Kombinerade genetiska och kemiska kapsid modifieringar av Adenovirus-baserade genöverföring vektorer för avskärmning och inriktning

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokollet beskrivs här gör det möjligt för forskare att specifikt modifiera adenovirus förhoppningsvis på valda platser genom enkel kemi. Skärmad adenovirus vektorer partiklar och omriktade gen överföring vektorer kan genereras, och vector värd-interaktioner kan studeras.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adenovirus vektorer är potent verktyg för genetiska vaccination och onkolytisk virotherapy. Men är de benägna att flera oönskade vektor-värd-interaktioner, särskilt efter i vivo leverans. Det är ett samförstånd att de begränsningar som oönskad vektor-värd-interaktioner kan bara övervinnas om definierade ändringar av vektor yta utförs. Dessa ändringar inkluderar avskärmning av partiklarna från oönskade interaktioner och inriktning genom införandet av nya ligander. Målet med det protokoll som presenteras här är att möjliggöra för läsaren att generera skärmade och, om så önskas, riktats mänskliga adenovirus gen överföring vektorer eller onkolytisk virus. Protokollet kommer att ge forskarna möjlighet att ändra ytan av adenovirus vektor förhoppningsvis genom specifika kemiska fastsättning av syntetiska polymerer, kolhydrater, lipider eller andra biologiska eller kemiska beståndsdelarna. Den beskriver den banbrytande tekniken kombinerad genetiska och kemiska kapsid ändringar, som har visat sig underlätta förståelsen och att övervinna hinder för i vivo leverans av adenovirus vektorer. En detaljerad och kommenterade Beskrivning av de avgörande stegen för att utföra specifika kemiska reaktioner med biologiskt aktiva virus eller virus-derived vektorer finns. Den teknik som beskrivs i protokollet är baserat på genetiska införandet av (naturligt frånvarande) cystein rester i lösningsmedel-exponerade slingor av adenovirus-derived vektorer. Dessa cystein rester ger en specifik kemisk reaktivitet kan, efter produktionen av vektorer till höga titrar, utnyttjas för mycket specifika och effektiva kovalent kemisk koppling för molekyler från ett brett utbud av ämnet klasser till vektorn partiklar. Allt kan detta protokoll enkelt anpassas för att utföra ett brett utbud av olika (icke-thiol-baserade) kemiska modifieringar av adenovirus vektor förhoppningsvis. Slutligen är det sannolikt de icke-höljebärande virus-baserat gen överföring vektorerna än adenovirus kan ändras från grunden för detta protokoll.

Introduction

Adenoviruses (Ad), medlemmar av familjen Adenoviridae, är icke-höljebärande DNA virus av vilka mer än 70 typer har hittills identifierade (http://hadvwg.gmu.edu). Beroende på hemaglutination egenskaper, genomstruktur och sekvensering resultat, kan de 70 annonstyper delas in i sju arter (mänskliga adenoviruses A till G)1,2. Det mänskliga genomet Ad är 38 kb i storlek och inkapslat av en ikosaedrisk nucleocapsid3. På grund av sitt överflöd kallas den kapsid protein hexon, penton base och fiber alla stora kapsid proteiner. Den största och mest riklig kapsid protein hexon bildar 20 kapsid fasetter, vardera bestående av 12 hexon homotrimers4,5. Penton, varje ikosaedriska utkanten (vertex), består av pentamers av en penton bas och utgör en bas för vertex spike som är byggd av glykosylerat fiber trimerer5,6. Den infödda Ad cellinmatning består i princip av två stora steg. Först binder reglaget fiber till primära receptorn. I annonstyper från arter A, C, E och F är detta coxsackie och adenovirus receptorn (bil). Denna interaktion ger virion i rumslig närhet av cellens yta, vilket underlättar samspelet mellan cellulära integriner och RGD-motiv i penton bas och följaktligen inducerande cellulära svar. Andra förändringar i cytoskelettet leda till internalisering av virion och transport till endosome7. Vid partiell demontering i endosome, virion släpps till cytoplasman und slutligen reser till kärnan för replikering.

Medan Ad kan levereras lokalt (t.ex., för genetiska vaccination), systemisk leverans genom blodomloppet som krävs för onco-virotherapy står inför flera hinder. Samtidigt cirkulerar i blodet, stöta injicerade virioner försvaret av värdens immunsystem, vilket leder till snabb neutralisering av virus-baserat vektorer och rendering Ad-baserat vektorer extremt ineffektiv i systemisk applikationer. Dessutom de naturliga hepatotropism av Ad stör systemisk leverans och måste lösas för att omdirigera Ad till dess nya målceller.

Könsceller-kodade naturliga IgM antikroppar av det medfödda immunsystemet snabbt känner igen och binder mycket repetitiva strukturer på ytan av virion8,9. Dessa immunkomplex sedan aktiverar Komplementsystemet, leder till snabbt komplement-medierad neutralizationen av en stor del av virioner8klassisk och icke-klassisk promenadstråken. En andra väg som leder till större borttagning av Ad virioner är medierad av makrofager10 och associerade med akut giftigt och hemodynamiska biverkningar11,12. I fallet Ad särskilt eliminera Kupffers celler bosatt i levern binder till och phagocytically tar upp Ad virioner via specifika gatsopare receptorerna, därmed dem från blod13,14,15 . Specifika scavenger-receptorer har också identifierats på leverns sinusformig endotelceller (LSE celler)16och LSE celler verkar också bidra till vektor eliminering17, men till vilken utsträckning fortfarande behöver förtydligas. Dessutom är vissa annonstyper och deras härledda vektorer effektivt binds av humana erytrocyter18 de binder via bil eller komplement receptorn CR119. Notera denna binda mekanism inte kan studeras i mus modell systemet som i kontrast till humana erytrocyter, mus erytrocyter uttrycker inte bil.

