Normotérmica Ex Situ corazón perfusión en modo de trabajo: evaluación de la función cardiaca y el metabolismo

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Summary

Normotérmica ex situ corazón perfusión (ESHP), conserva el corazón en un estado semi-fisiológico, paliza. Cuando se realiza en un modo de trabajo, ESHP proporciona la oportunidad de realizar evaluaciones sofisticadas de donantes viabilidad de función y órgano de corazón. Aquí, describimos nuestro método para la evaluación del desempeño miocardio durante ESHP.

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Hatami, S., White, C. W., Ondrus, M., Qi, X., Buchko, M., Himmat, S., Lin, L., Cameron, K., Nobes, D., Chung, H. J., Nagendran, J., Freed, D. H. Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism. J. Vis. Exp. (143), e58430, doi:10.3791/58430 (2019).

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Abstract

El método estándar actual de preservación de órgano (conservación en cámara frigorífica, CS), expone el corazón a un periodo de isquemia fría que limita el tiempo de conservación segura y aumenta el riesgo de resultados adversos del poste-trasplante. Por otra parte, la naturaleza estática de CS no permite evaluación de órgano o intervención durante el intervalo de preservación. Normotérmica ex situ corazón perfusión (ESHP) es un método novedoso para la preservación del corazón donado que minimiza la isquemia fría proporcionando solución oxigenada, ricos en nutrientes para el corazón. ESHP ha demostrado que no es inferior a CS en la preservación del donante estándar criterios corazones y también ha facilitado el trasplante clínico de los corazones donados después de la determinación circulatoria de la muerte. Actualmente, el dispositivo clínico sólo disponible del ESHP perfuses el corazón en un estado de descarga, no trabajo, limitando las evaluaciones de rendimiento miocardio. Por el contrario, ESHP en modo de trabajo ofrece la oportunidad para la evaluación integral del rendimiento cardiaco por evaluación de parámetros funcionales y metabólicos en condiciones fisiológicas. Por otra parte, antes de los estudios experimentales han sugerido que ESHP en modo de trabajo puede producir mejor preservación funcional. Aquí, describimos el protocolo para ex situ de la perfusión del corazón en un modelo (porcino) de grandes mamíferos, que es reproducible para tamaños de corazón y diferentes modelos animales. El programa de software de este aparato ESHP permite control automatizado y en tiempo real de la velocidad de la bomba para mantener la presión atrial izquierda y aórtica deseada y evalúa una variedad de parámetros funcionales y electrofisiológicas con mínima necesidad de supervisión/manipulación.

Introduction

Relevancia clínica

Mientras que la mayoría de los aspectos del trasplante cardiaco ha evolucionado significativamente desde que el primer centro de trasplante en 1967, almacenamiento en frío (CS) sigue siendo el estándar para la donante corazón conservación1. CS expone el órgano a un periodo de isquemia fría que limita el intervalo de preservación segura (4 – 6 horas) y aumenta el riesgo de fallo primario injerto disfunción2,3,4. Debido a la naturaleza estática del CS, las evaluaciones de la función o las intervenciones terapéuticas no son posibles en el tiempo entre la adquisición de órganos y trasplante. Esto es una limitación particular en criterios extendidos los donantes incluyendo corazones donados después de la muerte circulatoria (DCD), creando un obstáculo para la superación de la brecha considerable entre la demanda y la actual donante piscina5,6. A la dirección de que esta limitación, ex situ perfusión de corazón ha sido propuesta como un método de preservar corazones donados, minimizando la exposición a la isquemia fría proporcionando novela y semi-fisiológico oxigenada, solución rica en nutrientes para el corazón durante el tiempo de la preservación 1 , 7 , 8.

Ex situ de la perfusión corazón

Uno de los métodos más frecuentemente utilizados para ex situ la examinación del corazón aislado es perfusión de Langendorff. En este método, introducido por Oskar Langendorff en 1895, el sangre fluye en las arterias coronarias y el seno coronario del corazón aislado, con el corazón en un vacío y golpes de estado9,10. Clínica ESHP en un modo de Langendorff con el aparato Transmedics órgano Care System (OCS) se ha demostrado que no es inferior a CS en la preservación de corazones de donantes1de criterios estándar y ha facilitado el trasplante clínico de corazones DCD 11. sin embargo, hay preocupaciones sobre la capacidad del dispositivo para evaluar la viabilidad del órgano, como un número de corazones de donantes pensado inicialmente para ser transplantable fueron descartado después de perfusión en la OCS3. La OCS apoya el corazón en el modo de Langendorff (no trabajo) y así posee una capacidad limitada para la evaluación de la función de bombeo del corazón3,12. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que los parámetros funcionales ofrecen una mejor manera de evaluar la viabilidad del órgano, lo que sugiere que las evaluaciones de la función cardiaca pueden convertirse en una herramienta confiable para la evaluación y selección de corazones para trasplante en ESHP3 ,12,13,14, además, nuestros estudios en ex situ perfundidos porcina corazones sugieren que ESHP en modo de trabajo proporciona mayor preservación funcional del corazón durante el intervalo de perfusión15,16.

Un aparato ESHP capaz de preservar el corazón en un modo de trabajo debe poseer un nivel de automatización de forma segura y precisa mantener precarga, poscarga y caudales. Además, dicho sistema debe poseer la flexibilidad para facilitar evaluaciones integrales de la función cardiaca a llevarse a cabo. Aparato el ESHP aquí está equipado con software a medida que 1) proporciona y mantiene la deseada aórtica (Ao) y aurícula izquierda (LA) presión flujo y 2) proporciona análisis en tiempo real de parámetros funcionales y evaluación visual de formas de onda de la presión con mínima necesidad de supervisión. Datos de presión se adquiere con transductores de presión estándar llena de líquido y flujo de datos se adquiere con sondas de flujo doppler tiempo de tránsito. Estas señales son digitalizadas con un puente y la entrada analógica, respectivamente. El corazón se coloca horizontalmente con una ligera elevación de los grandes vasos en una membrana de silicona suave. Los accesorios de canalización pasen a través de la membrana, incorporando una cámara de cumplimiento para el humedecimiento de la eyección ventricular. El objetivo de este trabajo es proporcionar a los investigadores en el campo de trasplante cardiaco con un protocolo para ex situ de la perfusión y la evaluación del corazón, condiciones normotérmica, semi-fisiológica en el modo de trabajo, en un modelo de grandes mamíferos (cerdo Yorkshire).

