당 한 방법 이기도 합니다. EPM 테스트는 다이아 형 불안 완화 제 (, 다이아 제 팜)8, 뿐만 아니라,에 뿐만 아니라 다른 사람, 사이 아미노 산, monoamine, peptidergic 및 nucleosidergic 화합물 (예를 들어, N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 적으로 민감한 AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA) 적 CNQX, μ-opioid 수용 체 주 작동 근 모 르 핀, NPY1 적 BIBP3226, 물질 P, 렐, 옥 시 토 신, 세로토닌 수용 체 주 작동 근 및 8-오-DPAT 같은 길 항 근 및 WAY-100635, 및 β1-아드레날린 길 항 근 betaxolol)9,10,,1112. 따라서, 설치류에 EPM 분석 결과 적합 하 고 민감한 방법 완화 효과 (예를 들어, 편도 체, 해 마, 및 변 지역)에 관련 된 뇌 영역에 영향을 주는 다른 치료의 영향을 조사 하 고 불안2에 내포 된 행동 (예를 들어, serotonergic, GABAergic, 및 adenosinergic 시스템)의 메커니즘. 이러한 EPM 연구에서 테스트 에이전트 외 인 케 톤 보충 뇌 행동 변화를 감지 하는 민감한 방법 필요할 수 있는 미묘한 방법으로 신호를 변경 하는 포함 됩니다.

이 문서에서는, 우리는 실험적인 바이어스를 제거 하는 데 도움이 하 고 수집 및 행동 변경 소설 완화 치료에 대 한 응답에서의 분석을 용이 하 게 소프트웨어를 추적 하는 비디오와 함께 사용 하는 EPM 테스트를 설명 합니다.

Protocol

동물 치료 및 측정 절차 지침에 따라 사우스 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) (프로토콜 #0006R) 수행 했다. 모든 노력을 사용 하는 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다.

1입니다. 준비

참고: 프로토콜 일반적으로 필요 합니다 연구소 자란 쥐 또는 마우스 EPM 테스트. 그러나, 기니 돼지 등 다른 동물 또한 EPMs13에 테스트 되었습니다. 그것은 비디오 추적을 사용 하 여 미로에서 동물과 미로 색 사이의 색상 명암을 고려 하는 것이 중요입니다. 대비는 연구자 동물 라이브 또는 를 통해 비디오를 보고 덜 중요 합니다. 비디오 추적 소프트웨어 필요 하는 문서를 구성 하는 동물의 설정은 검은색 이나 흰색 검정색이 나 흰색 미로에 있습니다. 명확한 아크릴 미로 구성 설정에 문제가 발생할 수 있습니다 하지만 매트 회색 미로 두 쥐 색에 대 한 최적의 수 있습니다.