Specifika anti-annonsen antikroppar genereras av det adaptiva immunsystemet efter exponering för Ad antingen på grund av tidigare infektioner med Ad eller efter den första leveransen i systemisk program höja ett ytterligare hinder för effektiv användning av Ad vektorer, och de bör kringgås i effektiv systemisk leverans.

Slutligen, den starka hepatotropism av vissa Ad typer (inklusive Ad5) allvarligt hindrar tillämpningen av Ad i systemisk terapi. Detta tropism som resulterar i hepatocyte transduktion beror på den Ad virion hög affinitet till blod koagulationsfaktor X (FX), medieras av samspelet mellan FX med Ad hexon protein20,21,22. FX överbryggar virion till heparin sulfat glycans (HSPGs) på ytan av hepatocyter20,23,24,25. En avgörande faktor för denna interaktion verkar vara specifika omfattningen av N - och O-sulfatering av HSPGs i leverceller24, som är skild från HSPGs på andra celltyper. Förutom denna FX-medierad väg föreslår nygjorda studier ytterligare vägar ännu inte identifierats som resulterar i Ad transduktion hepatocyter26,27,28.

Nyligen, det har visat att FX medverkar inte endast i hepatocyte transduktion AD, men också genom bindning, virion skyddar den virus-partikeln mot neutralisering av komplement system26. Minskning av hepatocyte transduktion genom att förhindra FX bindande, därför skulle skapa oönskade bieffekt av ökande Ad neutralisering via det medfödda immunsystemet.

Djupa kunskaper om de komplexa interaktioner mellan vektorer och värdorganismer är därför nödvändigt att utveckla mer effektiva vektorer för systemisk program att kringgå de hinder som införts av värdens organism.

En strategi som ursprungligen använts för terapeutiska proteiner har anpassats för Ad vektorer att åtminstone delvis lösa de ovan beskrivna hindren. Antigenicitet och immunogenicitet av terapeutiska proteinkomponenter kan minskas genom koppling till polyetylenglykol (PEG)29,30. Därav, kovalent kopplingen av polymerer, såsom PEG eller poly [N-(2-hydroxipropyl) methacrylamid] (pHPMA) att kapsid yta skyddar vektorn från oönskade vektor-värd-interaktioner. Vanligen, polymer koppling mål ε-Amin grupper från lysin sida restprodukter som fördelas slumpmässigt på kapsid ytan. Vector partiklar i lösning, hydrofil pågrund av de bifogade polymererna, omges av en stabil vatten skal som minskar risken för immunceller erkännande eller enzymatisk nedbrytning. Dessutom visades pegylerat Ad vektorer att kringgå neutralisering av anti-hexon antikroppar i vitro och i förväg immuniserade mössen i vivo31. Till skillnad från genetiska kapsid modifieringar utförs kemiska kopplingen av polymerer efter produktion och rening, så att inte bara för användning av konventionella producent celler och produktionen av hög titer vektor bestånd, men också för samtidiga ändring av tusentals aminosyror på kapsid ytan. Men uppstår amine-riktad avskärmning slumpmässigt i hela hela kapsid ytan, vilket resulterar i höga heterogeneitiesna och inte tillåter ändring av specifika capsomers. Dessutom försämra de stor polymer delarna krävs för positiva effekter virus bioaktivitet32.

Att övervinna dessa begränsningar, Kreppel et al. 33 infört ett Arbetsmiljöverket-kemiska begrepp för vektor re- och de inriktning. Cysteines infördes genetiskt i virus kapsid på lösningsmedel-utsatta positioner som fiber HI-loop33, protein IX34och hexon35,36. Även om inte naturligt, cystein räntebärande Ad vektorer kan produceras på höga titrar i normala producent celler. Ännu viktigare, möjliggör införande av cysteines i vissa capsomers och i olika positioner inom en enda capsomer mycket specifika ändringar av tiol grupp-reaktivt beståndsdelarna. Detta Arbetsmiljöverket-kemiska tillvägagångssätt har visat att övervinna många hinder i Ad vektor design. Kombinationen av amine-baserade pegylering för detargeting och thiol-baserade koppling av transferrin åt fiber vredet HI-loop har bevisats att framgångsrikt nytt mål den Ad vektorer till bil-brist celler33. Eftersom hexon är inblandad i mest oönskade interaktioner (neutraliserande antikroppar, blod koagulationsfaktor FX), tillämpades thiol-baserade modifiering strategier även på hexon. Koppling små PEG beståndsdelarna till HVR5 av hexon förhindras Ad vektor partiklar för att transduce SKOV-3 celler i närvaro av FX, medan stora PEG beståndsdelarna ökade hepatocyte transduktion14,35. AD vektor partiklar bär mutationer i fiber vredet hämma bil bindning och HVR7 hämmande bindningen av FX (och uthärda införas cysteines i HVR1 för position-specifika pegylering) visades att kringgå antikropp - och komplement-medierad neutralisering, liksom scavenger receptor-medierad upptag utan förlust av smittsamhet. Intressant, trots bristen på naturliga FX sköld förbättrade pegylering igen transduktion av hepatocyter som en funktion av PEG storlek36. Emellertid var det visat att kovalent skärmning har en inverkan på intracellulära människohandel processer. Prill et al. jämfört med irreversibla kontra bioresponsive sköldar utifrån pHPMA och visat att varken funktionsläget av avskärmning eller kopolymer kostnad inverkade på cellinmatning men påverkade partikel människohandel till kärnan. Anställa en bioresponsive sköld med positivt laddade pHPMA sampolymerer tillåtet för partikel människohandel till kärnan, att upprätthålla de höga transduktion effektivitetsvinsterna av Ad vektorer in vitro- och in-vivo37.

Sammanfattningsvis visar dessa data att, även under antagandet att alla vektor-värd-interaktioner var känd och ansedd, överdriven kapsid ytmodifieringar är nödvändigt att övervinna de hinder som är associerad med systemisk vektor leverans.

Här tillhandahåller vi ett protokoll för att utföra platsspecifik kemiska modifieringar av adenovirus vektor förhoppningsvis för avskärmning eller retargeting av adenovirus-baserade onkolytisk virus och adenovirus vektor partiklar. Begreppet denna teknik beskrivs i figur 1. Det gör att strålskyddet av vissa kapsid regioner från oönskade interaktioner genom kovalent fastsättning av syntetiska polymerer. Samtidigt ger det också en möjlighet att bifoga ligander och kombinera skärmning och inriktning. Med hjälp av enkel kemi, kommer praktiker att kunna kovalent modifiera adenovirus vektor yta med en mängd olika molekyler inklusive peptider/proteiner, kolhydrater, lipider och andra små molekyler. Protokollet ger dessutom ett allmänt begrepp för kemisk modifiering av biologiskt aktiva virus-derived vektorer under underhåll av deras biologiska integriteten och aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: I följande, ett protokoll för Arbetsmiljöverket-kemiska pegylering av en annons som vektor beskrivs detalj. För att aktivera specifika kopplingen av de PEG-delen, en Ad5 vector var på förhand genetiskt modifieras av att införa en cysteinrest i det hexon proteinet på hypervariabel slingan 5 som beskrivs i en tidigare publikation36och en maleimide-aktiverat PEG förening används som koppling förening.

1. beredning av buffertar för Vector rening av CsCL steg övertoningar

  1. Förbereda 400 mL Adenovirus buffert (Ad-buffert) genom att lägga till 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) och 150 mM NaCl (3.504 g/400 mL) till dubbeldestillerat vatten (ddH2O). 350 mL av denna buffert behövs för att förbereda följande tre Ad-buffert varianter.
    1. Variant A: justera 150 mL Ad-buffert till pH 7,6 med NaOH.
    2. Variant B: lägga till en slutlig koncentration på 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] i 50 mL och justera till pH 7,2 med HCl.
    3. Variant C: Lägg till en slutlig koncentration av 0,5 mM TCEP (0.022 g) till 150 mL och justera till pH 7,2 med HCl.
    4. Förbereda buffertarna i ddH2O och analyskvalitet kemikalier. Använd 100 mL vardera av alternativ A och variant C för att förbereda CsCl buffertar (se steg 1.2 och 1.3; 50 mL av varje) nödvändiga för CsCl steg Övertoningarna (se 3.2.6. och 3.2.18).
  2. Förbereda CsCl steg gradient bufferten (ρCsCl = 1.41 g/cm3) i Ad-buffert
    Obs: Denna buffert kommer att behövas i två olika varianter:
    1. Väga två portioner av exakt 27.42 g CsCl in 50 mL rör.
    2. ΡCsCl = 1.41/TCEP buffert: lösa CsCl i 40 mL variant C av Ad-buffert.
    3. ΡCsCl = 1.41 buffert: lösa CsCl i 40 mL alternativ A Ad-buffert.
    4. Kontrollera och vid behov justera pH med HCl. Fyll upp till exakt 50 mL med motsvarande Ad-buffert variant. För att uppnå de bästa resultaten för separation, är den exakta CsCl koncentration och pH avgörande.
    5. Kontrollera tätheten (CsCl innehåll) vägning 1 mL (1.41 g) av varje övertoning buffert.
  3. Förbereda CsCl steg gradient bufferten (ρCsCl = 1,27 g/cm3) i Ad-buffert
    Obs: Denna buffert behövs i två olika varianter:
    1. Väga två portioner av exakt 18.46 g CsCl i 50 mL rör.
    2. ΡCsCl = 1,27/TCEP buffert: lösa CsCl i 40 mL variant C av Ad-buffert.
    3. ΡCsCl = 1,27 buffert: lösa CsCl i 40 mL alternativ A Ad-buffert.
    4. Kontrollera och vid behov justera pH med HCl. Slutligen, fyll upp till exakt 50 mL med motsvarande Ad-buffert variant. För att uppnå de bästa resultaten för separation, är den exakta CsCl koncentration och pH avgörande.
    5. Kontrollera tätheten (CsCl innehåll) vägning 1 mL (1,27 g) av varje övertoning buffert.
  4. Sterilisera alla buffertar (Ad-buffertar och CsCl steg gradient buffertar) genom filtrering (med 0,45 µm porstorlek maskstorlek) i sterila flaskor.
  5. Efter sterilisering för att förhindra oxidation av TCEP, mätta och overlay buffertar som innehåller TCEP med argon av sparging buffertar med argongas för ca 30 s. Var noga med att endast använda sterila enheter (t.ex., steril pipett tips) när tillämpa argongas, och använda flaskor tillräckligt stora för att tillåta argon späck.
    Obs: Alla buffertar bör förberedas färska och skyddat från ljus och kan lagras vid 4 ° C i flera dagar (särskilt CsCl steg gradient buffertar som ska endast förvaras några dagar).

2. kopplingen beståndsdelarna: Lagring och beredning

Obs: Moeities används för koppling till cysteines måste bära thiol-reaktiva grupper. Maleimide-aktiverat föreningar kommer att bilda stabila thioether obligationer med de genetiskt introducerade cysteines. Alternativt, ortho-pyridyldisulfide (OPSS)-aktiverat föreningar kan användas, som bilda bioresponsive disulfide broar mellan vektor partiklar och koppling biexponentiellt. Frystorkade malPEG-750 samt de flesta andra koppling reagenser är känsliga för hydrolys och bör förvaras torrt i form av frystorkat pulver vid-80 ° C.

  1. För att förhindra uppbyggnaden av kondenserande vatten vid upptining av injektionsflaskorna, förvara injektionsflaskorna i större rör (t.ex., 50 mL rör) fylld med en kudde av kiselgel pärlor. Förvara dessa rör i en adekvat större behållare också fylld med en kiselgel pärlor kudde.
  2. Innan du stänger tätt varje rör och behållare, utbyta luft med argongas. Detta kan uppnås genom att placera den öppna tubrör och behållare i exsickator, följt av att ta bort och byta ut luften med argongas. Eftersom argongas är tyngre än luft, rör och behållare är fyllda med argongas och kan nu placeras i varandra, med varje lock tillslut.
  3. Förvara behållare vid-80 ° C.
  4. När upptining, placera behållarna på kvarts pärlor i exsickator och långsamt värma dem upp till rumstemperatur, sedan öppna behållaren.
  5. När du utför en koppling reaktion, nymalen lösa mängden koppling substrat behövs i lämpliga lösningsmedlet. Ta hand inte för att lägga till mer än 10% av koppling lösning till det slutliga koppling reaktionen, särskilt om DMF eller DMSO används som lösningsmedel för koppling substratet.

3. förstärkning, rening och kemisk modifiering av Ad vektorer:

  1. Förstärkning av Ad vektorer
    Obs: Följande steg måste utföras med en säkerhet skåp enligt lokala biologiska säkerhetsbestämmelser.
    1. Transfect en replikering bristfällig ∆E1 Ad vektor som innehåller en (eller flera) genetiskt introducerade cystein restprodukter i HEK 293 celler som beskrivs av Kratzer och Kreppel38.
    2. Enligt det protokoll38, förstärka vektorn av sekventiell reinfections upp till en sista förberedande infektion i 15-20 stora (15 cm) cell kultur plattor (ca 1-2 x 107 celler/platta).
      Obs: Optimalt, den sista återinfektion ska tajmas så att celler Visa full cytopatisk effekt (CPE) på morgonen den rening och modifiering prestanda (se figur 2).
    3. Efter det slutliga förstärkning, kan celler resuspended i Ad buffert + 10 mM TCEP (variant B) frysas vid-80 ° C; för optimal avkastning av vektor partiklar rekommenderas dock en omedelbar uppföljning av cell lysis och vektor rening och modifiering.
  2. Rening och kemisk modifiering av Ad vektorer
    Obs: Rening av vektorer utförs enligt protokollet adenovirus rening beskrivs i38men under icke-oxiderande förhållanden. Cell skörd och lysis samt vektor rening och kemisk modifiering kan utföras inom en dag. Skörda och lyse infekterade celler enligt protokollet beskrivs tidigare38.
    1. Samla in celler genom skrapning plattorna och överför supernatanten till 200-500 mL centrifugering rör.
    2. Snurra den cell lösningen för 10 min vid 400 x g.
    3. Återsuspendera cellpelleten i 4 mL av Ad-buffert + 10 mM TCEP (pH 7,2) (variant B) och överföring till en steril 50 mL tub. Om cellen avkastningen är låg eller endast en svag CPE förmåddes, Återsuspendera det i 2 mL.
    4. Rädda vektorn av 3 cykler av frysning (i flytande kväve) och upptining (i 37 ° C vattenbad).
    5. Snurra i 10 min på 5 000 x g vid 4 ° C.
    6. Förbered två lika CsCl steg lutningar medan centrifugering:
      1. Först, som den lägsta fasen, tillsätt 3 mL 1,41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffert + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variant C) in i ultracentrifugen rören. Markera nivån på den lägsta fasen på röret innan du laddar den övre fasen.
      2. Försiktigt stack den övre fasen av 5 mL 1,27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffert + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variant C) genom mycket långsamt pipettering 5 mL volym längs väggarna i röret på den lägsta fasen.
        Obs: Sedan under koppling en hög koncentration av TCEP kan reagera med maleimide återstoden av malPEG-750 och leda till minskad koppling effektivitet, rening av CsCl steg lutning behöver utföras redan under en minskad TCEP koncentration.
    7. Ladda supernatanten på CsCl övertoningen [antingen lika dela supernatanten på båda övertoningar eller, vid en låg vektor avkastning (se ovan), lasta supernatanten på endast en kolumn], och fylla båda övertoningar lika till toppen med Ad buffert + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variant B).
    8. Justera vikten på motsatt rören till 0,0 g viktskillnad.
    9. Ultracentrifugen för 2 h vid 176 000 x g vid 4 ° C.
    10. Med en klämma, fixa ultracentrifugering röret till en monter, lämnar området runt den lägsta fas nivå mark tillgänglig. Placera svanhals lampan ovanför röret. Runt mark, på gränsen mellan de nedre och övre faserna, bör ett distinkt band (de vektor virioner) vara synliga (figur 3A-3 C).
    11. Samla vektorerna genom att punktera röret med en nål och blivande vektor bandet i en spruta. Överföra insamlade vektor virioner till en 15 mL tub.
      Obs: Svagare band ovan annons vektor bandet innehålla ofullständiga vektor partiklar och bör undvikas för aspiration. De cellfragment och grönt fluorescerande protein (andra) av andra-uttryckande Ad-vektorer samlar in i den övre delen av ultracentrifugen röret (se figur 3A och 3B). Detta och följande steg upp till koppling (steg 3.2.16) bör utföras snabbt, som vektorer är nu förnuftigt att disulfid limning på grund av den låga TCEP koncentrationen.
    12. För att beräkna mängden koppling substrat behövs för effektiv komplett bindningen av substratet till alla cystein resthalter i vektor preparatet, mäta OD260:
      1. Enligt protokollet beskrivs av Kratzer och Kreppel38, vortex en blandning av 10 µL av de insamlade vektor virioner, 89 µL av Ad buffert och 1 µL 10% SDS. Som en tom sond, vortex 99 µL Ad-buffert och 1 µL 10% SDS.
      2. För att denaturera virioner, inkubera både på 56 ° C i 10 min.
      3. Bestämma OD260.
      4. Beräkna fysiska vektor titern per µL med hjälp av följande ekvation: OD260 x faktor av utspädning x Empirically beslutsamt extinktionskoefficient av Ad (1.1 x 109 vektor partiklar = 1 OD260 enhet/µL). Därför en uppmätt OD260 av 1,36 av en vektor spätt 1:10, skulle beräkna till: 1.36 x 10 x 1,1 x 109 = ca 1,5 x 1010 vektor partiklar/µL.
        Obs: Denna titer är endast en grov uppskattning; Det är dock tillräckligt noggranna för de stökiometriska beräkningar som beskrivs i följande.
    13. Beroende på proteinet modifieras av införandet av en cystein, fastställa beloppet för koppling substrat (i gram) för en effektiv koppling reaktion, enligt följande allmänna ekvation: Virus titer x volym x antal cysteines x överskott av biexponentiellt x Molekylär vikt av biexponentiellt / 6,022 x 1023 = gram koppling substrat.
      Obs: I denna ekvation: 1) virus titer är den titer/µL, bestäms av OD260 som beskrivits ovan, 2) volym konton för volymen i µL av strävade vektor som används i kopplingen reaktionen, (3) antalet cysteines är antalet proteiner som cystein rester introducerades per vektor partikel, 4) överskott av biexponentiellt är faktorn biexponentiellt överskott som krävs för en effektiv koppling reaktion (50 x) och 5) molekylvikten för biexponentiellt måste införas som Da (inte kDa).
    14. Nymalen lösa mängden förening (eller genomförbart belopp) behövs i lämpligt lösningsmedel.
      Obs: Eftersom mängden koppling substrat behövs är låg och svårt att väga men dyra, väger den minimala mängden sammansatta möjliga och lös upp det i en lämplig koncentration för ansökan till koppling reaktion.
    15. Överföra vektor lösningen till en lämplig storlek tube (t.ex. 2 mL tub) och Lägg till det beräknade beloppet för koppling förening stamlösning till vektorn.
    16. Blanda försiktigt lösningen av overhead rotation för 1 h i rumstemperatur.
    17. Fyll upp vektor lösningen till 6 mL total volym med Ad-buffert (pH 7,6, alternativ A).
      Obs: Detta steg måste utföras innan lösningen appliceras på steg toningen så att vector lösningen, som fortfarande innehåller CsCl från den första steg gradienten, har en densitet under 1,27 g/mL.
    18. I ett andra CsCl banding steg, rena vektorn från den oreagerade koppling biexponentiellt:
      1. Förbered två lika CsCl steg övertoningar genom att utföra följande steg för varje: 1) lägre fas: 3 mL 1,41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffert (pH 7,6, alternativ A), (2) Markera nivå av lägre fas på röret innan du laddar övre, och (3) övre fas : 5 mL 1,27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffert (pH 7,6, alternativ A).
        Obs: Efter koppling har ägt rum, buffertar utan TCEP används, som inga gratis thiol grupper bör nu finnas på de vektor förhoppningsvis.
      2. Ladda supernatanten på CsCl toningen och fyll båda övertoningar lika till toppen med Ad-buffert (pH 7,6, alternativ A).
      3. Justera vikter av motsatt rören till 0,0 g viktskillnad.
    19. Ultracentrifugen för 2 h vid 176 000 x g vid 4 ° C.
    20. Strax före slutet av ultracentrifugering, temperera en PD-10 kolumn 5 gånger med 5 mL av Ad-buffert (pH 7,6, alternativ A).
    21. Som gjort i steg 3.2.10, fixa ultracentrifugering röret stå lämnar området runt den lägsta fas nivå mark tillgänglig. Placera svanhals lampan ovanför röret. Återigen, runt gränsen mellan de nedre och övre faserna, ett distinkt band (de vektor virioner) bör vara synliga (figur 3 c).
    22. Samla vektorerna genom att punktera röret med en nål och blivande vektor bandet i en spruta och överföra vektorn till en 15 mL tub. Var noga med för att samla virioner av både lutning rör ihop till en total volym 2,5 mL eller mindre. Om en mindre volym samlas, Fyll för att erhålla en 2,5 mL totalvolym med Ad buffert (alternativ A).
    23. Ladda den 2,5 mL på skakad PD-kolumnen. Kassera genomflöde.
    24. Tillsätt 3 mL Ad buffert (alternativ A) på kolumnen och samla den genomströmmande (innehållande de renade vektor virioner).
    25. Lägg till glycerol (333 µL) för att få en slutlig koncentration på 10% och dela upp i lämpliga alikvoter (t.ex. 400 µL varje), och inkluderar en alikvot av 20 µL för titerbestämning genom OD260 mätning.
    26. Lagra vektor lösningen vid-80 ° C.
    27. Bestäm titern av vektor genom att mäta OD260 20 µL vektor lösning, 79 µL av Ad-buffert (alternativ A) och 1 µL 10% SDS som beskrivs i steg 3.2.12. Som ett tomt använda 79 µL av Ad-buffert (alternativ A), 10 µL 10% glycerol och 1 µL 10% SDS.
    28. Beräkna vektor titern som: OD260 x faktor av utspädning x 1,1 x 109 vektor partiklar/µL.
      Som bereddes i steg 3.2.27, beräkna: OD260 x 5 x 1,1 x 109 vektor partiklar/µL

4. kontroll av kopplingen av SDS-PAGE:

Obs: Om föreningar med tillräckligt hög molekylvikt används för koppling till Ad virioner koppling kan verifieras av polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). Framgångsrik koppling bör sedan resultera i en förskjutning av protein bandet motsvarar den modifierade Ad virion protein, jämfört med protein i den omodifierade Ad virion (se figur 4).

  1. Enligt beräknade antikroppnivåns på vektor (steg 3.2.28), separat 1-2 x 1010 vektor partiklar av SDS-PAGE (8%).
  2. Utveckla gelen genom silver-färgning av gel39 att upptäcka även svag protein band:
    1. Förbereda buffertar för silverfärgning (de belopp som behövs för 100 mL buffert anges inom parentes):
      1. Förbered buffert 1 genom att blanda ddH2O, 50% 38 mL MeOH (50 mL 100 MeOH), 12% AcOH (12 mL 100% AcOH), och 0.0185% HCHO (50 µL av 37% HCHO).
      2. Förbereda buffert 2 genom att lägga 50% EtOH (50 mL 100% EtOH) till 50 mL ddH2O.
      3. Förbereda buffert 3 genom att lägga till 0,127 g/L Na2S2O3 (12.744 mg) till 100 mL ddH2O.
      4. Förbereda buffert 4 genom att lägga till 2 g/L AgNO3 (0.2 g) och 0.0185% HCHO (50 µL av 37% HCHO) till 100 mL ddH2O.
      5. Förbereda buffert 5 genom att lägga till 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185% HCHO (50 µL av 37% HCHO), och 2,5 mg/L Na2S2O3 (0.256 mg) till ddH2O få en slutlig volym av 100 mL.
      6. Förbered buffert 6 genom att blanda ddH2O, 50% 38 mL MeOH (50 mL 100% MeOH), och 12% AcOH (12 mL 100% AcOH).
      7. Förbered buffert 7 genom att blanda ddH2O, 30% 60 mL MeOH (30 mL 100% MeOH), och 10% glycerin (10 mL 100% glycerin).
      8. Förbered buffert 8 genom att blanda 10% glycerin (10 mL 100% glycerin) med 90 mL ddH2O.
  3. Utför silverfärgning
    1. Fixa gelen i buffert 1 för 30 min.
    2. Tvätta gelen i buffert 2 i 15 min.
    3. Förbehandla gelen i buffert 3 för 1 min.
    4. Tvätta gelen 3 gånger i ddH2O för 20 s.
    5. Impregnera gelen i buffert 4 i 20 min.
    6. Tvätta gelen 2 gånger i ddH2O för 20 s.
    7. Utveckla gelen i buffert 5 tills banden syns (10 s till 10 min).
    8. Tvätta gelen 2 gånger i ddH2O 2 min.
    9. Stoppa utvecklingen i buffert 6 för 5 min.
    10. Bevara gelen i buffert 7 i 20 min.
    11. Lagra gelen i buffert 8.
      Obs: Koppling effektivitet kan bestämmas genom Densitometrisk kvantifiering av de modifierade och oförändrad banden av den riktade capsomere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 visar exempel på den cytopatisk effekten (CPE) på 293 (HEK 293) celler som visar framgångsrika vektor produktion. Cellerna bör Visa morfologi (figur 2 c) 40-48 timmar efter inokulering med virus vektorn. Den rätt tidpunkt för skörd är avgörande för att inte förlora viruspartiklar av cell lysis och förebygga oxidation av de genetiskt introducerade thiol-grupperna. Om vector partiklar släpps till medium av cellys, de genetiskt introducerade tioler kommer nästan omedelbart blivit oxiderat, och det blir svårt att rena och kemiskt ändra dem.

Figur 3 visar exemplariskt CsCl band. Syftet med diskontinuerlig CsCl banding innan kemisk modifiering är att ta bort cellulära skräp från viruspartiklarna. Ändringen själv kan sedan ske i CsCl. Andra ränder efter kemisk modifiering serverar att avlägsna ett överskott av (oreagerad) koppling biexponentiellt. Notera, en lyckad ändring av viruset inte kan ses i övertoningen och kräver ytterligare molekylär analys, helst av SDS-PAGE.

Figur 4 visar typiska exempel på framgångsrika kapsid ändringar. De flesta beståndsdelarna kopplad till särskilda capsomeres kommer att förändra beteendet körs med respektive capsomeres i SDS-PAGE. Genom direkt jämförelse med en omodifierad kontroll, framgången för koppling kan verifieras och Densitometrisk analys kan hjälpa till att fastställa övergripande koppling effektivitet (i procent av skiftat och oskiftade band för den modifierade capsomere).

Figure 1
Figur 1: kombinerade genetiska och kemiska kapsid modifieringar av adenovirus vektor förhoppningsvis aktivera covalent tillbehöret av avskärmning polymerer och inriktning ligander. Cystein rester introduceras genetiskt på utvalda, lösningsmedel-exponerade kapsid slingor av adenovirus vektor förhoppningsvis att utrusta vektor partiklarna med ny kemisk reaktivitet. Vektorer kan produceras med konventionella producent celler och protokoll. Efter produktion, är genetiskt introducerade cystein rester specifikt och kovalent modifierad med thiol-reaktivt koppling beståndsdelarna (ligander, skärmning kolhydrater, fluorescerande färger, små molekyler, polymerer, etc.). För koppling, kan maleimide-aktiverat föreningar (som bildar stabila thioether band med vektor partikeln ytbehandlar) eller pyridyldisulfide derivat (som bildar bioresponsive disulfidbryggor) användas. Efter kopplingen renas vektorerna av diskontinuerlig CsCl ränder för att ta bort oreagerad överskott koppling beståndsdelarna. PEG, polyetylenglykol (skärmning polymer); L, ligander (härlett från ett brett utbud av ämnet klasser); -SH, thiol funktionalitet av genetiskt introducerade cystein rester. Med denna teknik ett definierat antal molekyler kovalent kan kopplas till de vektor förhoppningsvis, och en exakt urval av webbplatsen koppling är genomförbart. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: cytopatisk effekt under vektor produktionen. Konventionella producent celler (här, 293-HEK celler) kan användas för produktion av genetiskt modifierade vektorer före kemisk modifiering. Uppkomsten av CPE visar den bästa tidpunkt för att skörda cellerna. (A) celler två timmar efter infektion, (B) celler 24 timmar efter infektion och (C) celler 40 timmar efter infektion före skörd. Skala barer = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exemplariskt resultaten av CsCl övertoningar. CsCl övertoningar innan (A, B) och efter (C) kemisk modifiering. (A) ett adenovirus-vektor är Bandad med diskontinuerlig CsCl täthet lutning centrifugering. Den övre fasen visas gröna sedan vektorn visas björnar en hCMV-arrangören-driven uttryck kassett för andra. Den vektor virion är Bandad som ett enda, vita band i den nedre tredjedelen av röret. De två mindre banden (ovan) härrör från ofullständig partiklar, som inte bör samlas in. (B) en cystein räntebärande andra-uttryckande Ad vektor före kemisk modifiering. (C) samma vektor efter ändring. Bandet i den nedre tredjedelen av röret samlas och renas genom en avsaltning kolumn. Pen märket i B och C etiketter gränsen mellan de två densiteterna och möjliggör att identifiera platsen för vektor bandet som kommer att samlas in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: SiIver-färgade SDS-PAGE att bedöma koppling effektivitet. MW markör i lane 1. En vektor med cysteines införs i den capsomeres penton bas och hexon lämnades oförändrad (lane 2) eller modifierad med maleimide-aktiverat PEG (polyetylenglykol) med en molekylvikt av 5 kDa (lane 3). Både hexon och penton bas uppvisar en förskjutning under SDS-PAGE, som anger lyckad ändring av > 90% av monomersna per kapsid. En vektor med en cysteinrest i hexon lämnades oförändrad (lane 4), modifierat med 5 kDa PEG (lane 5) eller med 20 kDa PEG (lane 6). Det bör noteras att den större förskjutningen av hexon bandet beror på de 20 kDa PEG, jämfört med de 5 kDa PEG (lane 5) högre molekylvikt. Gelen visar specificiteten och effektiviteten i kopplingen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Effektivitet genom vilken de genetiskt introducerade cysteines kan vara kemiskt modifierade är typiskt 80-99%, och vissa variabler påverkar denna effektivitet. Det första är det avgörande att de genetiskt introducerade cysteines inte genomgår tidig oxidering. Samtidigt vara väl skyddade i reducerande miljö av producenten cellerna, är det obligatoriskt att tillhandahålla en icke-oxidativ miljö efter att ha släppt vektor partiklar från producenten celler och under kemisk modifiering. I detta syfte att minska reagenser kan användas vid koncentrationer från 0,1-10 mM, och det är nödvändigt att använda degressiv reagenser som inte innehåller thiol-grupper, som skulle lätt reagerar med maleimide-aktiverat föreningar. För det andra, när du använder maleimide-aktiverat föreningar, pH under koppling reaktionen bör inte överstiga 7,35, sedan pH större än 7,4 kan minska specificiteten av reaktionen. För det tredje, i varje fall amine-gratis buffertar (t.ex. HEPES, PBS) bör användas för reaktionen. Notera, kan cystein räntebärande vektor partiklar renas genom dubbel CsCl ränder som beskrivs, sedan lagrade i HEPES/10% glycerol före kemisk modifiering. I detta fall, 0,1-1 mM TCEP bör användas en reducerande reagens eller helst vektorer bör lagras i en argon-atmosfär. Argon-fyllda plastburkar med lock kan användas för detta ändamål. Dessutom påverkas modifiering effektivitet av hydrodynamisk diametern av föreningen kopplat till förhoppningsvis och platsen som det är kopplat. Många capsomeres som kan fungera som mål för specifika Arbetsmiljöverket-kemisk modifiering är närvarande i kapsid som trimerer (fiber, hexon) eller pentamers (penton bas). Därför, beroende på placeringen av genetiskt introducerade cystein, en del molekyl kopplad till en monomer kan koalisera hindra kopplingen av en annan molekyl till angränsande monomeren. Detta bör beaktas när du väljer idealiska platser för Arbetsmiljöverket-kemiska kapsid ändringar.

För att underlätta felsökning, kan några problem uppstå när följande protokollet beskrivs. Första, låg vektor avkastning (under 10.000 vektor partiklar per producent cell) kan resultera från suboptimala infektion av producenten celler. 100-300 MOI bör helst användas för infektion av producenten celler. Observera att både för höga och för låga vektor beloppen för inokulatet generera suboptimala avkastning. Det är idealiskt att passagen producenten celler dagen innan infektion. Andra, smetig band i de CsCl Övertoningarna kan visas. Den vanligaste orsaken för smetig utseende av banden i de CsCl lutningarna är ett pH av CsCl lösningar som är så surt. Att minska reagenset TCEP är mycket sura, och försiktighet måste iakttas för att justera pH innan du laddar vektorn på övertoningen, eftersom adenovirus vektorer lätt upplösas i en sur miljö. Tredje, låg koppling effektivitetsvinster (< 80% av kopplingen) är mest frekventerar resultatet av orena vektor preparat och/eller förtida oxidation av tiol grupper på vektor ytan. Orenheter kan upptäckas av SDS-PAGE och silverfärgning. I fall som signifikanta föroreningar uppstår, bör vektor produktion startas. Dessutom kan låg koppling effektivitetsvinster orsakas av fria icke-vektor tioler i reaktionen. Därför rekommenderas det inte att använda ß-merkaptoetanol eller Ditiotreitol som att minska reagenser, eftersom båda innehåller gratis thiol grupper. Notera, att välja lösningsmedel-tillgängliga platser att införa cystein restprodukter som kan lätt ändras, ska kristallen strukturerar användas; Annars, cysteines kanske inte tillgänglig för den koppling partnern. För tidig oxidering av tioler på vektor ytan kan undvikas genom stränga användning av argon eller TCEP.

Slutligen, felaktiga stökiometriska beräkningar kan också leda till låga koppling effektivitetsvinster. Följande exempel är tänkt att illustrera den generiska formel som presenterats ovan och underlätta de stökiometriska beräkningarna. I exempel införs ett cystein i den hexon capsomere. Antikroppnivåns på vektor partiklar efter den första CsCl-steget gradient rening bestäms som 1,5 x 1010 vektor partiklar per µL samt koppling biexponentiellt, malPEG-750 används. Varje vektor kapsid innehåller 720 hexon proteiner (240 trimerer), så antikroppnivåns på cysteines per µL summerar därför till 720 x 1,5 x 1010 = 1.08 x 1013 cysteines/µL. För att ändra 1,5 mL vektor partiklar, totalt 1,62 x 10 måste16 cysteines vara reagerade med den kopplingen biexponentiellt. För att nå effektiv koppling, 50 x molar överskott av kopplingen sammansatt av cystein rester totala rekommenderas: 1.62 x 1016 x 50 = 8,1 x 1017 molekyler av malPEG-750 behövs att effektivt till 1,5 x 1016 cysteines av 1,5 mL vektor lösning renas genom den första CsCl steg gradienten. MalPEG-750 uppvisar en molekylvikt av 750 Da; Därför väger 6.022 x 1023 molekyler av malPEG-750 750 g. Således, för effektiv koppling av 1,62 x 1016 cystein rester i 1,5 mL vektor lösning med en 50 x överskott av malPEG-750, 8,1 x 1017 molekyler av malPEG-750 = (750 x 8,1 x 1017) / (6,022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg malPEG-750 krävs.

Den presenterade metoden kompletterar och överskrider metoden för vektor pegylering. Konventionella, amine-riktad vektor pegylering inte tillåter platsspecifika fastsättning av avskärmning eller inriktning beståndsdelarna, medan Arbetsmiljöverket-kemiska kopplingen tekniken presenteras här kan användas att just fästa beståndsdelarna adenovirus-vektor ytor på definierade positioner och i definierade kopia nummer. Den är därför lämplig för både avskärmning och inriktning av adenovirus vektor partiklar.

Notera, kan detta protokoll också användas för en konventionell amine-regisserad pegylering Ad vektorer som nämns ovan. I så fall kan minska reagensen TCEP utelämnas från buffertar. Antalet tillgängliga amine grupper per partikel kan anses vara 18.000 för stökiometriska beräkningar, och typiska molar överdrifter av amine-reaktivt koppling beståndsdelarna är 20-100 fold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 3-35 (2003).
  2. Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
  3. Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
  4. van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
  5. Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
  6. Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
  7. Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
  8. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  9. Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
  10. Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
  11. Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
  12. Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
  13. Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
  14. Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
  15. Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
  16. Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
  17. Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
  18. Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
  19. Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
  20. Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
  21. Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
  22. Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
  23. Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
  24. Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
  25. Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
  26. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  27. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  28. Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
  29. Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
  30. Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
  31. O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
  32. Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
  33. Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
  34. Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, (11), 1813-1824 (2008).
  35. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  36. Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
  37. Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
  38. Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. Clifton, NJ. 377-388 (2017).
  39. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics