Élevée Plus de Test combiné avec vidéo dépistant le logiciel pour étudier l’effet anxiolytique des suppléments cétogène exogènes de labyrinthe

Behavior
 

Summary

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier les variations du niveau d’anxiété des modèles animaux rongeurs. L’élevées plus labyrinthe test (EPM), utilisé en association avec une vidéo dépistant le logiciel, fournit une méthode fiable afin de documenter les effets de divers traitements anxiolytiques potentiels dans les scénarios de laboratoire préclinique.

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Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

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Abstract

L’objectif général de cette étude est de décrire la méthodologie de l’élévation et le test du labyrinthe (EPM) en combinaison avec une vidéo logiciel de suivi. La méthode vise à documenter les effets de divers traitements anxiolytiques potentiels sur les modèles de rongeurs de laboratoire. Le test de l’EPM est basé sur la propension des rongeurs vers des espaces protégés et clos de sombres et inconditionnée peur des espaces ouverts et hauteurs et leur motivation intense innée à explorer de nouveaux environnements. L’EMP est un test comportemental largement utilisé pour étudier les réponses anxiolytique ou anxiogène des rongeurs étant donnés les médicaments qui sont connus pour affecter le comportement. Observation, démontrant une proportion une diminution du temps consacré aux bras fermés, une proportion accrue de temps consacré à bras ouverts, un réduction du nombre d’entrées à bras fermés et un nombre élevé d’entrées à ouvrir les bras mesurées par le test de l’EPM peut refléter réduite niveaux d’anxiété. En utilisant cette méthode, l’effet des suppléments de cétone exogènes sur le comportement lié à l’anxiété a été testé chez des rats Sprague Dawley (SPD). Suppléments de cétone exogène chronique servent à nourrir les rats pendant 83 jours ou subchronique et gavés aiguë par voie orale, par jour pendant 7 jours, avant d’effectuer l’EPM tester. Collecte de données comportementales s’effectue à l’aide de la vidéo intelligente, système de suivi par un observateur aveugle à la fin des traitements. Les principales constatations indiquent que le test de l’EPM est une méthode efficace pour détecter l’effet anxiolytique induite par le supplément de cétone et peut être considéré comme une mesure sensible pour évaluer les changements dans le comportement de l’anxiété associée à médicament ou métabolique-thérapies basées sur.

Introduction

Cet article vise à décrire la méthodologie de l’essai d’EMP en combinaison avec une vidéo logiciel de suivi afin de surveiller les changements dans le comportement lié à l’anxiété et nouveaux traitements dans les modèles de rongeurs de laboratoire. Le test de l’EPM est une méthode relativement simple évaluation comportementale, qui a été élaborée pour l’enquête de quantifier les niveaux de comportement anxieux et réactions d’anxiété des rats après l’application de médicaments soins1. En effet, il a été démontré que l’EMP est un test comportemental largement utilisé et efficace pour l’étude des changements dans les niveaux d’anxiété de rongeurs1,2. L’applicabilité du critère EMP chez les rongeurs (rats et souris) est issue de leur inclination vers les espaces clos, sombres (approche), une peur inconditionnelle des espaces ouverts/hauteurs (évitement) et leur haut niveau de motivation innée pour explorer le roman environnements. En conséquence, le critère de l’EPM est une méthodologie bien établie basée sur une approche-éviter les conflits2,3.

L’EMP est un appareil en forme de plus consistant en quatre bras élevés, qui a été décrit par Handley et Mithani4 (Figure 1) et se compose de deux bras opposés qui sont ouverts dans le milieu extérieur (bras ouverts), alors que les deux fermé bras opposés (bras fermés) sont équipées de murs. Après le traitement, si l’augmentation du temps est consacré aux bras ouverts et/ou un nombre accru d’entrées de bras ouverts comparée pour contrôler les animaux (non traités) est détecté sur l’EPM, cela indique un anxiolytique effet2,3. La réaction d’évitement plus robuste a été démontrée dans les 5 premières minutes après le début (placement des rats à l’intersection des quatre bras de l’EPM) de l’EMP dosage5; par conséquent, tout comportement après qu’un traitement est généralement enregistré pendant 5 min sur l’EPM. Tant que des mesures supplémentaires d’un niveau d’anxiété, le nombre de tête trempettes, se cabre (position verticale du rongeur sur deux pattes), boli fécale, ainsi que marche totale entrées (activité motrice spontanée) et différentes postures (étirements ou gel), peuvent également être enregistrées sur l’EMP2. Ainsi, plusieurs paramètres comportements peuvent être compilées pour fournir une évaluation globale du comportement lié à l’anxiété.

Afin d’accroître la validité des résultats, deux ou trois tests comportements sont couramment utilisés ensemble, tels que le critère de choix de lumière-obscurité, le test d’interaction sociale, et le test de l’EMP, pour mesurer les niveaux d’anxiété de différent animaux modèles6. L’essai d’EMP effectué seul sur les rongeurs est également une méthode appropriée pour étudier l’effet anxiolytique ou anxiogène de différentes drogues7. Le test d’emp est sensible non seulement de type benzodiazépines anxiolytiques (p. ex., diazépam)8, mais aussi, entre autres, à des composés aminés acide, monoamine, peptidergiques et nucleosidergic (p. ex., antagoniste de la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) AP7, antagoniste de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) CNQX, morphine agoniste des récepteurs µ-opioïdes, NPY1 antagoniste BIBP3226, substance P, ghréline, ocytocine, agonistes des récepteurs de la sérotonine et les antagonistes comme 8-OH-DPAT et Way-100635 et antagoniste β1-adrénergique betaxolol)9,10,11,12. Par conséquent, l’essai EPM sur rongeurs est une méthode appropriée et sensible pour étudier l’influence de différents traitements qui influent sur les zones du cerveau impliquées dans l’effet anxiolytique (p. ex., l’amygdale, hippocampe et régions limbiques) et mécanismes d’action (par exemple, le système sérotoninergique, GABAergiques et adenosinergic) impliqués dans l’anxiété2. Les agents mis à l’essai dans ces études EMP comprennent des suppléments de cétone exogène altérant le cerveau de signalisation de manière subtile qui peut exiger une méthode sensible pour détecter les changements de comportement.

Dans cet article, nous décrivons l’EPM test utilisé en combinaison avec une vidéo dépistant le logiciel, qui permet d’éliminer les biais expérimentaux et facilite la collecte et l’analyse des altérations comportementales en réponse aux traitements anxiolytiques roman.

Protocol

Le traitement par les animaux et les procédures de mesure ont été effectuées conformément à l’Université de Floride du Sud animaux soins et utilisation Comité (IACUC) directives institutionnelles (protocole #0006R). Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

1. les préparatifs

Remarque : Le protocole nécessite généralement des rats de laboratoire de race ou de la souris pour tester les EMP. Toutefois, autres animaux, comme les cochons d’Inde, ont également été testés sur GPE13. Il est important de considérer le contraste de couleur entre les animaux dans le labyrinthe et la couleur du labyrinthe avec suivi vidéo. Le contraste est moins important pour les chercheurs, je regarde les animaux vivants ou par vidéo. Les paramètres de la vidéo logiciel besoin d’être configuré pour que le document de suivi des animaux sont noir ou blanc sur un labyrinthe soit noir ou blanc. Problèmes avec les paramètres de configuration peuvent se produire avec un labyrinthe acrylique transparent, mais un labyrinthe gris mat peut être optimal pour les deux couleurs de rongeurs.

  1. Choisir des animaux pour l’expérience, étant donné le potentiel d’influencer des facteurs tels que la souche, sexe, cycle oestrus et âge, ainsi que de poids de corps2.
  2. Basé sur l’expérience individuelle, déterminer le nombre d’animaux par groupe pour le test.
    Remarque : La taille du groupe sera tributaire de l’ampleur de l’effet qui est attendue avec le traitement de l’essai. Analyses de puissance s’effectuent généralement avant que l’expérience est menée afin de déterminer le nombre minimal de sujets à inclure compte tenu de la variabilité dans les réponses de l’animal dans une tâche donnée, ainsi que le nombre de groupes/conditions expérimentales.
  3. Conception de l’expérience (où une batterie de tests comportements différents, tels que le test de plein champ, EPM essais, test trou-board et forcé-natation serviront) avec soin.
    NOTE : Avant l’exposition à un environnement de test nouveaux (par exemple, un test de plein champ) immédiatement avant les épreuves de l’EMP des rongeurs peut-être modifier le comportement des animaux sur l’EMP1,2.
  4. Traiter tous les animaux de la même manière avant l’essai de l’EMP.
    NOTE : Il a été démontré que les facteurs de stress différentes, application de médicaments (p. ex., injections), le stress expédition et manutention peut changer le comportement et les réactions comportementales des rongeurs sur l' EPM16. Ainsi, l’accoutumance des animaux à une animalerie (par exemple, après l’expédition, pour 1-2 semaines avant l’épreuve de l’EPM), conditions expérimentales et les procédures de traitement (p. ex., gavage) sont nécessaires. Il est également important que le traitement des rongeurs ainsi que toute expérience avec expériences stressantes antérieures, en particulier immédiatement avant l’essai, est compatible sur les animaux et les groupes de traitement.
  5. Mener les études comportementales chez les animaux nocturnes, comme les rats et les souris, en utilisant un cycle de lumière inversé, de sorte que l’évaluation comportementale peut être effectuée lorsque les animaux sont dans leur phase sombre, active.
    Remarque : Les effets des conditions de logement différents et lumière des rythmes circadiens/cycle sur le comportement et leur influence sur les résultats de l’EMP ont été démontrées précédemment17, étant donné que les hormones de l’animal sont réglementés par le cycle de lumière.
  6. Utilisez les expérimentateurs mêmes pendant les procédures et leur demander d’éviter les savons avec une forte odeur ou parfum.
  7. Demandez les expérimentateurs pas de parler près de l’animal au cours de l’expérience ou déplacer des objets près de l’environnement de l’EMP.
    Remarque : Il est extrêmement important que l’observateur fait des mouvements minimes et aucun bruit lors de la collecte des données comportementales.
  8. Nettoyer l’EPM ensemble après chaque essai pour effacer les odeurs d’animaux précédents qui risquent d’interférer avec l’exploration par l’animal.
  9. (Recommandé) Manipuler les animaux pendant plusieurs jours avant l’épreuve de l’EPM (ramasser doucement le torse et en maintenant pendant une minute ou deux) à les acclimater à l’expérimentateur.
  10. Lorsque vous placez les animaux sur l’EPM, assurez-vous de traiter tous les animaux d’une manière cohérente et placer chaque rongeur dans le EPM dans la même position face à la même branche (par exemple, dans le centre vers le bras de l’expérimentateur).

