عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

ERRATUM NOTICE

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لسرعة عزل نواة عالية الجودة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. نحن تشمل الأنسجة الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر تعطل وخلية تحلل الخيارات، التي يمكن أن تستخدم لعزل نواة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

سبر التعبير الجيني خلية واحدة يمكن التعرف على نوع الخلية والخلية الدولة. وقد ظهرت تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كأداة قوية لدراسة الملامح النسخي للخلايا، ولا سيما في الأنسجة غير المتجانسة مثل الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، تفكك الأساليب المطلوبة لتسلسل وحيد الخلية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات تجريبية في وفاة خلية والتعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب تقتصر عموما على أنسجة جديدة، مما يحد من دراسات بشأن المحفوظات والمواد البيولوجية-البنك. تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) هو بديل جذاب للدراسات النسخي، نظراً لأنه يحدد أنواع الخلايا بدقة، ويسمح بدراسة الأنسجة المجمدة أو يصعب فصل، ويقلل من فعل الانفصال النسخ. نقدم هنا، بروتوكول الفائق لعزل السريع من الأنوية للمتلقين للمعلومات سنرنا--ما يليها هذا الأسلوب يتيح عزل نواة من عينات النخاع الشوكي الطازجة أو المجمدة، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع اثنين من منصات تغليف الحبرية موازية على نطاق واسع.

Introduction

الجهاز العصبي يتكون من مجموعات مستمدة من الخلايا التي تعرض مجموعة متنوعة من الخصائص المورفولوجية والبيوكيميائية والكهربية. أثناء تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة كانت مفيدة لتحديد التغيرات على صعيد الأنسجة في التعبير الجيني في ظروف مختلفة، فإنه يحول دون الكشف عن التغييرات النسخي على مستوى خلية واحدة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في تحليل النسخي خلية واحدة قد مكنت تصنيف الخلايا ايربان إلى المجموعات الوظيفية استناداً إلى ذخيرتهم الجزيئية ويمكن حتى أن تكون الاستدانة للكشف عن مجموعات من الخلايا العصبية التي نشطت مؤخرا. 1 , 2 , 3 , 4 على مدى السنوات العشر الماضية، قد مكن تطوير الجيش الملكي النيبالي خلية مفردة التسلسل (سكرنا-Seq) دراسة التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وتقديم وجهة نظر إلى تنوع من نوع الخلية. 5

وقدمت ظهور نهج قابلة للتطوير مثل سرنا موازية على نطاق واسع-Seq، منصات لتسلسل أنسجة غير متجانسة، بما في ذلك مناطق عديدة في الجهاز العصبي المركزي. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ومع ذلك، أساليب تفكك خلية مفردة يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، فضلا عن التغييرات التجريبية في التعبير الجيني. 16 العمل مؤخرا بتكييف أساليب تسلسل خلية واحدة لتمكين المحافظة على الملامح النسخي الذاتية. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 وكانت هذه الاستراتيجيات ملائمة بصفة خاصة للكشف عن التعبير الجيني (IEG) المبكر الفوري عقب التحفيز الحسي أو السلوك. 3 , 4 في المستقبل، هذه الاستراتيجية أيضا يمكن لدراسة التغيرات الدينامية في الأنسجة في الحالات المرضية أو استجابة للتأكيد. من هذه الأساليب، هو تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) نهج واعدة التي لا تنطوي على الإجهاد يحفز تفكك الخلية ويمكن استخدامها على صعوبة أن تنأى بالانسجة (مثل الحبل الشوكي)، فضلا عن تجميد الأنسجة. 4 , 17 , 18 , 19 مواءمة من أساليب العزلة نويات السابقة،20،،من2122،،من2325 سنرنا Seq عادة يستخدم التقويض السريع الأنسجة والخلية تحلل تحت الظروف الباردة والطرد المركزي، وفصل النوى عن الحطام الخلوية. 4 نواة يمكن أن تكون معزولة لتسلسل الجيل المتلقين للمعلومات على منصات متعددة في تغليف الحبرية موائع جزيئية. 4 , 7 , 24 , 25 يسمح هذا الأسلوب للقطة من النشاط الترانسكربتي الآلاف من الخلايا في لحظة من الزمن.