  1. 같은 스트레인, 섹스, 발 정기 주기, 및 나이, 몸 무게2요인에 영향을 미치는 가능성을 고려 하 고 동물 실험에 대 한 선택 합니다.
  2. 개별 실험에 따라 달라 집니다, 동물 테스트에 대 한 그룹의 수를 결정 합니다.
    참고: 그룹 크기 테스트 치료와 함께 예상 되는 효과 크기에 종속 됩니다. 전력 분석 실험 실험 그룹/조건 수 뿐만 아니라 어떤 주어진된 작업에 동물의 응답에 가변성을 주어 포함 될 과목의 최소 수를 확인 하려면 시작 하기 전에 일반적으로 이루어집니다.
  3. (어떤 다른 행동 테스트, 오픈 필드 테스트, EPM 테스트, 구멍 보드 테스트, 강제 수영 테스트 등의 배터리 사용) 실험 디자인 신중 하 게.
    참고: EPM 테스트 직전 (오픈 필드 테스트) 등 소설 테스트 환경에는 설치류의 사전 노출 EPM1,2에 동물의 동작을 변경할 수 있습니다.
  4. 모든 동물 EPM 테스트 전에 비슷한 방식으로 처리 합니다.
    참고: 그것은 다른 스트레스 요인, 약물 (, 주사), 스트레스, 운송 및 처리의 응용 프로그램 동작 및 EPM16에 설치류의 행동 반응을 변경할 수 있습니다 입증 되었습니다. 따라서, (예를 들어, 선적, EPM 테스트 하기 전에 1-2 주 후)에 동물 집, 실험 조건 및 처리 절차 (, gavaging) 동물의 습관 들 임은 필요 합니다. 그것은 또한 중요 한 설치류와 어떤 경험과 사전 스트레스 테스트, 특히 바로 앞의 처리는 동물 및 치료 그룹에 걸쳐 일관성.
  5. 쥐와 쥐, 동물 그들의 어두운, 활성화 단계에 있을 때 행동 평가 수행할 수 있도록 리버스 라이트 사이클을 사용 하 여 같은 야행성 동물 행동 연구를 수행 합니다.
    참고: 다른 주택 조건 및 빛의 효과 동작에 주기 circadian 리듬과 EPM 결과에 그들의 영향 설명 되었다 이전17, 동물의 호르몬은 빛 사이클에 의해 규제 때문에.
  6. 절차 동안 동일한 경험을 사용 하 고 향수 나 강한 냄새를 가진 비누를 방지 하도록 요청.
  7. 실험 기간 동안 동물에 가까운 이야기 또는 EPM 환경 근처 개체 이동 경험 부탁 드립니다.
    참고: 관찰자는 최소한의 움직임과 소음 행동 데이터를 수집 하는 때 매우 중요 하다.
  8. 이전 동물 시험 동물에 의해 탐사를 방해할 수도의 모든 냄새를 지우려면 각 재판 후 전체 EPM을 청소.
  9. (권장) EPM 테스트 (몸통에 의해 그것을 부드럽게 따기와 1 분 또는 2를 위해 그것을 들고) 전에 몇 일 동안 동물을 처리 하는 실험에 그들을 적응.
  10. EPM에 동물을 배치할 때 (예를 들어, 센터는 실험에서 오픈 팔을 직면 하 고) 같은 팔을 직면 하 고 동일한 위치에서 EPM에서 각 짐승을 일관 된 방식으로 모든 동물을 처리할 확인 하십시오.

2입니다. 외 인 케 톤 보충의 응용

  1. 어떤 치료 결정 (, intragastric gavage) 치료에 대 한 노출량 계산을 시작 하기 전에 동물의 몸 무게를 측정 합니다.
  2. 케 톤 보충 (표준 설치류 차 우/표준 다이어트 [SD] + 물 gavage; 전에 5 d gavage 여 물을 사용 하 여 intragastric gavage 방법 (적응 기간)에 동물을 숙지 예를 들어, 2.5 g/kg 몸 무게 물/day의). Intragastric gavage 방법에 적응 하지 않는 어떤 동물 든 지의 사용을 제외 합니다.
  3. 만성 83 d와 subchronically sd 7 d와 어느 물으로 매일 gavage 동물 먹이 적응 기간에 따라 (예를 들어, 5 g/kg 몸 무게/일; 제어 그룹: n = 8), 케 톤은 케 톤 에스테 르 등 보충 (애; 1, 3- 부탄-acetoacetate diester; 예를 들어, 일/5 g/kg 몸 무게; n = 8), 케 톤 소금 (KS; /K++Na \u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] 미네랄 소금; 예를 들어, 일/5 g/kg 몸 무게; n = 8), 또는 KS + 중간 사슬 트리 글리세라이드 (1:1 비율, KSMCT; n = 8)18,,1920.
    참고: intragastric gavage를 받은 동물 치료 후 EPM 1 h에서 테스트 되었습니다. 쥐 제어 그룹으로 (케 톤 보충 제외) 물으로 표준 설치류 차 우와 gavaged를 먹이.

3. 불안의 분석 결과

  1. EPM 장치
    1. 결과 표준화 하는 연구를 통해 동일한 장치를 사용 합니다. EPM은 더하기 모양의 장치, 4 개의 팔으로 구성 되어 (예를 들어, 무기 수 10 c m 길이 50 c m): 2 개의 반대 팔, 열리고 두 팔 반대 폐쇄 (예를 들어, 30 cm) 높은 벽을 갖추고 있습니다. 기구 (예를 들어, 55 cm) 바닥 위에 상승2.
      참고: 가장 일반적으로 사용 되는 매개 변수는 누적된 시간 오픈 팔에 들고;에 항목 수 그러나, 폐쇄 팔 및 센터에서 소요 된 시간 및 거리에 뿐만 아니라 폐쇄 팔 및 센터에 항목의 수는 측정 각 지역에 여행.
    2. 간접 조명을 사용 하 여 EPM을 빛 (, 직접 빛 소스 EPM 기구를 직접 조명 대신 천장을 향해) 그리고 모든 4 개의 팔은 마찬가지로 조명 (그림자 없이 그림 2참조).
      참고: 빛의 수준에 변화는 EPM에 설치류의 동작 변경. 따라서, 유사한 조명 연속 실험 동물 및 일 (예를 들어, 룸에서 2800 루멘)2에 필요 합니다.
  2. 비디오 추적 시스템
    참고: 자동으로 쥐 (에서 행동 데이터를 수집 하는 데이터 컬렉션에 대 한 비디오 카메라와 컴퓨터 인터페이스 시스템을 추적 하는 비디오를 사용 하 여그림 3). 추적 시스템, 다양 한 표준 아날로그 카메라 또는 사용자 정의 이미지 소스 (적외선 카메라, 캠코더, WIA 호환 USB 카메라, 웹캠, 비디오에 대 한etc.) 사용 될 수 있다. 분석할 때 녹화 된 비디오, 운동 추적 소프트웨어.avi.vob,.wmv,.asf,.mov,.qt,.mpg,.mpeg,.mp4,.3gp,.mkv 등 모든 일반적인 비디오 포맷을 지원 합니다. 그것은 특정 코덱; 필요할 수 있습니다 경우 비디오는 올바르게 재생 하지 않습니다, 해당 코덱이 시스템에 설치 하는 경우 추가 비디오 포맷 지원 됩니다. 이전 취득된 동영상을 분석 하 고 DVD/HD 레코더, 디지털 비디오 파일 (.avi,.divx,.mpeg와 같은 다른 소스에서 이미지를 처리 하는 움직임 추적 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다.etc.), 웹캠, DV 카메라, 및 WIA 호환 이미징 장치.
    1. 시스템 설치 프로그램
      1. 움직임 추적 소프트웨어의 설치 키를 USB 2.0 포트에 연결 하 고 설치 도구를 실행.
      2. 실험 영역 위에 카메라를 수정 하는 그것은 실험 동안 움직이지 있을 것입니다 확인 합니다.
      3. 움직임 추적 소프트웨어 시스템에서 설명서를 사용 하 여 새 실험을 설정 합니다. 새로운 실험를 선택 합니다. 새로운 실험 (그림 3, 보충 파일 1) 따라야 프로토콜의 아이콘을 더블 클릭 합니다.
      4. 레이블/설명 실험 실험 정보 대화 상자에서 세부 정보를 입력 합니다.
      5. 처리할 비디오 시퀀스의 소스를 지정 합니다.
      6. 정확한 거리 측정에 대 한 변환 규칙을 정의 합니다. 교정 과정 거리와 속도 대 한 신뢰할 수 있는 값을 얻기 위해 실험 영역의 실제 크기의 정보를 이동 추적 소프트웨어 수 있습니다.
      7. 작업 영역에 관심 (영역) 영역을 결정 합니다.
      8. 검색 프로세스의 매개 변수를 조정 합니다.
        1. 움직임 추적 소프트웨어 이미지에서 동물의 위치를 정확 하 게 감지를 위해서, 일부 감지 조정 설정 해야 합니다.
        2. 추적 프로세스 감지 설정 패널의 밝기 및 대비 섹션에서 일반 밝기 및 대비 매개 변수의 정밀한 조정을 사용 하 여 명확 하 고 잘 대조 이미지를 필요 합니다. 필요에 따라 전체 이미지에 대 한 또는 사용자 정의 영역에 대 한 이러한 설정을 조정 합니다.
      9. 검색 프로세스를 테스트 하려면 각 경기장에 쥐를 넣어.
      10. 검색 프로세스 주제를 올바르게 식별할 수 있는 경우 확인 하려면 테스트 시작 버튼을 누릅니다. 검색 화면에 도트의 외관에 의해 활성화 됩니다 확인 합니다. 교정 과정 테스트를 시작 하기 전에 할 수 있다.
      11. 탐지는 플레이어에 표시만 검정색 점이 추적 되 고 동물 때 확인으로 간주 됩니다. 밀접 하 게 모든 동물의 변위에 따라 빨간색 라인을 추적 해야 합니다. 적절 한 추적 또한 변위를 기반으로 하는 좌표와 동물 숫자를 나열 하 고 해당 흰색 라벨 확인 된다. 이러한 검색을 취득 하지 감지 최적화 및 프로세스 추적에 대 한 임계값 아픕니다 매개 변수를 조정 합니다.
      12. 선명 하 고 잡음이 테스트 이미지를 얻으려면 임계값 침식 매개 변수를 조정 합니다.
      13. 추적 경로 잘못 검색 하는 경우 (그림 4) 중지 테스트 단추를 누릅니다. 이러한 모든 새로운 실험 파일에 사용할 경우, 기본값으로 저장 단추를 누릅니다. 새 검색 설정을 저장 하려면 적용 단추를 누릅니다.
      14. 시험의 시간 상태를 설정 합니다.
      15. 실험 프로토콜 추적 수집 과정 주제 실험 영역에 배치 됩니다 같은 시간에 시작 하는 경우, 소프트웨어와 함께 제공 되는 원격 장치를 설정 하는 무선 마우스를 사용 하 여 가능 하다.
        참고:이 옵션 원격 시작 및 중지 제어의 가능성을 제공 합니다.
    2. 시스템에 과목의 설치
      1. 실험 주제 데이터베이스를 관리 합니다. 실험 과목의 데이터베이스를 만들려면 실험 도우미 바에서 과목 버튼을 눌러 과목 데이터베이스 관리자를 입력 합니다.
      2. 데이터베이스에 새 주제를 추가 하려면 누르십시오 + 단추.
      3. 하나의 주제 옵션을 이미 선택의 코드를 입력 합니다.
      4. 주제 속성 섹션에서의 정보의 나머지 부분을 입력 합니다.
      5. 새 주제를 추가 하려면 만들기 를 누릅니다.
      6. 실험 계획을 정의 합니다. 스케줄러 를 사용 하 여 여러 단계를 정의 세션, 시련, 및 주제 실험 프로젝트 내에서 실행 될 계획. 재판은 "다음 재판"으로 자동으로 선택 되어 실행 될. 이 속성은 평가판 이름 왼쪽에 녹색 체크로 표시 됩니다.
    3. 동시 기록 하 고 추적 하 여 데이터 수집
      참고: 라이브 이미지 소스를 선택 하면 플레이어 패널 제공 합니다 포함 된 녹음 모듈을 쉽게 선택한 카메라에서 나오는 비디오를 캡처.
      1. 데이터 수집 (교정, 영역 정의 검색 설정, 시간 설정, 스케줄러)을 위한 운동-추적 소프트웨어를 준비 합니다.
      2. 데이터 패널을 엽니다.
      3. 없이 동물 실험의 비디오 소프트웨어에서 사용할 수 있는 녹음 시작 버튼을 눌러 녹음을 시작 합니다.
      4. 동물 실험 영역에 놓습니다.
      5. 시간 컨트롤 패널에서 시작 버튼을 누르면 데이터 수집 프로세스를 시작 합니다. 추적 과정 녹음 과정 동시 실시 될 것입니다. 필요한 경우, 행동 변수를 수동으로, 메모를 실험 자에 게 투우사, 같은 머리 딥, 그리고 폭포 (그림 5).
      6. EPM 데이터 수집 수동으로으로 시험장에서 멀게 관찰자 (별도 커튼으로 EPM에서 관찰자)에 의해.
      7. 추적 프로세스 기록의 끝까지 기다립니다 하거나 시간 컨트롤 패널에서 중지 단추를 누릅니다.
      8. 실험 지역에서 동물을 제거 합니다. 움직임 추적 소프트웨어 플레이어에서 사용할 수 있는 중지 버튼을 누르면 비디오 녹음 프로세스를 중지 합니다.
      9. 실험 영역을 세척 하 고 건조 하 여 다음 동물에 대비 합니다. 주기를 다시 반복 합니다.
    4. 데이터 분석
      1. 분석 도구에 액세스 하려면 실험 도우미 바에서 분석 단추를 누릅니다.
      2. 완성 된 시험의 분석 보고서를 생성 하려면 분석 실험을 선택 합니다. 구성 하 고 분석 보고서를 선택 합니다. 분석할 시간 간격을 설정 합니다. 생성 하 고 보고서를 검토 합니다. (그림 6) 스프레드시트 또는 이미지 형식으로 결과 내보냅니다.
  3. EPM의 불안 수준 측정에 대 한
    1. 구강 후 (어렴풋이 조명 하 고 조용한 방)에서 nonstress 조건에서 EPM 실험을 수행 합니다.
      참고: circadian 리듬 EPM15,17에 설치류의 행동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 실험은 가까운 시간 간격 (예를 들어, 1200과 1400 사이의)에서 실행 되 다는 것을 확인 하십시오. 실험 기간 동안 불필요 한 움직임 및 잡음을 피하십시오.
    2. 테스트 시작 하기 전에 EPM은 청소 하 고 건조 및 비디오 추적 시스템 사용 준비가 되어 있는지 확인 합니다.
    3. 그들의 집 안의 쥐 실험 하기 30 분 실험 룸에 전송 합니다.
    4. 장소는 실험의 반대 오픈 팔을 직면 하 고 EPM의 4 개의 팔의 교차로에 쥐.
    5. 추적 소프트웨어, 비디오를 실행 뿐만 아니라 수동으로 5 분에 대 한 동물의 동작을 기록 합니다.
    6. 동물 EPM에서 경우, 선택 하 고 다시 어디에서 떨어진 EPM의 같은 지점에 배치. 분석에서이 동물의 행동 데이터를 제외 합니다.
      참고: 시끄러운 소음 또는 운동 수 무력화/동결 팔에 동물. 큰 소리는 들 었 경우 실험 기간 동안, 분석에서 그 순간에 실험을 진행 하는 동물의 행동 데이터를 제외 합니다.
    7. 5 분 테스트의 끝에, 추적 소프트웨어 비디오를 중지 하 고 EPM에서 동물을 제거 합니다. 그것의 가정 케이지에 다시 배치.
    8. 다음 실험/동물, 하기 전에 뒤에 수돗물 소독 세제 (, Quatricide)로 EPM을 청소. 종이 타 올으로 장치 드라이.

