颅内药物治疗和啮齿动物疼痛检测

Neuroscience

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Summary

在这里, 我们提出了一个方案, 以执行颅内药理实验, 其次是在啮齿类动物的疼痛行为检测。该协议允许研究人员在大脑中提供分子和细胞靶标, 用于治疗疼痛的药理剂。

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Martinez, E., Zhou, H., Wang, J. Intracranial Pharmacotherapy and Pain Assays in Rodents. J. Vis. Exp. (146), e58473, doi:10.3791/58473 (2019).

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Abstract

疼痛是一种突出的感官体验, 具有情感和认知维度。然而, 对疼痛的核心机制仍然了解甚少, 阻碍了有效疗法的发展。颅内药理学是了解大脑疼痛的分子和细胞机制以及新治疗方法的重要工具。在这里, 我们提出了一个协议, 结合颅内药理学疼痛行为测试。具体而言, 我们展示了如何将镇痛药物注入到一个特定的大脑区域, 这可能是造成疼痛调节的原因。此外, 为了确定候选药物在中枢神经系统中的作用, 颅内治疗后进行疼痛检测。我们的研究结果表明, 颅内给药的镇痛药在目标区域可以提供缓解啮齿类动物的疼痛。因此, 我们的协议成功地证明, 颅内药理学, 结合疼痛行为测试, 可以是一个强大的工具, 研究大脑中的疼痛机制。

Introduction

据悉, 中枢神经系统在疼痛调节中发挥着关键作用。例如, 大脑中的谷氨酸信号在疼痛1,2的背景下具有调节作用。因此, 有必要研究大脑中有关疼痛的细胞和分子信号通路。此外, 还需要了解特定大脑区域的分子目标是否可以修改以治疗疼痛。目前对大脑疼痛的研究依赖于电生理的体外研究与全身 (腹腔) 药理药物的传递相结合。体外研究在揭示体内疼痛机制方面存在明显缺陷。同时, 系统药物输送并不能描述确切的细胞目标。体内化学和生物制剂的体内注射已成为研究大脑中神经和分子通路的有力工具。近年来, 其他领域已在体内颅内注射成功地研究成瘾和奖励行为和电路路径在啮齿类动物3,4。然而, 在疼痛的情况下,缺乏使用体内颅内药理学。

颅内注射可以精确地将药物注射到大脑的特定区域。此外, 特定的途径和受体可以使用高选择性药物的目标。颅内运载系统与精确药物的结合使我们能够瞄准分子和细胞的疼痛目标。这些药物在颅内分娩后, 研究人员可以观察到啮齿类动物行为的直接影响。从很好的实验中, 啮齿类动物的行为可以与药理学联系起来。

在这个协议中, 我们使用了在前额叶皮层 (PFC) 的 ampakine 输注的例子, 以证明皮质谷氨酸信号在疼痛调节的机制。Ampakine 是已知的合金调节剂的合成化合物。他们已经显示出在动物模型 5,6的能力来缓解急性和慢性疼痛。此前的研究表明, ampakine 的可能作用部位在大脑5,6。PFC 是大脑中的一个区域, 它表现出自上而下的控制, 以调节情绪和行为。其中一些产出预测已被证明是疼痛调节127的关键。更具体地说, 在 PFC 中谷氨酸信号已被证明可以调节疼痛。因此, PFC 被选定为目标脑区, 用于研究疼痛状态下的 Ampakine。

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Protocol

这项研究中的所有程序都得到了纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准, 认为这符合国家卫生研究所 (NIH) 《实验动物护理和使用指南》。

1. 立体定向插管植入术

  1. 使用10-12 大雄性 Sprague-Dawley 大鼠。
  2. 如前所述, 用1.5-2% 异氟醚1,3,5麻醉动物。一旦动物变得没有反应, 以尖锐的钳子强烈捏, 执行手术。一定要高压灭菌所有仪器, 使用无菌手术手套, 并添加眼膏到动物的眼睛, 以防止损坏。
  3. 立体定向植入双侧26规格的引导插管进入 PFC 在12.5 度角与坐标 AP: + 2.9 毫米;ML: +/-1.6 毫米;DV:-2.1 毫米。为了插入插管, 在颅骨上的所需坐标上钻孔, 并根据所使用的插管大小进行孔直径。
    注: 在这里, pfc 被研究作为潜在的目标颅内植入物, 因为它在疼痛处理中的重要作用, 这已经在以前的一些研究1,2,7已经证明。为了研究其他特定大脑区域的功能, 研究人员可以根据大脑地图集使用不同的坐标。关于进行颅内手术的更多细节, 见 Goffer人 (2013年)3、lee 等人 (2015年)1和 sun人 (2017年)10
  4. 让老鼠从手术中恢复至少1周。手术后, 在恢复前注射皮下液体, 以帮助支持代谢需求, 并在新闭合的切口中应用局部布比卡因。将动物放在温暖的垫子上, 直到它们醒来, 并监测动物手术 3天, 以确保良好的健康和适当的恢复。
  5. 一旦动物从手术中完全恢复, 开始注射 (下一步)。

2. 颅内和腹腔内注射

  1. 对于颅内注射, 使用 PE-50 管连接在一端10μl 汉密尔顿注射器与33规格的注射器插管, 延伸1.0 毫米超出植入的指南。
  2. 在这些大鼠的 PFC 中注入 0.5Μl (或更少 (如果需要) 研究药物或盐水。因为 PFC 是大鼠中较大的区域, 所以这个量不会扩散到其他区域。然而, 对于较小的大脑区域或小鼠, 使用较小的体积。注射量将取决于大脑的区域和动物的物种。
    注: 请注意, 盐水应用作对照, 而不是 DMSO, 因为 DMSO 是神经毒性的。然而, 极少量的 dmso 可能是安全的输液, 因为研究表明, 小于50% 的 dmso (小于0.3μl 的总体积, 在这种情况下) 可能不会干扰行为研究 8,9
  3. 在100秒内双边注入体积, 并在去除前保持喷射器插管的额外 60秒, 以允许这种溶液缓慢扩散。
  4. 对于协同药理作用的研究, 通过系统方法共同用药另一种药物。在这种情况下, 注射所需的药物或控制内部, 并在此后立即在腹腔内使用额外的药物。作为一个例子, 我们研究了吗啡和安巴金的协同镇痛作用, 以测试添加剂效应。我们在体内注入了 AMPAkine, 并与腹腔内注射 1 mg/kg 吗啡 (安全的全身剂量)结合使用.
    注: 建议先进行颅内注射, 因为它们比腹腔注射更难进行。

3. 镇痛检测和评估

  1. 为了研究颅内注射对大鼠急性疼痛行为的影响, 采用足底试验 (哈格里夫斯试验) 计算出对热刺激的戒断潜伏期。哈格里夫斯的装置通过玻璃平面将红外光束聚焦到老鼠的脚上;老鼠站在玻璃平面上方自由移动。在进行哈格里夫斯测试时, 将红外光束聚焦在大鼠足底区域下。
    1. 首先在注射前进行基线哈格里夫斯的测试, 以建立比较的基线值。
  2. 在确定基线值之前, 不要注射任何种类的药物。进行5次良好的试验, 间隔5分钟。一个很好的试验是通过明确的戒断来表示的,当老鼠弯曲膝盖, 抬起脚向上进入身体时。
    注: 确保试验间隔 5分钟, 以防止对大鼠过敏。一旦红外光束被破坏, Hargreaves 的装置会自动记录撤离时间。因此, 一定要从运动、换重等方面打折试验, 如果进行打折试验, 等 5分钟, 重复试验。
  3. 计算退出阈值的平均值的5试验。
  4. 在获得基线平均值后, 开始实验, 获得药物输注后的戒断时间。Hargreaves 的测试可以在颅内注射后20-30 进行, 尽管确切的时间可能取决于特定药物的药代动力学。这是为了确保老鼠已经吸收了这种药物, 并正在经历其影响。以与步骤3.1 相同的方式进行此实验。
  5. 计算步骤3.2 中提到的取款阈值。

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Representative Results

例如, 我们通过插管将 AMPAkine 注入 PFC (图 1)。我们还系统地注入吗啡, 以评估 Ampakine 和吗啡之间的协同镇痛作用。这些结果表明, Ampakine 和吗啡具有添加镇痛作用。这也表明, 颅内注射有能力发现, 至少在一定程度上, 在疼痛的情况下药物激活的机制。

Figure 1
图1。颅内注射 Ampakine 和全身注射吗啡提供补充镇痛.比较哈格里夫斯在颅内注射盐水、AMPAkines 或 AMPAkines 与全身注射吗啡后的戒断延迟的图表。错误条表示 SEM. n = 8 的平均值;p < 0.0001, * *p = 0.0099, *p = 0.0124, 未配对学生的 t测试。这一数字已从 Sun等人的改编.(2017年)1 0日, 经埃尔塞维耶允许。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

在这项研究中, 我们已经证明, 颅内药理学是一个强大的工具, 研究疼痛机制, 并具有作为治疗传递系统的潜力。在我们的协议中, 我们将 AMPAkines 直接送入 PFC, 发现通过增强 PFC 中的谷氨酸信号, AMPAkines 提供了止痛。我们能够通过使用颅内注射结合腹腔注射, 并随后进行疼痛检测来证明这一点。根据止痛效果的证据, 当 Ampakine 被送到 PFC 时, 目前的研究表明, PFC 可能是 Ampakine 的目标。这是颅内药理入路的一个重要优势, 当与行为测试相结合。此外, 将颅内与全身药物联合使用的能力使我们能够了解两种不同药物之间的治疗关系和潜在的药理相互作用。在本研究中显示的示例中, 将 AMPAkine 与吗啡联合引入 PFC 中, 显示出预期的添加剂效应, 这表明 Ampakine 和吗啡通过不同的分子机制进行操作。

虽然体内药理学是研究疼痛的有力工具, 但它确实有局限性。首先, 有可能, 在经验不足的手中, 注入的药物可以扩散到邻近的大脑区域。这是老鼠的一个特殊问题。这可以通过使用光激活药物和植入光纤、测量与注射部位不同距离的药物水平或在近解剖部位注射药物来克服。其次, 颅内注射可以是短期持久的, 但由于药物的药代动力学, 效果的时间并不完全清楚。其他技术, 如光遗传学, 允许瞬时激活或失活所需的大脑区域;这种技术更直接, 有已知的效果期。另一方面,在体内药理学可以针对特定的受体或信号通路, 从而提供一个额外的分子特异性水平。因此, 在未来, 将有必要探索结合体内药理学与其他技术, 如体内生理学和光遗传学。结合这些工具, 新的途径和受体特异性途径可以被发现, 并用于治疗疼痛。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家普通医学科学研究所 (GM102691, GM1115384)、国家神经疾病和中风研究所 (NS100065) (美国马里兰州贝塞斯达) 和纽约大学系麻醉研究基金的支持。麻醉学 (纽约州, 美国纽约)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterotaxic Cannula PlasticsOne 8I26GA8MMKIT
Digital Syringe Hamilton 8440
AMPAkine Sigma Aldrich C-271
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D4540
Hargreaves Apparatus Ugo Basile 37370
Male Sprague-Dawley rats Taconic Farms NTac:SD
Sterile Surgical gloves Dynarex 6535

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References

  1. Lee, M., et al. Activation of corticostriatal circuitry relieves chronic neuropathic pain. The Journal of Neuroscience. 35, (13), 5247-5259 (2015).
  2. Martinez, E., Lin, H. H., Zhou, H., Dale, J., Liu, K., Wang, J. Corticostriatal Regulation of Acute Pain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 146 (2017).
  3. Goffer, Y., et al. Calcium-permeable AMPA receptors in the nucleus accumbens regulate depression-like behaviors in the chronic neuropathic pain state. The Journal of Neuroscience. 33, (48), 19034-19044 (2013).
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