وهناك استراتيجيات متعددة للإفراج عن نواة من الخلايا قبل عزلة والتسلسل، كل منها بمزاياها وعيوبها. هنا، يمكننا وصف ومقارنة البروتوكولين الملحقين بتمكين عزل نواة من الحبل الشوكي الكبار لكثافة موازية المتلقين للمعلومات سنرنا-Seq: تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية وتحلل ناقص التوتر والميكانيكية. ويوفر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية اختلال الأنسجة كاملة وارتفاع عائد نهائي من الأنوية. ناقص التوتر الميكانيكية-تحلل يتضمن درجة السيطرة عليها من اختلال الأنسجة، مما أتاح فرصة لتحديد توازن بين الكمية ونقاء الغلة النووي نهائياً. وتوفر هذه النهج مقارنة الحمض النووي الريبي الغلة، أرقام تم اكتشاف الجينات كل نواة، والتنميط نوع الخلية وأيضا على حد سواء استخدامها بنجاح لما يليها سنرنا

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الحيوانات الأعمال قد أنجزت وفقا لبروتوكول أقرها المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. متوازنة في عينات من ذكور وإناث الفئران الممثل المدني الدولي/مؤتمر نزع السلاح-1 البرية من نوع، بين 8 وأسابيع 12 القديمة، كانت تستخدم لجميع التجارب. وينبغي التعامل مع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية المحلية.

1-إعداد المواد والمخازن المؤقتة

  1. تجهيز المخازن المؤقتة لكل يوم الاستخدام والبرد مسبقاً على الجليد (انظر الجدول 1).
    1. إذا كان استخدام تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية، إعداد المخزن المؤقت تحلل المنظفات (> 500 ميكروليتر كل عينة) والمخزن المؤقت السكروز منخفضة (> 6 مل كل عينة)، السكروز كثافة المخزن المؤقت (> 12.5 مل كل عينة) والحل استثارة (> 1 مل).
    2. في حالة استخدام تحلل ناقص التوتر والميكانيكية، إعداد تحلل ناقص التوتر المخزن المؤقت (> 5 مل كل عينة)، عب المتوسطة (> 5 مل كل عينة)، المخزن المؤقت السكروز منخفضة (> 3 مل كل عينة)، السكروز كثافة المخزن المؤقت (> 12.5 مل كل عينة)، واستثارة الحل (> 1 مل).
    3. إضافة 25 ميكروليتر من ديثيوثريتول (DTT) إلى 25 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة وآخر ميكروليتر 25 من DTT إلى 25 مل من السكروز الكثافة المتدرجة المخزن المؤقت فقط قبل بدء تشغيل البروتوكول.
  2. وتغطي سطح تشريح مع رقائق الألومنيوم للتقليل من تلوث العينة بألياف من المناشف الورقية أو مقاعد البدلاء حماة، التي يمكن أن تسد موائع جزيئية القنوات المستخدمة لالتقاط نواة واحدة.
  3. رذاذ أدوات تشريح والفضاء مقاعد البدلاء مع حلاً تطهير رناسي. بالإضافة إلى ذلك، رش داخل أنبوب الخالطون دونس (في حالة استخدام تحلل الخلية المنظفات الصناعية والميكانيكية) وأنبوب أوك ريدج مع حلاً تطهير رناسي. شطف من أنبوب دونس واوك ريدج بالماء عالي النقاوة وخالية من رناسي.
  4. قبل chill جميع أنابيب جمع (50 مل المخروطية، والبلوط ريدج) وأنابيب الخالطون دونس على الجليد.
  5. البولندية النار سلسلة من الماصات باستور (في حالة استخدام تحلل الخلية الميكانيكية وناقص التوتر).

2-إعداد الحبل الشوكي

  1. في حالة استخدام أنسجة جديدة، euthanize الماوس باستنشاق أول أكسيد الكربون2 . في أعقاب القتل الرحيم، رش معطف الماوس مع الإيثانول 70% لتقليل التلوث الشعر في العينة.
  2. قطع رأس الماوس مع المقص جراحية حادة وخالية من رناسي. بعد ذلك، رفع بلطف البطن الجلد بالملقط وجعل شق بطول الجسم للكشف عن أجهزة الداخلية.
  3. افيسسيراتي الماوس عن طريق سحب الأجهزة الداخلية من تجويف الجسم باستخدام الملقط. عدم استخدام المناشف الورقية لتنظيف المنطقة أو إزالة الأجهزة، وهذا قد يعرض الملوثات. باستخدام مقص، قص العمود الفقري بين فقرات العمود الفقري L2 و L3.
    ملاحظة: للممارسة، ويمكن تحقيق هذه الخطوة في أقل من 30 ثانية.
    1. لإخراج الحبل الشوكي، تناسب 3 مل حقنه تحتوي على برنامج تلفزيوني المثلج بإبرة ¼ بوصة 25 جرام. ضع طرف الإبرة في نهاية العمود الفقري المقدسة. استخدام اصبعين لقرصة فقرات لإنشاء ختم ضيق حول غيض الإبرة واضغط على المكبس لإخراج الحبل الشوكي روسترالي. ضع الحبل الشوكي في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني المثلج.
    2. عند هذه النقطة، تجميد الأنسجة وتخزينها في-80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور للمنظفات الصناعية والميكانيكية (الخطوة 3) أو ناقص التوتر والميكانيكية (الخطوة 4) تحلل.
  4. في حالة استخدام الأنسجة المجمدة، والحفاظ على الأنسجة في الثلج الجاف، تشرع في المنظفات الصناعية والميكانيكية (الخطوة 3) أو ناقص التوتر والميكانيكية (الخطوة 4) تحلل.