4. 비디오 추적 시스템에 의해 수집 된 데이터의 분석

  1. 기록 된 데이터에 따라 달라 집니다, 열려있는 팔 및 닫히는 팔; 소요 시간 분석 들고, 닫힌된 팔, 및 센터 영역; 항목 수 닫힌된 팔;로 진입 대기 시간 거리 들고, 닫힌된 팔, 그리고 센터 영역에서 여행.
    참고: 동물 영역에로 간주 됩니다 때 중앙 몸의 질량은 그 지역에서.
  2. 테스트/Tukey의 다중 비교 테스트 피셔의 최하위 차이 (LSD)는 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 동작에 치료의 효과 결정 합니다.

Representative Results

현재 실험 조사가 그 외 인 케 톤 보충 관리 하거나 만성 가설 (83 일 동안 먹이) 또는 subchronically (구두 7 일 gavaged)는 2 개월 남성 Sprague-Dawley (SPD) 쥐 (에 완화 효과 250-350 g). 만성 관리 다음 케 톤 보충의 구성: 낮은 복용량 케 톤 에스테 르 (아이크; 1, 3-부탄-acetoacetate diester, ~ 10 g/k g/일, 아이크), 높은 복용량 케 톤 에스테 르 (HKE; 25 g/k g/일, HKE), 베타-hydroxybutyrate-미네랄 소금 (bHB S; 25 g / k g/일, KS), 그리고 bHB S + 중간 사슬 트리 글리세라이드 (MCT; 25 g/k g/일, KSMCT). 아민 실험에 대 한 다음 치료 그룹 사용 되었다: 애, KS, 및 KSMCT (5 g/k g/일). 제어 그룹 포함 SD 또는 SD 물 gavage (제어). 모든 데이터는 의미로 표현 했다 ± 표준 오차 (SEM) 의미의. 결과 고려 되었다 중요 한 때 p < 0.05. 의미는 피셔의 LSD 테스트와 일방통행 ANOVA에 의해 결정 되었다.

만성 수 유 후 쥐 KSMCT 그룹에서 두 팔을 벌려에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈다 (p = 0.0094) 컨트롤 그룹에 비해. 닫힌된 팔에 소요 된 시간 아이크, KS, 및 KSMCT 그룹에 훨씬 덜 했다 (p = 0.0389, 0.0077, 0.0019, 각각) KS 그룹 센터에서 훨씬 더 많은 시간을 소요 하는 동안, (p = 0.0239) 컨트롤 (SD) 그룹 (에 비해 그림 7A) 18.

두 팔을 벌려에서 상당히 긴 거리를 여행 하는 KS 및 KSMCT 그룹 쥐 (p = 0.036 0.0165) 거리를 크게 보여 아이크, KS 및 KSMCT 그룹에서 쥐 닫힌된 무기에 여행 하는 동안, (p = 0.0252, 0.00041, 그리고 0.0032, 각각), 컨트롤 그룹 (SD) (그림 7B)에 비해. KS 및 KSMCT 그룹 큰 거리 중심 지역에 여행 했다 컨트롤 그룹에 비해, (p = 0.0206와 0.0482, 각각), KSMCT 그룹에서 닫힌된 팔에 첫 번째 입구에 대기 시간 후 상당히 큰 했다 만성 먹이 (p = 0.0038)18 (그림 ℃).

두 팔을 벌려에서 소요 시간 애 그룹에 큰 했다 (p = 0.0281) 구강의 7 일 후 애, KS, 및 KSMCT 그룹에서 소요 된 시간이 감소 센터에서 (p < 0.0001, 0.0005 = 및 = 0.023, 각각)는 contro에 비해, l 그룹 (그림 8A)18. 애 및 KS 그룹 닫힌된 팔에 항목의 수는 상당히 낮은 (p = 0.0436와 0.0234, 각각)의 관리 (그림 8B), 캔사스에 있는 쥐 그룹 또한 동안 7 일 자주 덜 센터를 입력 한 후 (p = 0.0193), 제어 (SD) 그룹에 비해.

Figure 1
그림 1: 미로 (EPM) 쥐 테스트용 플러스 상승. 각 팔 10 c m 이며 50cm 길이, 2 개의 반대 팔 제기 지 열. 2 무기 반대 폐쇄 30 cm 높은 벽을 갖추고 있습니다. 바닥에서 활주로 높이 55 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 예의 직접 및 간접 조명. 광원은, 천장을 향해 지적 실험 영역 위에 직접 빛을 차단 하는 동안 확인 합니다. 그것은 마찬가지로 그림자 없이 모든 4 개의 팔을 밝히는 간접 조명 EPM 실험 하는 동안 사용 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 운동 추적 소프트웨어의 실험 도우미 바. 그것은 주요 작업에 대 한 액세스를 제공 하도록 설계 되었습니다. 현재 허용 된 작업은 활성 버튼 전형적인 실험 과정 내에서 작업에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 제목 트랙 동물의 움직임 다음 빨간색 선으로 표시 됩니다. 임계값을 조정 하 여만 동물을 탐지 하 고 운용에 의해 추적 될 때까지 백그라운드를 감소 수 있습니다. 트랙 다음 주제의 질량 중심 그리고 현재 위치 좌표 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 오픈 올리다에 Sprague Dawley (SPD) 쥐와 미로 (EPM) 플러스 상승 실험 설정의 예는 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 재판 중 동물의 누적된 이동 트랙. 데이터 분석의 일환으로, 추적 영역에서 피사체의 수집된 궤적 추적을 표시할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 외 인 케 톤 보충의 만성 먹이의 83 일 후 EPM에서 SPD 쥐의 행동 반응. 이러한 패널 EPM 움직임 추적 시스템18에 의해 수집 된 대표적인 결과 보여줍니다. (A) KSMCT 그룹 보냈다 들고, 아이크, KS, 동안에 시간의 큰 비율 및 KSMCT 그룹 컨트롤 (SD) 그룹에 비해 닫힌된 무기에 적은 시간을 보냈다. (B)는 KS 및 KSMCT 그룹 들고, 아이크, KS, 동안에 더 많은 거리를 여행 하 고 KSMCT 그룹 여행 닫힌된 무기에 거리 컨트롤에 비해 불안을 감소를 보여주는 (SD) 그룹. (C)는 KSMCT 그룹 입력 후, 닫힌된 무기 감소 불안 (SD) 그룹 컨트롤에 비해 나타내는. 약어: SD = 표준 설치류 차 우 + 물 (25 g/kg의 몸 무게 (들어) 물/일); 아이크 = SD + 아이크 (1, 3-부탄-acetoacetate diester, 10g/kg b.w./day); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./day); KS = SD + 베타-hydroxybutyrate-미네랄 소금 (bHB S; 25 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB S + 중간 사슬 트리 글리세라이드 (MCT, 25 g/kg b.w./day); SPD Sprague-Dawley 쥐; = EPM = 높은 플러스 미로 (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001; * * * p < 0.0001). 이 그림은 아리에서 수정 되었습니다. 18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 외 인 케 톤 보충의 구강의 7 일 후에 SPD 쥐의 행동 반응. 대표 결과 EPM을 통해 수집 된 운동 추적 소프트웨어 시스템18를 사용 하 여 테스트. (A) 애 그룹 보냈다 들고, 애, KS, 동안에 시간의 큰 비율 및 KSMCT 그룹 적은 시간을 보냈다 ([SD] 컨트롤 그룹에 비해) 센터에 따라서 불안 감소를 나타내는. (B) (SD) 그룹 컨트롤에 비해, 더 적은 항목 애 및 KS 그룹 쥐에서 닫힌된 팔에서 발견 되었습니다. 약어: SD = 표준 설치류 차 우 + 물 (물/하루 5 g/kg 들어); KE = SD + 케 톤 에스테 르 (1, 3-부탄-acetoacetate diester, 5g/kg b.w./day); KS = SD + 베타-hydroxybutyrate-미네랄 소금 (bHB S; 5 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD Sprague-Dawley 쥐; = EPM = 높은 플러스 미로 (* p < 0.05; * * * p < 0.001; * * * p < 0.0001). 이 그림은 아리에서 수정 되었습니다. 18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

일반적으로 몇 가지 일반적으로 사용 테스트, 같은 빛 어두운 선택 테스트, 사회적 상호 작용 시험, EPM 테스트 사용 됩니다 다른 동물 모델에서 불안 수준을 측정 하. 그러나, 혼자 EPM 분석 결과 조사 하는 적당 한 방법은, 설치류의 불안 수준18,20외 인 케 톤의 효과 보충 하는 예를 들어.

EPM 방법의 주요 장점은 무조건된 고소 공포와 녹지의 어두운, 밀폐 된 공간으로 설치류의 본능적 경향에 의존. 다른 한편으로, 불안 같은 동작을 연구 하는 데 사용 하는 다른 방법은 행동 응답 특정 유해 자극, 전기 충격, 음식/물 부족, 시끄러운 소리, 등 노출 프레데터 냄새3을 기반으로 합니다. 이러한 테스트 일반적으로 귀 착될 조건부 응답 EPM 또한 더 자비 롭 대안을 나타내는 반면. 또한, EPM 서로 다른 뇌 영역 (예:변 지역, 해 마)와 기본 메커니즘의 관련 연구를 유용한 도구가 될 수 있습니다 (예를 들어, GABA, 글루타민 산 염, 세로토닌, 아데노신) 불안 행동2.

때 잠재적인, 미묘한 완화 효과 평가 하는 경우에 특히 동물 (예를 들어,는 구강), 모든 동물 같은 방식으로 처리 하는 것이 중요 하다와 같은 사람에 의해 아주 스트레스는 치료를 적용 합니다. 가능 하면 식 수 또는 통해 는 입에 마약/화합물의 도입을 '치료' 하는 것은 선호 하는 방법 있을 수 있습니다. 같은 금액은 각 동물에 관리 되도록는 구강을 사용할 수 있습니다. 화합물의 pharmacokinetic 속성을 기반으로, 그것은 일반적으로 gavaging 후 1 시간 이내 EPM에 동물을 테스트 하는 것이 좋습니다. 실험 과목을 선택할 때 그것은 중요 한 목표에 따라 그들의 긴장, 섹스, 발 정기 주기, 및 나이로 몸 무게를 고려 하 고 테스트 물질2. 나이에 관계 EPM 연구 설계 및 해석 데이터, 그것을 고려해 야 그 때 오픈 팔 항목의 백분율 선형 나이21 와 증가 하 고 EPM 행동의 노화와 관련 된 변화는 스트레인 전용22.

EPM 테스트를 할 때, 잠재적인 문제가 해결 될 필요가 있다. 때로는 동물 때문에 국외 자 성향 분석에서 제외할 필요 (예를 들어, 동물 떠날 수 없어 배치 위치 지역 거의 폭포는 기구에서 소음 또는 장치 외부 이벤트에 의해 산만). EPM 테스트 추가 합병증 치료 이러한 유형의 효과 평가 통해 EPM 매개 변수 될 필요가 있기 때문에 진정 또는 과다 발생을 포함할 수 있습니다.

두 팔을 벌려에서 활동 감소 때문에 한 번만 EPM 테스트에 동물을 노출 하는 것이 중요 하다 고 중앙 플랫폼에 대 한 지출 감소 총 시간 EPM 에 첫 번째 노출에 비해 설치류의 두 번째 (반복된) 노출에 설명 되었다 14,15. 따라서, EPM 테스트에 설치류의 단일 노출이 좋습니다. 그러나, 경우 최소 3 주 EPM 첫 번째 및 두 번째 노출 사이 EPM 설정 다른 룸 (다른 환경) 이동, 동물 EPM에 의해 조사 될 수 있습니다 테스트2번 이상.

EPM은 다른 물자, 크기 (예를 들어, 마우스 또는 쥐에 대 한), 그리고 주제를 공부 하는 색상을 선택할 때 고려 되어야. 그것은 장치에 이전 동물 남긴 냄새 후속 동물의 동작을 변경할 수 있습니다 염두에 두어야 하는 것이 중요. 따라서, 아크릴 유리 (투명 하지), 세탁 후 냄새를 유지 하지 않는 같은 정리 하기 쉬운 재료의 만든는 EPM을 사용 하는 것이 좋습니다. 나무로 만든 EPM 장치를 하지 마십시오. 가급적, EPM (예를 들어, 검은 흰색 동물 테스트 하는 경우)에서 테스트 하는 동물의 색과에서는 다른 매트 색상을 사용 합니다. 더 나은 동물 및 인클로저, 더 사이 대조는 동물 및 높은 신뢰성의 검색과 결과의 정밀도 획득 (덮여 거리, 속도, 추적) 무광택 회색 소재로 만든 EPM 기구는 흰색, 검은색, 그리고 흰색과 검은색 동물 유용 합니다.

비디오 추적 시스템의 추가 이용은 EPM, 뿐만 아니라 그것은 다양 한 물 미로, 오픈 필드, 플러스/레이디얼 팔/T-Y 미로, 행동 테스트 장소 특혜, 수영을 강제로 설정 하는 유연 하 고 쉬운 방법을 제공합니다 그리고 서 스 펜 션 테스트 꼬리.

요약,이 문서의 목표는 수집 하 고 분석 소설 완화 치료에 대 한 응답에서 행동 변경 추적 소프트웨어 비디오에 사용 하는 EPM 테스트를 설명 하는입니다. EPM의 가능한 응용 프로그램의 불안 관련 장애의 치료에 대 한 새로 개발된 된 약리 에이전트 prescreening 포함 됩니다. 완화 및 anxiogenic 에이전트 뿐만 아니라 다른 호르몬의 행동 효과 및 약물 남용의 수 또한 조사. 노화와 각종 스트레스에 노출의 영향 또한 평가 수 있습니다. 이 연구는 적절 한 조치는 때 EPM 사용 하 여 케 톤 보충18,20와 관련 된 행동 변화를 평가 하는 중요 한 방법 것을 입증 했다 결론 지었다.

Disclosures

다 봉 agostino, D.P., Kesl, S., 아놀드, P. 작곡 및 제작 방법 상승 하 고 Ketosis를 지속. 국제 특허 # PCT/US2014/031237입니다. 사우스 플로리다의 대학입니다.

아리, C., 다 봉 agostino, 불안 관련 행동을 줄이기 위한 D.P., 외 인 케 톤 보충. 임시 특허 # 62289749입니다. 사우스 플로리다의 대학입니다.

도미 닉 피 다 봉 agostino 및 Csilla 아리 케 톤 기술 유한 회사의 공동 소유자가 있습니다.

이 관심사를 검토 하 고 그것의 기관 및 개별 상충 정책에 따라 대학에서 관리 되었습니다. 모든 저자 추가 충돌의 관심은 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품 (아래 부여 번호 헝가리의 국가 개발 기관에 의해 ONR 그랜트 N000141310062와 GLUT1D의 기초는 부여 #6143113500 (도미 닉 피 다 봉 agostino)에 의해 지원 되었다 TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; Zsolt 마스) 하 고는 학과의 재향 군인 담당 (Kindy 표시)에 의해. 저자 (Csilla 아리)에이 주제에 지속적인 연구를 지원 하기 위한 퀘스트 영양 LLC를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

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