Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

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Summary

Qui presentiamo un protocollo per separare solubilizzate thylakoid complessi mediante elettroforesi in Gel verde nativo. Gel verde bande successivamente sono caratterizzati da tempo correlato Single Photon Counting (TCSPC) e vengono forniti i passaggi base per l'analisi dei dati.

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Schwarz, E., Blanchard, G. Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting. J. Vis. Exp. (144), e58470, doi:10.3791/58470 (2019).

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Abstract

Le reazioni di luce di fotosintesi sono effettuate da una serie di complessi proteici pigmentati nelle membrane tilacoidali. La stechiometria e l'organizzazione di questi complessi è altamente dinamico su sia in lungo che in breve tempo scale a causa di processi che si adattano fotosintesi al mutare delle condizioni ambientali (cioè, non-fotochimica tempra, transizioni di stato e la risposta a lungo termine). Storicamente, questi processi sono stati descritti spettroscopicamente in termini di cambiamenti in fluorescenza della clorofilla, e spettroscopia rimane un metodo fondamentale per il monitoraggio di parametri fotosintetici. Ci sono un numero limitato di modi in cui possono essere visualizzate le sottostanti dinamiche complesse della proteina. Qui descriviamo un metodo semplice e veloce per la separazione ad alta risoluzione e visualizzazione di thylakoid complessi, elettroforesi del gel verde nativo. Questo metodo è accoppiato con correlati nel tempo singolo fotone conteggio per la dettagliata caratterizzazione delle proprietà di fluorescenza clorofilla di bande separate sul gel verde.

Introduction

Gli organismi fotosintetici devono regolare costantemente la loro fisiologia alle mutevoli condizioni ambientali, per massimizzare la loro produttività e competere con successo con i vicini1. Questo è particolarmente vero per il macchinario responsabile per le reazioni di luce della fotosintesi, come luce ambientale condizioni possono fluttuare da tre ordini di grandezza tra ombre e pieno sole. Inoltre, fattori ambientali, come siccità, freddo o lo stress da calore possono ridurre la disponibilità di anidride carbonica per la fissazione del carbonio, che è il lavandino elettrone naturale per i prodotti delle reazioni luce. Piante devono, pertanto, raccolto e utilizzano la radiazione solare nel modo più efficiente possibile pur mantenendo la capacità di dissipare l'eccesso di energia luce necessaria. Mentre danno photooxidative persiste ordinariamente sotto tutte le condizioni di luce2,3, l'incapacità di gestire energia di eccitazione assorbita correttamente può portare a danni catastrofici delle cellule e la morte. Parecchi meccanismi adattivi esistono che permettono l'apparato fotosintetico essere sintonizzato sia cambiamenti nelle condizioni ambientali prevalenti e a fluttuazioni transitoria (cioè, più brevi e lunghi periodi di tempo)4. Questi includono la risposta a lungo termine (LTR) e non-fotochimica tempra (NPQ). NPQ è di per sé considerato a comprendere almeno tre altri fenomeni di componente, incluse le transizioni di stato (qT) ed energia rapidamente viscoelastica tempra (qE) fotoinibizione (qI)5.

Questi processi sono stati originariamente osservati e definiti in gran parte in termini di fenomeni spettroscopici [ad es., NPQ si riferisce a una goccia in fluorescenza clorofilla osservati (estinzione della fluorescenza della clorofilla) che non è dovuto ad un aumento del tasso di fotochimica]6. Il termine "transizioni di stato" si riferisce allo stesso modo al cambiamento osservato nella relativa quantità di fluorescenza da PSI e PSII7. Mentre le tecniche spettroscopiche che hanno reso possibile la enumerazione di questi fenomeni [in particolare, ampiezza di impulso modulata spettroscopia di fluorescenza (PAM)] e continuano ad essere uno strumento fondamentale per l'osservazione e la dissezione di processi fotosintetici in vivo, un ottimo affare di biochimica è richiesto per delucidare i meccanismi alla base di queste osservazioni spettroscopiche. Le transizioni di stato, per esempio, prevede un ciclo di fosforilazione/defosforilazione delle proteine LHCII dal STN7 chinasi e fosfatasi TAP38/PPH1, rispettivamente8,9,10. Questo ciclo di regola la distribuzione fisica dell'antenna LHCII tra due fotosistema spostando una parte dei trimeri LHCII da PSII PSI, modificando in tal modo l'assorbimento sezione trasversale del fotosistema11,12. Il componente qE di NPQ converte rapidamente energia di eccitazione in eccesso in calore attraverso le azioni del ciclo epossidazione/de-epossidazione violaxantina/zeaxantina e la proteina PsbS. Il ruolo esatto di PsbS in questo processo è ancora non pienamente compreso13. Il componente di qI di NPQ, fotoinibizione, è generalmente attribuito a danneggiare la proteina D1 del PSII. Restauro di competenza piena fotosintetico richiede un processo di riparazione elaborati per fissare danneggiato PSII photocenters. Il ciclo di riparazione PSII comporta la migrazione dei complessi PSII fuori il granal pile, smantellamento dei complessi, sostituzione di proteine danneggiate D1, rimontaggio dei complessi PSII e movimento dei complessi PSII nuovamente dentro il pile granal14. L'esatta natura di fotoinibizione e PSII photodamage rimane un argomento di esame accurato intenso15.

La difficoltà nello studio di fenomeni come stato transizioni o riparazione PSII deriva in parte dal fatto che c'è un modo semplice per visualizzare la meccanica dei sistemi biochimici complessi. Il classico approccio biochimico per comprendere un processo consiste nel separare prima suoi componenti in modo che essi possono essere caratterizzati in isolamento. Elettroforesi del gel nativo è sorto da iniziative di successo nel 1980 per separare e caratterizzano i complessi di fotosistema dalle membrane tilacoidali con più metodi preparativa (vale a dire la centrifugazione in gradiente di saccarosio e la cromatografia)16. I detergenti sistemi sviluppati per solubilizzare delicatamente i complessi nativi dalle membrane tilacoidali presto sono stati adattati ai metodi di separazione elettroforetica, in particolare da Allen e Staehelin17 ed e Peter e Thornber18, dando luogo a Natale verde gel elettroforesi. Mentre che rappresentano solo uno di una varietà di tecniche nell'arsenale sperimentale, PAGE nativo ha un numero di caratteristiche che lo hanno reso un metodo ampiamente impiegato nella ricerca di fotosintesi. PAGINA nativo è relativamente veloce e semplice, che richiede attrezzature poco specializzata, fornendo contemporaneamente separazione di alta risoluzione di un gran numero di complessi thylakoid. Questo rende la pagina nativa un comodo strumento per studiare thylakoid dinamica e, quando combinato con pagina standard nella seconda dimensione, nonché una varietà di sistemi tampone e detergente, un sistema versatile per trovare e caratterizzare nuovi thylakoid complessi.

Detto questo, gel verde nativo hanno avuto la reputazione di essere una tecnica inaffidabile, soprattutto in mani inesperte, in quanto è facile produrre scarsi risultati composto da gel fuzzy, untuosa con poche bande. Questo problema è stato risolto, in parte, con l'introduzione del blu-natale pagina19. L'uso della tintura di coommassie nel sistema di buffer BN rende la separazione delle proteine più robusto. Di conseguenza, BN-PAGE è spesso una tecnica più semplice e affidabile per un novizio relativa impostare e separazioni di alta risoluzione di thylakoid complessi in grado di fornire. Per questi motivi, BN-PAGE è diventato il metodo di scelta per la maggior parte del lavoro di questo campo. BN-PAGE è generalmente più lento per l'esecuzione di elettroforesi del gel di colore verde, il suo principale svantaggio è che la colorazione di tintura coommassie interferisce con l'identificazione delle fasce deboli contenenti clorofilla, rendendo anche a valle spettroscopiche caratterizzazione problematico.

Le informazioni biochimiche fornite da gel nativo e SDS-PAGE 2D può essere notevolmente rafforzata quando combinati con dati di tecniche spettroscopiche. Indipendentemente dal sistema impiegato, un problema centrale con l'utilizzo di gel nativo per identificare complessi è che l'identificazione può sempre essere impugnata (cioè, le proteine trovate in una band potrebbe sempre rappresentare comigrating complessi o componenti, piuttosto di un unico complesso fisiologicamente autentico). Caratterizzazione spettroscopica fornisce informazioni biofisiche i pigmenti in bande di gel verde e può essere utilizzato per determinare quali tipi di complessi sono propensi a contenere. Fluorescenza della clorofilla è particolarmente utile a questo proposito a causa della spesso drammaticamente differenti spettri e durate di fluorescenza che sono caratteristici dei complessi pigmento-proteici fotosintetici differenti. Mentre gli spettri di fluorescenza di semplice allo steady-state 77K sono stati storicamente utili nel confermare l'identità dei complessi di Natale del gel, moderno correlati nel tempo singolo fotone conteggio (TCSPC) è in grado di fornire molte più informazioni. TCSPC permette non solo la caratterizzazione di complessi basati sulla durata di fluorescenza, ma rende anche possibile la descrizione dettagliata del trasferimento di energia tra componenti spettrali all'interno di un complesso. Questo tipo di caratterizzazione sta diventando sempre più necessario come l'uso di varie creme di sistemi di Natale del gel e vengono scoperti nuovi presunti complessi, permettendo l'identificazione di complessi proteici di meglio essere autenticati e offrire nuovi biofisiche informazioni sul funzionano di questi complessi.

In questo articolo forniamo un metodo che permette a coloro che hanno poca o nessuna esperienza con elettroforesi nativa per ottenere alta qualità risoluzione dei nativi thylakoid complessi allo scopo di indagare i meccanismi delle reazioni di luce fotosintesi. Questa tecnica di base può poi essere aumentata a discrezione dello sperimentatore di migliorare i risultati o estendere l'applicabilità di altre specie. Quindi si descrive il processo per il soggetto bande di gel verde nativo di TCSPC, come pure alcuni passaggi per analisi di base e la presentazione dei dati forniti dalla tecnica. L'accoppiamento di elettroforesi nativa con analisi TCSPC estende l'utilità di questi sistemi di gel fornendo l'autenticazione e la caratterizzazione biofisica dei complessi della proteina all'interno delle fasce. Il sistema gel verde qui descritto si basa su che sviluppato da Allen e Staehelin17 con alcune modifiche ed è lo stesso di quello utilizzato in Schwarz et al. 20. questo sistema è uno dei tanti, ma ha caratteristiche specifiche che sono utili per questa metodologia. È abbastanza veloce in modo che thylakoid isolamento, elettroforesi del gel e l'analisi TCSPC conveniente può essere eseguite in un solo giorno, prevenendo potenziali problemi di conservazione dei campioni e la degradazione. Troviamo anche che questo metodo è robusto nelle mani di utenti inesperti, pur fornendo risultati che vanno dal buono al superiore, a seconda del grado di ottimizzazione.

È importante da tenere a mente che i complessi visualizzati su un gel nativo dipendono da sistemi tampone sia il detergente utilizzati, nonché sulla biologia dell'organismo in esame. Diversi sistemi tampone e detergente preferenzialmente separano diversi tipi di complessi, e un dato organismo fotosintetico avrà diversi complessi da altri organismi, dei quali non tutti saranno presenti sotto qualsiasi circostanza. Il sistema qui descritto è particolarmente adatto allo studio del PSI megacomplexes, come descritto in Schwarz et al. 20, ma cade sull'estremità più destabilizzante dello spettro per coloro che studiano PSII megacomplexes. Per uno studio completo dei vari sistemi tampone e detergente utilizzato nel Natale del gel elettroforesi delle proteine tilacoide, si consiglia di rivedere Järvi et al. 21 e Rantala et al. 22.

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Protocol

1. magazzino soluzioni preparazione per colata gel verde nativo

  1. Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per la risoluzione di gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 8.3.
  2. Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per stacking gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 6,3.
  3. Memorizzare i buffer a 4 ° C per prevenire la crescita di muffa.
    Nota: I buffer sono stabili per mesi a 4 ° C, quindi è consigliato preparazione di 100-200 mL di ogni buffer per uso continuato.
  4. Preparare 1 L di 10 x in esecuzione tampone contenente 250 mM Tris-HCl pH 8.3, glicina 1,92 M e 1% SDS. Memorizzare le 10 x tampone di corsa sul banco.

2. soluzione preparazione per isolamento e solubilizzazione dei tilacoidi

  1. Preparare 100 mL di tampone di omogeneizzazione di TMK contenente tampone Tris 50 mM (pH 7), 10 mM MgCl2e 10 mM KCl e conservare a 4 ° C.
    Nota: Questo è il buffer principale per omogeneizzazione e manipolano campioni thylakoid. In alternativa, soluzioni concentrate stock possono essere preparate e diluite come necessario (tampone Tris, MgCl2e KCl può tutti essere facilmente memorizzati sul banco come si concentra 1m).
  2. Preparare soluzioni di riserva del thylakoid detergenti solubilizzazione, B-decyl maltoside (DM) e n-ottile B-d-glucoside (OG), sciogliendo ogni detersivo nel buffer di TMK al 20% w / v. congelare a-20 ° C in aliquote di 1 mL.
  3. Preparare il tampone di solubilizzazione di thylakoid (SB), che è anche il buffer di caricamento del campione.
    1. In primo luogo, buffer di marca TMK-glicerolo combinando 7 ml di buffer di TMK e 3 ml di glicerolo.
    2. A 800 μL di tampone di TMK-glicerolo, aggiungere 100 μL di soluzione di riserva di DM e 100 μL di soluzione di riserva di OG. Conservare la soluzione di lavoro di SB, contenente 2% DM e 2% OG, congelati a-20 ° C in aliquote di 1 mL.
      Nota: Ciascuna aliquota può essere scongelato e ricongelato se necessario.

3. colata gel Mini verde per un uso successivo

  1. Preparare separata di accatastamento e di risoluzione dei gel di soluzioni in provette monouso da 15 mL.
    Nota: I volumi sono forniti sufficienti per un singolo mini gel mediante distanziali di piastra di 1,5 mm.
    1. Per la soluzione di gel di impilamento, unire 1,25 mL di 4 x 3,25 mL di acqua per dare 5 mL di acrilammide 4% in tampone di impilamento 1x buffer gel d'impilamento e 0,5 mL di soluzione di riserva di 40% acrilammide (39: 1 C). Per fare il gel di risoluzione soluzione unire 1,875 mL di 4 x risolvere buffer, 0,94 mL della soluzione di riserva di 40% acrilammide (39: 1 C) e 4,7 mL di acqua per dare 7,5 mL di 5% di acrilammide in 1x tampone di risoluzione.
  2. Versare il gel di risoluzione.
    1. Aggiungere 50 μL di 10% ammonio persolfato (APS) per la soluzione di gel di risoluzione, quindi aggiungere 10 μL di TEMED, richiudere la provetta e capovolgere delicatamente più volte per mescolare. Versare immediatamente la soluzione di gel tra le piastre di gel, lasciando circa 1 cm tra la parte superiore del gel di risoluzione e inferiore dei denti pettine per il gel d'impilamento.
    2. Pipettare delicatamente etanolo al 100% sulla parte superiore del gel di risoluzione a livello il gel.
      Nota: Se il gel non imposta entro 15 min, soluzione APS fresca dovrebbe essere fatta e/o nuove TEMED dovrebbe essere usato.
    3. Dopo il gel ha polimerizzato (l'interfaccia tra il gel e l'etanolo sarà facilmente visibile e non si muove quando il gel è una mancia), versare l'etanolo e tamponare con carta assorbente.
  3. Versare il gel d'impilamento.
    1. Aggiungere 25 μL di 10% APS per la soluzione di gel di impilamento, aggiungere 5 µ l di TEMED, poi tappo e capovolgere per mescolare nello stesso modo come il gel di risoluzione. Versare la soluzione di gel sulla parte superiore del gel di risoluzione fino a riempita completamente lo spazio tra le piastre e inserire un pettine 10 pozzetti.
      Nota: Quando è pronto per essere utilizzato, togliere il pettine dal gel e lavare i pozzetti con acqua, assicurandosi che i pozzetti siano dritto e senza ostacoli dal gel. Il gel possa essere memorizzato con il pettine in posto a 4 ° C per almeno alcuni giorni.

4. isolamento delle membrane tilacoidali grezzo da spinaci foglie

Nota: Tutti i passaggi dovrebbero essere effettuati sul ghiaccio con buffer e attrezzature pre-refrigerate. Illuminazione soffusa è anche raccomandato. A seconda della discrezione dello sperimentatore e i processi biologici sotto studio, inibitori della proteasi e/o fosfatasi dovrebbero aggiungersi fresco ai buffer di TMK prima di omogeneizzazione.

  1. Omogeneizzare completamente di foglie di spinaci nel buffer di TMK con un vetro lisata omogeneizzatore.
    Nota: Circa 1-2 mL di tampone è normalmente sufficiente per una foglia di spinaci del bambino piccolo. Una foglia di spinaci singolo baby generalmente è in grado di fornire materiale sufficiente per caricare diversi pozzi su un gel di mini 1,5 mm.
  2. Filtrare l'omogenato di greggio foglia per rimuovere i residui insolubili.
    1. Per fare un semplice dispositivo di filtraggio, tagliata un compito delicato pulire nella metà e piegarlo in quarti. Imballare il wipe delicato compito nella parte inferiore di una siringa monouso da 5 mL e pre-bagnato il wipe con buffer di TMK.
    2. Utilizzare lo stantuffo della siringa per premere un tampone in eccesso fuori il panno delicato compito ed essere sicuri che il filtro di wipe è premuto saldamente sul fondo della siringa dopo lo stantuffo viene rimosso.
    3. Pipettare l'omogenato di foglia sul centro del filtro pulire e usare lo stantuffo per passare l'omogenato attraverso il filtro. Raccogliere l'omogenato filtrato in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
  3. Centrifugare l'omogeneizzato a 5.000 x g per 10 min a 4° C a pellet materiale insolubile, tra cui membrane tilacoidali. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone TMK.
  4. Normalizzare la quantità di clorofilla in ciascun campione regolando il volume di ogni campione di sedimento thylakoid affinché ogni campione contiene la stessa quantità totale di clorofilla, come descritto di seguito.
    Nota: Questo permetterà di ogni campione essere solubilizzato nello stesso volume di detersivo e riduce al minimo la variabilità nella solubilizzazione a causa delle differenze nel volume della pallina.
    1. Per estrarre la clorofilla da ogni campione di membrane tilacoidali sedimento, prendere un 50 μL aliquota in una microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 950 μL di metanolo ad esso. Richiudere la provetta e miscelare capovolgendo più volte.
    2. Centrifugare l'Estratto del metanolo/clorofilla a 10.000 x g per 10 min a pellet proteine precipitate.
    3. Determinare la concentrazione di clorofilla del pigmento contenente surnatante secondo Porra et al. 23. prendere le letture di assorbanza a 652 a 665 nm utilizzando uno spettrofotometro e una cuvetta di 1 cm. Calcolare la concentrazione di clorofilla totale mediante l'equazione seguente:
      CHLS un + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)
    4. Utilizzando misure di concentrazione di clorofilla come guida, rimuovere e scartare qualche volume di ogni campione, come necessario, affinché ogni provetta contiene la stessa quantità totale di clorofilla.
  5. Ri-pellet membrane tilacoidali mediante centrifugazione a 5.000 x g per 10 min. rimuovere e gettare il supernatante. Fare attenzione a rimuovere il surnatante tutti senza aspirare qualsiasi del pellet.

5. solubilizzazione delle membrane tilacoidali per il caricamento gel nativo

  1. Scongelare un'aliquota della soluzione detergente TMK 30% glicerolo (SB) e mescolare capovolgendo. Tenerlo su ghiaccio.
  2. Dissolva la pallina thylakoid aggiungendo il volume appropriato di SB in modo da ottenere una concentrazione di clorofilla di 1 mg/mL.
    Nota: Questa concentrazione è un punto di partenza per trovare le condizioni ottimali di solubilizzazione, che devono essere determinate empiricamente. La concentrazione di clorofilla deve essere mantenuta lo stesso tra i campioni per consentire raffronti validi.
  3. Pipettare su e giù ripetutamente mentre facendo attenzione ad evitare la formazione di schiuma del campione. Tenere sul ghiaccio per consentire thylakoid campioni di solubilizzare.
    Nota: Solubilizzare per almeno 10 minuti. Solubilizzazione tempo dovrebbe essere abbastanza a lungo che la differenza nel tempo di solubilizzazione tra campioni è ridotto al minimo.
    Esempio: Se solubilizzare tutti i campioni sono necessari 3 minuti, circa 30 minuti dovrebbe essere consentiti per solubilizzazione.
  4. Centrifugare solubilizzate tilacoidi a 10.000 x g a 4 ° C a pellet materiale insolubile.
    Nota: Solubilizzato thylakoid campioni sono stabili sul ghiaccio per ore, ma la conservazione a-70 ° C dovrebbe essere evitata, come cicli di gelo-disgelo possono comportare una perdita di megacomplex band.

6. separazione delle proteine solubilizzate Thylakoid mediante elettroforesi nativa

  1. Caricare il surnatante thylakoid solubilizzate preparata al punto 5.4, direttamente sul gel nativo, preparato in precedenza. Per un gel di 1,5 mm, carico 15 μL di thylakoid solubilizzate per pozzetto.
  2. Esegua il gel verde nativo essenzialmente allo stesso modo come gel di SDS-PAGE utilizzando 1x tampone di corsa. Esegua il gel a 100 V e appoggiate il serbatoio intero gel su ghiaccio bagnato per tutta la durata dell'esecuzione per mitigare il riscaldamento resistivo del gel.
    Nota: Il gel dovrebbe richiedere circa 2 ore per il pigmento libero nella parte anteriore di migrazione per raggiungere il fondo del gel (Figura 1).

7. l'asportazione delle fasce Thylakoid complesso dai nativi gel verde

Nota: Asportare la banda specifica di interesse dal gel è necessario consentire la band per essere inserito nel percorso del fascio e per prevenire randagio fluorescenza da complessi vicini da essere raccolti.

  1. Rimuovere il gel dalla cella di elettroforesi e risciacquo tampone fuori le piastre di gel di corsa con acqua distillata. Rimuovere la piastra superiore dal gel e risciacquare il gel con acqua distillata.
  2. Mantenere il gel sulla lastra di vetro di fondo e mettere il gel e la piastra sul ghiaccio. Quando non in uso, tenere il gel al buio e coprire con una pellicola trasparente per evitare che si secchino.
  3. Con il gel rimanente sulla lastra di vetro, asportare ogni banda di interesse quando si è pronti per l'analisi TCSPC. Accise bande in modo pulito con un bisturi affilato o una lama di rasoio e si prendono cura che la band asportata non contiene nessun materiale contaminante della band.

8. raccolta di spettri di fluorescenza Steady-State di temperatura ambiente

  1. Per ogni complesso che sarà analizzato da TCSPC, uno spettro di fluorescenza di temperatura ambiente è preso tra 600 e 800 nm utilizzando uno spettrometro di fluorescenza.
    Nota: La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata per raccogliere questo spettro deve corrispondere alla lunghezza d'onda utilizzata per TCSPC.

9. TCSPC di bande di Gel verde

Nota: Fare riferimento alla Figura 2 per una raffigurazione del setup TCSPC.

  1. La fetta di gel tra due vetrini microscopia a sandwich. Utilizzare nastro adesivo, posizionato su ciascuna estremità di una delle diapositive microscopia e piegato più volte, per creare distanziali in modo che le diapositive possono essere tenute insieme saldamente senza comprimere la fetta di gel.
    Nota: Questo creerà un percorso per il raggio laser passare tra i vetrini da microscopio e attraverso la fetta di gel.
  2. Aggiungere una piccola quantità di acqua per la fetta di gel al bordo delle diapositive di vetro per creare un'interfaccia liscia che ridurrà la dispersione del segnale.
  3. Morsetto del gel/diapositiva a sandwich nel percorso ottico affinché il fascio colpisce la fetta di gel attraverso il bordo aperto delle piastre, che consente l'emissione di fluorescenza essere attraverso il lato le diapositive di vetro in cui il gel è intramezzato, perpendicolare al percorso ottico.
    Nota: La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata dipenderà l'esperimento. Una lunghezza d'onda di 435 nm ecciterà sia clorofilla a e clorofilla b, mentre 465 nm ecciterà preferenzialmente clorofilla b. In questo caso, 435 nm è stato usato come la lunghezza d'onda di eccitazione.
  4. Raccogliere 10.000 punti di totale dati a intervalli regolari in tutto lo spettro di emissione di fluorescenza per ogni complesso. Ad esempio, raccogliere dati ogni 10 nm, a partire a 680 nm e fino a 750 nm.
    Nota: Preparare più bande di gel per ogni complesso essere studiato in modo tale campione fresco è disponibile nel caso in cui photobleaching impedisce il segnale sia sufficientemente collection.

10. TCSPC (analisi dati)

  1. Per un dato complesso, prima di normalizzare l'altezza del picco di ogni curva di decadimento per tutte le lunghezze d'onda raccolti.
    Nota: Questo passaggio non è necessario per la costruzione di DAS ma consente per le curve di decadimento essere sovrapposti e confrontati tra loro visivamente come una prima ispezione dei dati.
  2. Coda-partita ogni curva di decadimento per lo spettro di fluorescenza di stato stazionario del complesso come descritto di seguito.
    1. Scegliere un timepoint dopo che il segnale di decadimento ha appiattito, solitamente dopo pochi nanosecondi.
    2. Per ogni lunghezza d'onda, normalizzare la curva di decadimento in modo che l'intensità di segnale al timepoint selezionato è uguale al valore dello spettro di fluorescenza di stato stazionario a quella lunghezza d'onda (cioè, i valori di tutte le lunghezze d'onda insieme al timepoint selezionato verrà ricreare lo spettro di fluorescenza di stato stazionario).
  3. Costruire il decadimento-associ spettri (DAS) le curve di decadimento di coda-abbinato, come descritto di seguito.
    1. Usando dati punti dalle curve di decadimento di coda-abbinato costruiscono una serie di trame rappresentare graficamente l'intensità di fluorescenza vs lunghezza d'onda a intervalli di tempo regolari (per esempio, ogni 10 ps). Ad esempio, il DAS al 50 ps riportando il valore di ogni curva di decadimento al 50 ps vs lunghezza d'onda.
    2. Sovrapposizione di tutti gli spettri di decadimento-associati per creare una trama di stile cascata che mostra il deperimento dello spettro di fluorescenza nel corso del tempo.

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Representative Results

Risultati rappresentativi per elettroforesi del gel di colore verde sono presentati nella Figura 1. Lane 1 fornisce un esempio di risultati ideali per elettroforesi del gel verde di spinaci tilacoidi, in cui è visibile un numero massimo di bande verdi chiare e nitide. Questi risultati sono un po' atipici, in parte perché non tutte le bande vista nel vicolo 1 sono normalmente presenti in un dato campione. Pulitura di esempio aggiuntivi, sotto forma di isolamento cloroplasto prima thylakoid solubilizzazione e gradient gel electrophoresis (4-7% di acrilammide) inoltre sono normalmente necessari per ottenere risultati ottimali. 2 corsie e 3 presenti più tipici risultati ottenuti utilizzando il protocollo dettagliato qui in combinazione con un gel di pendenza non del 5%. Corsie, 4, 5 e 6 forniscono un esempio di scarsi risultati a causa della crescente gradi di sotto-solubilizzazione del campione thylakoid. Corsia 7 fornisce un esempio dei risultati tipici realizzati con Arabidopsis tilacoidi invece di spinaci. Notare che per Arabidopsis le bande di megacomplex nella parte superiore del gel tendono ad essere mal risolti rispetto a quelli negli spinaci.

Una rappresentazione grafica dell'installazione TCSPC utilizzato per la raccolta dati da bande di gel verde nativo è illustrata nella Figura 2. La figura 3 Mostra un tipico flusso di lavoro per analisi di inizio dopo TCSPC dati sono stati raccolti come descritto nel passaggio 10. Quando vengono raccolti dati TCSPC, ogni curva di una determinata lunghezza d'onda rappresenta un numero arbitrario di punti dati, o "conta". Quando queste curve si sovrappongono uno con l'altro, come mostrato in Figura 3A, le curve non possono rispetto uno con l'altro direttamente perché non sono rappresentati alla stessa scala e possono essere non tutti registrati per lo stesso punto di tempo iniziale. Il primo passo nell'analisi dei dati è pertanto confrontare ogni curva alla sua funzione di risposta dello strumento corrispondente (IRF). Il picco dell'IRF per una determinata curva è impostato al tempo t = 0, e il bordo della curva di decadimento fluorescenza corrispondente è impostato su si sovrappongono all'avanguardia dell'IRF, come mostrato nella Figura 3B. Questo imposterà tutte le curve al tempo stesso registro per un'analisi successiva.

Mentre non è necessario per la costruzione di DAS, normalizzare tutte le curve alla stessa altezza di picco a questo punto permette un utile confronto tra curve per essere fatto come una prima analisi dei dati. Nella Figura 3, le stesse curve di decadimento per LHCII presentato in Figura 3A sono mostrate dopo la registrazione del tempo, come in Figura 3Be la normalizzazione di altezza del picco. Come si vede in Figura 3D, curve di decadimento picco-normalizzati da diversi complessi possono essere sovrapposti quindi uno con l'altro a una determinata lunghezza d'onda, permettendo che le differenze di comportamento tra i complessi possano essere visualizzati. Ad esempio, LHCII ha una fluorescenza tipicamente longeva che decade lentamente, mentre fluorescenza PSI è fortemente placata, decadente molto rapidamente. La curva di decadimento fluorescenza Band 5 fornisce un interessante esempio di dati molto suggestivi, in parte perché è chiaramente bifasico. La curva di decadimento fluorescenza iniziale per la Band 5 complesso segue lo stesso tasso PSI per circa 500 ps ancora decade ancora più rapidamente in seguito. Intrigante risultati di questo tipo possono essere analizzato in dettaglio da costruire spettri di decadimento-collegata (DAS).

Nella Figura 4, diagrammi a cascata DAS rappresentativi sono indicati per LHCII e la Band 5 complessi. Costruzione di DAS richiede innanzitutto che le curve di decadimento per un dato complesso coda-corrispondere allo spettro di fluorescenza di temperatura per il complesso, come descritto al punto 11.2. I risultati della coda di corrispondenza di curve di decadimento per LHCII sono mostrati in Figura 4A. DAS quindi sono costruiti da queste curve come descritto al punto 11.3. DAS per LHCII sono stati costruiti dalle curve di decadimento mostrate nella Figura 4A e i risultati sono presentati in Figura 4B. DAS tra 0 e 100 ps sono stati omessi per chiarezza e solo presentato ogni 100 ps da allora in poi a causa del decadimento tipicamente lento per LHCII isolato. Il DAS per LHCII è notevole per la mancanza di funzionalità dinamiche, e la forma dello spettro di fluorescenza LHCII rimane lo stesso come il decadimento del segnale nel tempo. Inoltre viene ritardato il deperimento dello spettro di fluorescenza, che richiedono 100 ps per raggiungere la massima fluorescenza. Ciò suggerisce, come ci si aspetterebbe per isolato luce raccolta complessi della proteina, che l'energia non viene trasferito tra pigmenti energicamente distinte all'interno del complesso come il decadimento della fluorescenza. L'eccezione a questa è lo spostamento nello spettro che si verificano durante i primi 100 ps, presumibilmente dovuto la ridistribuzione iniziale di energia di eccitazione in tutto il complesso.

DAS per la Band 5 complessi sono mostrati in Figura 4, costruito in modo simile a quello riportato per LHCII. Band 5 fornisce un contrasto istruttivo per LHCII in diversi modi. Rispetto al LHCII, fluorescenza da Band 5 decade molto più rapidamente, raggiungendo la massima intensità in soli 30 ps e decadente a meno del 20% dell'intensità iniziale dopo 500 ps. Lo spettro di fluorescenza del 5 Band complesso espone anche una serie di interessanti dinamiche come i decadimenti di emissione. Confrontando gli spettri a 0 e 60 ps mostra chiaramente un aumento nella fluorescenza a 720 nm a scapito della fluorescenza a 680 e 710 nm. Da allora in poi, il picco a 680 nm si sposta verso 690 nm e amplia, mentre il picco a 720 nm sposta indietro verso 710 nm (ad es., confrontare 60 ps 500 CV). Dati di questo tipo consentono di escludere la presenza di estranei LHCII antenna proteine fornendo prove per il trasferimento di energia dal LHCII all'antenna PSI e alla fine il nucleo PSI.

Queste dinamiche suggeriscono anche che ci sono probabilità di avere picchi di irrisolti circa 680 nm, 690 nm, 710 nm e 720 nm. Questi dati forniscono pertanto un esempio dove caratteristiche spettrali potrebbero essere meglio risolto raccogliendo i dati di TCSPC a intervalli più vicini (ad esempio ogni 5 nm, piuttosto che ogni 10 nm). Anche in assenza di più alta risoluzione spettrale, tuttavia, il DAS per la Band 5 complessi è un esempio di prova per il trasferimento di energia tra le specie più fluorescenti all'interno di un complesso. Sembra che ci sia anche essere a picco rapidamente decadente di 740 nm, suggerendo che i dati dovrebbero essere raccolti anche su uno spettro più ampio per includere ulteriori caratteristiche spettrali.

Figure 1
Figura 1: risultati di gel verde rappresentante. Gel verde bande sottoposti ad analisi TCSPC sono etichettati PSI-LHCII (fotosistema ho LHCII megacomplexes), PSI (fotosistema I LHCI), Band 5 (PSI-LHCII complesso), PSII-LHCII (fotosistema II e associati luce-raccolta complesso II), PSII (fotosistema II core complessi) e LHCII (luce-raccolta complesso II). Lane 1 Mostra un disegno a strisce ideale derivanti dall'isolamento del cloroplasto prima di solubilizzazione e verde gel elettroforesi su un gel di pendenza di acrilammide 4-7%. Corsie 2 e 3 mostrano risultati medi da thylakoid semplice isolamento ed elettroforesi su un gel di acrilammide 5% non-gradiente. Corsie 4-6 mostrano crescente gravità del sotto-solubilizzazione. Corsia 7 sono risultati rappresentativi di Arabidopsis utilizzando il protocollo semplice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: schematico di correlati nel tempo singolo fotone Conteggio strumento. Sorgente di luce è un laser a4 NdYVO passivamente mode-locking che pompa un laser a coloranti dumping cavità. impulsi di 5-ps a tassi di ripetizione variabile e lunghezze d'onda sono caratterizzati utilizzando un'autocorrelazione. Gli impulsi sono divisi, con una porzione andando a un fotodiodo di riferimento e il resto emozionante il campione. Emissione del campione viene raccolto tramite un obiettivo del microscopio, e componenti polarizzati vengono rilevati utilizzando due canali di rilevazione. Emissione del campione è ora risolto utilizzando l'elettronica di rilevamento indicato, dove CFD = discriminatore frazione costante, TAC = MCA e convertitore di tempo-a-ampiezza = analizzatore multicanale. Risoluzione di tempo è determinata dalla funzione di risposta dello strumento (ca. 40 ps). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: dati TCSPC crudi rappresentativi e fluorescenza normalizzata decadimento curve. (A) sovrapposizione di dati grezzi di TCSPC per LHCII. TCSPC dati sono stati raccolti ogni 10 nm tra 670 nm e visualizzando curva rappresentativa di 740 nm (B) A registrazione dei dati di fluorescenza per la funzione di risposta dello strumento (IRF). (C) i dati LHCII da (A) normalizzato ad un'altezza di picco massimo di 1 dopo tutte le curve sono state registrate a loro rispettivi IRFs. (D) sovrapposizione di decadimento della fluorescenza delle curve a 680 nm per PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII e banda 5. Tutte le curve di decadimento sono state normalizzate ad un'altezza di picco massimo di 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: costruzione di stile cascata DAS. (A) coda di corrispondenza delle curve di decadimento per LHCII in preparazione per la costruzione di DAS trame. (B) DAS terreni in LHCII per tempo t = 0, per ogni 100 ps da 100 a 500 ps e alle 1000 PS. (C) DAS Plot per Band 5 ogni 30 ps da t = 0 a 210 CV e ogni 100 ps da allora in poi a 500 ps. Per entrambi (B) e (C), tempo = 0 è definita da IRF, ovvero 40 PS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un successo thylakoid solubilizzazione e Natale gel eseguire comporterà la risoluzione di più distinte bande verde visibile sul gel senza distorsione significativa o sbavature delle bande. Sovraccaricare il gel, un'alta concentrazione di detersivo, un pH di esempio errato, non disciolto materiale, correre il gel troppo rapidamente o ad una temperatura troppo elevata, e un gel indebitamente versato sono tutti fattori che possono contribuire alla mal risolto thylakoid complessi. Ottimizzando le condizioni del gel stesso (ad es., concentrazioni di gradienti di acrilamide), può aiutare a massimizzare la risoluzione delle bande di interesse. È la nostra esperienza che condizioni di solubilizzazione e la biologia del materiale campione stesso sono i più importanti fattori che contribuiscono alla qualità e alla quantità di complessi thylakoid risolto il gel verde nativo. È importante ricordare che non tutti i complessi sarà presenti in tutte le condizioni biologiche.

Gel verde nativo sono versati essenzialmente allo stesso modo come normale gel di SDS-PAGE mini. Gel può essere versato al mattino e sono pronti per l'uso più tardi lo stesso giorno, o possono essere conservati a 4 ° C per diversi giorni con il pettine nel gel e nessun cambiamento significativo nelle prestazioni. Soluzioni di acrilammide standard, prontamente disponibili 39: 1 C possono essere utilizzati per versare entrambi i gel di impilamento e risolutivo. Cosiddetto "grande poro" gel può essere fatta utilizzando acrylamide:bis superiore-rapporti di acrilamide (ad es., 100: 1 C) al fine di aumentare la separazione di megacomplexes nella parte superiore del gel, ma noi trovare che questo inoltre tende a provocare meno acutamente risolto bande. Nella nostra esperienza, la massima risoluzione di banda (con il maggior numero di bande separate) si ottiene il rapporto più basso di C e con una pendenza di concentrazione di acrilammide lineari di 5-7%. Tuttavia, se una sfumatura ex non è disponibile, separazione di banda molto soddisfacente e risoluzione ottenibile con una concentrazione di gel di risoluzione di circa il 5% dell'acrilamide. È importante che elettroforesi effettuate alla tensione relativamente bassa per ridurre il riscaldamento del gel, che potrebbe denaturare i complessi, e per consentire nativi complessi separare uno da altro con l'alta risoluzione.

Il metodo per l'isolamento di thylakoid dato qui è rapido ma relativamente "sporca" (cioè, non tenta di separare i cloroplasti da altri organelli o membrane tilacoidali da altre membrane cellulari). Ciò è sufficiente ai fini della visualizzazione thylakoid complessi e successive misure basate sulla fluorescenza, poiché solo clorofilla-contenere le proteine sono visualizzate. Va notato che per altre applicazioni a valle (ad es., seconda dimensione rilevamento SDS-PAGE e proteina), proteine non-thylakoid sarà presente. Si deve inoltre osservare che la risoluzione migliore è raggiunta quando cloroplasti sono isolati prima di solubilizzazione, presumibilmente a causa della rimozione dei materiali insolubili prima di solubilizzazione. Quando il metodo descritto qui di seguito, altri metodi di omogeneizzazione come un frullatore può essere utilizzato, ma un vetro lisata omogeneizzatore è rapida ed efficace e consente tutto il materiale omogeneizzato foglia devono essere conservati quantitativamente. Il rapporto di buffer-per-foglia materiale non sembra essere importante, a nostra conoscenza. Circa 2 mL di tampone per una metà di una foglia di spinaci baby è un comodo punto di partenza ma può essere regolata in base alle esigenze sperimentali.

Il rapporto appropriato di tampone di solubilizzazione di clorofilla è cruciale per l'ottimizzazione delle prestazioni di gel verde e dovrebbe essere determinato dallo sperimentatore per una determinata specie o messa a punto sperimentale. Solubilizzazione corretto si tradurrà in un surnatante di verde smeraldo chiaro, profondo sopra una pallina di amido bianco. Uno strato di materiale verde in cima la pallina bianca indica che i tilacoidi sono stati sotto-solubilizzato. Sotto-solubilizzazione deve essere evitato, come esso si tradurrà in scarsa migrazione sul gel, compreso l'incollamento delle fasce e non fornirà un preciso disegno a strisce. Le palline di thylakoid prodotte da questo metodo dovrebbero essere facile da Risospendere e solubilizzare. In caso di pellet compatta che non può essere risospesi rapidamente e in modo omogeneo si raccomanda un metodo alternativo. Campioni possono prima essere risospesi in metà del volume di tampone di TMK-glicerolo, a cui viene poi aggiunto un ulteriore mezzo-volume di tampone di TMK-glicerolo contenente una concentrazione di 2 X di detergenti.

Sovra-solubilizzazione anche dovrebbe essere evitato, in quanto può provocare la perdita di densità di alcune bande di megacomplex. Inoltre, non è possibile effettuare per sovra-solubilizzazione, caricando un volume maggiore di campione sul gel - abbiamo trovato che più di 15 μL del campione per pozzetto su un gel di 1,5 mm di caricamento riduce la qualità della separazione; anche se, così facendo può essere desiderabile per visualizzare complessi con abbondanza bassa. Al contrario, caricando meno di 15 μL può migliorare risoluzione di banda e ridurre sbavature ma ridurrà la visibilità di alcune bande a bassa densità. In generale, sia concentrazione aumentata nella proteina e aumento della concentrazione detergente contribuiscono alla distorsione banda e gel sbavature.

Per correlati nel tempo singolo fotone conteggio analisi (TCSPC) dei complessi gel verde, le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione devono essere scelto dallo sperimentatore a loro discrezione. Per i nostri scopi, la lunghezza d'onda di eccitazione selezionate era 435 nm, che ecciterà sia clorofilla a e clorofilla b. diverse lunghezze d'onda possono, tuttavia, essere usati per eccitare selettivamente specifiche clorofille o altri pigmenti (ad es., un'eccitazione lunghezza d'onda circa 465 nm ecciterà preferenzialmente clorofilla b). Allo stesso modo, uno spettro di emissione di fluorescenza che copre una regione da 680 a 740 nm è stato selezionato basato sullo spettro di emissione segnalato per LHCII, PSI e PSII. Pertanto, questa regione copre tutte le pertinenti caratteristiche spettrali di interesse per i nostri scopi. Gli intervalli di lunghezza d'onda a cui i dati sono raccolti sono anche fino a discrezione dello sperimentatore. Intervalli più brevi, ad esempio ogni 5 nm invece ogni 10 nm, renderà possibile costruire uno spettro di decadimento-collegata più dettagliato, ma questo richiede più tempo e potrebbe non essere necessario. Al contrario, gli intervalli più lunghi potrebbero essere Impossibile risolvere dettagli rilevanti spettrali.

Semplicemente sovrapponendo fluorescenza normalizzata curve di decadimento da diversi complessi può fornire rivelare informazioni su quei complessi. Fluorescenza da LHCII, ad esempio, è tipicamente di lunga durata, mentre fluorescenza da decadimenti PSI molto più rapidamente. A questo punto si dovrebbe prestare attenzione per esaminare i dati contro la funzione di risposta dello strumento (IRF) per garantire che la cinetica di decadimento osservata sono temporaneamente risolti dal tempo di risposta dello strumento.

Costruzione di spettri di decadimento-collegata (DAS), dai dati TCSPC crea un quadro molto più dettagliato del trasferimento di energia tra cromofori all'interno di un complesso di quello che è possibile semplicemente guardando le curve di decadimento isolato. Durante la costruzione di DAS, coda in corrispondenza delle curve di decadimento TCSPC per lo spettro di fluorescenza di stato stazionario è necessario perché l'intensità del segnale raccolto da TCSPC è arbitrario. A intervalli di tempo lunghi ad esempio 5.000 ps, tuttavia, l'intensità della fluorescenza a una determinata lunghezza d'onda (la "coda" del decadimento) è lo stesso come l'intensità di fluorescenza di stato stazionario per quella lunghezza d'onda. Lo spettro di fluorescenza allo steady-state è quindi utilizzabile per normalizzare tutti i decadimenti TCSPC in modo che le loro code sono equivalenti allo spettro allo stato stazionario. Questo dà la vera intensità relativa del segnale di fluorescenza per ogni curva di decadimento. L'intera serie di DAS, quando sovrapposti insieme in stile di stampa di cascata, fornisce una rappresentazione grafica del decadimento dello spettro di fluorescenza nel corso del tempo. Se le trame sono effettuate per abbastanza a lungo tempo punti (per le code delle curve di decadimento) la trama di cascata decadrà completamente verso lo spettro di fluorescenza allo steady-state. Il punto più in anticipo di tempo, d'altra parte, è determinato dalla funzione risposta dello strumento TCSPC.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Finanziamento e sostegno sono stati forniti dal dipartimento di chimica presso la Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycine Sigma G8898
Tris base Sigma #648310
SDS Sigma L3771
Decyl Maltoside Sigma D7658 n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside Sigma O8001
Acrylamide BioRad 161-0148 37.5/1 C 40% solution
TEMED BioRad 161-0800
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Magnesium Chloride Sigma M2670
Potassium Chloride Sigma P9333

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References

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