Author Produced

تنقية مثقبيات خارج الخلية، بما في ذلك البلدان الأفريقية، من الدم بشاردة-مبادلات (ديثيلامينوثيل-السليلوز أعمدة)

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا الأسلوب من المثقبيات انفصال الدم يعتمد على تهمة السطحية يجري أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم. وضع الدم الملوث ويعامل على عمود مبادل شاردة. يوفر هذا الأسلوب، الأكثر ملائمة في التشخيص لداء المثقبيات الأفريقي، الطفيليات المنقي للتحقيقات المناعية، والبيولوجية، والكيميائية الحيوية، الصيدلة والبيولوجيا الجزيئية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Courtois, P., Nabos, P., Nzoumbou-Boko, R., Reix, C. E., Dauchy, F. A., Daulouede, S., Bringaud, F., Robinson, D. R., Vincendeau, P. Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns). J. Vis. Exp. (146), e58415, doi:10.3791/58415 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هذا الأسلوب يتيح فصل مثقبيات، الطفيليات المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (قبعة)، من الدم الملوث. وهذا هو أفضل طريقة لتشخيص المرحلة الأولى قبعة وعلاوة على ذلك هذا الأسلوب تنقية الطفيلي تصاريح المصلية والبحوث التحقيقات.

قبعة بسبب ذبابة التسي تسي أحال المثقبيات البروسية الغامبية و رهوديسينسي ت.. مثقبيات ذات الصلة هي العوامل المسببة لداء المثقبيات الحيواني. الكشف عن المثقبيات ضروري للقبعة التشخيص والعلاج والمتابعة. الأسلوب الموصوفة هنا هو أسلوب الكشف عن الطفيليات الأكثر حساسية، تتكيف مع الظروف الميدانية لتشخيص الغامبية ت. قبعة ويمكن أن تنجز في غضون ساعة واحدة. الطبقات الدم على عمود مبادل شاردة (دي السليلوز) سبق تعديلها لدرجة الحموضة 8، وتتم إضافة شطف المخزن المؤقت. مشحونة سلبا على درجة عالية من خلايا الدم هي تمتز فوق العمود بينما يمر مثقبيات مشحونة بأقل تأثيراً سلبيا. مثقبيات جمعها القريبون من الطرد المركزي والتقيد بالفحص المجهري. وعلاوة على ذلك، تعد الطفيليات دون الأضرار الخلوية مع الحفاظ على هذه العدوى.

مثقبيات المنقي مطلوبة لاختبار المناعية؛ وتستخدم في الفحص تريبانوليسيس، معيار الذهب في الأمصال قبعة. الطفيليات الملون تستخدم في اختبار تراص بطاقة (كات) لحقل علم الأمصال. مولدات المضادات من مثقبيات المنقي، مثل بروتين سكري السطحي البديل، اكسوانتيجينس، تستخدم أيضا في تحديدكم المختلفة. ويهدف الإجراء الموضح هنا المثقبيات الأفريقي؛ ونتيجة لذلك، يضطر شروط الفصل اللوني لتكييفها لكل سلالة المثقبيات، وبشكل أعم، للدم من كل الأنواع من الثدييات المضيفة.

هذه رائعة مسببات الأمراض سهولة المنقي ومتاحة للاستخدام في الجزيئي، والكيمياء الحيوية وخلية دراسات علم الأحياء بما في ذلك ثقافة المشارك مع الخلايا المضيفة للتحقيق في علاقات الطفيلي المضيف على مستوى مستقبلات الغشاء، والإشارات، والجينات التعبير؛ المخدرات في المختبرمن الاختبار؛ التحقيق حذف الجينات أو طفرة أو overexpression على العمليات الأيضية ونشوء حيوي سيتوسكيليتال وبقاء الطفيلي.

Introduction

طريقة عرض وصف هنا يسمح فصل مثقبيات، الطفيليات المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (قبعة) من الدم. وهذا هو أفضل طريقة لتشخيص المرحلة الأولى قبعة وعلاوة على ذلك يسمح هذا الأسلوب تنقية الطفيلي التحقيق المصلية وبحوث قوية.

قبعة بسبب ذبابة التسي تسي أحال المثقبيات البروسية الغامبية و rhodesiense ت1. تتكاثر هذه الطفيليات الأوالي اكستراسيلولارلي في مجرى الدم والليمفاوية، وسوائل الخلالي خلال المرحلة الأولى من المرض (المرحلة هيموليمفاتيك). تبدأ المرحلة الثانية (مرحلة مينينجونسيفاليتيك) عند الطفيليات عبور حاجز الدم في الدماغ؛ علامات عصبية، بما في ذلك اضطراب نوم، التي أعطت لهذا المرض باسم "مرض النوم"، نموذجية لهذه المرحلة الثانية2. مثقبيات ذات الصلة (افانسي ت.، النشيطة ت. ت. ب-البروسية، كونجولينسي ت.) هي العوامل المسببة للحيوان المثقبيات الأفريقي (محكمة الاستئناف الإدارية)3.

وتهدف منظمة الصحة العالمية (WHO) للقضاء على قبعة كمشكلة من مشاكل صحة العامة بحلول عام 2020، والتوقف عن الإرسال بحلول عام 20304. وقد الأخذ في الآونة الأخيرة من اختبارات التشخيص السريع تحسين التشخيص المصلية1،،من45. وضعت العديد من الاختبارات التشخيصية الجزيئية ولكن دورها في مجال التشخيص لم المنشأة5. يتم استخدامها لتحديد الأنواع الفرعية للمجموعة البروسية وداء المثقبيات شاذة الناجمة عن الطفيليات المسؤولة عن المثقبيات الحيواني6.

الكشف عن الطفيليات ضروري للتشخيص والعلاج والمتابعة، كما علم الأمصال يمكن أن تعطي نتائج سلبية كاذبة إيجابية وكاذبة للأسف1. الملاحظة المباشرة تقنيين من الاولانيات هيموفلاجيلاتي هذه يصعب في حالات القبعة التي تسببها الغامبية. ت.، (أكثر من 95% حالات) كما باراسيتيمياس المنخفضة هي القاعدة، بينما للقبعة الناجمة عن ت. رهوديسينسي، كبير عدد الطفيليات موجودة غالباً في الدم. وقد استخدمت تقنيات تركيز مختلفة، مثل إسقاط سميكة والأنبوبة الشعرية الطرد المركزي (مكافحة الإرهاب)، ولكن فصل الطفيليات من الدم بعمود شاردة-مبادل (دي السليلوز) متبوعاً بالطرد المركزي والمراقبة المجهرية بيليه، وهو الأسلوب الأكثر حساسية (ويمكن الكشف عن الطفيليات حوالي 50 مليلتر من الدم)1،7. ونتيجة لذلك، هو تنقية مثقبيات بهذا الأسلوب شاردة-مبادلات (السليلوز دي) الأفضل، وحتى هذا التاريخ، أسلوب المرجع لتصور وعزل الطفيليات من الدم لتشخيص القبعة. في الظروف الميدانية، عمود صغير من السليولوز دي قد استخدمت بنجاح وسهلت العديد من التحسينات الملاحظة تقنيين7،8.

يعتمد الأسلوب الفصل المثقبيات من الدم، المبينة أدناه، في مقابل سطح الطفيلي، الذي أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم9. من المثير للاهتمام، هذا الأسلوب قد وضعت قبل 50 عاماً، في عام 1968 بالدكتورة شيلا لنهام، ويظل معيار الذهب للكشف وإعداد مثقبيات مجرى الدم. فسريع واستنساخه مثقبيات ساليفاريان من مجموعة واسعة من الثدييات، وتسمح بتشخيص داء المثقبيات الحيوانية والبشرية على حد سواء10.

للحصول على الطفيليات الحية، وتنقية، تتم إضافة الدم المصاب على عمود مبادل شاردة. الظروف اللوني (أساسا درجة الحموضة، القوة الأيونية للمخازن المؤقتة/وسائل الإعلام) لها لكي تلائم كل الأنواع المثقبيات، وبصورة أعم، كل مزيج من الثدييات خلايا الدم ومثقبيات10. يتم ضبط العازلة شطف تحديداً على درجة الحموضة 8 لمعظم الأفارقة مثقبيات10. هذا الأسلوب يفضل تركيز الطفيليات في الدم للمرضى، ونظرا لأن باراسيتيمياس يمكن أن تكون منخفضة للغاية للكشف عنها بواسطة المراقبة المجهرية وحدها، وكما أنها تمكن الفحوص المختبرية. العمل مع مثقبيات طازجة المعزولة وفي الدم من الحيوانات المصابة باستخدام هذا الأسلوب، أكثر صلة بالموضوع للتحقيقات المختلفة من الدراسات مع الطفيليات التي قد تم مثقف في ظروف أكسينيك في المختبر لأجل غير مسمى.

علاقات الطفيلي المضيف يتم دراسة أفضل مع طفيلي إصابة المضيف الطبيعي، ولذلك، ت. موسكولي، طفيلي مورين طبيعية، وهو ممثل مثقبيات خارج الخلية، مزايا عديدة تنطوي الإصابة مورين في الحيوانات المختبرية الصغيرة ولا تتطلب واقية شروط السلامة المستوى (BSL). موسكولي ت. لا تقتل الفئران الأشخاص، خلافا لكثير من الأنواع مثقبيه الأخرى، بما فيها مسببات الأمراض البشرية. لا يتم القضاء موسكولي ت. في الفئران المحرومين من خلية تي ويمكن زيادة باراسيتيمياس في الفئران المصابة بتعديل كمية الغذاء والمغذيات11. ينظم هذا الطفيلي الاستجابة المناعية في التهابات المشارك مع مسببات الأمراض الأخرى12. هو التعبير عن مستقبلات Fc غشاء موسكولي ت من الفئران المصابة معرض الاختلافات من مثقف ت. موسكولي، على سبيل المثال، فقدت في الثقافات موسكولي ت. أكسينيك، مقارنة بالطفيليات تنقيته من الفئران المصابة13 , 14-العوامل التي تفرز اكسكريتيد (كلية العلوم التربوية) هي أيضا نوعيا وكمياً أقل المعرب عنه في الثقافات المثقبيات أكسينيك وتختلف بين السلالات المعزولة في15من المناطق الموبوءة. كلية العلوم التربوية هي المستضدات الأولى عرض لاستضافة الجهاز المناعي وذلك تلعب دوراً هاما في المضيف الأولى الاستجابة المناعية16.

ويسهل هذا البروتوكول في الحيوانات المصابة تجريبيا للفحوص المختبرية، التجريب على عدد أكبر من الطفيليات، والتقليل من عدد الفئران المطلوبة لا سيما عند استخدام الحيوانات إيمونوسوبريسيد. لا يزال يتم تنقيته glycoproteins السطحي البديل (فسجس) التي يتم استخدامها في "اختبار تراص بطاقة" "داء المثقبيات" (كات) في الفحص الشامل من المثقبيات التي تم نشرها في الفئران. هما الاختبارات التشخيصية السريعة (شرائط ملفوفة على حدة) التي أصبحت الآن متاحة للاستخدام في الميدان، تزال تستخدم مصدر معدية نموذج أصلي فسجس ولا في المختبر مثقف مثقبيات1،4، 5. وقد تيسر النهوض بالدراسة من المثقبيات علم المناعة وعلم الأحياء منذ هذه الطفيليات السليلوز تنقية دي يمكن بسهولة الحصول على كميات كبيرة من المضيفين المصابة طبيعيا أو تجريبيا، وفي القوارض خاصة،.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

التحقيقات مطابقة للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85±23، تنقيح عام 1996). بروتوكولات وافق لجنتنا الأخلاقيات المحلية.

1-الحيوانات

  1. تبقى الإناث الفئران السويسرية (من-1) الذين تتراوح أعمارهم بين ثمانية إلى عشرة أسابيع من العمر، 20-25 غ، في حيوان الإسكان مرفق خمسة عشر يوما قبل كل تجربة. بيت لهم في خانات مهواة التي يحتفظ بها في المحمية، درجة الحرارة (22 درجة مئوية) والرطوبة (50%) التحكم في الغرفة، مع 12 ساعة تشغيل/إيقاف تشغيل دائرة الضوء.
  2. تعطي الحيوانات حرية الوصول إلى الغذاء والماء. التقليل من الألم والمعاناة والشدة وتوفر الإثراء للبيئة.
  3. للإسكان، واستخدام الجدران واضحة أقفاص، الإثراء بالعصي الخشبية والورق المقوى الإنفاق. رسم حيوان برفق في نفق بنقلها من القفص إلى كف اليد.
  4. القيام بالمراقبة اليومية لتقييم علامات السجود، والعزلة الاجتماعية، وإصابة الجسم، تكدرت الشعر، أو الافتقار إلى الاستمالة.
  5. تزن كل الحيوانات مرة واحدة في الأسبوع. إجراء عمليات تفتيش منتظمة من قبل طبيب بيطري.
  6. للطفيليات الطبيعية، جمع الدم في ذروة تطفلن والطفيليات التي تسبب وفاة الحيوان، وجمع الدم في اليوم قبل الوفاة المفترضة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع التجارب مع العوامل المعدية في غرف مخصصة، وفقا للمبادئ التوجيهية جامعة وافق.

2-المخازن المؤقتة، وسائل الإعلام الأعمال التحضيرية

  1. تزن من كل مادة وإضافة الماء المقطر للمخازن المؤقتة التالية:
    1. إعداد تركيز المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (2x):
      غ2هبو4 (لا مائي) (MW 141.96 ز) ز 10.14
      نة2بو4∙2H2س (MW 156.01 ز) ز 0.62
      كلوريد الصوديوم (MW 58.44 ز) ز 2.55
      المقطر ح2س إلى 1 لتر
    2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة-الجلوكوز:
      غ2هبو4 (لا مائي) (MW 141.96 ز) ز 5.39
      نة2بو4∙2H2س (MW 156.01 ز) ز 0.31
      كلوريد الصوديوم (MW 58.44 ز) ز 1.70
      الجلوكوز (ز 180 ميغاواط) 10 جرام
      المقطر ح2س إلى 1 لتر
    3. تحضير 1 م خ2ص4.
    4. إعداد المخزن المؤقت شطف: تكملة مخزنة الفوسفات المالحة-الجلوكوز مع
      البنسلين (100 U/mL)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، والفينول الأحمر (5 ميكروغرام/مل).

3-إعداد دي-السليلوز

  1. خطة حوالي 5 ساعات لإعداد دي-السليلوز.
  2. أغسل 100 غ دي-السليلوز مع الماء المقطر في قارورة مع رقبة ضيقة والسماح لتسوية، ثم تجاهل الجسيمات الدقيقة. كرر يغسل حتى المادة طافية الواضح.
  3. إضافة ل 3 من مركزة 2 × "فوسفاتيبوفيريد المالحة" وآثاره.
  4. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.0 مع 1 م خ2ص4 ، وتجاهل المادة طافية.
  5. تغسل مرتين بالماء المقطر ويترك لتسوية.
  6. أغسل والسماح لتسوية مرتين مع 3 لتر فوسفاتيبوفيريد المالحة-الجلوكوز وتجاهل في supernatants.
  7. قياس حجم السليلوز وإضافة وحدة تخزين متساوية من المحلول الملحي-الجلوكوز فوسفاتيبوفيريد وتوزيعها في زجاجات بلاستيكية وتخزينها في-20 درجة مئوية.

4-الطفيليات

  1. جمع السلالات المثقبيات في المناطق الموبوءة لداء المثقبيات البشري والحيواني. الاحتفاظ بالطفيليات تجميدها في نيتروجين سائل.
    ملاحظة: موسكولي مثقبيه غير ممرضة للبشر وهو المثقبيات خارج الخلية المستخدمة لاستبدال بأمان مثقبيات المسببة للأمراض في مختلف التجارب المختبرية.
  2. في حالة التحاليل المختبرية التي تتطلب مسببات الأمراض البشرية، التعامل مع تجارب مع العناية في واقية مناسبة مخصصة سلامة المستوى (BSL) شروط وإجراءات وقائية؛ BSL2 ت. الغامبية و BSL3 ل rhodesiense ت.. في الظروف الميدانية، يتم تأسيس معيار الممارسة الميكروبيولوجية: تأمين أخذ العينات، بيبيتينج الميكانيكية، متكررة إزالة تلوث الأسطح، وتعقيم النفايات.

5-الماوس العدوى

  1. سرعة ذوبان الجليد الطفيليات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  2. نلاحظ قطره دم المصابين المذابة مجهر. تقييم جدوى الطفيلي بقياس النسبة المئوية لأشكال متحركة17.
  3. حقن الطفيليات إينترابيريتونيلي في الفئران (0.5 مل في الماوس). كل يوم، ما بعد الإصابة، جمع 20 ميليلتر من الدم ذيل بثقب الإبرة، ومراقبة تحت مجهر. تقييم تطفلن وفقا هربرت ولومسدين18 عد الطفيليات في العديد من المجالات المجهر، أو باستخدام هايموسيتوميتير.
  4. عندما يصل تطفلن عتبة المحددة لكل سلالة، جمع الدم (1 مل/الماوس) في المخزن المؤقت شطف (5 مل/الماوس) التي تحتوي على الهيبارين (10 U/mL).
    ملاحظة: عن العمل الأصلي ورواية لنهام وغودفري الأمثل قوة الأيونية للفوسفات مخزنة المالحة الجلوكوز للعديد من الأنواع المضيفة/الطفيلي من حل أسهم pH 8.0.

6-الفصل الطفيلي

ملاحظة: يجب القيام بتجارب كل من هذه النقطة فصاعدا في غطاء زراعة الأنسجة ارتداء القفازات. درجة حرارة الغرفة والرطوبة في المختبرات المستخدمة كانت 22 درجة مئوية و 45 في المائة على التوالي. في الظروف الميدانية، تم فصل الطفيلي يؤديها بنجاح في 34 درجة مئوية.

  1. ضع حقنه 10 مل في دعم عمودي وإضافة تعميما سابقا قطع قطعة من ورق الترشيح أو الصوف الزجاجي أو الأسفنج السليلوز.
  2. صب السليلوز دي في المحاقن حتى يتم التوصل إلى مستوى 8 مل، ثم يغسل مع 25 مل من المخزن المؤقت شطف.
  3. إضافة 2 مل دم المخفف بعناية في أعلى العمود ثم قم بإضافة شطف المتوسطة. إضافة شطف المخزن المؤقت وفقا لعبور المثقبيات بانتظام.
  4. جمع قطرات النفايات السائلة من الأعمدة في أنبوب الطرد مركزي والتحقق بشكل منتظم لوجود الطفيليات مع مجهر.
  5. عندما لم يعد يتم الكشف عن الطفيليات في النفايات السائلة العمود، الطرد المركزي الأنبوب (1,800 س ز، 10 دقائق، في 4 درجات مئوية في المختبر وفي درجة الحرارة المحيطة في ظروف ميدانية).
  6. إزالة المادة طافية وتعليق الطفيليات في 1 مل المتوسطة ذات الصلة المطلوبة للخطوة التالية في التحقيق.
  7. عد الطفيليات مع هيموسيتوميتير وتمييع لهم في المتوسط المناسبة إذا لزم الأمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدمت مثقبيات المنقاة في الاختبارات الصيدلانية. يتم نقل الطفيليات في آبار الثقافة التي تتضمن تخفيف المسلسل محددة المخدرات، أما وحدها أو مختلطة19. الملاحظات المجهرية، تقييم حركية هو علامة على استمرارية، يمكن أن يؤديها عندما يجري اختبار دوجس قليلة فقط، بينما الاماربلوي خلية تحليل الجدوى هو وسيلة ممتازة لفحوصات حركية كبيرة خلال فحص20المخدرات. يتم عرض تأثير pentamidine، مرجع المخدرات المستخدمة في العلاج بقبعة، في الشكل 1.

الضامة مفيدة جداً في الثقافات كتغذية الخلايا. أنها تسمح، في المختبر، البدء وتطوير المثقبيات الثقافات21. لقد أبلغ أن عدد الضامة تفعيلها بدلاً من ذلك تتزايد في الثدييات المصابة المثقبيات الذي كانوا يفضلون النمو الطفيلي22. لوازم هذا التنشيط بلعم البديلة لأورنيثيني، هو أمر ضروري لنمو الطفيلي. في المختبر بلعم-الطفيلي الثقافات المشتركة أظهرت أن يستحث مثقبيات بلعم التنشيط البديلة عن طريق عوامل يفرزها. مثقبيات خارج الخلية تفرز kinesin التي تربط مستقبلات ملزم يطلق بلعم الذي يحفز التعبير أرجيناسي توفير إنتاج لتر-ornithine تحابي الطفيلي تمايز وتكاثر23،24 ( الشكل 2). يطلق يحول دون kinesin ملزم واستحثاث أرجيناسي، والفئران التي تفتقر إلى مستقبلات يطلق توضيح هدف kinesin على الضامة (الشكل 3).

منذ الآن تم تسلسل الجينوم المثقبيات عديدة والمشروح، تمكنا من الاستفادة من هذه مجموعات كبيرة من البيانات. وفي وقت لاحق، تمكنا من القيام بالوراثة إلى الأمام وعكس على هذه الطفيليات. باستخدام هذه البيانات، تنقية مجرى الدم شكل مثقبيات قد استخدمت لوصف وتحليل هياكل هامة مثل جيب فلاجلر (FP) وبه سيتوسكيليتون المرتبطة بها. تنظيم الأسرة هو الموقع الوحيد إندو والرقابة في مثقبيات وهو أيضا حيث يتم تهريب glycoproteins السطح المتغير من نظام اندوميمبراني25. جيب فلاجلر ذوي الياقات البيضاء (FPC) حلقية على شكل الهيكل المرتبط بالسوط عند النقطة حيث أنه يخرج تنظيم الأسرة، ولكن حتى مؤخرا كان يعرف إلا القليل عن مكونات البروتين الشركة العامة للفوسفات. ونحن قد حددت بروتين رئيسي للشركة العامة للفوسفات، BILBO1 السل، وأظهرت أنه من الضروري لبقاء الطفيلي في شكل مثقف حشرة ذبابة التسي تسي وفي شكل مجرى الدم26. ضربة قاضية السلBILBO1 من [رني] يمنع تشكيل وتنظيم الأسرة، ويحول دون نشوء حيوي للعديد من الهياكل cytoskeletal الهامة الأخرى، مما يجعل الشركة العامة للفوسفات وأهداف تنظيم الأسرة مهم للتدخل في جميع مثقبيات المسببة للأمراض. سبر الخلايا الطفيلي المنقي أو مثقف مع الأجسام المضادة السلBILBO1 يشير إلى أنه يخلق في شكل مجرى الدم والنموذج بروسيكليك (الحشرات)، بنية على شكل حلقة تلتف السوط. هذه العلامات، على شكل مجرى الدم، ويظهر في الشكل 4.

مثقبيات شكل مجرى الدم المنقي سمحت توصيف العديد من الخصائص البيوكيميائية والايض غير عادية، بما في ذلك التمثيل الغذائي للسكر، التي تجري في العضيات مثل بيروكسيسومي تسمى جليكوسوميس (انظر الشكل 5). كان من المقبول عموما أن بيروفات هو الناتج النهائي الرئيسية تفرز من استقلاب الجلوكوز من مثقبيات مجرى الدم، مع تقريبا لا إنتاج succinate وخلات داخل ميتوكندريا. وفي المقابل، تحويل مثقبيات بروسيكليك ثريونين إلى خلات والجلوكوز في27،سوكسيناتي وخلات28. ويمكن تقييم استقلاب الطاقة تريبانوسوماتيدس بالتكيف مع مصادر الكربون المتاحة. الجمع بين علم الوراثة العكسي وتحليلات metabolomic أكد إنتاج في ميتوكندريا مثقبيات مجرى الدم من خلات من بيروفات المستمدة من السكر وثريونين، فضلا عن إنتاج سوكسيناتي من الجلوكوز19،20 (الشكل 5). على سبيل المثال، 1تحليل ح-الرنين المغناطيسي للمنتجات النهائية التي تفرز بمجرى الدم شكل مثقبيات المحتضنة في برنامج تلفزيوني يحتوي على الجلوكوز 4 مم، وكشفت أن الجلوكوز يتم تحويلها أساسا إلى بيروفات (85.1% المنتجات النهائية أغلبه)، مع إنتاج ثانوية ألانين (9.2%)، خلات (4.9%) و succinate (0.8 في المائة)29. هذه المسارات، وثانوية من حيث التمويه الأيض مقارنة بإنتاج بيروفات من الجلوكوز، ضرورية لنمو الطفيليات. وبالتالي يمكن اعتبار في مسار الإنتاج succinate كهدف محتمل جيدة لتطوير عقاقير جديدة تريبانوسيدال.

Figure 1
الشكل 1 : في المختبر تأثير بينتاميديني على البروسية. ت.. تخفيف pentamidine أضيفت إلى 2 × 105 الطفيليات لتحديد تركيز تثبيط النمو الطفيلي بنسبة 50% (IC50). تأثير الجرعة المنحنيات في 24 ساعة للثقافة. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للوسط من 5 تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الحث المثقبيات بوساطة أرجيناسي. Kinesin نشرته مثقبيات ربط مستقبلات يكتين ج-نوع مما يؤدي إلى تحريض أرجيناسي. هذه النتائج في زيادة إنتاج لتر-ornithine وبوليامينيس، ضروري لنمو الطفيلي والتمايز، ونضوب ارجينين، أدى إلى انخفاض الإنتاج لا السامة للخلايا من بلعم الثاني NOS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : نشاط أرجيناسي بلعم. النشاط أرجيناسي في الضامة من الفئران التحكم ويطلق مستقبلات ضرب الفئران (كو) المزروعة في المختبر في المتوسط لمدة 48 ساعة، مع أو بدون kinesin أو يطلق. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للوسط من 5 تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 4
الشكل 4 : تيرابايت BILBO1 تسمية نموذج مجرى الدم مثقبيه البروسية البروسية خلية (أ) الفلورة وسم من مجرى الدم، شكل ثقافة، 427 الخلية 90-13 التي قد تم التحقيق مع مكافحة--BILBO1 [مونوكلونل] جسم متبوعاً بجسم ماوس المضادة المسمى فيتك وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية، (السل BILBO1 هي إشارات حلقية الأخضر) والحمض النووي ملزم صبغ DAPI (الإشارات الزرقاء) A (ب) دمج الصور على النقيض DAPI ومكافحة BILBO1 والمرحلة من الجدول ألف شريط يساوي 10 ميكرون. BILBO1 مكافحة الماوس [مونوكلونل] كان المخفف 01:10 في برنامج تلفزيوني و (جسم الثانوية وكان الماوس المضادة IgM فيتك) المخفف 1: 100. صور أخذت في مجهر المزودة بكاميرا رقمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 5
الشكل 5 : التمثيل التخطيطي استقلاب الغلوكوز وثريونين في مجرى الدم شكل مثقبيات. هي محاصر المنتجات النهائية أغلبه من استقلاب الجلوكوز وثريونين. الأسهم الزرقاء سميكة تبين الخطوات الانزيمية استقلاب الجلوكوز مما يؤدي إلى إنتاج بيروفات، الذي هو المنتج النهائي الرئيسية تفرز من تحلل. تمثل الأسهم السوداء إغفال طفيفة الأيضية من تدهور الجلوكوز وثريونين، التي ضرورية لنمو الطفيليات. تم التحقق من مساهمة الإنزيمات المشار إليه تجريبيا: منظمة العمل ضد الجوع، أسيتيل ثيويستيراسي (EC 3.1.2.1)؛ أسكت، خلات: succinate CoA-ترانسفيراز (المفوضية الأوروبية 2.8.3.18)؛ أككت، 2-أمينو-3-كيتوبوتيراتي إنزيم A ليجاسى (المفوضية الأوروبية 2.3.1.29)؛ بيبك، فوسفونولبيروفاتي كاربوكسيكيناسي (المفوضية الأوروبية 4.1.1.49)؛ PDH، بيروفات نازعة المعقدة (EC 1.2.4.1)؛ TDH، ثريونين 3-نازعة (المفوضية الأوروبية 1.1.1.103). المختصرات: أككوا، البيروفات؛ نطاقا، أوكسوبوتيراتي الأمينية؛ دهب، فوسفات ديهيدروكسياسيتوني؛ G3P، جليسيرالديهيدي 3-فوسفات؛ القانون النموذجي للتحكيم، ومآلات؛ الزراعة العضوية، أوكسالواسيتاتي؛ بيب، فوسفونولبيروفاتي؛ PYR، بيروفات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مثقبيات المنقي تمثل وسيلة قوية لدراسة علم المناعة، والكيمياء الحيوية، والخلوية والبيولوجيا الجزيئية. وحصلت مساحات كبيرة من البيانات والنتائج من المثقبيات، ثم مما ساعد على الحصول على المعلومات من خلايا حقيقية النواة الأخرى30. مثقبيات هي أيضا موضوع بحوث هامة ومثيرة للاهتمام لأنه قد وضعت العديد من الآليات التي تسمح لهم بالبقاء على قيد الحياة وتنمو في بيئات مختلفة جداً: ناقل ذبابة التسي تسي و الثدييات المضيفة23، 31. وقد تم الإبلاغ عن تقنيات مختلفة لعزل مثقبيات، واستعراض بشأن النهج القائم على ميكروفلويديكس وقد تم مؤخرا نشر32. ومن ثم، وسيلة لعزل الطفيلي استنساخه وقوى أمر أساسي.

إعداد السليلوز دي خطوة لا غنى عنها في هذا البروتوكول إعداد الطفيلي. شروط الغسل تتم بحذر إزالة الجسيمات الدقيقة، وحجته الراتنج، ويجب تعديل درجة الحموضة تحديداً (pH 8.0 مناسب لمعظم الأنواع المثقبيات). جميع الخطوات يجب أن تعدل لتحسين تنقية الطفيلي والعائد مع الحفاظ على خصائص البقاء والخلوية الطفيلي. الأهم من ذلك، ظلت بقاء الطفيلي والعدوى بعد التنقية عن طريق عمود دي-السليلوز. ومع ذلك، بعض السلالات أكثر هشاشة من الآخرين وقد يكون أقل المعدية بعد تنقية33. ولذلك، قد أثر ظروف الانفصال على مكونات غشاء بيليكولار، الأيض الطفيلي، إشارات، وظائف الأحماض النووية، والعدوى الحيوانية، تقييم وظروف الانفصال تكييفها تبعاً لذلك.

القيود على هذا الأسلوب هي أن هذا الإجراء قد يتعين تكييفها مع كل الأنواع المثقبيات في مجموعة معينة، وهو أيضا مضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، السليلوز دي الآن باهظة الثمن. فحوصات تمهيدية ضرورية لتحسين شروط الانفصال، لا سيما وسائل الإعلام، التي قد تكون متفاوتة القوة الأيونية ودرجة حموضة دقيقة. ويتم اختيار العمود قبل الخطوات، بما في ذلك خيار التخثر، الطرد المركزي السابقة لإزالة معظم الكريات الحمراء واستخدام معطف بافي، وتحلل كرات الدم الحمراء، وفقا لكل تجربة. التغييرات الدقيقة في معلمة واحدة (المخازن المؤقتة، ودرجة الحرارة في جميع أنحاء البروتوكول، معلمات الطرد المركزي) قد زيادة كبيرة في العدد، والحصول على33درجة لتنقية والجدوى للطفيليات. قد يكون من الضروري وضع معلمات فصل جديد وفقا لأنواع الطفيليات والثدييات خلايا الدم فصل،. تعديلات على بروتوكول لنهام وفي غودفري الأولية أتاح تنقية الحفاظ على بيولوجيا و antigenically الكروزية ت من الدم34. يمكن أيضا اختبار راتنجات الجديدة واستخدامها مع الظروف الملائمة لمختلف الأنواع35.

في الآونة الأخيرة الدور الرئيسي يفرز يفرز عوامل (ES) التي تريبانوسوماتيدس في التشديد على16. وفاق تحتوي على الجزيئات في علم الأمراض والمرباة، مثل kinesin، التي يتم الحفاظ عليها بين مثقبيات24. ويتطلب إعداد وفاق من الطفيليات المنقي عناية خاصة لتجنب التلوث بعناصر الوسائط شطف وتفكيك الطفيليات.

لقاح المستندة إلى وفاق فعالة ضد الليشمانيا، طفيلي ذات صلة، موجود مسبقاً وهو متاح (كانيليش فيرباك)36. الرابطة لجزيئات مصانة بأدوار أساسية في بقاء الطفيلي والنمو قد يمثل أساسا لمستقبل لقاح ضد المثقبيات، لكل من البشر والحيوانات، وفي نهج واحد-الصحة. تنقية مثقبيات الأفريقي من الدم حسب الأعمدة دي-السليلوز، مع إدخال تحسينات، ويظل معيار الذهب للكشف عن المثقبيات في المضيفين الطبيعية مع باراسيتيمياس منخفضة في المناطق الموبوءة والحاجة للطفيليات في إعداد كبيرة تحقيقات تجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر جميع أعضاء 177 قاسم أغا إينتيرتريب سيراد IRD جامعة بوردو دي. هذا البحث كان يدعمها التمويل الداخلي من جامعة بوردو والدعم من وكالة الاستخبارات الوطنية، لابيكس ANR بارافراب-11-لابكس-0024، والرابطة من أجل le التنمية de la البحوث في باراسيتولوجي et تروبيكال الطب والخدمات التعاون والعمل الثقافي de لعمباسادي à فرنسا دي بانغي (أفريقيا الوسطى).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Pipettes  Falcon 357,551
2 mL Pipettes  Falcon 352,507
Centrifugation tube 50 mL Falcon 352,070
Centrifuge Sigma Aldrich 4K15
DEAE cellulose Santa Cruz s/c- 211213 100 G
filter paper  Whatman 1,001,125
Flat bottom flask narrow neck Duran 21 711 76 6000 mL
Glucose  VWR 101174Y 500 G
Heparin Sigma Aldrich H3149-50KU 5 000 U
KH2PO4 VWR 120 26936.260 500 G
Microscope Olympus CH-20
Microscope coverslips Thermofisher scientific CB00100RA020MNT0
Microscope slides Thermofisher scientific AGAA000001
Na2HPO4  VWR 100 28026;260 500 G
NaCl VWR 27800.291 1 KG
NaH2PO4  VWR 110 33616;262 500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL Thermofisher scientific 342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL Thermofisher scientific 342024-0500
Pasteur Pipette VWR BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg EUROBIO CABPES01 OU 100 mL
Phenol red Sigma Aldrich P0290 100 mL
Syringue  Dutscher SS+10S21381
Tissue culture hood Thermoelectro Corporation MSC-12
Trypanosoma brucei brucei Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). ITMAP 1893
Trypanosoma musculi London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) Partinico II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390, (10110), 2397-2409 (2017).
  2. Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
  3. Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review. Parasitology. 143, (14), 1862-1889 (2016).
  4. Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, (4), e0005454 (2017).
  5. Büscher, P., Deborggraeve, S. How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis? Expert Review of Molecular Diagnostics. 15, (5), 607-615 (2015).
  6. Truc, P., et al. Atypical human infections by animal trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, (9), e2256 (2013).
  7. Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, (3), 312-317 (1979).
  8. Büscher, P., et al. Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3, (11), e471 (2009).
  9. Lanham, S. M. Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers. Nature. 218, (5148), 1273-1274 (1968).
  10. Lanham, S. M., Godfrey, D. G. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Experimental Parasitology. 28, (3), 521-534 (1970).
  11. Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice. Journal of the National Medical Association. 89, (1), 48-56 (1997).
  12. Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization. Journal of Wildlife Diseases. 50, (1), 11-20 (2014).
  13. Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages. Infection and Immunity. 53, (3), 600-605 (1986).
  14. Vincendeau, P., Daëron, M. Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses. Journal of Immunology. 142, (5), 1702-1709 (1989).
  15. Holzmuller, P., et al. Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics. Microbes and Infections. 10, (1), 79-86 (2008).
  16. Holzmuller, P., et al. How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages? Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).
  17. Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi. Parasitology. 75, (3), 317-323 (1977).
  18. Herbert, W. J., Lumsden, W. H. Trypanosoma brucei: a rapid "matching" method for estimating the host's parasitemia. Experimental Parasitology. 40, (3), 427-431 (1976).
  19. Dauchy, F. A., et al. Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, (11), e0005125 (2016).
  20. Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro. Acta Tropica. 68, (2), 139-147 (1997).
  21. Albright, J. W., Albright, J. F. In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol. International Journal for Parasitology. 10, (2), 137-142 (1980).
  22. Gobert, A. P., et al. L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis. Infection and Immunity. 68, (8), 4653-4657 (2000).
  23. De Muylder, G., et al. A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity. PLoS Pathogens. 9, (10), e1003731 (2013).
  24. Nzoumbou-Boko, R., et al. Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog. Journal of Immunology. 199, (5), 1762-1771 (2017).
  25. Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated. PLoS Biology. 6, (5), e105 (2008).
  26. Albisetti, A., et al. Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei. PLoS Pathogens. 13, (11), e1006710 (2017).
  27. Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate. Parasitology. 71, (2), 311-326 (1975).
  28. Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and Biochemical Parasitology. 149, (1), 1-9 (2006).
  29. Mazet, M., et al. Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, (12), e2587 (2013).
  30. Coutton, C., et al. Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human. Nature Communications. 9, (1), 686 (2018).
  31. Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake. Parasitology. 142, (3), 417-427 (2015).
  32. Barrett, M. P., et al. Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes. Pathogens. 6, (4), (2017).
  33. Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes. Experimental Parasitology. 35, (2), 196-208 (1974).
  34. Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism. Parasitology. 76, (2), 159-176 (1978).
  35. Cruz-Saavedra, L., et al. Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies. Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).
  36. Lemesre, J. L., et al. Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial. Vaccine. 25, (21), 4223-4234 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics