Isolement des CD4+ T-cellules et analyse de circulation folliculaire T Helper (cTfh) des sous-ensembles de cellules de sang périphérique à l’aide 6-color Flow Cytometry

Biology

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Summary

Ici, un protocole pour l’isolement et la caractérisation des CD4+ T-cellule sous-ensembles de sang périphérique humain est décrite. Purifiée CD4+ T-cellules sont analysés par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des sous-ensembles de cellule auxiliaire T-folliculaire.

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Byford, E., Carr, M., Piñon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e58431, doi:10.3791/58431 (2019).

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Abstract

Aberrante activité folliculaire T des cellules d’assistance (Tfh) est détectable dans les maladies auto-immunes et leur présence est associée à des résultats cliniques lorsque le microenvironnement de ganglion lymphatique en cellules B lymphome non hodgkinien-est analysé. Sous-ensembles de circulation les cellules folliculaires-T helper (cTfh), le compartiment mémoire circulant de Tfh cellules dans le sang, sont également perturbées dans la maladie et représentent donc les potentiels nouveaux biomarqueurs prédictifs. Test basé sur sang périphérique est avantageuse car elle est relativement non invasive et permet la surveillance série simple. Cet article décrit une méthode pour isoler les CD4+ T-cellules de sang humain et une analyse plus approfondie par cytométrie en flux-énumérer les cellules cTfh et les proportions de leurs divers sous-ensembles (cTfhPD-1-/ + / hi, cTfh1, 2, 17 et cTfh1/17). Le niveau de ces sous-ensembles a ensuite été comparé entre les sujets normaux et de patients atteints de lymphome. Nous avons trouvé que la méthode était assez robuste pour obtenir des résultats fiables de matériel patient systématiquement recueilli. La technique nous décrivons pour l’analyse peut être facilement adaptée à la cellule de tri et d’applications en aval comme la RT-PCR.

Introduction

T-folliculaires cellules auxiliaires (Tfh) sont un CD4+ sous-ensemble de cellules T qui était initialement définie dans les tissus lymphoïdes1. Ces cellules expriment PD-1 et des récepteurs de surface CXCR5, sécrètent IL-21 et IL-4 et show nucléaire expression de BCL-62,3, le facteur de transcription. Comme leur nom l’indique, ils sont trouvent dans les centres germinatifs et sont essentielles pour haute affinité anticorps production1.

Les réponses de Dysregulated Tfh ont été impliqués dans la pathogenèse de la maladie, notamment une maladie auto-immune, où ils favorisent l’expansion des cellules de lymphocytes B4. Ils jouent également un rôle dans le microenvironnement tumoral de solide5,6 et cancers lymphoïdes7. À l’inverse, des anomalies génétiques, des protéines de surface indispensables pour Tfh fonctionnent comme résultat de costimulator (ICOS) T-cell inductible de syndromes d’immunodéficience humaine8. CD4+ CXCR5+ cellules dans le sang périphérique humain sont appelés lymphocytes auxiliaires T-folliculaire (cTfh) en circulation et sont censées être le compartiment de la mémoire des cellules Tfh en tissus9. Le but de la méthode décrite ici est l’analyse des sous-ensembles de cTfh suite CD4+ cellule d’isolement à partir d’échantillons de sang périphérique.

Plusieurs sous-ensembles cTfh ont été définis et l’efficacité avec laquelle ils fournissent aide de B-cellule diffère d’un sous-ensemble à un autre9,10,11,12. Les proportions relatives de ces sous-ensembles sont modifiées dans un certain nombre de maladies, la plupart en évidence une maladie auto-immune dans laquelle il est presque toujours une augmentation relative la plus fonctionnelle PD-1+ / Salut ou cTfh2 ou cTfh17 des sous-ensembles en comparaison avec le moins Functional PD-1 et/ou de sous-ensembles de cTfh112. L’ampleur de ces changements souvent associé avec des paramètres cliniques, y compris les titres de l’activité et les auto-anticorps maladie, indiquant un rôle potentiel de distribution sous-ensemble cTfh comme biomarqueur pronostique dans la maladie, qui pourrait refléter l’activité de Tfh dans les tissus lymphoïdes9,12,13,14. En outre, prélever des échantillons de sang des participants est rapide, sécuritaire et acceptable et donc permet série suivi pour l’analyse de la progression de la maladie ou la réponse au traitement.

L’utilisation de CD4 isolé+ T-cellules sur des suspensions de cellules mononucléées (PBMNC) traditionnels circulants permet à plus haut débit écoulement cytometry des expériences en réduisant le temps nécessaire pour acquérir un nombre substantiel de cellules cTfh pour analyse. C’est particulièrement utile lorsque le tri des cellules provenant de sous-ensembles cTfh rare qui utilise les flux activé la cellule triant (FACS). Pour l’efficacité de l’aide, ces suspensions peuvent être cryogénisées pour activer le « dosage » d’échantillons pour être utilisé dans l’expérience de cytométrie de flux. Sur les tests, les CD4+ pureté n’a pas été réduite par cryoconservation.

Alors que les différents marqueurs différents laboratoires utilisés pour classer les cellules cTfh dans les premiers stades de leur découverte, la méthode présentée ici utilise un schéma unifié de deux groupes de marqueurs de surface cellulaire tel que proposé par Schmidt et al.12, 15 pour permettre l’identification simultanée des cTfh et leurs sous-ensembles reconnus neuf dans un seul écoulement cytometry expérimenter.

Comme seuls marqueurs de surface de cellules sont utilisées, les cellules ne nécessitent pas de fixation ou la perméabilisation et peuvent ainsi rester en vifs pour des études fonctionnelles en aval. Cela pourrait être facilité par la cellule de tri à l’aide de FACS avec le même panneau d’anticorps. Ce panneau pourrait être élargi afin d’inclure d’autres marqueurs, permettant à des restrictions du cytomètre en flux utilisé.

L’analyse d’expériences de cytométrie en flux multi-color peut être difficile en raison de la nature intrinsèquement subjective de blocage sur des parcelles de dot 2-dimensionnel, surtout lorsque populations cellulaires n’ont pas une distribution bimodale clair en fluorescence de marqueur, comme c’est le Etui pour cTfh cellules et de leurs sous-ensembles. Pour cette raison, il est impératif de mettre en place des contrôles efficaces pour réduire les artefacts pour permettre la meilleure résolution des populations et pour définir le déclenchement des stratégies en toute confiance. Ainsi, les anticorps panneau conception et la mise en place de contrôles de base pour un écoulement cytometry experiment, c'est-à-dire, à l’aide de la compensation et FMO contrôles sont décrites à l’étape 3.4.2 et 3.4.3,respectively.

Toutes les cellules cTfh sont définis comme CD4+ CXCR5+ CD45RA. Le niveau d’expression du marqueur d’activation Tfh caractéristique PD-1 peut décider pour identifier les sous-ensembles de PD-1-, PD-1+ ou cellulesSalut cTfh PD-1. Puis, en utilisant une combinaison des récepteurs de chimiokine CXCR3 et CCR6, qui sont exprimés de façon traditionnelle Th1, 2 ou 17 cellules, cTfh peuvent être caractérisées comme cTfh1, 2 ou 17-like par un profil de CXCR3+ CCR6-, CXCR3CCR6- et CXCR3CCR6+, respectivement.

Le panneau des anticorps utilisé par notre laboratoire est affiché dans le tableau 1. L’utilisateur peut avoir à adapter leur sélection de fluorophore pour tenir compte pour le laser et la configuration de filtrage de la lumière disponible sur leur cytomètre de flux local.

Les considérations suivantes influent sur le choix des fluorophores. Utilisez des fluorophores lumineux lorsque c’est possible. En particulier, utilisez les plus brillants fluorophores disponibles sur les marqueurs plus sombre (moins fortement exprimés). Gradateurs marqueurs incluent PD-1, CXCR3 et CCR6 et dans une moindre mesure, CXCR5. Nous avons fait spécifiquement utiliser le nouveau BB, BV et BUV fluorophores qui offrent une luminosité et ainsi permettre une résolution plus facile des populations distinctes des cellules.

Étend la sélection de fluorophore sur les spectres d’émission autant que possibles réduire au minimum le chevauchement spectrale et donc le niveau de compensation nécessaire. Un outil gratuit et en ligne qui peut être utilisé pour aider à concevoir un panneau de cytométrie de flux peut être trouvé ici : http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Pour économiser l’espace sur le spectre d’émission, nous avons utilisé un « canal de décharge » en utilisant un colorant de la viabilité d’une longueur d’onde d’émission qui chevauche celui de APC-H7 (conjugué à CD45RA) afin de permettre la détection et exclusion des deux morts et/ou CD45RA+ en utilisant un détecteur unique.

Ici, un protocole est présenté pour l’isolation du sang périphérique CD4+ T-cellules et leur analyse ultérieure par cytométrie de flux pour déterminer les proportions des différents et récemment décrite sous-ensembles en circulation.

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Protocol

Des échantillons de sang ont été prélevés des sujets normaux (NS) (n = 12) ainsi que des patients atteints de lymphome (MZL) de la zone marginale (n = 7) et d’autres types de cellules B lymphome non hodgkinien-(BNHL) (FL 6 patients, 2 patients de lymphome lymphoplasmocytique et 1 bas grade B-cellule lymphome non-hodgkinien non précisés patient). Les patients ont été recrutés dans les cliniques d’hématologie à Leicester Royal Infirmary, après avoir donné a informé, le consentement écrit, avec l’approbation éthique mis en place pour toutes les études. Approbation éthique a été obtenue par le Leicestershire, Northamptonshire et Rutland recherche éthique comité 1 référence 06/Q2501/122 pour les échantillons de patients et de l’autorité HRA (Health Research Authority) NRES Comité East Midlands-Derby, référence 14/EM/1176 pour sujets normaux.

1. isolement des CD4+ lymphocytes du sang périphérique ensemble

  1. Prendre du sang périphérique (2 à 15 mL) en K les2tubes EDTA par ponction veineuse standard et processus dès que possible pour maintenir la viabilité maximale.
    Remarque : Utiliser l’équipement de protection individuelle standard de laboratoire (manteau, gants, lunettes) et réaliser les travaux dans une enceinte de sécurité biologique II de classe.
  2. Apporter le sang et tous les réactifs nécessaires (CD4+ enrichissement cocktail, 2 % fœtale bovine sérique/tamponné phosphate salin (FBS/PBS), média gradient de densité et congélation moyen si la cryoconservation des cellules) à température ambiante.
  3. Mélanger le sang avec un cocktail disponible dans le commerce des anticorps pour l’enrichissement des CD4 humain+ des cellules T. Utilisez 50 µL de réactif pour chaque 1 mL de sang. Utiliser un tube en polypropylène conique de 50 mL pour 5 à 15 mL de sang.
    Remarque : Si à l’aide de 2 à 4 mL de sang, effectuez cette étape dans un tube en polypropylène conique 14 mL.
  4. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.
  5. Diluer le mélange avec un volume égal de 2 % FBS/PBS
  6. Couche de ce mélange dilué sur le dessus de la média de gradient de densité lentement pour éviter de déranger l’interface et de procéder à une centrifugation immédiatement pour éviter la diffusion du sang dans le milieu de gradient de densité.
    1. Pour 2 à 3 mL de sang, utiliser 3 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène à fond conique 14 mL, mais 4 ml de sang, utiliser 4 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène conique 14 mL et de 5 à 15 mL de sang , utiliser 15 mL de milieu de gradient de densité dans un tube en polypropylène conique de 50 mL.
  7. Centrifuger le mélange de couches pendant 20 min à 1 200 g avec le frein au large à 20 ° C.
    Remarque : Une température inférieure à l’environnement peut entraîner la contamination par les globules rouges et des granulocytes. Une vitesse inférieure provoquera le CD4+ échec du processus d’isolement. Laissant la pause engagée diminuera le rendement cellulaire. Utiliser une centrifugeuse de paillasse albums avec rotors qui peuvent être fermés pour éviter les aérosols.
  8. Supprimer le CD4 enrichi+ couche de cellules à partir de l’interface à l’aide d’une pipette Pasteur.
    Remarque : La couche de cellules enrichi ressemblera à une norme « couche leuco-plaquettaire » des cellules nuageux blancs, mais comme seulement CD4+ les cellules sont présentes, ce sera naturellement plus petites et plus difficiles à voir.
  9. Ajouter 2 % FBS/PBS pour le CD4 des cellules jusqu'à un volume total de 10 mL et puis laver deux fois avec 2 %+ FBS/PBS par centrifugation pendant 10 min à 400 x g lors de chaque lavage.
  10. Resuspendre le culot dans 2 % FBS/PBS et comte les cellules colorent avec un colorant vital (le bleu trypan) pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité.
  11. Étape facultative : remettre en suspension de 5 x 105 à 1 x 106 cellules de congélation moyen (10 % diméthylsulfoxyde dans FBS) en aliquotes de 1 mL.
    Remarque : Niveaux de certains marqueurs de surface peuvent être modifiés par cryo-préservation et du dégel. Il est donc très important que tous les échantillons sont systématiquement traités. Afin de minimiser les différences dans les variables de l’analyses, les échantillons ont été cryoconservés et par lot pour analyse dans la présente étude.

2. cytométrie en flux

  1. Décongeler le CD4 cryoconservés+ cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C et lavage une fois dans préchauffé moyen (RPMI 1640 + L-glutamine, additionné de 10 % de SVF et 1 x pénicilline-streptomycine).
  2. Ajouter les cellules dans 9 mL de milieu, centrifuger pendant 5 min à 400 x g et éliminer le surnageant.
  3. Remettre en suspension les cellules de 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS (50 µL) afin que chaque condition à tester utilise entre 5 x 10,5 et 1 x 106 cellules.
  4. Mélanger les cellules avec du tampon de coloration (50 µL).
    Remarque : Tampon de tache brillante empêche divers artefacts de coloration qui peuvent interférer avec l’analyse des données, lorsque deux ou plusieurs taches de BV ou BUV sont utilisés en même temps en raison des propriétés chimiques intrinsèques de ces colorants. Dans des conditions simples ou non colorées, les 50 µL de tampon de tache brillante peut être substituée à 50 µL de 1 % BSA/PBS.
  5. Ajouter les anticorps aux cellules (selon le « volume utilisé » colonne dans le tableau 1) et incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 30 min.
  6. Laver les cellules deux fois chez 1 % BSA/PBS par centrifugation pendant 3 min à 600 x g lors de chaque lavage.
  7. Remettre en suspension dans 1 % BSA/PBS (400 µL) et transférez dans un tube d’acquisition de cytométrie de flux.
  8. Vortex les cellules doucement avant d’acquérir des données sur un cytomètre en flux :

3. régulateur de mise en place et les contrôles de la cytométrie en flux

  1. En utilisant un échantillon non coloré, définissez photodiode tensions afin que les lymphocytes se distingues des débris évident et les cellules mortes (événements avec zone de diffusion (SSC) côté haut et faible dispersion vers l’avant (FSC))16. À l’aide de simples échantillons colorés, régler photomultiplicateur (PMT) tensions afin que la fluorescence positive peut discerner de fluorescence de fond tout en s’assurant que tous les événements relèvent de l’échelle détectable.
    Remarque : Une amélioration consisterait à tracer CV contre les surtensions du PMT pour chaque PMT à l’aide de perles faiblement fluorescents pour trouver la tension minimale pour optimiser la résolution (la méthode « Peak 2 »19).
  2. Compte de chevauchement spectrale en générant une matrice de compensation à l’aide de simples taches avec des perles de capture. Ajouter les perles de l’indemnisation disponible dans le commerce (60 µL) et billes de contrôle négatif (60 µL) à 1 % BSA/PBS (100 µL) et vortex.
    Remarque : Les perles de capture utilisés doivent correspondre à l’espèce hôte et IgG isotype de l’anticorps utilisé. La matrice de la compensation devrait être recalculée si le numéro de lot de n’importe quel tandem colorants changements, car ils peuvent afficher une variabilité considérable dans leurs spectres d’émission entre les lots.
  3. Ajouter un seul anticorps (20 µL) et vortex.
  4. Incuber dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.
  5. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
  6. Resuspendre dans 1%BSA/PBS (500 µL) et vortex.
  7. Acquérir l’échantillon avec un cytomètre en flux à l’aide du générateur de matrice de rémunération désigné dans le logiciel d’acquisition selon les instructions du fabricant.
  8. Utiliser les contrôles FMO pour guider le placement des portes pour fluorescence marqueur positif tenir compte des déversements de colorant, qui est la principale source de fluorescence de fond dans les expériences à l’aide de ≥ 4 couleurs16. Suivez la coloration de surface cellulaire générale du protocole tel que décrit à l’étape 3, mais pour chaque condition, omettre l' un des fluorophores de l’étape de coloration (où CD45RA est omis, également omettre la tache de vivre/morts). 100 000 lymphocytes pour chaque condition de l’acquisition.
  9. Définir la positivité porte à ≤0. 5 % des cellules. Voir la Figure 2 pour obtenir un exemple illustré des contrôles de la FMO.

4. analyse des données

  1. Employer le logiciel d’acquisition du cytomètre définir un seuil de 5 000 unités sur le paramètre FSC d’exclure les débris de très petite taille.
  2. Utiliser une grille d’arrêt en vue d’acquérir 10 000 cellules cTfh (CD4+ CD45RA CXCR5+).
    Remarque : L’utilisateur individuel peut recueillir plus de 10 000 cellules. Ce nombre était un compromis entre la collecte suffisamment de cellules pour fournir des résultats significatifs et le temps nécessaire à la collection.
  3. À l’aide d’une superficie de FSC / parcelle de SSC-zone de dot, dessinez une ellipse ou polygone porte pour sélectionner la population de lymphocytes, tout en excluant les débris et ouvertement la mort des cellules (événements avec un SSC-région haute et basse FSC-zone).
  4. À l’aide d’une superficie de FSC / parcelle de FSC-largeur dot, dessiner un polygone gate pour sélectionner des cellules individuelles tout en excluant les doublets (les doublets ont une superficie accrue mais largeur semblable aux cellules individuelles).
  5. À l’aide d’une superficie de FSC / marqueur CD45RA et viabilité point intrigue, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner direct, CD45RA (cellules avec une fluorescence faible pour ce marqueur).
  6. À l’aide d’une superficie de FSC / CD4 point intrigue, dessiner une porte rectangulaire pour sélectionner CD4+ (cellules avec une fluorescence élevée de ce marqueur).
  7. En utilisant un CD4 / CXCR5 point tracé, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner CXCR5+ (c.-à-d. cTfh) des cellules (cellules avec une fluorescence élevée de ce marqueur).
  8. À l’aide d’un CXCR3 / CCR6 terrain de dot, placez une quadruple gate à subdiviser les cellules cTfh cTfh1, 2 et 17 (cellules qui sont hautes et basses pour chaque marqueur).
    Remarque : Les cellules avec le phénotype CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ sont mal caractérisé. Nous appelons ces cellules cTfh1/1718 parce que les cellules T helper classique (CD4+ CXCR5) qui sont en transition entre l’expression voir la Th17 et Th1 de CXCR3 et CCR6 et ont été décrits comme cTfh1/1719.
  9. À l’aide d’un histogramme de PD-1, utilisez l’outil de la gamme pour subdiviser les cellules cTfh (ou si l'on préfère, les cTfh1 individuels, sous-ensembles 2, 17 ou 1/17) en PD-1-/ + ou le Salut des populations.
    Remarque : La distinction entre PD-1+ et PD-1Salut n’est pas bien définie dans la littérature. Le seuil a été fixé comme la même intensité de PD-1, nécessaire pour la détection des và © ritable Tfh dans des suspensions de lymphocyte humain amygdale utilisant l’écoulement cytometry avec le même panneau d’anticorps. Alternativement, un marqueur d’ICOS peut être ajouté du panel d’anticorps, comme seules PD1Salut cellules sont ICOS+.

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Representative Results

CD4 élevé+ pureté a été réalisée en utilisant le CD4+ protocole d’isolement, qui était fiable dans l’ensemble de tous les échantillons de sang testé par nos soins (signifie : 96,6 %, SD : 2.38, n = 31) (Figure 3).

Identification du cTfh (CD4+ CXCR5+ cellules) chez un sujet normal représentatif est présenté (Figure 4A). La proportion de cellules CD4 cTfh total+ les cellules ont une valeur médiane de 29,4 % (intervalle interquartile (IQR) = 10,8) dans l’ensemble de 12 sujets normaux. De nombreuses études à travers plusieurs maladies différentes dont hepatocellular carcinoma17,20, lupus systémique érythémateux11,21et polyarthrite rhumatoïde11,14 ont été contradictoires dans la capacité à détecter une différence globale cTfh entre témoins heathy et patients. Aucune différence significative ne trouvées dans cTfh globale entre sujets normaux et de patients (Figure 4B) MZL ou BNHL21.

Identification de PD-1 expression dans les cellules d’un sujet normal représentatif et patient BNHL pour comparaison cTfh est montrée dans la Figure 5A. PD-1 expression était significativement plus élevée chez les patients MZL et BNHL que des sujets normaux (Figure 5B)21. PD-1 expression des augmentations semblables ont été démontrées dans plusieurs maladies auto-immunes11,12,13,14.

Identification de cTfh1, 2, 17 et 1/17 au sein de la population de cellules cTfh avec CXCR3 et CCR6 l’expression d’un sujet normal représentatif est montré dans la Figure 6A. La proportion de cellules cTfh1 était significativement plus élevée chez les patients MZL et BNHL que des sujets normaux (Figure 6B)21.

Figure 1
Figure 1 : Illustration de la stratégie globale de blocage utilisé pour identifier les cellules cTfh et leurs sous-ensembles. Du haut à gauche, on distingue une population de lymphocytes, et les doublets sont exclus. Vivre CD45RA cellules sont sélectionnées à l’aide d’un « canal de décharge ». CD4+ cellules sont bloquées et CXCR5+ cellules sont identifiées comme cTfh. cTfh sont divisés en cTfh1, 2 ou 17-like avec CXCR3 et CCR6 l’expression. PD-1 expression au sein de ces sous-ensembles se distingue ensuite. Chiffres tirés d’un échantillon de sang représentant sujet normal. FSC-A, zone de FSC ; Zone de SSC SSC-A ; FSC-W, largeur FSC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Contrôle d’illustration de la FMO. Chaque parcelle de cytométrie de flux biaxial montre CD4+ cellules colorées avec des fluorophores tous sauf celui de l’intérêt de montrer le minimum à laquelle gates pour positivité de fluorescence peut être définie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Diagrammes de cytométrie de flux biaxial montrant l’identification des CD4 + cellules Après blocage pour vivre lymphocytes. Prélevée sur un échantillon de sang représentant sujet normal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Identification des cellules cTfh. Diagrammes de cytométrie de flux Biaxial (A) montrant CXCR5+ expression gated pour CD4 des cellules+ CD45RA. Prise d’un sujet normal représentatif. (B) les pourcentages relatifs de cTfh dans CD4 total+ cellules chez des sujets normaux (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Lignes horizontales représentent la médiane, et les barres d’erreur représentent intervalle interquartile. Aucune des différences significatives entre les groupes pratiquant le test U de Mann-Whitney. Ce chiffre a été modifié par Byford Al21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : PD-1 expression et relation avec les cellules cTfh. (A) écoulement cytometry histogramme permet de déterminer le PD-1 expression dans les cellules cTfh total. Tirée d’un sujet normal représentatif et patient BNHL. (B) PD-1+ cellules en proportion du total cTfh cellules. Lignes horizontales représentent la médiane, et les barres d’erreur représentent intervalle interquartile. Médianes sont significativement (test U de Mann-Whitney) différents entre les sujets normaux (21,5 %, IIQ = 10,8, n = 12) et lymphome patients (MZL 54,1 %, IQR = 21.2, n = 7, p = 0,0008 et BNHL 45,2 %, IQR = 11,4, n = 9, p = 0,0003). Ce chiffre a été modifié par Byford Al21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Expression CXCR3 et CCR6 et leur relation avec les numéros de cTfh1. Parcelle de cytométrie en flux Biaxial (A) montrant l’expression de CXCR3 et CCR6 sur les CD4+ CD45RA CXCR5+ cellules. Tirée d’un sujet normal représentatif et patient BNHL. (B) les cellules de cTfh1 en pourcentage du total cTfh cellules. Lignes horizontales représentent la médiane, et les barres d’erreur représentent intervalle interquartile. Médianes sont significativement (test U de Mann-Whitney) différents entre les sujets normaux (20,8 %, IQR = 6,7, n = 12) et lymphome patients (MZL 32,1 %, IIQ = 6,8, n = 7, p = 0,013 et BNHL 35,4 %, IQR = 7,6 %, n = 9, p = 0,0056). Ce chiffre a été modifié par Byford Al21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table 1
Tableau 1 : panneau de Flow cytometry anticorps.

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Discussion

Ce protocole représente un moyen simple et efficace pour analyser les cellules du sang périphérique cTfh, permettant la détection de tous les sous-ensembles pertinentes identifiées jusqu'à présent dans la littérature. Des échantillons de sang peuvent procurer facilement et efficacement comme partie du standards cliniques ambulatoires et des échantillons de la série peut être collecté en parallèle avec les données cliniques. À son tour, cela permet des études prospectives évaluant cTfh sous-ensembles comme biomarqueurs pour la progression de la maladie ou la réponse au traitement. Ces études seraient particulièrement justifiées dans les maladies où les Tfh dysrégulation est impliquée dans la pathogenèse comme auto-immunité et certains types de cancers solides et hématologiques. En outre, les changements dans la fonction cTfh dans la maladie puissent être examinés par un tri de cellules cTfh utilisant l’écoulement cytometry comme seuls marqueurs de surface cellulaire sont utilisés dans le présent protocole. Tri cTfh cellules chez les patients MZL nous a permis de trouver des différences dans les gènes des profils d’expression par rapport aux sujets normaux21.

Nous avons trouvé ça efficaces CD4+ isolement de cellules T amélioré l’analyse des données. Nous décrivons les étapes en détail parce que des problèmes mineurs tels que la centrifugeuse de freinage et de vitesse ont été essentiels à la technique d’isolation. Une autre étape importante, en ce qui concerne toutes les analyse en cytométrie en flux, est de définir la rémunération et les contrôles de la FMO.

PD-1 expression varie sur cTfh les cellules et les cellules avec le PD-1 plus haut pourraient être la plus fonctionnelle et par conséquent pertinentes, en particulier pour l’étude des maladies auto-immunes11,12. Une question importante a été de décider la porte pour l’identification des PD-1Salut cellules, le sous-ensemble cTfh activés, car il n’y a aucune limite standard définie dans la littérature. Ce sous-ensemble important mais mineur reflète probablement active Tfh différenciation dans le tissu lymphoïde,11. Pour relever ce défi, le seuil a été fixé telle qu’elle était la même que celle nécessaire à la détection des cellules Tfh véritable de l’amygdale humaine avec le même panneau d’anticorps. Nous reconnaissons que l’obtention des amygdales pourrait être problématique pour certains utilisateurs. Une alternative, serait d’élargir le Comité de l’anticorps utilisé dans le présent protocole, par l’ajout de l’anti-ICOS, comme seules PD-1Salut cellules sont ICOS+ 12.

Nous présentons ici un panel d’anticorps pour détecter des marqueurs de surface caractéristiques consistant à diffuser les CD4+ T-cellules. Cellules régulatrices T-folliculaires circulantes (cTfr) sont le compartiment mémoire de sang des cellules régulatrices T-folliculaire (ISF) qui résident dans les tissus lymphoïdes et jouer un rôle important dans la régulation du centre germinatif réaction22,23 . cTfr sont sang CD4+ CXCR5+ cellules que marqueurs de cellules T régulateurs express co dont le facteur de transcription FoxP3. Mesure cTfr aux côtés de cTfh peut fournir une image plus complète de l’activité dans le centre germinatif et pourrait présenter un biomarqueur dans la maladie dans sa propre droite24. Bien que cTfr numéros sont intrinsèquement faibles (moyenne : 1,82 %, SD : 1.40, n = 24 de CD4 total+ cellules dans nos propres expériences), sépare cTfr cTfh augmenterait aussi la spécificité de l’analyse cTfh. Ajout d’une combinaison de marqueurs de surface cellulaire T régulateurs spécifiques à notre panneau comme CD25 et CD12725 permettrait la détection de cTfr en plus de tous les sous-ensembles de cTfh dans la même expérience en utilisant un protocole très similaire. Alternativement, le marqueur de régulation intracellulaire FoxP3 plus classique pourrait être utilisé, même si cela nécessite la fixation et la perméabilisation empêchant les essais fonctionnels en aval. En se concentrant sur l’analyse cTfh, cependant, il y a aussi des avantages à définir un panneau minimal qui peut être utilisé en conjonction avec un cytomètre en flux standard de laboratoire pour obtenir cliniquement ou résultats expérimentalement utiles.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le travail a été soutenu par une subvention de leucémie UK ETB et MJA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES 15062
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 BD Horizon 565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 BD Horizon 563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 BD Horizon 562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4 BD Horizon 564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 BD Pharmingen 557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100 BD Pharmingen 560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific L34973
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD CompBead 552843
FACS Aria II Flow Cytometer BD Biosciences 644832
FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 643629 Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2 Treestar Inc. Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody BD Horizon  565223
Anti-CCR6 antibody BD Horizon  563923
Anti-CXCR5 antibody BD Horizon  562747
Anti-CD4 antibody BD Horizon  564419
Anti-PD-1 antibody BD Pharmingen  557946
Anti-CD45RA antibody BD Pharmingen  560674
Viability Marker ThermoFisher Scientific  L34973

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References

  1. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34, (1), 335-368 (2016).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325, (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
  3. Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192, (11), 1545-1552 (2000).
  4. Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206, (3), 561-576 (2009).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39, (4), 782-795 (2013).
  6. Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123, (7), 2873-2892 (2013).
  7. Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26, (5), 1053-1063 (2012).
  8. Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177, (7), 4927-4932 (2006).
  9. Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34, (1), 108-121 (2011).
  10. Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39, (4), 758-769 (2013).
  11. He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39, (4), 770-781 (2013).
  12. Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35, (9), 436-442 (2014).
  13. Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62, (1), 234-244 (2010).
  14. Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174, (2), 212-220 (2013).
  15. Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
  16. Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69, (9), 1037-1042 (2006).
  17. Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10, (2), 0117458 (2015).
  18. Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13, (1), 0190468 (2018).
  19. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  20. Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6, (42), 44239-44253 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24, (9), 909-917 (2015).
  22. Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14, (2), 152-161 (2013).
  23. Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124, (12), 5191-5204 (2014).
  24. Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12, (2), 163-171 (2015).
  25. Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35, (6), 1773-1780 (2012).

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