2. les demandes de suppléments de cétone exogène

  1. Mesurer le poids corporel des animaux avant de commencer tout traitement pour déterminer le calcul de la posologie pour le traitement (p. ex., gavage gastrique).
  2. Familiariser les animaux à la méthode de gavage gastrique (stage) à l’aide de l’eau par gavage pour 5D avant la supplémentation cétone (chow rongeurs standard/régime [SD] + eau gavage ; par exemple, 2,5 g/kg de poids corporel de l’eau/jour). Exclure l’utilisation d’un animal qui ne s’adapte pas à la méthode de gavage gastrique.
  3. Après la période d’adaptation, nourrir les animaux chroniquement pour 83 d et subchronique 7D avec SD et gavage tous les jours avec l’eau (p. ex., 5 g/kg de poids corporel/jour ; groupe témoin : n = 8), cétone les suppléments tels que de l’ester de cétone (KE ; 1,3 - diester butanediol-acétoacétate d’éthyle ; par exemple, 5 g/kg de poids de corps/jour ; n = 8), sel de cétone (KS ; Sel de minéraux na+/k+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] ; par exemple, 5 g/kg de poids de corps/jour ; n = 8), ou KS + triglycérides à chaîne moyenne (rapport 1:1, KSMCT ; n = 8)18,19,20.
    NOTE : Les animaux ayant reçu de gavage gastrique ont été testées sur l’EMP 1 h après le traitement. Des rats nourris à la moulée des rongeur standard et gavés avec de l’eau (à l’exclusion de la supplémentation en cétone) servi de groupe témoin.

3. test d’anxiété

  1. Appareil d’EPM
    1. Utiliser le même appareil à travers une étude de standardiser les résultats. L’EMP est un appareil en forme de plus, qui se compose de quatre bras (par exemple, les bras peuvent être de 10 cm de large et 50 cm de long) : deux bras opposés sont ouverts, et les deux fermés en face de bras sont équipés de parois secondaires (p. ex., 30 cm). L’appareil est élevé au-dessus du sol (p. ex., par 55 cm)2.
      Remarque : Les paramètres plus couramment utilisés sont le temps cumulé passé dans les bras ouverts et le nombre d’entrées dans les bras ouverts ; Cependant, le temps passé dans le centre et le bras fermés, et le nombre d’entrées dans le centre et le bras fermés est mesuré, ainsi que de la distance parcourue dans chaque région.
    2. Lumière vers le haut de l’EPM en utilisant l’éclairage indirect (c.-à-d., direct la source lumineuse vers le plafond au lieu d’éclairer directement l’appareil EMP) et s’assurer que tous les quatre bras sont illuminés de la même façon (sans ombres, voir Figure 2).
      Remarque : Les changements dans le niveau de lumière modifient le comportement des rongeurs sur l’EPM. Par conséquent, éclairage similaire est nécessaire dans les animaux de laboratoire consécutives et jours (p. ex., 2 800 lumens dans la chambre),2.
  2. Système de suivi vidéo
    Remarque : Utilisez une vidéo système avec une interface d’ordinateur et une caméra vidéo pour la collecte de données, ce qui permettra de recueillir automatiquement des données comportementales chez des rats (de suiviFigure 3). Pour la vidéo tracking system, une grande variété de caméras analogiques standards ou sources d’image défini par l’utilisateur (caméras infrarouges, caméscope, caméra USB compatible WIA, webcams,etc.) peut être utilisé. Lors de l’analyse de la vidéo enregistrée, le logiciel de suivi du mouvement prend en charge tous les formats vidéo courants, tels que .avi, .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp et .mkv. Si la vidéo ne fait pas la lecture correctement, il pourrait avoir besoin d’un codec spécifique ; autres formats vidéo sont pris en charge si le codec correspondant est installé dans le système. Le logiciel de suivi du mouvement permet également d’analyser les vidéos acquises antérieurement et de traiter les images provenant de différentes sources, telles que des fichiers vidéo numériques (.avi, .divx, .mpeg, enregistreurs de DVD/HDetc.), webcams, caméras DV, et dispositifs d’imagerie compatible WIA.
    1. Configuration du système
      1. Branchez la clé d’installation du logiciel de suivi de mouvement sur un port USB 2.0 et lancer l’outil d’installation.
      2. Fixez la caméra au-dessus de la zone expérimentale et veiller à ce qu’il va rester immobile pendant la durée de l’expérience.
      3. Mettre en place une nouvelle expérience dans le système de logiciel de suivi du mouvement à l’aide de la notice. Sélectionnez la nouvelle expérience. Double-cliquez sur l’icône du protocole que la nouvelle expérience devrait suivre (Figure 3, supplémentaire 1 fichier).
      4. Entrez les détails d’étiquette/décrire l’expérience dans la boîte de dialogue Info expérimenter .
      5. Spécifier la source des séquences vidéo à traiter.
      6. Définir la règle de transformation pour une mesure de distances correctes. Le processus d’étalonnage permet le logiciel de suivi du mouvement à être informé de la dimension réelle de la zone expérimentale afin d’obtenir des valeurs fiables pour les distances et les vitesses.
      7. Déterminer les zones d’intérêt (zones) dans la zone de travail.
      8. Ajustez les paramètres du processus de détection.
        1. Afin que le logiciel de suivi du mouvement détecter avec précision la position de l’animal dans l’image, quelques ajustements de détection doivent être définies.
        2. Le processus de suivi nécessite une image claire et bien contrastée en utilisant un réglage fin des paramètres de contraste et luminosité générale dans la section de luminosité / contraste du panneau Paramètres de détection . Au besoin, ajuster ces paramètres pour l’ensemble de l’image ou pour les zones définies par l’utilisateur.
      9. Mettre un rat dans chaque arène pour tester le processus de détection.
      10. Appuyez sur le bouton Démarrer le Test pour vérifier si le processus de détection peut identifier l’objet correctement. Confirmer que la détection est activée par l’apparition d’un point sur l’écran. Le processus d’étalonnage doit être fait avant de commencer le test.
      11. Détection est considérée comme confirmée lorsque le point seulement noir montré le joueur est l’animal étant l’objet d’un suivi. Le rouge, suivi de ligne doit suivre de près les déplacements de l’animal. Suivi approprié est également confirmé avec une étiquette blanche répertoriant le nombre d’animaux et correspondant coordonnées calculées pour le déplacement. Si un tel dépistage n’est pas obtenue, ajustez les paramètres seuil et érosions pour optimiser la détection et le suivi des processus.
      12. Ajustez les paramètres seuil et l’érosion pour obtenir une image plus nette et sans bruit.
      13. Si le chemin suivi est correctement détecté, appuyez sur le bouton Arrêter le Test (Figure 4). Si ces ajustements vont être utilisées pour chaque nouveau fichier expérimentale, appuyez sur le bouton enregistrer comme valeur par défaut . Appuyez sur le bouton accepter pour enregistrer les nouveaux paramètres de détection.
      14. Définir les conditions de temps des essais.
      15. Si le protocole expérimental requiert le processus d’acquisition de piste pour commencer dans le même temps, que le sujet est placé dans la zone expérimentale, il est possible de mettre en place l’unité mobile qui accompagne le logiciel ou d’utiliser une souris sans fil.
        Remarque : Cette option offre la possibilité de contrôler à distance le démarrage et arrêt.
    2. Installation des sujets dans le système
      1. Gérer la base de données du sujet de l’expérimentation. Pour créer une base de données des sujets expérimentaux, entrer dans le gestionnaire de Base de données de sujets en pressant la touche de sujets dans la barre d’Expérimentation Assistant .
      2. Sur le bouton + pour ajouter de nouveaux sujets à la base de données.
      3. Avec l’option d’un sujet déjà sélectionnée, entrez code du sujet.
      4. Remplir le reste de l’information du sujet dans la section Propriétés de l’objet .
      5. Appuyez sur le bouton créer pour ajouter le nouveau sujet.
      6. Définir le plan de l’expérimentation. Le programmateur permet de définir les différentes phases, sessions, essais et sujets prévu pour être exécuté au sein du projet expérimental. Le procès est sélectionné automatiquement comme « le prochain procès » doit être exécutée. Cette propriété s’affiche comme une coche verte sur le côté gauche du nom du procès.
    3. Acquisition de données par l’enregistrement simultané et de suivi
      Remarque : Lorsqu’une source de l’image en direct est sélectionnée, le panneau du lecteur offre un module d’enregistrement intégré pour facilement capturer la vidéo provenant de la caméra sélectionnée.
      1. Préparer le logiciel de suivi du mouvement pour l’acquisition de données (étalonnage, définition de fuseau horaire, paramètres de détection, les paramètres de temps, planificateur).
      2. Ouvrez le panneau de l’acquisition de données .
      3. Démarrer l’enregistrement de la vidéo de l’expérience sans l’animal en appuyant sur le bouton Démarrer l’enregistrement disponible dans le logiciel.
      4. Placer l’animal dans la zone expérimentale.
      5. Démarrez le processus d’acquisition de données en appuyant sur le bouton Start sur le panneau de contrôle horaire . Le processus de suivi s’effectuera simultanément avec le processus d’enregistrement. Au besoin, demander l’expérimentateur de noter les variables comportementales manuellement, comme se cabre, tête trempettes et chutes (Figure 5).
      6. Collecter les données EMP manuellement ainsi que par un observateur aveugle (séparer l’observateur de l’EPM par un rideau) dans la salle d’examen.
      7. Attendre la fin de l’enregistrement de suivi-process ou appuyez sur le bouton Stop sur le panneau de contrôle horaire .
      8. Retirer l’animal de la zone expérimentale. Arrêter le processus d’enregistrement vidéo en appuyant sur le bouton stop disponible sur le lecteur de logiciel de suivi du mouvement.
      9. Préparez la zone expérimentale pour le prochain animal par lavage et séchage. Répétez le cycle recommence.
    4. Analyse des données
      1. Pour accéder à l’outil d’analyse , appuyez sur le bouton analyse dans la barre d’Expérimentation Assistant .
      2. Pour générer des rapports d’analyse des procès terminés, sélectionnez les essais à analyser. Configurer et de sélectionner le rapport d’analyse. Définir les intervalles de temps à analyser. Produire et examiner les rapports. Exporter les résultats vers un tableur ou une image formats (Figure 6).
  3. EPM pour la mesure des niveaux d’anxiété
    1. Réaliser les expériences EMP dans des conditions également (dans une pièce faiblement éclairée et calme) après gavage oral.
      Remarque : Assurez-vous que les expériences sont exécutés dans un intervalle de temps proche (p. ex., entre 1200 et 1400) parce que le rythme circadien peut influencer le comportement les rongeurs sur l’EPM15,17. Éviter les mouvements inutiles et bruit pendant l’expérience.
    2. Avant le début du test, assurez-vous que l’EPM est nettoyé et séché et la vidéo, système de suivi est prête à l’emploi.
    3. Transférer les rats dans leur cage maison à la salle d’expérience 30 min avant le début de l’expérience.
    4. Place un rat à l’intersection des quatre bras de l’EPM, face à bras ouvert en face de l’expérimentateur.
    5. Lancer la vidéo logiciel de suivi, ainsi qu’enregistrer manuellement le comportement de l’animal, pendant 5 min.
    6. Si l’animal tombe l’EPM, ramasser et remettez-la sur le même point de l’EMP, où il est tombé. Exclure les données comportementales de cet animal de l’analyse.
      Remarque : Un mouvement ou un bruit fort peut immobiliser/gel animaux à bras ouverts. Si un bruit se fait entendre pendant l’expérience, exclure les données comportementales des animaux en cours de l’expérience à ce moment de l’analyse.
    7. À la fin de l’essai de 5 min, arrêter la vidéo logiciel de suivi et de retirer l’animal de l’EPM. Placez-le dans sa cage maison.
    8. Avant la prochaine expérience/animal, nettoyez l’EMP avec un détergent désinfectant (par exemple, Quatricide), suivie de l’eau du robinet. Sécher l’appareil avec du papier absorbant.

4. les analyses des données recueillies par la vidéo Tracking System

  1. En s’appuyant sur les données enregistrées, analyser la quantité de temps passé dans les bras ouverts et dans les bras fermés ; le nombre d’entrées prises pour les bras ouverts, fermés d’armes et pour la zone centre ; la latence à l’entrée dans les bras fermés ; la distance parcourue dans les bras ouverts, fermés d’armes et dans la zone centre.
    Remarque : L’animal est considéré comme dans une région lorsque le centre du corps, la masse est dans ce domaine.
  2. Déterminer les effets des traitements sur le comportement en utilisant une analyse de variance (ANOVA) avec écart significatif de Fisher (LSD) test de comparaisons multiples de test/Tukey.

Representative Results

L’expérience en cours étudie l’hypothèse que la supplémentation en cétone exogène soit administré à long terme (nourris pendant 83 jours) ou subchronique (gavés par voie orale pendant 7 jours) a un effet anxiolytique sur deux mois (mâles) rats Sprague-Dawley (SPD) 250-350 g). Administration chronique se composait de cétone suppléments suivants : ester de bas-dose cétone (LKE ; 1, 3-butanediol-acétoacétate diester, environ 10 g/kg/jour, LKE), ester de haut-dose cétone (HKE ; ~ 25 g/kg/jour, HKE), bêta-hydroxybutyrate-minéraux sel (bHB-S ; ~ 25 g / kg/jour, KS) et de triglycéride à chaîne bHB-S + moyennes (MCT ; ~ 25 g/kg/jour, KSMCT). Pour les expériences subchroniques, les groupes de traitement suivants ont été utilisés : KE, KS et KSMCT (5 g/kg/jour). Les groupes de contrôle incluse SD ou SD avec gavage d’eau (contrôle). Toutes les données étaient représentées sous forme de moyenne ± l’écart-type de la moyenne (SEM). Les résultats ont été considérés comme significatifs lorsque p < 0,05. La signification a été établie par ANOVA à test LSD de Fisher.

Après s’être nourries chronique, rats du groupe KSMCT a passé beaucoup plus de temps dans les bras ouverts (p = 0,0094) comparativement au groupe témoin. Le temps passé dans les bras fermés était significativement plus faible dans les groupes LKE, KS et KSMCT (p = 0.0389 0.0077 et 0,0019, respectivement), tandis que le groupe KS passé beaucoup plus de temps dans le centre (p = 0.0239) par rapport à la (groupe de contrôle (SD) Figure 7 a) 18.

Des rats dans les groupes KS et KSMCT parcouru des distances beaucoup plus longues dans les bras ouverts (p = 0,036 et 0,0165), tandis que les rats dans les groupes LKE, KS et KSMCT a montré nettement moins de distance parcourue dans les bras fermés (p = 0.0252, 0,00041, et 0,0032, respectivement), comparativement au groupe témoin (SD) (Figure 7 b). Comparativement au groupe témoin, les groupes de KS et KSMCT avaient une plus grande distance parcourue dans la zone centrale (p = 0.0206 et 0.0482, respectivement), tandis que dans le groupe KSMCT, la latence à la première entrée dans les bras fermés était significativement plus élevée après chronique alimentation (p = 0,0038)18 (Figure 7).

Le temps passé dans les bras ouverts était plus élevé dans le groupe KE (p = 0,0281) après 7 jours de gavage oral, tandis que dans les groupes KE, KS et KSMCT, le temps passé dans le centre ont diminué (p = 0,0005, < 0,0001 et = 0,023, respectivement), comparativement à la contro l groupe (Figure 8 a)18. Dans les groupes KE et KS, le nombre d’entrées dans les bras fermés était significativement plus faible (p = 0.0436 et 0,0234, respectivement) après 7 jours d’administration (Figure 8 b), alors que les rats dans le KS groupe également entré dans le centre moins fréquemment (p) = 0.0193), comparativement au groupe témoin (SD).

Figure 1
Figure 1 : élevé plus le labyrinthe (EPM) utilisé pour le test des rats. Chaque bras est de 10 cm de large et 50 cm de long, muni de deux bras opposés ouvert avec un bord relevé. Les deux fermés en face de bras sont équipés de 30 cm de haut murs. La hauteur de la piste du sol est de 55 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : exemples de direct et éclairage indirect. S’assurer que la source lumineuse est pointée vers le plafond, tandis que la lumière directe au-dessus de la zone expérimentale est bloquée. Il est important d’utiliser une lumière indirecte au cours d’expériences d’EMP afin d’éclairer de la même façon tous les quatre bras sans ombres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : la barre d’assistant expérimentation du mouvement suivi logiciel. Il est conçu pour fournir un accès aux principales opérations. Les boutons correspondent à la tâche au sein du processus d’expérimentation typique, alors que seules les tâches actuellement autorisés sont actifs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : la piste de l’objet est marquée avec une ligne rouge en suivant le mouvement de l’animal. En ajustant le seuil, le fond peut être diminué jusqu'à ce seulement l’animal est détecté et suivi par la ligne rouge. La piste suit le centre de la masse de l’objet et les coordonnées de position actuelles sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : élevé plus labyrinthe (EPM) avec un rat Sprague Dawley (SPD) dans les ARM. ouvert Un exemple de la mise en place expérimentale est démontré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : piste de mouvement accumulé de l’animal au cours d’un procès. Dans le cadre de l’analyse des données, la trace de la trajectoire recueillies du sujet en matière de suivi peut être affichée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : réponses comportementales des rats SPD dans l’EMP après 83 jours d’alimentation chronique de la supplémentation en cétone exogènes. Ces panneaux montrent des résultats représentatifs prélevés par l’EPM et le système de suivi de mouvement18. (A), le groupe KSMCT ont dépensé un plus grand pourcentage de temps dans les bras ouverts, tandis que le LKE, KS, et les groupes KSMCT moins de temps dans les bras fermés, comparée au groupe témoin (SD). (B) The KS et KSMCT groupes ont voyagé plus de distance dans les bras ouverts, tandis que le LKE, KS, et groupes KSMCT parcouru moins de distance dans les bras fermés, montrant la diminution de l’anxiété par rapport au contrôle groupe (SD). (C), le KSMCT groupe entré les bras fermés plus tard, indiquant l’anxiété réduite par rapport au contrôle groupe (SD). Abréviations : SD = chow rongeur standard + eau (25 g/kg de poids corporel (m.c.) d’eau par jour) ; LKE = SD + LKE (1, 3-butanediol-acétoacétate diester, 10 g/kg p.c./jour) ; HKE = SD + HKE (25 g/kg p.c./jour) ; KS = SD + sel de bêta-hydroxybutyrate-minéral (bHB-S 25 g/kg p.c./jour) ; KSMCT = SD + triglycéride à chaîne bHB-S + moyennes (MCT, 25 g/kg p.c./jour) ; SPD = rat Sprague-Dawley ; EPM = élevé plus de labyrinthe (* p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 ; *** p < 0,0001). Ce chiffre a été modifié par Ari et al. 18. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : les réponses comportementales des rats SPD après 7 jours de gavage oral de la supplémentation en cétone exogènes. Résultats représentatifs ont été recueillies par le biais de l’EPM tester, à l’aide d’un logiciel de suivi du mouvement système18. (A), le groupe KE passé un plus grand pourcentage de temps dans les bras ouverts, tandis que le KE, KS, et groupes KSMCT passaient moins de temps dans le centre (comparé au groupe témoin [SD]), indiquant ainsi la diminution de l’anxiété. (B) par rapport au contrôle de groupe (SD), moins les entrées ont été détectées dans les bras fermés de rats dans les groupes KE et KS. Abréviations : SD = chow rongeur standard + eau (5 g/kg de poids corporel de l’eau/jour) ; KE = SD + cétone ester (1, 3-butanediol-acétoacétate diester, 5 g/kg p.c./jour) ; KS = SD + sel de bêta-hydroxybutyrate-minéral (bHB-S, 5 g/kg p.c./jour) ; KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg p.c./jour) ; SPD = rat Sprague-Dawley ; EPM = élevé plus de labyrinthe (* p < 0,05 ; *** p < 0,001 ; *** p < 0,0001). Ce chiffre a été modifié par Ari et al. 18. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

En général, plusieurs couramment utilisé des tests, tels que le critère de choix de lumière-obscurité, le test d’interaction sociale et l’essai de l’EMP, servent à mesurer le niveau d’anxiété dans différents modèles animaux. Cependant, le dosage de l’EMP seul est une méthode appropriée pour étudier, par exemple, l’effet de la cétone exogène complète sur anxiété niveaux18,20 des rongeurs.

Le principal avantage de la méthode EPM, c’est qu’il repose sur l’inclination instinctive des rongeurs vers des espaces sombres et clos, en plus de l’inconditionné peur des hauteurs et éviter les espaces ouverts. En revanche, autres méthodes utilisées pour étudier le comportement de type anxiété reposent sur les réponses comportementales à certains stimuli nocifs, tels que l’électrocution, privation de nourriture et d’eau, des bruits forts et l’exposition aux prédateurs odeur3. Ces tests résultent habituellement en une réponse conditionnée, tandis que l’EPM représente également une alternative plus humaine. En outre, l’EPM peut être un outil utile pour étudier la participation des différentes régions du cerveau (par exemple, les régions limbiques, hippocampe) et les mécanismes sous-jacents (p. ex., GABA, glutamate, la sérotonine, l’adénosine) d’anxiété comportement2.

Lors de l’application de traitements qui sont très stressants pour les animaux (p. ex., le gavage oral), il est important que tous les animaux sont traités de la même manière et par la même personne, en particulier lors de l’évaluation des effets anxiolytique potentiel, les subtiles. Si possible, l’introduction du médicament/composé dans l’eau potable ou par un savoureux « traite » peut être une méthode préférée. Pour vous assurer que le même montant est administré à chaque animal, un gavage oral peut être utilisé. Basé sur les propriétés pharmacocinétiques du composé, il est généralement conseillé de tester les animaux sur l’EPM dans 1 heure après gavage. Lors de la sélection des sujets expérimentaux, il est important de considérer leur souche, sexe, cycle oestrus et âge, ainsi que du poids corporel, selon les objectifs et2des substances d’essai. En ce qui concerne l’âge, lorsque la conception d’études de l’EPM et interpréter les données, il est important de considérer que le pourcentage des entrées de bras augmente linéairement avec l’âge de21 et les changements liés au vieillissement dans le comportement de l’EPM sont spécifiques à la souche22.

Lorsqu’il procède à un test de l’EMP, il y a des problèmes potentiels qui doivent être abordées. Animaux ont parfois besoin d’être exclues de l’analyse en raison des tendances aberrantes (p. ex., l’animal ne quitte jamais la zone où il était placé, près des chutes hors tension de l’appareil, est distrait par un bruit ou un événement à l’extérieur de l’appareil). Autres complications avec EPM essais peuvent inclure des traitements entraînant sédation ou hyperactivité car ces types d’effets doivent être évalués via les paramètres de l’emp.

Il est important d’exposer les animaux à l’épreuve de l’EPM qu’une seule fois car la diminution de l’activité sur les bras ouverts et un diminution temps total passé sur la plateforme centrale ont été démontrés sur la deuxième exposition (répétée) des rongeurs par rapport à la première exposition sur l’EMP 14,,15. Par conséquent, une seule exposition de rongeurs à l’épreuve de l’EPM est fortement recommandée. Cependant, si il y a un minimum de trois semaines entre la première et la deuxième exposition à l’EPM et la mise en place EPM est déplacé dans une autre pièce (environnement différent), les animaux peuvent être étudiés par l’EPM tester plus d’une fois2.

L’EMP est disponible en différents matériaux, tailles (par exemple, pour la souris ou le rat), et des couleurs, qui doit être examinée lors du choix d’étudient des sujets. Il est important de garder à l’esprit que les odeurs laissées par l’animal précédent sur l’appareil peuvent changer le comportement de l’animal ultérieur. Par conséquent, nous recommandons à l’aide d’un emp faite d’un matériau facile à nettoyer, comme le verre acrylique (pas transparent), qui ne retient pas les odeurs après le lavage. Évitez les appareils EPM en bois. Utilisez de préférence, une couleur Mate qui est différente de la couleur des animaux testés sur l’EPM (p. ex., noir si blanc animaux est mis à l’essai). Le mieux, le contraste entre l’animal et l’enceinte, le mieux la détection de l’animal et de plus la fiabilité et la précision des résultats obtient (distance parcourue, vitesse, suivi). Appareil d’EMP en matériau gris mat est utiles avec animaux blancs, noirs et blancs et noirs.

Un autre avantage du système de poursuite vidéo est qu’en plus de l’EPM, il offre un moyen flexible et facile à mettre en place avec une grande variété de tests comportementaux, comme le labyrinthe aquatique, plein champ, labyrinthes de plus/radial de bras/T-Y, lieu de préférence, forcée de natation et des essais de suspension de la queue.

En résumé, l’objectif de cet article est de décrire le test d’EMP utilisé en combinaison avec une vidéo logiciel de suivi pour recueillir et analyser des altérations comportementales en réponse aux traitements anxiolytiques roman. Les applications possibles de l’EPM comprennent la présélection d’agents pharmacologiques nouvellement mis au point pour le traitement des troubles liés à l’anxiété. Outre les agents anxiolytiques et anxiogène, l’effet comportemental de différentes hormones et drogues d’abus peuvent également être étudiées. L’influence du vieillissement et l’exposition à différents facteurs de stress peut aussi être évalué. Cette étude a conclu que lorsque des mesures appropriées sont prises, l’utilisation de l’EMP s’est avéré pour être une méthode sensible pour évaluer des changements comportementaux associés à la cétone supplémentation18,20.

Disclosures

Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, P. Compositions et méthodes de production élevée et soutenue de la cétose. # Brevet international PCT/US2014/031237. Université de Floride du Sud.

Ari, C., D'Agostino, D.P., cétone exogène suppléments pour réduire le comportement lié à l’anxiété. Provisoire brevet #62289749. Université de Floride du Sud.

Dominic P. D'Agostino et Csilla Ari sont co-propriétaires de la compagnie cétone Technologies LLC.

Ces intérêts sont examinées et gérés par l’Université conformément à ses politiques institutionnelles et individuelles de conflit d’intérêts. Tous les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts supplémentaires.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l’ONR Grant N000141310062 et un GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (pour Dominic P. D'Agostino), par l’agence de développement nationale de Hongrie (sous le Grant no. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008 ; à Zsolt Kovács) et par les ministère des anciens combattants (de la marque Kindy). Les auteurs tiennent à remercier Quest Nutrition LLC pour soutenir la recherche en cours sur ce sujet (pour Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

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References

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