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Protocol

Todos los procedimientos en este manuscrito se realizaron conforme a las directrices del Consejo Canadiense en el cuidado Animal y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los protocolos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado animal de la Universidad de Alberta. Este protocolo se ha aplicado en los cerdos de Yorkshire juveniles femeninos entre 35-50 kg. Todas las personas involucradas en los procedimientos de ESHP habían recibido capacitación adecuada bioseguridad.

1. pre-quirúrgicos preparados

  1. Coloque la cámara de órgano correctamente en el carro del aparato e instalar la membrana de soporte de silicio dentro de la cámara de órgano. El Ao, la arteria pulmonar (PA) y los puntos de LA conexión puede verse en la figura 1.
  2. Instale el oxigenador ESHP tubería red (representado en la figura 2AB) y el filtro. Conecte las líneas de agua del intercambiador de calor y el tubo de gas de barrido para el oxigenador.
  3. Lugar el flujo de las sondas para la medición del seno coronario/PA y LA de flujo en la tubería correspondiente.
  4. Conecte los transductores de presión de la Ao y LA las líneas representativas en el circuito.
  5. Asegúrese de que todas las conexiones de tubería están conectadas firmemente y todas las llaves y cerraduras luer se cierran adecuadamente en los sitios.
  6. Cebar el circuito con 750 mL de solución de Krebs-Henseleit modificado (NaCl, 85; KCl, 4.6; NaHCO3, 25; KH2PO, 1.2; MgSO4, 1,2; glucosa, 11; y CaCl2, 1.25 mmol/L) que contiene 8% de albúmina. -Bombas de aire, el Ao y LA colocando la salida de la bomba por encima de la entrada para que el aire sale de la cámara de la bomba (figura 3). La solución por lo general no necesita ser oxigenada antes de iniciar la perfusión.
  7. Iniciar el software después de la Ao y LA bombas se- transmitió y el circuito está preparado.

2. ajustes e inicialización de Software ESHP

Nota: El aparato ESHP aquí está equipado con un programa de software a la medida para permitir el control de la velocidad de la bomba con el fin de lograr y mantener la deseada las presiones de LA y Ao. El software también analiza parámetros funcionales y proporciona una evaluación visual de formas de onda de presión (figura 4).

  1. Para iniciar el programa ESHP, haga clic en el atajo del programa en el monitor.
  2. En la página de "configuración", haga clic en "iniciar". El mensaje de inicialización aparecerá en el tablero (figura 5).
  3. En la misma página, cero los sensores de flujo de clic en el "cero flujo LA" y "cero flujo de PA". Aparece el mensaje en el tablero.
  4. Ajustar la altura de los transductores de presión a la altura del soporte de silicona. A cero los transductores de presión, abra el Ao y LA transductores de presión (y cualquier otros transductores para controlar la presión) a la atmósfera y, a continuación, haz clic en el botón de "cero todas las presiones". Aparece el mensaje en el tablero.
  5. En la página "principal", aumentar la velocidad de la bomba de Ao gradualmente hasta el punto donde el flujo de la cánula de Ao aparece en la cámara de órgano. En el sistema actual, esto se consigue con las revoluciones de 900-1000 por minuto (RPM).
  6. Añadir 750 mL de sangre a la solución de la solución para llevar el volumen total de solución a 1.5 L (como se describe en el "cirugía, recolección de sangre y la consecución de corazón" sección) y entonces aumentar la bomba de LA PRM (800-900 RPM) para que no quede aire en la cánula de LA o la tubería de LA debajo de la membrana de soporte de silicona.
  7. Después de inicializar el software de control y de-respiradero del aparato ESHP, contratación de corazón de donante puede proceder.

3. preparación y anestesia

  1. Administrar 20 mg/kg de ketamina y 0,05 mg/kg de atropina para la premedicación por vía intramuscular.
  2. Transferir el cerdo a la suite quirúrgica y colocar el cerdo en la mesa con tablero de calefacción para mantener la normotermia.
  3. Valorar el flujo de oxígeno para la inducción de la máscara según el peso de los animales y el sistema anestésico. Los circuitos anestésicos de círculo cerrado el flujo de oxígeno debe ser 20-40 mL/kg.
  4. Encienda el isoflurano a 4 – 5%; después de uno o dos minutos esto puede reducirse al 3%.
  5. Evaluar la profundidad de la anestesia. El cerdo no es en el plano quirúrgico si no hay ningún reflejo de retirada en respuesta a los estímulos nocivos.
  6. Después de la confirmación de la adecuada profundidad de la anestesia, proceder a la intubación.
  7. Coloque la sonda oxímetro de pulso en la lengua (de preferencia) o el oído. La saturación de oxígeno medida por oximetría de pulso debe mantenerse por encima del 90%.
  8. Afeitarse los parches de cabello en las regiones del codo izquierdo y derecho y sofocar la izquierda. Lavar aceites de la piel con agua y jabón, enjuagar con alcohol isopropílico y secar completamente. Colocar los contactos de ECG. Evitar interferencias de alambre de plomo con el sitio quirúrgico. Conecte los cables a las ubicaciones correctas.
  9. Para mantener la anestesia, ajustar el flujo de oxígeno (20 – 40 mL/kg) y tipo de gases inhalantes (1 – 3%). La frecuencia cardíaca debe ser de 80 a 130 latidos por minuto tarifa de respiración debe ser 12 – 30 respiraciones/min.
  10. Afeitarse, lavar y preparar asépticamente la zona de la incisión.

4. sangre y adquisición del corazón

  1. Evaluar el nivel de anestesia cada mínimo cada 5 min para confirmar el plano quirúrgico (no reflejo pedal y no reflejo de parpadeo, sin respuesta a estímulos dolorosos).
  2. Realizar un sternotomy mediano.
    1. Identificar jugulum y xifoides como puntos de referencia.
    2. Usando el electrocauterio, desarrollar la línea media entre los puntos de interés, dividiendo el tejido subcutáneo y la fascia entre las fibras del músculo pectoral mayor.
    3. Marcar la línea media a lo largo del hueso esternal con el cauterio. Realizar osteotomía esternal con una sierra eléctrica o de aire. Para evitar la creación de lesiones en las estructuras subyacentes (e.g. pericardio y vena braquiocéfala y la arteria innominada), proceden gradualmente con la sierra.
    4. Retraiga el esternón poco a poco, usando un retractor esternal. Para evitar la tensión excesiva y lesiones vasculares, no coloque el retractor demasiado lejos cranially.
    5. Libre de los ligamentos sternopericardial de la superficie posterior del esternón mediante cauterización.
    6. Abrir el pericardio con una tijera de Metzenbaum y fijar los bordes pericárdicos al esternón mediante sutura de seda de 1-0.
  3. Ampliamos la incisión del midline cranially por 2 – 3 cm y exponer la arteria carótida común derecha y la vena yugular interna.
  4. Obtener control proximal y distal de los vasos alrededor de los vasos con lazos de seda (2-0).
  5. Ate los lazos cerco craneales en cada recipiente.
  6. Abrir el anterior 1/3 de cada vaso con una hoja de 11 y luego inserte una vaina de 5 – 6 en cada recipiente. Forra el lazo el lazo caudal cerco alrededor de cada recipiente para garantizar el respectivo.
  7. Monitorear la presión venosa central y arterial conectando cada vaina a un transductor de presión.
  8. Entregar 1.000 de U/kg de heparina por vía intravenosa.
  9. Colocar una sutura en jareta polipropileno 3-0 en la orejuela derecha y sujetarla con una trampa.
  10. Dentro de la sutura en jareta, crear una incisión de 1 cm en el apéndice con una hoja de 11. Insertar una cánula venosa de dos etapas (28/36 FR) dentro de la incisión y posición de la punta distal de la vena cava inferior. Fijar la cánula lazo empatando a la cánula venosa. Control de la salida de la cánula con una abrazadera de tubo.
  11. De la cánula venosa de dos etapas en la aurícula derecha, recogen 750 mL de sangre entera de cerdo gradualmente durante un período de 15 minutos en un recipiente de vidrio esterilizado y simultáneamente sustituir el volumen con 1 L de una solución cristaloide isotónica como Plasmalyte A.
  12. Añadir la sangre en el circuito de perfusión (que ha sido previamente imprimado con 750 mL Krebs-Henseleit buffer que contiene 8% de albúmina) para llegar a un volumen final de 1.5 L de solución. La solución es una combinación 1:1 de Krebs-Henseleit conteniendo solución de 8% de albúmina y de sangre del animal donante 17.
  13. Colocar una aguja de cardioplegia (14-16) en el Ao ascendente y asegúrelo con una trampa.
  14. Conectar la cánula de cardioplejía a la bolsa de cardioplegia y añadir 100 mL de sangre a 400 mL de cardioplegia (St. Thomas Hospital solución) para llegar a un volumen final de 500 mL sangre cardioplejía.
  15. Eutanasia el cerdo por exsanguinación. Si con la intención de añadir más sangre a la solución después del comienzo de la perfusión (según los objetivos del estudio), recoger la sangre y añadirle 10-30 U/mL de heparina y guárdelo en un recipiente de vidrio o una bolsa de plástico a 4 ° C durante períodos cortos (horas
  16. Pinzamiento de la Ao ascendente con una abrazadera del Ao y entregar la solución cardiopléjicas en la raíz del Ao.
  17. Una vez finalizada la entrega de la solución cardiopléjicas, retire la abrazadera de Cruz y realizar la cardiectomy.
    1. Para la facilidad de montar el Ao y PA a su representante cánula, disecar parcialmente el Ao ascendente del PA usando unas tijeras de Metzenbaum.
    2. Transecto de la superior e inferior de la vena cava, dejando aproximadamente 1 cm de longitud en cada uno.
    3. Separar el corazón del mediastino posterior por transecting las venas pulmonares.
    4. Suprimir el corazón procurando todos del Ao se obtienen vasos arcos junto con un segmento de Ao de descendiente. Conservar hasta la bifurcación de la PA.
  18. Pesar el corazón vacío. La cantidad de ganancia de peso en el intervalo de conservación ex situ puede utilizarse como una medida para el edema del órgano.

5. colocación del corazón en el aparato ESHP y el inicio de la perfusión

  1. Recorte el exceso de tejido alrededor de la LA con una tijera de Metzenbaum y corte entre las venas pulmonares para crear un orificio común.
  2. Colocar una sutura en jareta alrededor del orificio de LA mediante una sutura de polipropileno 3-0.
  3. Sutura y cierre de la vena cava inferior con una sutura de polipropileno 3-0. Salir la vena cava superior abierta al comienzo de la perfusión para que el ventrículo derecho (RV) sea descomprimido hasta que la solución se calienta y se obtiene un ritmo organizado.
  4. Coloque la LA cánula en el orificio de LA y asegúrelo con una trampa (figura 6).
  5. Apriete suavemente los ventrículos para eliminar del aire el corazón"de 5.5. y añadir a 5.7. como aumentar la velocidad de la bomba de Ao a 1600 RPM como exprimir suavemente el corazón. El aire restante en raíz Ao se expulsará a través de las ramas innominadas y subclavias.
  6. Fije el Ao a la cánula de Ao incrustada en la membrana de silicona. Asegure el Ao alrededor de la cánula con una corbata de seda. Recorte del Ao para alcanzar una mentira adecuada libre de tensiones y torceduras.
  7. Aumentar la velocidad de la bomba de Ao a 1600 RPM. El aire restante en raíz Ao se expulsará a través de las ramas innominadas y subclavias.
  8. Conecte la línea de purga de Ao a la arteria innominada. Asegure la conexión con una corbata de seda.
  9. Trampa del orificio de la arteria subclavia izquierda con un lazo de seda. Asegure el cierre con lazo y encaje. A través del orificio de la arteria subclavia, colocar un introductor (5f). Asegúrese de que la longitud del catéter y su orientación se ajusta correctamente para que no interfiera con la función de válvula Ao.
  10. Conectar el transductor de presión de la Ao al puerto de lado vaina del introductor.
  11. Leer la presión de la Ao en el monitor. Ajustar la velocidad de la bomba del Ao para llegar a una presión media de 30 mm Hg. En este momento (tiempo 0), habrá iniciado la perfusión en el modo de no funcionamiento (modo de Langendorff) y aparición de una solución desoxigenada oscuro en la línea de PA es un reflector de reestablecimiento del flujo coronario. Ajustar un temporizador para seguir la duración de la perfusión si es necesario.
  12. Encienda el intercambiador de calor y la temperatura a 38 ° C. La solución caliente hasta 37 – 38 ° C en aproximadamente 10 minutos. Para perfusión normotérmica de un corazón porcino, mantener la temperatura a 38 ° C durante la perfusión.
  13. Mantener la perfusión en modo no operativo durante la primera hora de la perfusión. Ajustar la velocidad de LA bomba para mantener la presión de LA 0 mmHg.
  14. Una vez que la temperatura de la solución es > 34 ° C, evaluar el ritmo cardíaco y el ritmo y desfibrilar como requeridos (5 – 20 julios). Asegúrese de que el corazón se descomprime completamente antes de intentar la cardioversión.
  15. Comprobar el estado del gas disuelto usando un analizador del gas de sangre. Ajustar la mezcla de gas para mantener un pH: 7.35 – 7.45, la presión parcial arterial de dióxido de carbono (PaCO2): 35 – 45 mmHg, la presión parcial arterial de oxígeno (PaO2): 100 – 150 mmHg y saturación (tan2) ≥ 95% de oxígeno.
  16. Una vez que el corazón esté normotérmico y en un ritmo estable, ligar la vena cava superior.
  17. Conecte conductores de marcapasos temporal a la pared atrial derecha y ritmo del corazón en modo AAI a 100 latidos/min.
  18. Conecte los electrodos de electrocardiografía epicárdico a la superficie del corazón.
  19. Cambiar al modo de trabajo después de 1 h de perfusión en el modo de Langendorff. Para ello, introduce el deseo LA presión (típicamente 6-8 mmHg) en el lado izquierdo de la Página principal, en la sección "vuelta deseada" del software y haga clic en el botón para iniciar el bucle de retroalimentación. El modo de funcionamiento activado aparecerá como un enlace, y aumentar y disminuir para alcanzar y mantener la presión deseada de LA automáticamente la velocidad de LA bomba.
  20. El corazón comienza a trabajar, la resistencia vascular coronaria caerá dando por resultado una presión diastólica baja. Ajustar la velocidad de la bomba de Ao para mantener la presión diastólica de la Ao de 40 mmHg como la poscarga durante la perfusión en el modo de funcionamiento.

6. metabólica apoyo durante ESHP

Nota: Soluciones de perfusión del órgano, incluyendo tampón Krebs-Henseleit, normalmente contienen glucosa como sustrato de energía primaria.

  1. Compruebe el nivel de glucosa (por ejemplo, con análisis de gases sanguíneos) a intervalos regulares durante la perfusión. Acuerdo con las tarifas de consumo, utilizando una glucosa de reemplazar la bomba de infusión estándar por dosis infusión o bolo arteriales continuadas, para mantener una concentración arterial de 6 – 8 mmol/L de glucosa durante la perfusión.
  2. Utilizando una bomba de infusión separada, entregar 2 U/h de insulina a la solución durante la perfusión, cambiando la tasa de infusión de insulina según los objetivos del estudio.
  3. Para la estimulación de receptores β-adrenérgicos del corazón, entregar 0.08 μg/minuto de epinefrina a la solución con una bomba de infusión estándar y continuar a lo largo de la perfusión. Alternativamente, puede utilizarse una infusión de 4 μg/min de dobutamina.

7.-antimicrobiano y antiinflamatorios agentes

  1. Añadir un antibiótico de amplio espectro (e.g. 3,375 gramos de piperacilina-tazobactam) a la solución en el inicio de la perfusión.
  2. Añadir a agentes antiinflamatorios (por ejemplo 500 mg de metilprednisolona) a la solución de conformidad con los objetivos del estudio, si es necesario.

8. evaluación de la función

Nota: ESHP controlar software automáticamente calcula y registra índices de estado estable hemodinámicos y funcionales cada diez segundos.

  1. Evaluación de la función sistólica y diastólica de estado estacionario
    1. Para la evaluación y registro de los datos de estado estacionario, a través del introductor colocado en la arteria subclavia, colocar un catéter de espiral lleno de líquido en el ventrículo izquierdo (LV) en la modalidad de trabajo.
      1. Lave el catéter pigtail con solución salina y colocar la guía en su interior.
      2. Suavemente inserte el catéter de la cánula de vaina, previamente colocada en la arteria subclavia. Tan pronto como pasa a través de la válvula Ao, remueva el alambre guía lentamente y conectar el catéter cola de cochino a la línea de presión del LV.
      3. Seguir la onda de presión de LV en el monitor. La porción diastólica de la onda de presión llegará a cero cuando el catéter ha colocado correctamente dentro del VI. De nota, este paso sólo es posible en el modo de trabajo ya que la válvula Ao debe abrir normalmente para que el catéter pigtail poder entrar en la cámara. Una vez que el catéter flexible se coloca en LV y conectado a transductor de presión del LV, se grabará automáticamente la tarifa máxima y mínima de LV del cambio de presión (dP/dT min y dP/dT max).
    2. Determinar el rendimiento miocardio por indexación el caudal medido en la línea de LA masa del corazón (mL·min-1·g-1), a una presión constante dada de LA (6-8 mmHg) y una presión diastólica de Ao de 40 mm Hg y una frecuencia cardíaca de 100 beats·min-1. La presión de LA iguala el gasto cardíaco, suponiendo que no hay ninguna escasez de Ao. Examinar la forma de onda de presión de Ao para asegurar que no hay ninguna escasez de Ao.
  2. Evaluación del trabajo de movimiento recruitable precarga (PRSW)
    Nota: PRSW es la relación lineal entre el volumen telediastólico y trabajo de movimiento del LV (LVSW) y representa un índice para la evaluación de la función ventricular, independiente de la precarga, la poscarga y el tamaño del ventrículo18,19. PRSW puede medirse con este sistema de manera no invasiva como se describe a continuación13.
    1. Retire el catéter cola de cochino de el LV, ya que el catéter puede inducir arritmias durante el análisis PRSW que afectarán negativamente a la precisión de los resultados.
    2. En la Página principal, en la sección "Captura de PVL", ajustar la velocidad deseada de la caída en LA velocidad de la bomba durante el análisis (típicamente 100-200 RPM) y desea tiempo durante el cual el análisis llevará a cabo (típicamente 10-12 s) (figura 4).
    3. Después de realizar los ajustes mencionados anteriormente, haga clic en "Registro de PVL". El software de salida automáticamente el modo de trabajo y reducir gradualmente LA bomba RPM mientras se graban simultáneamente LVSW y LA presión. En la conclusión de la recolección de datos, el software desempeñará regresión lineal sobre el conjunto de datos recién adquirido para producir PRSW. Después de que el software ESHP ha completado el análisis, aparecerá un mensaje en la Página principal, que muestra el coeficiente de correlación de los análisis. Pulse "OK" si el coeficiente de (valor r) es deseable (típicamente > 0,95). Se registrarán los resultados del análisis PRSW.
    4. Después de realizar el análisis, para volver a la perfusión en el modo de trabajo, haga clic en "Pulse para iniciar el modo de trabajo;" de lo contrario el software continuará en modo de Langendorff (no trabajo). El botón gris que se convertirá en verde lo que indica un retorno al modo de trabajo. Si se repite el análisis PRSW es necesario, antes de cada nuevo intento garantizar que los valores de presión y flujo de LA vuelta a los anteriores valores de estado estacionario.

9. metabólico evaluación de Ex Situ perfusión corazón

  1. Evaluar el estado metabólico del corazón y la solución durante ESHP, usando la información obtenida a partir del análisis del gas de sangre de las muestras de solución recogida de Ao (arterial) y líneas (venosas) PA cada 1 – 2 h.
  2. Realizar gasometría arterial (cada 1 – 2 h) para controlar el gas y el estado iónico de la solución. Ajustar la composición del gas (O2 y CO2) y barrido de velocidad para mantener un pH de 7.35-7.45 y paO2 de 100-150 mmHg paCO2 de 35 – 45 mmHg. Ajustar y mantener la concentración iónica de la solución de potasio y calcio en el rango fisiológico durante la perfusión (por ejemplo, por adición de cloruro de calcio si es necesario).
  3. Utilizar la información obtenida en la gasometría arterial y el flujo de sangre coronaria para calcular parámetros metabólicos. Por ejemplo, calcular el consumo miocárdico de oxígeno (MVO2) y LV eficiencia mecánica (EM) como sigue:
    1. Determinar el MVO2 (mL O2 · min-1 · 100 g-1) multiplicando el flujo de sangre coronaria (CBF) por la diferencia arterial y venosa en el contenido de oxígeno (CaO2 – CvO2).
      MVO2 = [CaO2 - CvO2 (mL O2 · 100 mL-1)] × CBF (mL. min-1 . 100 g masa del corazón), donde;
      Contenido de oxígeno arterial (CaO2) = [1.34 (mL O2 . g Hb-1) × saturación de oxígeno de Hb concentración (g · 100 mL-1) × (%)] + [0.00289 (mL O2 · mm Hg-1 · 100 mL-1) × PaO2 (mmHg)]
      Contenido en oxígeno venoso (CvO2) = [(mL O2 · g Hb-1) 1.34 x saturación de oxígeno de Hb concentración (g · 100 mL-1) × (%)] + [0.00289 (mL O2 · mm Hg-1 · 100 mL-1) × (mm Hg) PvO2 ]
    2. Calcular el rendimiento mecánico del LV (yo) como sigue:
      ME = LVSW (J. beat-1) / MVO2 (J. beat-1) donde
      Movimiento de trabajo = {media presión arterial (mmHg) - LA presión (mmHg)} × {LA flujo (mL. min-1) / frecuencia cardíaca (latidos. min-1)} × 0.0001334 (J. mL-1 . mmHg-1), y
      MVO2 (J. beat-1) = {MVO2 (mL. min-1) / frecuencia cardíaca (latidos. min-1)} × 20 (julios. mL-1)

10. quitar el corazón de ESHP aparatos al final de la perfusión

  1. Salir del modo de trabajo. Traer la bomba de LA RPM cero.
  2. Disminuir la bomba Ao RPM a cero.
  3. Quite la coleta y vainas.
  4. Quitar rápidamente todos los accesorios para el corazón.
  5. Pesar el corazón vacío para determinar el grado de formación del edema miocardio.
  6. Rápidamente tomar muestras de tejido del tamaño adecuado de los ventrículos izquierdos y derecho y Coloque gel de corte óptimo temperatura (OCT), formalina o snap les congelar en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras para futuras investigaciones (OCT y muestras congeladas en un congelador de-80 ° C, las muestras almacenados en formol en un recipiente bien cerrado a temperatura ambiente).
  7. Cerrar el programa; se guardarán todos los datos registrados.
  8. Deseche el tejido restante, sangre, materiales bioactivos y componentes de aparatos usados ESHP según protocolos institucionales.
  9. Limpiar el carro ESHP usando una superficie dura sanitizante limpiador (p. ej. etanol al 70%).

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Representative Results

Al inicio de la perfusión (en modo de no trabajo), el corazón reanudará normalmente un ritmo sinusal cuando la temperatura del sistema y la solución acerca a normotermia. Al entrar en el modo de trabajo, como las presiones de LA se aproximan a los valores deseados, debe observarse la eyección en el trazo de la presión de la Ao y el flujo de LA (un reflejo del gasto cardiaco) debe aumentar gradualmente. En un modelo de cerdo Yorkshire (35-50 kg) y un peso inicial de corazón de 180 a 220 gramos, el flujo inicial de LA ~ 2.000 mL/min, y típicamente esto se acercará ~ 2.750 mL/min durante la primera hora de la perfusión en el modo de trabajo. Figura 7 muestra las tendencias de presión Ao (A), así como LA y flujo arterial pulmonar (B) más de 12 h de perfusión.

Durante ESHP en el modo de funcionamiento fisiológico, diversas evaluaciones metabólicas del corazón también son posibles. Evaluaciones de análisis metabólico del gas de sangre en las muestras de solución obtenidas durante ESHP proporcionan amplia información sobre el estado metabólico del corazón en el tiempo (tablas 1 y 2) y (figura 8A, B)20 . Además de gasometría arterial, muestras de solución pueden ser recogidas y evaluadas diferentes biomarcadores tales como péptido natriurético cerebral y troponina-I; sin embargo, debe señalarse que ESHP ocurre en un sistema cerrado, sin intercambio de solución solución. En ausencia de los órganos que metabolizan/claro naturalmente estos factores (por ejemplo, riñones), la acumulación de biomarcadores en el tiempo en la solución de la solución por lo general se observa (figura 9).

Evaluación funcional del corazón mediante esta plataforma puede incluir parámetros dependientes de la carga [incluida la performance miocárdica (índice cardiaco, CI), LVSW, máximas y mínimas tasas de cambio de presión (dp/dt max y min)] y () independiente de la carga de parámetros PRSW) (tabla 3). Figura 10 se muestra la evaluación de LV PRSW durante una reducción lineal controlado por ordenador por la presión de LA13. En nuestra experiencia con ESHP de > 200 corazones porcinos y > 10 corazones humanos, el uso de un programa de software automatizado de ESHP ha estado en asociación con el desarrollo de procedimientos normalizados de trabajo, dando por resultado la variabilidad mínima inter-intra-operador y en los parámetros funcionales. El sistema de aparatos y software ESHP aquí han sido diseñados para mantener la presión deseada y recoger los parámetros funcionales con mínima necesidad de ajustes manuales, y hemos observado un coeficiente de correlación interclase (ICC) ≥0. 9 para todos los evaluaron parámetros (e.g. LVSW y dP/dt max y min) que representa el excelente confiabilidad inter-calificador, intra-evaluador y test-retest. En este sistema, el monitoreo electrocardiográfico del corazón durante la perfusión también puede tener lugar mediante dos electrodos como se describe en el protocolo, proporcionando información sobre la frecuencia cardíaca y el ritmo durante la perfusión (figura 4).

La evaluación del corazón durante ESHP puede ampliarse a diferentes modalidades de imágenes. Ecocardiografía en ESHP puede proporcionar información adicional sobre la función miocárdica (fracción de eyección ventricularpor ejemplo ) y parámetros anatómicos (figura 11 y figura 12). Por otra parte, una evaluación de la vasculatura coronaria es posible con imágenes angiográficas21.

Realizando un análisis de regresión identifica qué parámetros mejor correlacionaron con el funcionamiento miocardio (índice cardiaco: mL·min1·g1) durante ESHP. Previamente demostramos que a pesar de la significativa variación en la capacidad de los parámetros funcionales medidos a predecir el rendimiento miocardio, parámetros generales, funcionales muestran una alta correlación con el gasto cardíaco. Los mejores predictores funcionales incluyen trabajo de movimiento sistólico [coeficiente de determinación (R2) = 0.759], función sistólica y mínima dP/dt, (R2 = 0.738) para la función diastólica. Curiosamente, parámetros metabólicos solo muestran una capacidad muy limitada para predecir el rendimiento miocardio (consumo de oxígeno: R2 = 0,28; la resistencia vascular coronaria: R2 = 0.20; concentración de lactato: R2 = 0.02). 13 la perfusión del corazón en un modo de trabajo normotérmico ofrece la oportunidad de obtener evaluaciones integrales de metabólicas y funcionales del corazón durante la preservación del órgano. Un dispositivo ESHP clínico con la capacidad para apoyar el corazón donante en modo de trabajo proporcionará el equipo de salud con la oportunidad de las decisiones hechas sobre viabilidad de órganos basados en datos objetivos antes del trasplante.

Figure 1
Figura 1: la membrana de soporte de silicona para el corazón. Membrana de soporte en la foto con cánula aórtica integrado (A), la cánula auricular izquierda (B) y cánula (C) de la arteria pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: circuito del ESHP. (A) Figura esquemática del circuito ESHP. (B) ESHP aparatos utilizados en nuestro medio. A = órgano cámara y silicona soporte membrana, B = depósito, C = filtro de línea arterial, D = bomba atrial izquierda, E = bomba aórtica, F = oxigenador de membrana e intercambiador de calor, G = mezclador de gas, H = sensor de flujo de tubo, I = sensor de presión, J = llave de paso/Luer-lock. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: grupos de las bombas mediante el posicionamiento de la salida de la bomba a un nivel superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: pantalla de captura del programa software ESHP mostrando parámetros funcionales cardiacos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: pantalla de tiro desde el programa inicializado ESHP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: la cánula auricular izquierda magnética fijada a la cara posterior de la aurícula izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: monitorización de presiones y flujos durante la perfusión de. (A) evolución de la presión aórtica durante 12 h de ESHP. (B) las tendencias en la aurícula izquierda y la arteria pulmonar fluye durante 12 h de ESHP haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: tendencias en el tiempo. Consumo de oxígeno miocárdico (A) y (B) venosa lactato concentración durante 12 h de ESHP haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: tendencias en el tiempo de solución concentración de troponina-I durante 12 h de ESHP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: evaluación de la carga movimiento recruitable trabajar un corazón mal funcionamiento (gris) versus un corazón funcionando bien (negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: imágenes ecocardiográficas bidimensionales representante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: imágenes ecocardiográficas modo representante M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetros (arteriales) aórticos Parámetros (venosos) PA
T1 T5 T11 T1 T5 T11
Valores de gases en sangre
pH 7.28 7,44 7.33 7.25 4.42 7: 30
pO2 (mmHg) 123.00 149.00 141.00 44.00 55.40 57.80
pCO2 (mmHg) 38.00 33.90 42.50 43.00 37.10 46,10
Valores de la oximetría
HB (g/dL) 4.20 4.10 3.90 4.20 4.10 3.90
Tan2 (%) 100.00 100.00 100.00 64.00 95.50 92.00
Valores de electrolitos
K+ (mmol/L) 4.20 4.60 5.20 4.20 4.60 5.20
Na+ (mmol/L) 142.00 144.00 149.00 142.00 144.00 149.00
CA2 + (mmol/L) 1.02 1.20 1.40 1.02 1.20 1.40
CL(mmol/L) 107.00 109.00 114.00 107.00 109.00 114.00
OSM (mmol/kg) 291.30 292.50 302.40 291.90 292.90 302.40
Valores de metabolito
Glucosa (mmol/L) 7.00 5.30 5.10 7.00 5.20 5.00
Lactato (mmol/L) 3.00 2.30 2.00 3.10 2.40 1.90
Estado Base ácido
Hco3(mmol/L) 17.60 23.10 21.90 18.50 23.70 22.40

Tabla 1: un caso de la gasometría arterial realizada durante la ex situ perfusión de corazón. CA2 +, ión de calcio; CL-, ion cloruro; HB, hemoglobina; HCO3-, ion bicarbonato; K+, ion potasio; Na+, en iones de sodio; OSM, osmolaridad; paCO2, la presión parcial arterial de dióxido de carbono; paO2, la presión parcial arterial de oxígeno; así que2, la saturación de oxígeno; T1, 1 h de ex situ perfusión (perfusión precoz); T5, 5 h de ex situ perfusión (perfusión media); T11, 11 h de ex situ perfusión (perfusión tardía)

hora
Parámetros metabólicos T1 T5 T11
MVO2 mL/min/100 g 6.68 2.44 1.77
Mmol/L de lactato venoso 3.1 2.4 1.9
Venosa - Arterial de lactato mmol/L de diferencia 0.1 0.1 -0,1
Utilización de la glucosa g/h 1.23 0.6 1.14

Tabla 2: parámetros metabólicos calculados usando los datos de análisis de gas de sangre. MVO2, consumo de oxígeno miocardio; T1, 1 h de ex situ perfusión (perfusión precoz); T5, 5 h de ex situ perfusión (perfusión media); T11, 11 h de ex situ perfusión (perfusión tardía)

hora
Parámetros funcionales T1 T5 T11
CI (mL/min/g) 10,26 9,66 7.50
SW (mmHg * mL) 2253 de 1965 1323
dP/dT máxima (mmHg/s) 1781 1783 1482
Sys p (mmHg) 128 121 91
ME (%) 6.69 16.85 21.68
PRSW 399 348.38 248.63
dP/dT min (mmHg/s) -1444 -2350 -844

Tabla 3: un caso de parámetros funcionales ventriculares izquierdos evaluada durante ex situ perfusión de corazón. IC: índice cardiaco; tasa máxima, máximo de dP/dT del cambio de presión; dP/dT min, mínima tasa de cambio de presión; ME, eficiencia mecánica; PRSW, trabajo de movimiento recruitable precarga; SW, trabajo de movimiento; Sys p, presión sistólica; T1, 1 h de ex situ perfusión (perfusión precoz); T5, 5 h de ex situ perfusión (perfusión media); T11, 11 h de ex situ perfusión (perfusión tardía).

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Discussion

La perfusión exitosa se define según los objetivos del estudio; sin embargo, esto debe incluir ESHP ininterrumpido para la cantidad deseada de tiempo y completa colección de los datos sobre la función cardiaca durante la perfusión. Para ello, deben seguirse unos pasos críticos en el protocolo.

El corazón es un órgano con altas concentraciones de oxígeno y demanda de energía, y minimizar el tiempo isquémico antes de la canulación y perfusión es un principio importante que debe seguirse. El proceso de contratación, el corazón de montaje sobre el aparato ESHP e iniciar perfusión no debe superar 20-30 min.

Para perfusión eficaz y fiable evaluación funcional, el proceso de montar el corazón en el aparato tiene importancia crítica. Correcta alineación anatómica de los grandes vasos desempeña un papel importante en este sentido. El corazón debe adquirirse con una longitud adecuada de PA y arco Ao ramas para que estos buques no se estiran cuando la cánula representativa. Desde el inicio de la perfusión, perfusión coronaria eficaz desempeña un papel fundamental en la protección del corazón durante ex situ de la perfusión. Después del comienzo de la perfusión en modo no operativo, la presión de la Ao debe ser monitoreada y ajustada en al menos 30 mmHg para apoyar la perfusión coronaria eficaz. La aparición de una solución desoxigenada oscuro en la línea de PA es un reflector del reestablecimiento del flujo coronario. Después de cambiar al modo de funcionamiento, la presión de la Ao debe ajustarse a 40 mmHg para proporcionar presión de perfusión coronaria adecuada para el centro de trabajo.

Es esencial para éxito ESHP deairing las cámaras y Ao. En el momento de colocar la cánula de LA, apretando las cámaras ayudarán en deairing el corazón. Cualquier aire que queda en el LV que es expulsado debe recircular a través de la línea de purga en la arteria innominada, que minimiza el riesgo de una embolia coronaria. Sin embargo, si aire substancial permanece en el corazón izquierdo a la hora de cambiar el modo de funcionamiento, embolia coronaria es posible llevando a una disminución significativa en la función del miocardio.

El objetivo del enfoque presentado es proporcionar una plataforma fiable y reproducible para estudios experimentales ESHP en modelos de mamíferos grandes. Este sistema brinda la oportunidad para perfusión en un modo de funcionamiento fisiológico y evaluación extensa del corazón perfundido. Esto proporciona una oportunidad para evaluar protocolos cardioprotector a resucitar disfuncional donantes de órganos. Este sistema facilita las evaluaciones simples y reproducibles de parámetros funcionales cardíacos junto con parámetros metabólicos durante ESHP, proporcionando datos objetivos que pueden utilizarse para identificar los órganos viables para trasplante. Una exhaustiva evaluación es de particular importancia cuando evaluar criterios extendidos donó corazones y corazones donados después de la muerte circulatoria. Por otra parte, según nuestras observaciones en el entorno de ESHP experimental, corazones perfundidos en un modo de trabajo pantalla superior preservación de la función sistólica y diastólica en el tiempo comparado con el corazón conservado en un modo de Langendorff y pueden ayudar a extender el seguro tiempo de conservación.

ESHP en un modo de trabajo es un método eficaz para preservar el corazón donado y evaluar su viabilidad, sin embargo, es un entorno artificial, que carece de muchos de los aspectos fisiológicos del cuerpo (por ejemplo, en tiempo real equilibrio y soporte nutricional y hormonal y radicales libres sistemas de depuración). El corazón es un órgano con demandas de energía sofisticado, metabólico. Por lo tanto, es críticamente importante apoyo consistente y eficiente metabólica del corazón inundada. Hemos observado una disminución en la función del ex situ perfundido corazón, particularmente durante la perfusión prolongada veces22. Tal disminución puede ser refleja de ineficiencia metabólica que afectan a la función del corazón inundada por el modo de trabajo. Más estudios están garantizados para caracterizar el óptimo apoyo metabólico para el corazón durante ESHP. Un desafío adicional es la complejidad de la perfusión del corazón de modo de trabajo. A pesar de la mayor sencillez de ESHP en este sistema, perfusión de modo de trabajo debe realizarse por personal capacitado.

El aparato ESHP con capacidad de realizar una evaluación integral funcional y metabólica de los corazones en un modelo de mamífero grande, ofrece gran potencial para desarrollar protocolos terapéuticos traslacionales para mejorar disfuncional/subóptima corazones donados . ESHP puede servir como una plataforma para administrar las intervenciones terapéuticas dirigidas a una amplia gama de condiciones (por ejemplo, isquemia por reperfusión) y evaluar sus efectos sobre los parámetros metabólicos y funcionales del corazón perfundido12. Por otra parte, el modo de trabajo ESHP puede facilitar la extensión del intervalo de preservación segura, que puede ayudar a superar las limitaciones geográficas de donación de órganos y facilitar la mejor asignación de los corazones donados.

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Disclosures

DH tiene patentes en ex situ tecnología de perfusión de órganos y los métodos. DH y JN son fundadores y principales accionistas de Tevosol, Inc.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la canadiense programa nacional de investigación de trasplante. SH es el receptor de una Facultad de medicina y odontología Motyl beca postgrado en Ciencias cardiacas. DH es un receptor de una subvención de proyectos de investigación colaborativa (CHRP) en ayuda de las Ciencias nacionales y Consejo de investigación de ingeniería e institutos canadienses de investigación en salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Debakey-Metzenbaum dissecting scissors Pilling 342202
MAYO dissecting scissors Pilling 460420
THUMB forceps Pilling 465165
Debakey straight vascular tissue forceps  Pilling 351808
CUSHING Gutschdressing forceps Pilling 466200
JOHNSON needle holder Pilling 510312
DERF needle holder Pilling 443120
Sternal saw Stryker 6207
Sternal retractor Pilling 341162
Vorse tubing clamp Pilling 351377
MORRIS ascending aorta clamp Pilling 353617
Surgical snare (tourniquet) set Medtronic CVR79013
2-0 SILK black 12" x 18" strands ETHICON A185H
3-0 PROLENE blue 18" PS-2 cutting ETHICON 8687H
Biomedicus pump drive (modified) Medtronic 540 Modified to allow remote electronic control of pump speed
Biomedicus pump Maquet BPX-80
Membrane oxigenator D 905 SORIN GROUP 50513
Tubing flow module   Transonic Ts410
PXL clamp-on flow sensor Transonic ME9PXL-BL37SF
TruWave pressure transducer Edwards VSYPX272
Intercept tubing 3/8" x 3/32" xX 6' Medtronic 3506
Intercept tubing 1/4" x 1/16" x 8' Medtronic 3108
Heated/Refrigerated Bath Circulator  Grant TX-150
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer Radiometer 989-963
DLP cardioplegia cannula (aortic root cannula) Medtronics 20613994495406
5F Ventriculr straight pigtail cathter CORDIS 534550S
5F AVANTI+ Sheath Introducer CORDIS 504605A
Emerald Amplatz Guidewire CORDIS 502571A
Dual chamber pace maker Medtronic 5388
Defibrilltor CodeMaster M1722B
Infusion pump Baxter AS50
Surgical electrocautery device Kls Martin ME411
Gas mixer SECHRIST 3500 CP-G
Medical oxygen tank praxair 2014408
Cabon dioxide tank praxair 5823115
Bovine serum albumin MP biomedicals 218057791

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References

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