Elevato oltre a Test combinato con Video Software di monitoraggio per studiare l'effetto ansiolitico dei supplementi chetogenica esogeni del labirinto

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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le variazioni del livello di ansia di modelli animali roditori. L'elevata plus labirinto (EPM) test, utilizzato insieme a un video software di tracking fornisce un metodo affidabile per documentare l'effetto di vari trattamenti potenziali di ansiolitico in scenari di laboratorio preclinica.

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Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

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Abstract

L'obiettivo generale di questo studio è di descrivere la metodologia di elevato più l'analisi del labirinto (EPM) in combinazione con un video software di monitoraggio. Lo scopo del metodo è quello di documentare l'effetto di vari trattamenti potenziali di ansiolitico su modelli di roditori di laboratorio. Il test EPM si basa sulla propensione dei roditori verso spazi scuri protetti, recintati e incondizionata paura di spazi aperti e l'altezza, la loro innata motivazione intensa per esplorare nuovi ambienti. La EPM è un ampiamente usato test comportamentali per indagare le risposte ansiolitico o ansiogeni di roditori somministrati farmaci che sono noti per influenzare il comportamento. Osservazione che dimostrano una diminuzione percentuale di tempo trascorso sulle braccia chiuse, una proporzione aumentata di tempo speso su braccia aperte, un ridotto numero di voci da bracciolo chiuso e di un elevato numero di voci per aprire le braccia misurate dal test EPM può riflettere ridotto livelli di ansia. Utilizzando questo metodo, l'effetto degli integratori chetone esogeno sul comportamento di relazione con l'ansia viene testato in ratti Sprague Dawley (SPD). Integratori chetone esogeno cronicamente sono alimentati ai ratti per 83 giorni o subchronically e acutamente oralmente gavaged, tutti i giorni per 7 giorni, prima di condurre l'EPM test. Raccolta di dati comportamentali viene eseguita utilizzando il video intelligente sistema di tracciamento di un osservatore cieco alla fine dei trattamenti. I principali risultati indicano che il test EPM è un metodo efficace per rilevare l'effetto ansiolitico indotta da supplemento chetone e può essere considerato una misura sensibile per valutare i cambiamenti nel comportamento di ansia associata con droga o metabolica-terapie a base di.

Introduction

L'obiettivo di questo articolo è di descrivere la metodologia del test EPM in combinazione con un video software di monitoraggio per monitorare i cambiamenti nel comportamento di relazione con l'ansia e nuovi trattamenti in modelli di roditori di laboratorio. Il test EPM è un metodo relativamente semplice valutazione comportamentale, che è stato sviluppato per le indagini di quantificare i livelli di comportamento di ansia e ansia risposte dei ratti dopo l'applicazione del farmaco trattamenti1. Infatti, è stato dimostrato che il test EPM è un'analisi comportamentale diffuso ed efficace per l'indagine sui cambiamenti nei livelli di ansia di roditori1,2. L'applicabilità del test EPM nei roditori (ratti e topi) si basa sulla loro propensione verso spazi chiusi, scuri (approccio), una paura incondizionata di spazi aperte/altezze (evitare) e l'alto livello di motivazione innata per esplorare romanzo ambienti. Di conseguenza, il test EPM è una consolidata metodologia basata su un approccio-evitamento conflitto2,3.

EPM è un apparecchio a forma di più composta da quattro bracci elevati, che è stato descritto da Handley e Luca4 (Figura 1) e si compone di due braccia opposte che sono aperte per l'ambiente circostante (braccia aperte), mentre i due chiuso braccia opposte (bracci chiusi) sono dotati di pareti. Dopo il trattamento, se aumentato il tempo viene speso per le braccia aperte e/o un aumento del numero di voci di braccio aperto rispetto per controllare gli animali (non trattati) viene rilevato su EPM, ciò indica un effetto ansiolitico di2,3. La risposta più robusta di elusione è stata dimostrata nel primo 5 min dopo l'inizio (posizionamento dei ratti nell'intersezione di quattro bracci di EPM) del EPM dosaggio5; Pertanto, qualsiasi comportamento dopo un trattamento comunemente è registrato per 5 min su EPM. Come misure supplementari di un livello di ansia, il numero di tuffi di testa, alleva (verticale in piedi del roditore su due zampe posteriori), boli fecali, nonché totale braccio voci (attività motoria spontanea) e diverse posture (stretching o congelamento), possono anche essere registrati sull'EPM2. Così, più parametri comportamentali possono essere compilati per fornire una valutazione complessiva del comportamento di relazione con l'ansia.

Al fine di aumentare la validità dei risultati, due o tre saggi comportamentali sono comunemente usati insieme, come il test di scelta di chiaro-scuro, il test di interazione sociale, e il test EPM, per misurare i livelli di ansia di animale diverso modelli6. Il dosaggio EPM effettuato da solo sui roditori è anche un metodo adatto per studiare l'effetto ansiolitico o ansiogeni di diversi farmaci7. Il test EPM è sensibile non soltanto a benzodiazepine tipo ansiolitici (ad es., diazepam)8, ma anche, tra gli altri, per composti amminici acido, monoamino, peptidergic e nucleosidergic (ad es., antagonista del N-metilico-D-aspartato (NMDA) AP7, antagonista di acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) CNQX, morfina agonista oppioide µ, antagonista BIBP3226 NPY1, sostanza P, grelina, ossitocina, agonisti del recettore della serotonina e antagonisti come 8-OH-DPAT e Way-100635 e β1-adrenergici antagonista betaxolol)9,10,11,12. Di conseguenza, il dosaggio EPM su roditori è un metodo adatto e sensibile per studiare l'influenza dei diversi trattamenti che influenzano le aree cerebrali coinvolte nell'effetto ansiolitico (ad esempio, l'amigdala, ippocampo e aree limbiche) e meccanismi di azione (ad esempio, il sistema serotoninergico, GABAergici e adenosinergico) implicati in ansia2. Gli agenti provati in questi studi EPM includono integratori chetone esogeno che alterano il cervello in modi sottili che potrebbero richiedere un metodo sensibile per rilevare i cambiamenti del comportamento di segnalazione.

In questo articolo, descriviamo il test EPM usato in combinazione con un video software di monitoraggio, che aiuta ad per eliminare i pregiudizi sperimentale e facilita la raccolta e l'analisi delle alterazioni comportamentali in risposta ai trattamenti romanzo ansiolitico.

Protocol

Il trattamento degli animali e le procedure di misurazione sono stati effettuati in conformità con la University of South Florida animale cura ed uso Committee (IACUC) le linee guida istituzionali (protocollo n. 0006R). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre il numero degli animali utilizzati.

1. preparati

Nota: Il protocollo richiede in genere mouse o ratti allevati in laboratorio per le prove di EPM. Tuttavia, altri animali, come cavie, sono stati testati anche su EPMs13. È importante considerare il contrasto di colore tra gli animali nel labirinto e il colore di labirinto quando si utilizza il rilevamento video. Il contrasto è meno importante per i ricercatori guardando gli animali dal vivo o via video. Le impostazioni del video monitoraggio software c'è bisogno di essere configurato per documentare che gli animali sono nero o bianco su entrambi un labirinto bianco o nero. Possono verificarsi problemi con le impostazioni di configurazione con un labirinto di acrilico trasparente, ma un labirinto grigio opaco può essere ottimo per entrambi i colori del roditore.

  1. Selezionare gli animali per l'esperimento, considerando il potenziale di influenzare i fattori, come il ceppo, sesso, ciclo di estro ed età, nonché corpo peso2.
  2. Basato sull'esperienza individuale, determinare il numero di animali per gruppo, per il test.
    Nota: La dimensione del gruppo sarà dipendente dal formato di effetto che è previsto con trattamento della prova. Analisi di potenza sono generalmente fatto prima che l'esperimento è iniziato per determinare il numero minimo di soggetti da includere dato la variabilità nelle risposte dell'animale in qualsiasi compito dato, come pure il numero di gruppi/condizioni sperimentali.
  3. Progettare l'esperimento (in cui verrà utilizzata una batteria di test comportamentali differenti, come il test di campo aperto, EPM test, test di scheda del foro e prova di nuoto forzato) con attenzione.
    Nota: Pre-esposizione dei roditori per un ambiente di prova romanzo (ad esempio un test di campo aperto) immediatamente prima delle prove EPM può modificare il comportamento degli animali sul EPM1,2.
  4. Gestire tutti gli animali in un modo simile prima della prova EPM.
    Nota: È stato dimostrato che fattori di stress differenti, applicazione di farmaci (es., iniezioni), stress spedizione e movimentazione può cambiare il comportamento e le risposte comportamentali dei roditori il EPM16. Così, l'assuefazione degli animali per un animale house (ad es., dopo la spedizione, per 1-2 settimane prima della prova EPM), condizioni sperimentali e le procedure di trattamento (ad esempio, gavaging) sono necessari. È anche importante che la gestione dei roditori e qualsiasi esperienza con precedenti fattori di stress, specialmente immediatamente prima della prova, è coerenza in animali e gruppi di trattamento.
  5. Condurre gli studi comportamentali in animali notturni, come ratti e topi, utilizzando un ciclo inverso di luce, in modo che la valutazione del comportamento possa essere eseguita quando gli animali sono nella loro fase di buio, attivo.
    Nota: Gli effetti di luce e condizioni abitative differenti ritmi circadiani/ciclo sul comportamento e la loro influenza sui risultati EPM sono stati dimostrati in precedenza17, poiché gli ormoni degli animali sono regolati dal ciclo di luce.
  6. Utilizzare lo stessi sperimentatori durante le procedure e chiedere loro di evitare saponi con un forte odore o profumo.
  7. Chiedere gli sperimentatori non di parlare vicino all'animale durante l'esperimento o spostare gli oggetti vicino l'ambiente EPM.
    Nota: È criticamente importante che l'osservatore rende minimi movimenti e nessun rumore durante la raccolta di dati comportamentali.
  8. Pulire l'intero EPM dopo ogni prova per cancellare eventuali odori di animali precedenti che potrebbero interferire con l'esplorazione da parte dell'animale di prova.
  9. (Consigliato) Gestire gli animali per diversi giorni prima della prova EPM (raccoglierlo delicatamente dal torso e tenendolo premuto per un minuto o due) di acclimatare li allo sperimentatore.
  10. Quando si posizionano gli animali su EPM, assicurarsi di gestire tutti gli animali in modo coerente e posizionare ogni roditore in EPM nella stessa posizione rivolto verso il braccio stesso (ad es., nel centro della fronte il braccio aperto lontano lo sperimentatore).

2. applicazione di integratori chetone esogeno

  1. Misurare il peso corporeo degli animali prima di iniziare qualsiasi trattamenti per determinare il calcolo del dosaggio per il trattamento (ad es., intragastrica sonda gastrica).
  2. Familiarizzare gli animali al metodo intragastrico "gavage" (periodo di adattamento) utilizzando acqua mediante sonda gastrica per 5 d prima del completamento di chetone (dieta standard roditore chow/standard [SD] + acqua alimentazione mediante sonda gastrica; ad esempio, 2,5 g/kg di peso corporeo di acqua al giorno). Escludere l'uso di qualsiasi animale che non si adatta al metodo intragastrico "gavage".
  3. Dopo il periodo di adattamento, nutrire gli animali cronicamente per 83 d e subchronically per la 7D con SD e sonda gastrica al giorno con acqua (per esempio, 5 g/kg peso corporeo/giorno; gruppo controllo: n = 8), chetoni integrano come estere di chetone (KE; 1,3 - Butandiolo-acetoacetato diestere; per esempio, 5 g/kg di peso corporeo; n = 8), sale di chetone (KS; Sale minerale di na+/k+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB]; per esempio, 5 g/kg di peso corporeo; n = 8), o KS + trigliceridi a catena media (rapporto 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    Nota: Gli animali che hanno ricevuto intragastrica sonda gastrica sono stati testati su EPM 1 h dopo il trattamento. I ratti alimentati con cibo del roditore standard e gavaged con dell'acqua (escludendo il completamento chetone) servito come gruppi di controllo.

3. ansia dosaggio

  1. Apparato EPM
    1. Utilizzare la stessa apparecchiatura attraverso uno studio di standardizzare i risultati. EPM è un apparato a forma di più, che consiste di quattro braccia (ad es., le armi possono essere 10 cm di larghezza e 50 cm di lunghezza): due braccia opposte vengono aperti e due chiusi di fronte armi sono dotate di pareti alte (ad es., 30 cm). L'apparato è elevato sopra il pavimento (ad es., di 55 cm)2.
      Nota: I parametri più comunemente utilizzati sono il tempo accumulato trascorso a braccia aperte e il numero di voci nelle braccia aperte; Tuttavia, il tempo trascorso tra le braccia chiuse e il centro, e il numero di voci nel bracciolo chiuso e centro è misurato, così come la distanza percorsa in ogni area.
    2. Accendono l'EPM utilizzando illuminazione indiretta (cioè, diretto la sorgente di luce verso il soffitto invece di illuminare direttamente l'apparato EPM) e garantire tutte le quattro braccia sono similmente illuminate (senza ombre, Vedi Figura 2).
      Nota: Le variazioni del livello di luce alterano il comportamento dei roditori su EPM. Pertanto, illuminazione simili è necessario in animali da esperimento consecutivi e giorni (ad es., 2.800 lumen in camera)2.
  2. Sistema di tracciamento dei video
    Nota: Utilizzare un video sistema di tracciamento con un'interfaccia computer e una videocamera per la raccolta di dati, che raccoglierà automaticamente dati comportamentali in ratti (Figura 3). Per il video tracking system, una vasta gamma di telecamere analogiche standard o fonti di immagini definite dall'utente (telecamere a infrarossi, videocamera, fotocamera WIA compatibile USB, webcam,etc.) può essere utilizzato. Quando si analizza il video registrato, il software di monitoraggio di movimento supporta tutti i formati video comuni, come AVI,. VOB,. wmv,. ASF,. MOV,. QT,. mpg,. MPEG,. MP4,. 3GP e. MKV. Se il video non viene riprodotto correttamente, potrebbe richiedere un codec specifico; Ulteriori formati video sono supportati se il codec corrispondente è installato nel sistema. Il software di monitoraggio di movimento utilizzabile anche per analizzare video precedentemente acquisite ed elaborare le immagini da diverse fonti, quali registratori DVD/HD, digitali file video (. avi,. DivX,. MPEG,etc.), webcam, videocamere DV, e WIA compatibile con periferiche di imaging.
    1. Configurazione del sistema
      1. Inserire la chiave di installazione del software di rilevamento di movimento in una porta USB 2.0 e avviare lo strumento di installazione.
      2. Fissare la fotocamera sopra l'area sperimentale e garantire che rimarrà immobile per tutta la durata dell'esperimento.
      3. Impostare un nuovo esperimento nel sistema del movimento-tracking software utilizzando il manuale di istruzioni. Selezionare nuovo esperimento. Fare doppio clic sull'icona del protocollo che il nuovo esperimento dovrebbe seguire (Figura 3, complementare File 1).
      4. Inserisci i dati per etichetta/descrivere l'esperimento nella finestra di dialogo Informazioni di sperimentare .
      5. Specificare l'origine delle sequenze video da elaborare.
      6. Definire la regola di trasformazione per una misurazione di distanze corrette. Il processo di calibrazione consente al software di rilevamento di movimento essere informato sulle dimensioni effettive dell'area sperimentale al fine di ottenere valori affidabili per distanze e velocità.
      7. Determinare le aree di interesse (zone) nell'area di lavoro.
      8. Regolare i parametri del processo di rilevamento.
        1. In ordine per il software di monitoraggio di movimento rilevare con precisione la posizione dell'animale nell'immagine, alcuni aggiustamenti di rilevamento devono essere impostati.
        2. Il processo di rilevamento richiede un'immagine chiara e ben contrastata mediante una regolazione fine dei parametri di contrasto e luminosità generale nella sezione del contrasto e della luminosità del pannello Impostazioni di rilevamento . Se necessario, regolare queste impostazioni per l'intera immagine o per le zone definite dall'utente.
      9. Messo un topo in ogni arena per testare il processo di rilevamento.
      10. Premere il pulsante Avvia Test per verificare se il processo di rilevamento può identificare correttamente il soggetto. Confermare che il rilevamento è attivato dalla comparsa di un puntino sullo schermo. Il processo di calibrazione deve essere fatto prima di iniziare il test.
      11. Rilevamento è da considerarsi confermata quando il puntino nero solo mostrato nel lettore è l'animale monitorata. Il rosso linea di puntamento deve seguire da vicino gli spostamenti dell'animale. Movimento corretto è confermato anche con un'etichetta bianca elenca il numero di animali e corrispondenti coordinate basate sulla cilindrata. Se non si ottiene così un rilevamento, regolare i parametri di soglia e le erosioni per ottimizzare il rilevamento e monitoraggio di processo.
      12. Regolare i parametri di soglia ed erosione per ottenere un'immagine più nitida e priva di rumore prova.
      13. Se il percorso di rilevamento viene rilevato correttamente, premere il pulsante Interrompi Test (Figura 4). Se queste regolazioni sono da utilizzarsi per ogni nuovo file sperimentale, premere il pulsante Salva come predefinito . Premere il tasto accetta per salvare le nuove impostazioni di rilevamento.
      14. Impostare le condizioni di tempo delle prove.
      15. Se il protocollo sperimentale richiede il processo di acquisizione di traccia per avviare nel momento stesso in cui che il soggetto è posizionato nell'area sperimentale, è possibile impostare il telecomando che viene fornito con il software o utilizzare un mouse wireless.
        Nota: Questa opzione offre la possibilità di controllare in remoto la start e stop.
    2. Installazione dei soggetti del sistema
      1. Gestire database di oggetto di sperimentazione. Per creare un database dei soggetti sperimentali, è necessario immettere il gestore Database soggetti premendo il pulsante di soggetti nella barra Assistente di sperimentazione .
      2. Premere il pulsante + per aggiungere nuovi oggetti al database.
      3. Con l'opzione di un soggetto già selezionata, inserire il codice del soggetto.
      4. Riempire il resto delle informazioni del soggetto nella sezione Proprietà oggetto .
      5. Premere il pulsante Crea per aggiungere il nuovo soggetto.
      6. Definire il piano di sperimentazione. Utilizzare l' utilità di pianificazione per definire le diverse fasi, sessioni, prove e soggetti progettato essere eseguito nell'ambito del progetto sperimentale. La prova viene selezionata automaticamente come "la prossima prova" deve essere eseguito. Questa proprietà viene visualizzata come un segno di spunta verde sul lato sinistro del nome prova.
    3. Acquisizione dei dati da simultanea registrazione e monitoraggio dei
      Nota: Quando è selezionata una fonte immagine live, pannello del lettore fornisce un modulo di registrazione incorporato per catturare facilmente il video proveniente dalla telecamera selezionata.
      1. Preparare il movimento-tracking software per acquisizione dati (calibrazione, definizione di fuso, le impostazioni di rilevamento, le impostazioni di tempo, utilità di pianificazione).
      2. Aprire il pannello di acquisizione dati .
      3. Iniziare a registrare il video dell'esperimento senza l'animale premendo il pulsante Avvia la registrazione disponibile nel software.
      4. Posizionare l'animale nell'area sperimentale.
      5. Avviare il processo di acquisizione dei dati premendo il tasto Start sul pannello di controllo del tempo . Il processo di monitoraggio sarà effettuato simultanea con il processo di registrazione. Se necessario, chiedere lo sperimentatore di annotare manualmente, le variabili comportamentali come posteriori, testa tuffi e cascate (Figura 5).
      6. Raccogliere i dati EPM manualmente così come da un osservatore cieco (separa l'osservatore da EPM da una tenda) in sala prove.
      7. Attendere la fine della registrazione processo di rilevamento o premere il tasto Stop sul pannello di controllo del tempo .
      8. Rimuovere l'animale dall'area sperimentale. Interrompere il processo di video-registrazione premendo il pulsante stop disponibile sul movimento-tracking software player.
      9. Preparare l'area sperimentale per il prossimo animale di lavaggio e asciugatura. Ripetere il ciclo di nuovo.
    4. Analisi dei dati
      1. Per accedere allo strumento di analisi , è necessario premere il pulsante di analisi nella barra di Assistente di sperimentazione .
      2. Per generare report di analisi delle prove finite, selezionare le prove da analizzare. Configurare e selezionare il report di analisi. Impostare gli intervalli di tempo per essere analizzati. Generare ed esaminano i rapporti. Esportare i risultati in un foglio di calcolo o immagine formati (Figura 6).
  3. EPM per la misurazione dei livelli di ansia
    1. Eseguire gli esperimenti EPM condizioni nonstress (in una stanza scarsamente illuminata e tranquilla) dopo sonda gastrica orale.
      Nota: Assicurarsi che gli esperimenti vengono eseguiti in un intervallo di tempo vicino (ad esempio, tra il 1200 e 1400), perché il ritmo circadiano può influenzare il comportamento dei roditori l'EPM15,17. Evitare movimenti inutili e il rumore durante l'esperimento.
    2. Prima dell'inizio della prova, assicurarsi che l'EPM è puliti e asciugati e il video sistema di tracciamento è pronto all'uso.
    3. Trasferire i ratti nella loro gabbia a casa la camera sperimentale 30 min prima dell'inizio dell'esperimento.
    4. Posto un ratto all'incrocio dei quattro bracci di EPM, rivolto verso il braccio aperto fronte dello sperimentatore.
    5. Eseguire il video software di monitoraggio, così come registrare manualmente il comportamento dell'animale, per 5 min.
    6. Se l'animale si stacca l'EPM, pick up e posizionarlo nuovamente sullo stesso punto di EPM dove è caduto. Escludere i dati comportamentali di questo animale dall'analisi.
      Nota: Un forte rumore o movimento può immobilizzare/freeze animali a braccia aperte. Se un rumore è sentito durante l'esperimento, escludere i dati comportamentali dell'animale che subiscono l'esperimento in quel momento dall'analisi.
    7. Alla fine del test 5 min, fermare il video software di monitoraggio e rimuovere l'animale da EPM. Inserirlo nuovamente dentro la sua gabbia a casa.
    8. Prima l'esperimento successivo/animale, pulire EPM, con un detergente disinfettante (ad es., Quatricide), seguita da acqua di rubinetto. Asciugare l'apparecchio con carta assorbente.

4. analisi dei dati raccolti dal sistema di monitoraggio Video

  1. Basato sui dati registrati, analizzare la quantità di tempo trascorso tra le braccia aperte e tra le braccia chiuse; il numero di voci apportate a braccia aperte, chiuse le braccia e alla zona centro; la latenza a voce tra le braccia chiuse; la distanza percorsa a braccia aperte, chiuse le braccia e nella zona centro.
    Nota: L'animale è considerato di essere in un'area quando il centro del corpo massa è in quella zona.
  2. Determinare gli effetti dei trattamenti sul comportamento utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) con differenza meno significativa di Fisher (LSD) test di comparazioni multiple di prova/Tukey.

Representative Results

L'esperimento corrente indaga l'ipotesi che il completamento esogeno chetone o somministrati cronicamente (alimentati per 83 giorni) o subchronically (gavaged oralmente per 7 giorni) ha un effetto ansiolitico sul due-mese-vecchio maschio (di ratti Sprague-Dawley (SPD) 250-350 g). La somministrazione cronica ha consistito dei seguenti supplementi chetone: estere della basso-dose chetone (LKE; 1,3-butandiolo-acetoacetato diestere, ~ 10 g/kg/giorno, LKE), estere della alto-dose chetone (HKE; ~ 25 g/kg/giorno, HKE), beta-hydroxybutyrate-mineral salt (bHB-S; ~ 25 g / kg/giorno, KS) e del trigliceride bHB-S + media catena (MCT; ~ 25 g/kg/giorno, KSMCT). Per gli esperimenti subcronici, sono stati utilizzati i seguenti gruppi di trattamento: KE, KS e KSMCT (5 g/kg/giorno). I gruppi di controllo inclusi SD o SD con sonda gastrica acqua (controllo). Tutti i dati sono stati rappresentati come media ± errore standard della media (SEM). I risultati sono stati considerati significativi p < 0.05. Il significato è stato determinato da One-way ANOVA con test LSD di Fisher.

Dopo la poppata cronica, ratti nel gruppo KSMCT trascorso molto più tempo a braccia aperte (p = 0.0094) rispetto al gruppo di controllo. Il tempo trascorso tra le braccia chiuse era significativamente di meno nei gruppi LKE, KS e KSMCT (p = 0.0389 0.0077 e 0,0019, rispettivamente), mentre il gruppo di KS ha trascorso molto più tempo nel centro (p = 0.0239) rispetto al gruppo di controllo (SD) ( Figura 7A) 18.

Ratti nei gruppi di KS e KSMCT viaggiato distanze significativamente più lunghe a braccia aperte (p = 0,036 e 0.0165), mentre i ratti nei gruppi LKE, KS e KSMCT hanno mostrati significativamente meno distanza ha viaggiato tra le braccia chiuse (p = 0.0252, 0.00041, e 0,0032, rispettivamente), rispetto al gruppo di controllo (SD) (figura 7B). Rispetto al gruppo di controllo, i gruppi di KS e KSMCT avevano una maggiore distanza percorsa in zona centro (p = 0.0206 e 0.0482, rispettivamente), mentre nel gruppo KSMCT, la latenza al primo ingresso per il bracciolo chiuso era significativamente maggior dopo alimentazione cronica (p = 0.0038)18 (Figura 7).

Il tempo trascorso a braccia aperte era maggiore nel gruppo KE (p = 0.0281) dopo 7 giorni di alimentazione mediante sonda gastrica orale, mentre nei gruppi KE, KS e KSMCT, il tempo trascorso nel centro è diminuito (p = 0,0005, < 0,0001 e = 0,023, rispettivamente), rispetto al contro l gruppo (Figura 8A)18. I gruppi KE e KS, il numero di voci per il bracciolo chiuso era significativamente più basso (p = 0.0436 e 0.0234, rispettivamente) dopo 7 giorni di somministrazione (Figura 8B), mentre i ratti del KS gruppo anche entrati nel centro meno frequentemente (p = 0.0193), rispetto al gruppo di controllo (SD).

Figure 1
Figura 1: elevato più labirinto (EPM) utilizzato per il test ratti. Ogni braccio è 10 cm di larghezza e 50 cm di lunghezza, con due braccia opposte aperto con un bordo rialzato. I due chiusi di fronte armi sono dotati di pareti di altezza cm 30. L'altezza della pista dal pavimento è di 55 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: esempi di diretta e indiretta. Garantire che la sorgente luminosa è punta verso il soffitto, mentre la luce diretta sopra l'area sperimentale è bloccata. È importante utilizzare luce indiretta durante gli esperimenti EPM per illuminare allo stesso modo tutti i quattro bracci senza ombre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: la barra di assistente di sperimentazione del movimento-tracking software. Esso è progettato per fornire accesso alle operazioni principali. I pulsanti corrispondono all'attività all'interno del processo di sperimentazione tipica, mentre solo le attività attualmente consentite sono attive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: la pista di soggetto è segnata con una linea rossa seguendo il movimento dell'animale. Regolando la soglia, lo sfondo può essere ridotta fino a quando non solo l'animale è rilevato e monitorato dalla linea rossa. La pista segue il centro della massa del soggetto, e sono indicate le coordinate della posizione corrente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: elevato plus (EPM) di labirinto con ratto Sprague Dawley (SPD) nel braccio aperto Un esempio della disposizione sperimentale è dimostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: pista accumulato movimento dell'animale durante la prova. Come parte dell'analisi dei dati, può essere visualizzata la traccia raccolti traiettoria del soggetto nella zona di rilevamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: le risposte del comportamento dei ratti SPD in EPM dopo 83 giorni di alimentazione cronica del completamento esogeno chetone. Questi pannelli mostrano risultati rappresentativi raccolti da EPM e il sistema di rilevamento movimento delle18. (A), il gruppo KSMCT trascorso una percentuale maggiore di tempo a braccia aperte, mentre il LKE, KS, e gruppi KSMCT trascorso meno tempo a braccia chiuse, rispetto al gruppo di controllo (SD). Gruppi (B) The KS e KSMCT viaggiato più distanza tra le braccia aperte, mentre il LKE, KS, e gruppi KSMCT viaggiato minore è la distanza tra le braccia chiuse, mostrando ridotto l'ansia rispetto al controllo gruppo (SD). (C) la KSMCT gruppo è entrato più tardi, il bracciolo chiuso che indica ansia ridotta rispetto al controllo gruppo (SD). Abbreviazioni: SD = cibo roditore standard + acqua (25 g/kg peso corporeo (p.c.) di acqua al giorno); LKE = SD + LKE (1,3-butandiolo-acetoacetato diestere, b.w./day 10 g/kg); HKE = SD + HKE (b.w./day 25 g/kg); KS = SD + beta-hydroxybutyrate-minerale sale (bHB-S b.w./day 25 g/kg); KSMCT = SD + trigliceride bHB-S + media catena (MCT b.w./day 25 g/kg); SPD = ratto Sprague-Dawley; EPM = elevated plus maze (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Questa figura è stata modificata da Ari et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: le risposte del comportamento dei ratti SPD dopo 7 giorni di alimentazione mediante sonda gastrica orale del completamento esogeno chetone. Risultati rappresentativi sono stati raccolti attraverso l'EPM di prova, utilizzando un sistema software di rilevamento movimento delle18. (A) il gruppo KE trascorso una percentuale maggiore di tempo a braccia aperte, mentre il KE, KS, e gruppi KSMCT trascorso meno tempo nel centro (rispetto al gruppo di controllo [SD]), indicando così ridotto l'ansia. (B) rispetto al controllo gruppo (SD), meno le voci sono state rilevate tra le braccia chiuse dai ratti nei gruppi KE e KS. Abbreviazioni: SD = cibo roditore standard + acqua (5 g/kg di peso corporeo di acqua al giorno); KE = SD + chetone estere (1,3-butandiolo-acetoacetato diestere, b.w./day di 5 g/kg); KS = SD + beta-hydroxybutyrate-minerale sale (bHB-S b.w./day 5 g/kg); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5g/kg b.w./day); SPD = ratto Sprague-Dawley; EPM = elevated plus maze (* p < 0.05; * * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Questa figura è stata modificata da Ari et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In generale, molti comunemente utilizzati test, come il test di scelta di chiaro-scuro, il test di interazione sociale e la prova EPM, sono utilizzati per misurare il livello di ansia in diversi modelli animali. Tuttavia, il dosaggio EPM da solo è un metodo adatto per studiare, per esempio, l'effetto del chetone esogeno supplementi su ansia livelli18,20 roditori.

Il vantaggio principale del metodo EPM è che si basa sulla propensione istintiva dei roditori verso spazi scuri, recintati, oltre la paura incondizionata delle altezze e l'elusione degli spazi aperti. D'altra parte, altri metodi utilizzati per studiare il comportamento di ansia-come si basano sulle risposte comportamentali a determinati stimoli nocivi, come scosse elettriche, privazione di cibo/acqua, rumori molesti e l'esposizione a predator odore3. Questi test risultato solitamente una risposta condizionata, mentre l'EPM rappresenta anche un'alternativa più umana. Inoltre, l'EPM può essere uno strumento utile per studiare il coinvolgimento delle regioni differenti del cervello (ad esempio, regioni limbiche, ippocampo) e i meccanismi di fondo (ad es., GABA, glutammato, serotonina, adenosina) di ansia comportamento2.

Quando l'applicazione di trattamenti che sono abbastanza stressante per gli animali (ad esempio, l'alimentazione mediante sonda gastrica orale), è importante che tutti gli animali vengono gestiti allo stesso modo e dalla stessa persona, soprattutto quando valutano gli effetti dell'ansiolitico potenziali, sottile. Se possibile, l'introduzione del farmaco/composto in acqua potabile o tramite un appetitoso 'trattare' può essere un metodo preferito. Per garantire che la stessa quantità è somministrata a ciascun animale, una sonda gastrica orale può essere utilizzato. Basato sulle proprietà farmacocinetiche del composto, è solitamente consigliabile per testare gli animali su EPM entro 1 ora dopo gavaging. Quando si seleziona soggetti sperimentali, è importante considerare il loro sforzo, sesso, ciclo di estro ed età, nonché del peso corporeo, secondo gli obiettivi e testare sostanze2. A proposito di età, quando progettare studi EPM e interpretazione dei dati, è importante considerare che la percentuale di voci braccio aperto aumenta linearmente con l'età21 e il relazione con l'invecchiamento cambiamenti nel comportamento EPM sono ceppo-specifiche22.

Lo svolgimento di un test EPM, esistono potenziali problemi che devono essere affrontate. A volte gli animali devono essere esclusi dall'analisi a causa di tendenze outlier (ad es., l'animale non lascia mai l'area dove è stato collocato, quasi cade l'apparato, è distratto da un rumore o un evento di fuori dell'apparato). Ulteriori complicazioni con EPM test possono includere trattamenti che causano sedazione o iperattività, perché questi tipi di effetti devono essere valutati tramite parametri di EPM.

È importante per esporre gli animali alla prova EPM solo una volta perché attività sulle braccia aperte in diminuzione e un diminuzione tempo totale trascorso sulla piattaforma centrale sono stati dimostrati sulla seconda esposizione (ripetuta) di roditori rispetto alla prima esposizione su EPM 14,15. Pertanto, si consiglia vivamente una singola esposizione dei roditori alla prova di EPM. Tuttavia, se c'è un minimo di tre settimane tra la prima e la seconda esposizione di EPM e il set-up EPM viene spostato in un'altra camera (ambiente diverso), gli animali possano essere istruiti da EPM testare più di una volta2.

EPM è disponibile in diversi materiali, dimensioni (ad es., per mouse o ratto), e colori, che deve essere considerato nella scelta di oggetti di studio. È importante tenere a mente che gli odori lasciati dall'animale precedente sull'apparecchio possono modificare il comportamento dell'animale successiva. Si consiglia pertanto di utilizzare un EPM fatte di un materiale che è facile da pulire, come il vetro acrilico (non trasparente), che non trattiene odori dopo il lavaggio. Evitare di apparato EPM in legno. Preferibilmente, utilizzare un colore opaco che è diverso dal colore degli animali testati su EPM (ad es., nero se gli animali bianchi sono testati). Meglio il contrasto tra l'animale e il recinto, il migliore, il rilevamento dell'animale e maggiore sarà l'affidabilità e la precisione dei risultati ottenuti (distanza percorsa, velocità, inseguimento). Apparato EPM fatta da materiale grigio opaco è utili con gli animali bianchi, neri e bianchi e neri.

Un ulteriore vantaggio del sistema di puntamento a video è che oltre l'EPM, esso offre un modo semplice e flessibile per configurarlo con una vasta gamma di test comportamentali, come il labirinto dell'acqua, campo aperto, plus/radiale braccio/T-Y labirinti, preferenza di posto, costretta nuoto e test di sospensione di coda.

In sintesi, l'obiettivo di questo articolo è di descrivere il test EPM usato in combinazione con un video software di monitoraggio per raccogliere e analizzare le alterazioni comportamentali in risposta ai trattamenti romanzo ansiolitico. Le possibili applicazioni di EPM includono il prescreening di recente sviluppati agenti farmacologici per il trattamento dei disordini da ansia. Oltre agli agenti di ansiolitico e ansiogeni, possono essere studiate anche l'effetto del comportamento di diversi ormoni e droghe d'abuso. Può essere valutato anche l'influenza di invecchiamento e l'esposizione a vari fattori di stress. Questo studio ha concluso che, quando sono prese misure adeguate, l'uso di EPM ha dimostrato di essere un metodo sensibile per valutare i cambiamenti comportamentali associati con chetone completamento18,20.

Disclosures

D'Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, p. composizioni e metodi per la produzione di elevati e sostenuti di chetosi. N # di brevetto internazionale PCT/US2014/031237. Università di Florida del sud.

Ari, C., D'Agostino, D.P., esogeno chetoni integrano per ridurre il comportamento correlato all'ansia. Provvisorio brevetto #62289749. Università di Florida del sud.

Dominic P. D'Agostino e Csilla Ari sono co-proprietari dell'azienda chetone Technologies LLC.

Questi interessi sono stati recensione e gestiti dall'Università secondo le proprie politiche istituzionali e individuali conflitto di interessi. Tutti gli autori dichiarano che non esistono nessun ulteriori conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da un ONR Grant N000141310062 e un GLUT1D Foundation Grant n. 6143113500 (a Dominic P. D'Agostino), di agenzia di sviluppo nazionale dell'Ungheria (sotto Grant No. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; a Zsolt Kovács) e dall ' Department of Veterans Affairs (per contrassegnare Kindy). Gli autori desiderano ringraziare Quest nutrizione LLC per sostenere la ricerca in corso su questo argomento (per Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

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