3-تحلل الخلية المنظفات الصناعية والميكانيكية

  1. وضع الحبل الشوكي القطني في الخالطون دونسي مبردة مسبقاً وإضافة 500 مل يبرد قبل تحلل المنظفات المخزن المؤقت.
    ملاحظة: حبل الشوكي قطني ماوس هو مغ 325.5 ± مغ 63.9 الخطأ المعياري للوسط (وزارة شؤون المرأة، N = 4). 50 ملغ – 1.5 غرام أنسجة يمكن أن تستخدم بنجاح.
  2. دونس مع 5 ضربات المدقة (مدقة 'فضفاض')، ثم 5-10 ضربات المدقة ب (المدقة 'مشددة'). تجنب رفع الخالطون خارج الحل تحلل ما بين السكتات الدماغية، وتجنب إدخال الفقاعات.
  3. ضع مصفاة 40 مم أكثر من أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 50 مل وبرويت مع 1 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة.
  4. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة إلى الخالطون دونس التي تحتوي على نواة النفط الخام في المخزن المؤقت لتحلل وتخلط بلطف قبل بيبيتينج 2 – 3 مرات.
  5. تمرير الإعدادية نوى الخام عبر مصفاة 40 مم في أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 50 مل.
  6. تمرير مؤقت سكروز منخفضة 1 مل إضافية عبر مصفاة 40 مم، يصل الحجم النهائي إلى 3 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة و 500 مل من المخزن المؤقت تحلل.
  7. كرر الخطوات من 3.1 – 3.6 إذا كان الجمع بين الحبال متعددة، تجمع في أنبوب مخروطي الشكل نفسه.
  8. الطرد المركزي العينة في 3,200 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، صب المادة طافية. انتقل إلى الخطوة 5.

4-تحلل الخلية ناقص التوتر الميكانيكية

  1. مكان الحبل الشوكي القطني في 5 مل من المخزن المؤقت تحلل ناقص التوتر في طبق استنبات الأنسجة. استخدام نهاية حادة مقص الربيع لتقسم الحبل الشوكي، ثم استخدام مقص الربيع لقطع الحبل السري إلى قطع 3 – 4 مم، ولكن لم تخطر.
    ملاحظة: 50 ملغ – 1.5 غرام أنسجة يمكن أن تستخدم بنجاح.
  2. تبني على الجليد لمدة 15 دقيقة، يحوم 2 – 3 مرات.
  3. إضافة 5 مل عب المتوسطة إلى تمييع المخزن المؤقت تحلل ناقص التوتر.
  4. تريتوراتي الأنسجة 10 مرات مع 5 مل ماصة مصلية، أو حتى جميع قطع الأنسجة الانتقال بسلاسة من خلال فتح الماصة.
  5. تريتوراتي مع سلسلة من ثلاث ماصات باستور مصقول النار مع أقطار أضيق تدريجيا (~ 900-600 مم).
    1. لكل ماصة، تريتوراتي 5-15 مرة، تسمح الأنسجة تسوية وإزالة مل 1 – 2 من المادة طافية المحتوية على نواة معزولة ويمر عبر مصفاة 40 مم في أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 50 مل.
    2. بعد تريتوريشن مع ماصة باستور أصغر الحجم، ضمان تدفق هوموجيناتي سلاسة من خلال تلميح ماصة. تمرير حل المتبقية عبر مصفاة 40 مم في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
      ملاحظة: يمكن ضبط إجمالي عدد تريتوريشنز النحو المرغوب فيه. سوف تظل السحايا الحبل الشوكي الماوس، ولكن من المهم أن تريتوراتي أي قطع مرئية من الحبل الشوكي. تمرير هوموجيناتي المتبقية عبر مصفاة 40 مترا. تجنب إدخال فقاعات أثناء تريتوريشن.
  6. الطرد المركزي العينة التي تمت تصفيتها في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، صب وتجاهل المادة طافية. انتقل إلى الخطوة 5.

5. التجانس والتدرج كثافة السكروز

  1. بعد الخطوة 3 أو 4، ريسوسبيند بيليه استخدام 3 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة. دوامة برفق لإزالة بيليه من الجدار لتسهيل استثارة. واسمحوا العينة الجلوس على الجليد لمدة 2 دقيقة ونقل التعليق إلى أنبوب أوك ريدج.
  2. استخدام الخالطون في الإعداد 1، مجانسة الأنوية في المخزن المؤقت السكروز منخفضة ل 15 – 30 ثانية، حفظ العينة على الجليد.
    ملاحظة: s استخدام 15 إذا كان استخدام الحبل الشوكي القطني واحد أو 30 ثانية في حالة استخدام تجميع عينات أو حبل الشوكي كله.
  3. استخدام ماصة مصلية، طبقة 12.5 مل من كثافة السكروز العازلة تحت هوموجيناتي المخزن المؤقت السكروز منخفضة، مع الحرص على عدم خلق فقاعة أن يعطل الطبقات الكثافة.
  4. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,200 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، فورا صب المادة طافية في حركة عبها.
    ملاحظة: وحدة تخزين متبقية (أقل من 400 مل) السكروز المخزن المؤقت يمكن التخلص إذا كان المطلوب لإنتاج حجم أقل ونظافة العينة النهائية، ولكن هذا الحجم المتبقي تحتوي على نواة ويمكن الحفاظ على تعظيم العائد الأنوية.
  6. استخدام 100 مل-1 مل من محلول استثارة، ريسوسبيند الأنوية المتبقية على الجدار. تجنب المايلين 'التجهم' أن يبقى مع إعداد المستندة إلى المنظفات.
  7. تصفية الأنوية من خلال مصفاة حجم مسام 30 – 35 ملم، وجمع في أنبوب مبردة مسبقاً.
  8. تحديد العائد الأنوية باستخدام هيموسيتوميتير لعد الأنوية تحت هدف X 10.
    ملاحظة: يمكن إضافة تريبان الأزرق لتصور النوى، التي يجب أن تظهر زرقاء. ملاحظة كمية الحطام الخلوية.
  9. تابع إلى الخطوة 6 أو 7.

6-كثافة موازية سنرنا-التسلسل: "منهاج الأكاديمية"7

  1. إجراء تسلسل سنرنا موازية على نطاق واسع (مثل، قطره Seq) الأسلوب كما تم وصفه سابقا7 مع إدخال التعديلات التالية:4
    1. ضبط الأنوية لتركيز نويات 225 كل مل نهائي.
    2. إعداد حبات المراقب بتركيز 250 الخرز كل مل.
    3. إعداد المخزن المؤقت تحلل مع ساركوسيل 0.7%.
    4. ضبط معدلات تدفق إلى 35 مل في الدقيقة الخرز و 35 مل في الدقيقة لانويه 200 مل في الدقيقة للنفط.

7-كثافة موازية سنرنا-التسلسل: "منصة تجارية"26

  1. أداء سنرنا-تسلسل موازية على نطاق واسع استخدام منصة تجارية (مثلاً، التعبير الجيني حل الكروم وحيد الخلية) المنتجات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة26 مع إجراء التعديل التالي:
    1. أثر عكسي-النسخ، إضافة دورة إضافية لبكر أن يحسب عدد دورات للتضخيم كدنا استناداً إلى استرداد الخلية المستهدفة للتعويض عن انخفاض كدنا من نويات الخلايا بالمقارنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، نحن تنفيذ عزل نواة من الحبل الشوكي القطني الماوس الكبار المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. البروتوكول شملت ثلاثة عناصر رئيسية: الأنسجة التعطيل والخلوية تحلل السكروز وتجانس الكثافة الطرد المركزي (الشكل 1). في غضون ثوان، أثمر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية إعداد نواة النفط خام مع عدد كبير من الأنوية فضلا عن الحطام الخلوية والأنسجة (الشكل 2A، الجدول 2). بعد خمس عشرة دقيقة، أثمر تحلل ناقص التوتر والميكانيكية إعداد نواة النفط خام كان الحطام أقل، ولكن أيضا أقل نوى (الشكل 2B، الجدول 2). خضع كل الاستعدادات للتجانس (الشكل 2 ود) وكثافة السكروز التدرج الطرد المركزي قبل استثارة في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 0.04% (الشكل 2E وو). في متوسط، حبل الشوكي قطني ماوس (مغ 325.5 ± مغ 63.9 الخطأ المعياري للوسط، ووزارة شؤون المرأة، ن = 4) أسفرت عن 5، 1 × 105 نوى (± 6.3 × 104 SEM، N = 3) عقب تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية و 2.0 × 105 نوى (± 5.9 × 104 ووزارة شؤون المرأة، N = 3) عقب تحلل ناقص التوتر والميكانيكية. وقدرت عدد الأنوية في الحبل الشوكي القطني من إعداد الخام الأولية بعد تجانس دونس في البروتوكول تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية (2.6 × 106 أنوية ± 4.0 × 105 SEM، N = 3، الجدول 2). العينة النهائية من البروتوكول تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية ويتكون من 20% الأنوية الأولية (± 2% ووزارة شؤون المرأة، N = 3، الجدول 2). إعداد نواة النفط الخام من تحلل الميكانيكية وناقص التوتر عقب تريتوريشن يحتوي على 62 في المائة الأنوية الأولية (± 2% ووزارة شؤون المرأة، N = 3، الجدول 2). العينة النهائية ناقص التوتر الميكانيكية وتحلل تحتوي على 8 في المائة فقط من الأنوية الأولية (1% ± ووزارة شؤون المرأة، N = 3، الجدول 2). ونحن لم يكشف عن أي فرق في مجموع العائد الحمض النووي الريبي أو العائد كدنا لجين التدبير المنزلي (جابده) بين أساليب إعداد اثنين. استخدام قبكر، أسفرت عن الأسلوب المنظفات 463.7 نغ (± 98.9 SEM، N = 6) من مجموع الحمض النووي الريبي والكشف عن متوسط عتبة دورة من 25.2 (± 1.3 SEM) لكدنا جابده qPCR والأسلوب ناقص التوتر أثمر 419.2 نغ (± 85.3 SEM، N = 6) مجموع الجيش الملكي النيبالي وعتبة الكشف عن متوسط دورة 26.1 كدنا جابده (± 0.8 SEM). الخيارين تحلل كل من عزل نواة من صعوبة فصل الأنسجة وتقدم المواد عالية الجودة لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة المتلقين للمعلومات.

نظراً لحجم قنوات موائع جزيئية المصب منصات تسلسل نواة واحدة موازية على نطاق واسع، من الضروري إدخال تعليق أنوية خالية من جزيئات كبيرة أو الحطام الخلوية للحيلولة دون انسداد. بعد البروتوكول المعروضة هنا، كانت هناك أية حالات من انسداد على منصة مقتبس من ماكوسكو et al. 2015 (N = 17) وتسد جزئية واحدة على منصة تجارية (N = 16).

واستخدمت الإجراءات الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر لعزل الأنوية بنجاح لاثنين من منصات تغليف الحبرية موازية على نطاق واسع ويتم إظهار النتائج الممثلة في الشكل 3. تم تمكين كل من هذين النهجين التنميط النسخي آلاف نوى، وتصنيف أنواع الخلايا في الحبل الشوكي القطني الماوس الكبار (الشكل 3). 4 هذه النهج أدى إلى جينات مماثلة كل نواة لكل نوع من الخلايا (الشكل 3 و دال). وتختلف معدلات الاسترداد نويات الإدخال بين الأنظمة الأساسية اثنين. منهاج مقتبس من ماكوسكو et al. عام 2015 مع تعديلات من ساثيامورثي et al. 2018 استرداد ما يقدر 0.59 ٪ من نوى (0.05% ± ووزارة شؤون المرأة، N = 17)، في حين أن منصة تجارية المستردة نوى 53.7 في المائة المقدرة (N = 2).

هذا البروتوكول يثري قليلاً لنوى الخلايا العصبية في الإعداد النهائي. في المقاطع أنسجة النخاع الشوكي القطني، وجدنا أن 27 في المائة نوى كانت إيجابية بالنسبة لعلامة العصبية NeuN (N = نوى 7,368 من الحيوانات 2)، في حين أن إعداد الأنوية المنظفات الصناعية والميكانيكية للحبل الشوكي القطني أدى إلى 31.9 في المائة من مجموع أنوية معربا عن NeuN، كما يحددها fluorescence تنشيط الخلية الفرز (N نظام مراقبة الأصول الميدانية، 2.0 ٪ ± ووزارة شؤون المرأة، = 13 الاستعدادات نواة مستقلة باستخدام العينات المجمعة من الحيوانات متعددة في كل إعداد، الرقم 4). هذا مماثل لما قد لوحظ سابقا لنسبة نويات NeuN المصابات في الحبل الشوكي كامل (20% إلى 24% تبعاً للعمر)،27 بما في ذلك مناطق عنق الرحم والصدر التي لها أكثر من المسألة الأبيض و oligodendrocytes. من المذكرة، لم يتم التعبير عن NeuN/Rbfox3 في جميع الخلايا العصبية، وتبعاً لذلك، أن هذه الأرقام لا يقلل احتمال متواضعة. فمن الممكن أن الخلايا غير العصبية أصغر تنضب قليلاً أثناء تنقية السكروز التدرج. وبالإضافة إلى ذلك، قد يغير المصب معلمات التصفية وتحليل أثر تسلسل التوزيع النهائي من نوع الخلية لأن الخلايا العصبية أكثر الجينات في نواة (الشكل 3 ود) ومن ثم، هي أقل احتمالاً لإزالتها أثناء عملية التصفية.

وهناك العديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول التي تتطلب العناية. دونسينج الأولى من الإفراط أو تريتوريشن (في الخطوتين 3 و 4، على التوالي) يمكن أن يؤدي إلى زيادة في تكوين الحطام والجسيمات الخلوية. على الرغم من أن الترشيح والطرد المركزي كثافة السكروز يمكن فصل الجزيئات الكبيرة، مجرد جزيئات صغيرة يتم إنشاؤها أثناء تحلل الخلوية، وهم من الصعب إزالته. ثانيا، خلال تحقيق التجانس، لا تضع الخالطون مباشرة على الجزء السفلي من الأنبوب أوك ريدج. بدلاً من ذلك، غمر نهاية الخالطون في حل السكروز منخفضة تحتوي على نويات حراكه، دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب. تجانس يحسن العزلة النووية بإزالة الحطام الخلوية والحد من كتل ومولتيبليتس (الشكل 5). عقب السكروز كثافة استخدام الطرد المركزي، من الضروري فورا إزالة أنبوب أوك ريدج من أجهزة الطرد المركزي، وصب المادة طافية في حركة 'عبها' سريع بسرعة. عندما ريسوسبيندينج نوى من جدار الأنبوبة أوك ريدج، ريسوسبيند بيليه 'المالح' من منتصف الطريق بين الفرقة المايلين والجزء السفلي من الأنبوب. علما بأن بيليه قد لا تكون مرئية. ريسوسبيندينج نوى أعلى على طول الأنبوب قد يؤدي إلى تلوث المايلين في إعداد الأنوية. تحلل الخلوية وكثافة السكروز الطرد المركزي الخطوات هي الأكثر أهمية للحد من الجسيمات التي قد تسد قنوات موائع جزيئية للتطبيق المتلقين للمعلومات.

اسم المواد/المعدات تركز الأسهم التركيز النهائي الحجم/المبلغ
المخزن المؤقت لتحلل المنظفات
المخزن المؤقت السكروز منخفضة - - ميكروليتر 600
تريتون-X 20% 0.10 في المائة 3 ميكروليتر
ناقص التوتر تحلل العازلة
تريس-HCl (pH = 7.4) م 1 10 ملم 100 ميكروليتر
كلوريد الصوديوم 5 M 10 ملم 20 ميكروليتر
مجكل2 م 1 3 مم ميكروليتر 30
P40 نونيديت - 0.01 ٪ 1 ميكروليتر
المياه خالية من نوكلاس يصل إلى 10 مل
عب المتوسطة
السبات-أ - - 10 مل
جلوتاماكس - - 100 ميكروليتر
B27 - - 200 ميكروليتر
المخزن المؤقت السكروز منخفضة
السكروز - 0.32 M ز 2.75
حبيس (الرقم الهيدروجيني = 8.0) م 1 10 ملم 250 ميكروليتر
كاكل2 م 1 5 مم ميكروليتر 125
مجاك م 1 3 مم ميكروليتر 75
يدتا 0.5 M 0.1 مم 5 ميكروليتر
DTT م 1 1 مم 25 ميكروليتر
المياه خالية من نوكلاس يصل إلى 25 مل
المخزن المؤقت لكثافة السكروز
السكروز - م 1 ز 8.6
حبيس (الرقم الهيدروجيني = 8.0) م 1 10 ملم 250 ميكروليتر
مجاك م 1 3 مم ميكروليتر 75
DTT م 1 1 مم 25 ميكروليتر
المياه خالية من نوكلاس يصل إلى 25 مل
الحل استثارة
1 X برنامج تلفزيوني - - 1 مل
جيش صرب البوسنة 20 ملغ/مل 0.4 ملغ/مل 20 ميكروليتر
مثبط رناسي 40 ش/ميكروليتر 0.2 يو/ميكروليتر 5 ميكروليتر

الجدول 1: جدول للحلول.

النفط الخام تجانس النهائي
المنظفات الصناعية والميكانيكية 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
ناقص التوتر والميكانيكية 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

الجدول 2: عائد أنوية في كل خطوة في البروتوكول. عدد الأنوية في إعداد الخام الأولية بعد أن تم استخدام تجانس دونس في البروتوكول تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية لتقدير عدد الأنوية في الحبل الشوكي القطني. العائد الأنوية الأولية (2.6 × 106 أنوية ± 4.0 × 105 SEM، N = 3) تم استخدامه لحساب العائد الأنوية في كل خطوة المتلقين للمعلومات بالنسبة لكلا البروتوكولين تحلل المنظفات وناقص التوتر الميكانيكية. تمت تسوية عدد الأنوية معزول بواسطة إعداد ناقص التوتر والميكانيكية إلى الأنوية الأولية المقدرة. تكون القيم في الجدول يعني ± ووزارة شؤون المرأة، N = 3.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي للعزلة النووية. يمكن أن تكون نواة من الحبل الشوكي الكبار معزولة تحلل الخلية المنظفات الصناعية والميكانيكية أو ناقص التوتر والميكانيكية، متبوعاً بالتجانس، والسكروز الكثافة المتدرجة الطرد المركزي باستخدام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: برايتفيلد الممثل ونوى DAPI الملون في مفتاح خطوات في البروتوكول.  نوى الخام (أ وب) عقب تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية أو ناقص التوتر والميكانيكية. (ج، د) نوى بعد التجانس. (ه، و) أنوية حراكه في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 0.04 في المائة عقب السكروز كثافة استخدام الطرد المركزي. كانت ثابتة بنسبة 2% بارافورمالدهيد نوى والملون في وقت لاحق باستخدام تريبان الأزرق أو DAPI. أخذت الصور في 10 X (شريط المقياس = 100 ميكرومتر) باستخدام برايتفيلد وبرنامج التحصين الموسع-الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مؤامرة تسن ممثل نويات التسلسل: استخدام تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية والميكانيكية وناقص التوتر. (أ) النتائج المستخلصة من التسلسل نوى 17,000 أكثر من الماوس الكبار تشريح النخاع الشوكي القطني عقب تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية ووفقا ماكوسكو et al. عام 2015 مع تعديلات من ساثيامورثي et al. 2018. تم تعديل هذا الرقم مع إذن من ساثيامورثي et al. 2018-4 (ب) النتائج التي تم الحصول عليها من نوى 5,000 تسلسل من الحبل الشوكي القطني الكبار طرد عقب تحلل ناقص التوتر والميكانيكية ومنصة تغليف خلية مفردة موائع جزيئية تجارية. 26  (ج، د) الجينات متوسط كل النتائج نواة بعد تجميع أنواع الخلايا الرئيسية في ± الحبل الشوكي الماوس الكبار sem. من المذكرة، تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية الإجراء متبوعاً ماكوسكو وآخرون. أجرى عام 2015 منصة استخدام تشريح النخاع الشوكي القطني، بينما أنجز تحلل ناقص التوتر والميكانيكية تليها منصة تجارية باستخدام إخراج الحبل الشوكي القطني (كما هو موضح في هذا البروتوكول). نظراً لأن إخراج الحبل يزيل دوراً والعقد الجذرية الظهرية، الكتلة خلية شوان/سحائي غائب من الشكل 3B ود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: نظام مراقبة الأصول الميدانية مؤامرة نويات NeuN+ عقب تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية- مؤامرة نظام مراقبة الأصول الميدانية تظهر الأنوية الثابتة الملون ل NeuN (متوسط 31.9 في المائة من مجموع أنوية ± 2.0% SEM، ن = 13)، ومعزولة باستخدام البروتوكول تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية. للتثبيت الفوري، نواة للتحقق من صحة نظام مراقبة الأصول الميدانية، تم الحصول على إعداد نواة النفط خام بتجانس دونس الحبال الشوكي إعداد المنظفات الصناعية والميكانيكية، متبوعاً بالتثبيت الفوري مع 1% باستخدام منهاج عمل بيجين مع فترة حضانة المرض 5 دقيقة. كان مروي التثبيت مع 250 مم جليكاين، وجمعت الأنوية. تلطيخ مع الأجسام المضادة-NeuN أجرى في الحل. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية على ثابتة، NeuN الملون الأنوية استخدام أرز خلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: إعداد الأنوية دون تجانس. كانت حراكه نوى قبل السكروز كثافة استخدام الطرد المركزي بعد المنظفات الصناعية والميكانيكية أو تحلل ب ناقص التوتر والميكانيكية، دون تحقيق التجانس. * تشير إلى الحطام الخلوية التي تعلق على نويات (A) ومولتيبليت نويات تعلق بالحطام الخلوية (ب). أنوية حراكه في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 0.04 في المائة عقب السكروز كثافة استخدام الطرد المركزي. كانت ثابتة بنسبة 2% بارافورمالدهيد نوى والملون في وقت لاحق باستخدام تريبان الأزرق أو DAPI. صور أخذت في 10 × (مقياس بار 100 ميكرومتر) باستخدام برايتفيلد وبرنامج التحصين الموسع-الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

والهدف النهائي لهذا البروتوكول عزل الأنوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل النسخي المتلقين للمعلومات. علينا تكييف أساليب Seq سنرنا أجل الشخصية كافة أنواع الخلايا في الحبل الشوكي. وفي البداية، وجدنا أن الخلية النموذجية الانفصال من أساليب غير فعالة لتسلسل وحيد الخلية الجيش الملكي النيبالي، كما تعرضا لموت الخلايا العصبية الحبل الشوكي. وعلاوة على ذلك، حمل الخلية الانفصال من أساليب التعبير من مختلف النشاط والإجهاد استجابة الجينات التي تصل إلى عدة هوندريدفولد. 3 , 4 , 16 نظراً للعيوب المرتبطة بالأعمال التحضيرية خلية مفردة، نحن وآخرون قد استخدمت نوى كبديل. 16 , 17 , 18 , 24 هذا الأسلوب يمكن أيضا استخدامها في الأنسجة البشرية، بما في ذلك أنسجة النخاع الشوكي المجمدة. 4 , 19 , 24 هنا، ونحن سوف تصف القوة والضعف في هذا النهج.

وتشمل مواطن القوة في هذه الطريقة تجنب إييجس المستحثة تجريبيا وكذلك القدرة على استخدام الأنسجة على حد سواء الطازجة والمجمدة. 4 هكذا، هذا النهج يمكن أن يكون مفيداً لسبر إييجس الذاتية اتباع سلوك أو التحفيز. 1 , 3 , 4 ومن فوائد هذا الأسلوب هو أنه لا يتطلب أجهزة متخصصة للاستفادة نوى لتسلسل نواة واحدة موازية على نطاق واسع، ولكن يمكن استخدام منصة وضعتها ماكوسكو et al. عام 2015، مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة من معدل تحلل المخزن المؤقت والتدفق، أو استخدام النظم المتاحة تجارياً. وعلاوة على ذلك، تتابع نواة واحدة ثبت أن أسلوب مقارنة بتسلسل خلية واحدة للتعرف على أنواع الخلايا، والإقراض بقوة هذا النهج. 28 , 29 ومع ذلك، هناك العديد من القيود الهامة لهذا النهج. نواة تحتوي على 20-50% تقريبا من مرناً الخلوية،29 وهذا ينعكس في عدد أقل من النصوص كل نواة مقارنة بتسلسل وحيد الخلية. 18 , بما في ذلك ما يلي: إينترونيك من سنرنا-Seq 29 نهج واحد لزيادة عدد الجينات المكتشفة.

وهناك العديد من البروتوكولات المتوفرة التي تمكن من عزل نواة من الأنسجة. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 بالمقارنة مع معظم الأساليب الأخرى، البروتوكولات المقدمة هنا لا تتطلب إزالة المايلين، تنبيذ فائق، أو العديد من الخطوات الطرد المركزي أو يغسل يمكن أن تؤدي إلى انخفاض الأرقام النهائية من النوى. وعلاوة على ذلك، يأخذ هذا البروتوكول 1 ساعة أو 45 دقيقة (المنظفات الصناعية والميكانيكية) (ناقص التوتر الميكانيكية) لإكمال. البروتوكولات التجارية معتمدة على منصات موائع جزيئية هي أكثر من ضعف الوقت، وتتطلب العديد من الخطوات الطرد المركزي أكثر، مما زاد من خطر فقدان الأنوية. على النقيض من نواة بروتوكولات العزلة التي تنطوي فقط تحلل وتصفية، تشمل أساليب المقدمة هنا تدرج سكروز زيادة نقاء الأنوية النهائي. هذه الخطوة غير مطلوبة لانسجة النخاع الشوكي الكبار نظراً لنسبة كبيرة من المسألة الأبيض والحطام المايلين الناتجة.

يمكن استخدام البروتوكول تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية لتفكك النسيج الكامل وتحلل، ويمكن استخدام البروتوكول تحلل ناقص التوتر والميكانيكية للتحكم في مقدار الحطام الانفصال والخلوية الأنسجة المسموح بها في تطبيق المتلقين للمعلومات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لمواد البنك الحيوي، يصعب فصل الأنسجة والتحري عن التغييرات النسخي تعتمد على النشاط من خلال عزل نواة للمتلقين للمعلومات سنرنا-يليها موازية على نطاق واسع بالإضافة إلى تسلسل موازية على نطاق واسع واحد نواة الجيش الملكي النيبالي، ويمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل نواة للتطبيقات البديلة، بما في ذلك الفلورة ونظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليل جينية مثل الدراسات مثلايشن الحمض النووي والرقائق-Seq (الرقم 4 ). 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لدينا لا تضارب في الكشف.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها برنامج NINDS داخلية (1 ضياء NS003153 02) و NIDCD (1 ضياء DC000059 18). ونحن نشكر لي ل. و C.I. دوبروت للدعم الفني ومناقشات مفيدة، وكاثي جيم لاستعراض المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21, (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68, (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96, (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22, (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20, (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18, (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26, (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17, (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18, (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356, (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352, (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11, (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19, (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14, (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218, (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics