Kombinert genetiske og kjemiske kapsid modifikasjoner av Adenovirus-baserte genoverføring vektorer for skjerming og målretting

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokoll beskrevet her kan forskere spesielt endre adenovirus capsids på utvalgte områder av enkel kjemi. Skjermet adenovirus vektorer partikler retargeted gene overføring vektorer kan genereres og vektor vert interaksjoner kan studeres.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adenovirus vektorer er potent verktøy for genetisk vaksinasjon og kan virotherapy. Men er de utsatt for flere uønskede vektor-vert samspill, spesielt etter i vivo levering. Det er konsensus at begrensningene pålagt av uønskede vektor-vert interaksjoner kan bare overvinnes hvis definerte modifikasjoner av vektor overflaten er utført. Disse endringene inkluderer skjerming partikler fra uønsket interaksjon og målretting etter innføring av nye ligander. Målet med protokollen presenteres her er å aktivere leseren til å generere skjermet og, hvis ønskelig, retargeted menneskelige adenovirus gene overføring vektorer eller kan virus. Protokollen lar forskere å endre overflaten av adenovirus vector capsids ved bestemte kjemiske vedlegg av syntetiske polymerer, karbohydrater, lipider eller andre biologiske eller kjemiske moieties. Den beskriver den banebrytende teknologien kombinert genetiske og kjemiske kapsid endringer, som har vist seg å lette forståelsen og overvinne av barrierer i vivo levering av adenovirus vektorer. En detaljert og kommentert beskrivelse av avgjørende trinn for å utføre bestemte kjemiske reaksjoner med biologisk aktive virus eller virus-avledet vektorer er gitt. Teknologien beskrevet i protokollen er basert på genetisk innføring av (naturlig tilstede) cystein rester i løsemiddel-eksponerte ledd av adenovirus-avledet vektorer. Disse cystein rester gi en bestemt kjemiske reaktivitet som kan, etter produksjon av vektorer til høy titers, utnyttes for spesifikke og effektiv kovalente kjemiske kopling av molekyler fra en rekke stoff klasser til vektor partikler. Viktigere, kan denne protokollen enkelt tilpasses for å utføre et bredt spekter av forskjellige (ikke-thiol-baserte) kjemiske modifikasjoner av adenovirus vector capsids. Til slutt, er det sannsynlig at ikke-innhyllet virus-basert genet overføring vektorer annet enn adenovirus kan endres fra grunnlaget for denne protokollen.

Introduction

Adenoviruses (Ad), medlemmer av familien Adenoviridae, er ikke-innhyllet DNA virus som mer enn 70 typer så langt har vært identifisert (http://hadvwg.gmu.edu). Avhengig av hemaglutination egenskaper, genomet struktur og sekvensering resultater, kan 70 annonsetypene deles inn i syv arter (menneskelige adenoviruses A til G)1,2. Det menneskelige genomet annonsen er 38 kb inne størrelse og innkapslet av en icosahedral nucleocapsid3. På grunn av sin overflod kalles kapsid protein hexon, penton base og fiber alle store kapsid proteiner. Den mest rikelig og største kapsid protein hexon danner 20 kapsid fasetter, hver bestående av 12 hexon homotrimers4,5. Penton, ligger icosahedral kanten (toppunkt), består av pentamers av penton base og representerer en base for vertex topp som bygges glycosylated fiber trimers5,6. Den opprinnelige annonsen celleoppføring består i utgangspunktet av to hovedtrinn. Først binder knotten fiber til primære reseptoren. I annonsetyper fra arter A, C, E og F er coxsackie og adenovirus reseptoren (bil). Dette samspillet bringer virion i romlig nærhet til celleoverflaten, og dermed tilrettelegge for samspill mellom mobilnettet integrins og RGD-motiv i penton base og dermed indusere mobilnettet svar. Andre endringer i cytoskeleton føre til internalisering virion og transport til endosome7. Ved delvis demontering i endosome, virion slippes til cytoplasma und slutt reiser til kjernen for replikering.

Mens annonsen leveres lokalt (f.eks., for genetisk vaksinasjon), systemisk levering gjennom blodet som kreves for onco-virotherapy ansikter flere barrierer. Mens sirkulerer i blodet, møte injisert virions forsvar av vertens immunsystemet, fører til rask nøytralisering av virus-basert vektorer og gjengivelse Ad-basert vektorer ekstremt ineffektiv i systemisk programmer. Videre den naturlige hepatotropism annonse forstyrrer systemisk levering og må løses omadressere annonsen til sin nye målcellene.

Germline-kodet naturlig IgM antistoffer av det medfødte immunsystemet raskt gjenkjenner og binder svært repeterende strukturer på overflaten av virion8,9. Disse immun komplekser aktivere klassisk og ikke-klassiske veier av komplement systemet, fører til rask komplement-mediert nøytralisering av en stor del av virions8. En andre sti som fører til store fjerning av annonsen virions er formidlet av makrofager10 og forbundet med akutt bivirkninger11,12-med giftig og hemodynamiske. I annonsen spesielt eliminere Kupffer celler i leveren binde til og phagocytically ta opp Ad virions via bestemte åtseldyr reseptorene, og dermed dem fra det blod13,14,15 . Bestemt åtseldyr reseptorer også identifisert på leveren sinusformet endotelceller (LSE celler)16, og LSE cellene også synes å bidra til vektor eliminering17, men til hvilken grad fortsatt trenger avklaring. Videre er enkelte annonsetyper og deres avledet vektorer effektivt sequestered av menneskelig erytrocytter18 som de binder via bil eller supplement reseptoren CR119. Av notatet, denne sequestering mekanismen kan studeres i mus modell systemet i kontrast til menneskelig erytrocytter, musen erytrocytter uttrykke ikke bil.

Spesifikke anti-annonse antistoffer generert av adaptive immunsystemet etter eksponering for annonsen enten på grunn av tidligere infeksjoner med annonsen eller etter den første leveransen i systemisk programmer heve en ytterligere hindring for effektiv bruk av annonsen vektorer, og de bør unngikk i effektiv systemisk levering.

Til slutt, den sterke hepatotropism av enkelte annonsetyper (inkludert Ad5) alvorlig hindrer programmet annonse i systemiske terapi. Denne tropism som fører til hepatocyte signaltransduksjon er høy affinitet av annonsen virion blod koagulasjon faktor X (FX), formidlet av samspillet av FX med det annonse hexon protein20,21,22. FX broer virion til heparin sulfate glykaner (HSPGs) på overflaten av hepatocytter20,23,24,25. En avgjørende faktor for denne samhandlingen synes å være bestemt omfanget av N - og O-sulfation av HSPGs i leveren24, som er forskjellig fra HSPGs på andre celletyper. I tillegg til denne FX-mediert veien tyder nyere studier ytterligere veier ikke identifisert som resulterer i annonsen signaltransduksjon hepatocytter26,27,28.

Nylig har det vist at FX ikke er bare involvert i hepatocyte signaltransduksjon annonse, men også av bindingen, virion skjold viruset partikkel mot nøytralisering av komplement systemet26. Reduksjon av hepatocyte signaltransduksjon ved å hindre FX bindende, derfor ville skape uønskede bivirkning av økende annonse nøytralisering via det medfødte immunsystemet.

En dyp kunnskap om komplekse interaksjoner mellom vektorer og vert organismer er derfor nødvendig å utvikle mer effektive vektorer for systemisk programmer som omgå hindringene pålagt av verten organisme.

En strategi som har vært opprinnelig brukt i terapeutisk proteiner er tilpasset annonse vektorer til minst delvis overvunnet ovenfor beskrevet barrierer. Antigenicity og immunogenisitet terapeutiske protein forbindelser kan reduseres ved å koble til polyetylenglykol (PEG)29,30. Derfor kovalente koblingen av polymerer som PEG eller poly [N-(2-hydroksypropylcellulose) methacrylamid] (pHPMA) til kapsid overflaten skjold vektor fra uønskede vektor-vert interaksjoner. Vanligvis mål polymer kopling ε-Amin grupper fra lysin siden rester som er tilfeldig fordelt på kapsid overflaten. Vector partikler i løsningen er, på grunn av hydrofile natur de vedlagte polymerer, omgitt av en stabil vann skall som reduserer risikoen for immun celle anerkjennelse eller enzymatisk degradering. Videre ble pegylert annonse vektorer vist å unngå nøytralisering av anti-hexon antistoffer i vitro og pre vaksineres mus i vivo31. I motsetning til genetisk kapsid modifikasjoner utføres kjemiske koblingen av polymerer etter produksjon og rensing, tillater ikke bruk av konvensjonelle produsent celler og produksjon av høy titer vektor aksjer, men også samtidig modifisering av aminosyrer på kapsid overflaten. Men skjer Amin rettet skjerming tilfeldig gjennom hele kapsid overflaten, noe som resulterer i høy heterogeneities og ikke tillater endring av bestemte capsomers. Videre, de store polymer moieties kreves for gunstige effekter svekke virus bioactivity32.

Å overvinne disse begrensningene, Kreppel et al. 33 innført en geneti-kjemiske konsept for vektor re- og de målretting. Cysteinene introdusert genetisk i virus kapsid løsemiddel-eksponerte posisjoner som fiber HI-loop33, protein IX34og hexon35,36. Selv om ikke naturlig forekommende, cystein rentebærende annonse vektorer kan produseres på høy titers i normal produsent celler. Viktigere, gir innsetting av cysteinene i bestemte capsomers og i ulike stillinger innenfor en enkelt capsomer svært spesifikke endringer av thiol gruppe-reaktive moieties. Denne geneti-kjemiske har vist seg å overvinne mange hindringer i annonsen vektor design. Kombinasjonen av Amin-baserte PEGylation for detargeting og thiol-baserte koblingen av transferrin til fiber knotten HI-loop har vist seg å lykkes bør du omkonfigurere modifisert annonse vektorer til bil-mangelfull celler33. Siden hexon er involvert i mest uønsket interaksjon (nøytralisere antistoffer, blod koagulasjon faktor FX), ble thiol-baserte endring strategier også brukt til hexon. Koble små PEG-moieties til HVR5 av hexon hindret annonse vektor partikler for å transduce SKOV-3 celler i nærvær av FX, mens store PEG moieties økt hepatocyte signaltransduksjon14,35. Annonse vektor partikler bærer mutasjoner i fiber knotten hemme bil bindende og HVR7 hemme binding av FX (og peiling satt cysteinene i HVR1 for posisjon-spesifikk PEGylation) ble vist å unngå antistoff - og komplement-mediert nøytralisering, og åtseldyr reseptor-mediert opptak uten tap infectivity. Interessant, til tross for mangel på naturlige FX skjoldet forbedret PEGylation igjen signaltransduksjon hepatocytes som en funksjon av PEG størrelse36. Imidlertid ble det vist at kovalente skjerming har en innvirkning på intracellulær menneskehandel prosesser. Prill et al. sammenlignet irreversibel versus bioresponsive skjold basert på pHPMA og viste at verken modus av skjerming eller co polymer hatt innvirkning på celleoppføring men påvirket partikkel handel til kjernen. Ansette en bioresponsive skjold med positivt ladede pHPMA co polymerer tillatt for partikkel handel til kjernen, opprettholde høy signaltransduksjon effektiviteten av annonsen vektorer i vitro og vivo37.

Oppsummert viser disse data at selv under forutsetning av at alle vektor-vert-interaksjoner ble kjent og vurdert, overdreven kapsid overflaten endringer er nødvendig å overvinne hindrene forbundet med systemisk vektor levering.

Her gir vi en protokoll for å utføre områdespesifikke kjemiske modifikasjoner av adenovirus vector capsids skjerme og/eller retargeting adenovirus vektor partikler og adenovirus-baserte kan virus. Konseptet med denne teknologien er skissert i figur 1. Den lar skjerming av visse kapsid regioner fra uønsket interaksjon av kovalente vedlegg av syntetiske polymerer. Samtidig gir det også en måte å knytte ligander og kombinere skjerming og målretting. Bruke enkel kjemi, vil forskere kunne endre covalently adenovirus vektor overflaten med en rekke molekyler inkludert peptider/proteiner, karbohydrater, lipider, og andre små molekyler. Videre gir protokollen et generelt begrep for kjemisk endring av biologisk aktive virus-avledet vektorer under vedlikehold av deres biologiske integritet og aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: I følgende, en protokoll for geneti-kjemisk PEGylation av en annonse vektor er beskrevet på detaljer. For å aktivere bestemte koblingen av PEG moiety, en Ad5 vektor var på forhånd genetisk endret ved å innføre en cystein rester i hexon proteinet hypervariable loop 5 som beskrevet i en tidligere publikasjon36, og en maleimide-aktivert pinne sammensatte brukes som kobling sammensatte.

1. utarbeidelse av buffere for vektor rensing av CsCL trinn graderinger

  1. Forberede 400 mL Adenovirus buffer (Ad-buffer) ved å legge til 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) og 150 mM NaCl (3.504 g/400 mL) til dobbel-destillert vann (ddH2O). 350 mL av denne bufferen er nødvendig for å forberede de følgende tre annonse-buffer variantene.
    1. Variant A: justere 150 mL Ad-buffer til pH 7.6 med NaOH.
    2. Variant B: legge en siste konsentrasjon av 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] til 50 mL og Juster den til pH 7.2 med HCl.
    3. Variant C: legge en siste konsentrasjon på 0,5 mM TCEP (0.022 g) til 150 mL og Juster den til pH 7.2 med HCl.
    4. Forberede bufferne i ddH2O og analytisk klasse kjemikalier. Bruk 100 mL hver variant A og variant C til å klargjøre CsCl-buffere (se trinn 1.2 og 1.3; 50 mL av hver) nødvendig for CsCl trinn graderingene (se trinn 3.2.6. og 3.2.18).
  2. Forbereder CsCl trinn gradient bufferen (ρCsCl = 1.41 g/cm3) i Ad-buffer
    Merk: Denne bufferen vil være nødvendig i to forskjellige varianter:
    1. Veie to dele akkurat 27.42 g CsCl til 50 mL rør.
    2. ΡCsCl = 1,41/TCEP buffer: løse CsCl i 40 mL variant C Ad-bufferen.
    3. ΡCsCl = 1.41 buffer: løse CsCl på 40 mL A type annonse-buffer.
    4. Sjekk og om nødvendig justere pH HCl. Fyll opp nøyaktig 50 mL av tilsvarende annonse-buffer-varianten. For å oppnå de beste resultatene for separasjon, er nøyaktig CsCl konsentrasjonen og pH avgjørende.
    5. Kontroller tetthet (CsCl innhold) ved veiing 1 mL (1.41 g) av hvert gradient buffer.
  3. Forbereder CsCl trinn gradient bufferen (ρCsCl = 1.27 g/cm3) i Ad-buffer
    Merk: Denne bufferen er nødvendig i to forskjellige varianter:
    1. Veie to dele akkurat 18.46 g CsCl i 50 mL rør.
    2. ΡCsCl = 1.27/TCEP buffer: løse CsCl i 40 mL variant C Ad-bufferen.
    3. ΡCsCl = 1.27 buffer: løse CsCl på 40 mL A type annonse-buffer.
    4. Sjekk og om nødvendig justere pH med HCl. Til slutt, fylle opp nøyaktig 50 mL av tilsvarende annonse-buffer-varianten. For å oppnå de beste resultatene for separasjon, er nøyaktig CsCl konsentrasjonen og pH avgjørende.
    5. Kontroller tetthet (CsCl innhold) ved veiing 1 mL (1.27 g) av hvert gradient buffer.
  4. Sterilisere alle buffere (Ad-buffere og CsCl trinn gradient buffere) av filtrering (bruker 0,45 µm mesh porestørrelse) i sterilt flasker.
  5. Etter sterilisering, for å hindre oksidasjon av TCEP, mette og overlegg bufferne som inneholder TCEP med argon ved sparging bufferne med argongass for om 30 s. Ta vare å bare bruke sterilt utstyr (f.eks., sterile Pipetter tips) når den argongass, og bruk flasker stor nok argon spekk.
    Merk: Alle buffere bør være forberedt fersk og beskyttet fra lys og kan lagres på 4 ° C i flere dager (spesielt CsCl trinn gradient bufferne som bare vare et par dager).

2. koblingen Moieties: Lagring og tilberedning

Merk: Moeities brukes for kopling til cysteinene må bære thiol-reaktive grupper. Maleimide-aktivert forbindelser vil danne stabil thioether obligasjoner med genetisk introdusert cysteinene. Alternativt Orto-pyridyldisulfide (OPSS)-aktivert forbindelser kan brukes, som danner bioresponsive disulfidbroer mellom vektor partikler og kopling moiety. Lyofilisert malPEG-750 som de fleste andre kopling reagenser er følsomme for hydrolyse og bør lagres tørt i form av lyofilisert pulver på-80 ° C.

  1. For å hindre oppbygging av kondens vann ved tiner hetteglass, lagre ampullene i større rør (f.eks., 50 mL rør) fylt med en pute av silica gel perler. Lagre disse rørene i en tilstrekkelig større beholder også fylt med en silica gel perle pute.
  2. Før du lukker tett hver rør og container, utveksle luften med argongass. Dette kan oppnås ved å plassere det åpne rør og beholdere i en desiccator, etterfulgt av fjerne og erstatte luften med argongass. Siden argongass er tyngre enn luft, rør og beholdere er fylt med argongass og kan nå plasseres i hverandre, med hver lokk tett lukket.
  3. Lagre containere på-80 ° C.
  4. Når tining, plasser containere på silica perler i en desiccator og sakte varm dem opp til romtemperatur, deretter åpne beholderen.
  5. Når du utfører et koblingen reaksjon, fersk løse mengden kopling substrat trengte inn riktig løsemiddelet. Ta vare ikke å legge til mer enn 10% av løsning til den endelige kopling reaksjonen, spesielt hvis DMF eller DMSO brukes som løsemiddelet for kopling underlaget.

3. forsterkning, rensing og kjemiske modifikasjoner av annonsen vektorer:

  1. Forsterkning av annonsen vektorer
    Merk: Følgende fremgangsmåte må utføres med sikkerhet regjering etter lokale biologiske sikkerhetsregler.
    1. Transfect en replikering mangelfull ∆E1 annonse vektor inneholder en (eller flere) genetisk introdusert cystein residue(s) i HEK 293 celler som beskrevet av Kratzer og Kreppel38.
    2. Ifølge protokollen38, forsterke vektoren av sekvensiell reinfections til en siste skytevåpen infeksjon i 15-20 store (15 cm) celle kultur plater (ca 1-2 x 107 celler/plate).
      Merk: Optimalt, den siste infeksjon bør være tidsbestemt slik at celler Vis full cytopathic virkning (CPE) om morgenen rensing og endring (se figur 2).
    3. Etter siste forsterkning trinn, kan celler resuspended i annonsen buffer + 10 mM TCEP (variant B) være frosset om-80 ° C; men for optimal avkastning av vektor partikler anbefales en umiddelbar oppfølging av cellen lyse og vektor rensing og modifikasjon.
  2. Rensing og kjemisk endring av annonsen vektorer
    Merk: Rensing av vektorer er utført i henhold til adenovirus rensing protokollen beskrevet i38men under ikke-oksiderende forhold. Høsting og lyse samt vektor rensing og kjemisk endring kan utføres innen en dag. Høste og lyse infiserte celler i henhold til protokollen beskrevet tidligere38.
    1. Samle celler ved skraping platene og overføre nedbryting til 200-500 mL sentrifugering rør.
    2. Spinne celle løsningen for 10 min 400 x g.
    3. Resuspend celle pellet 4 mL av Ad-buffer + 10 mM TCEP (pH 7.2) (variant B) og overføring til en steril 50 mL tube. Hvis cellen avkastningen er lav eller bare en svak CPE ble indusert, resuspend det i 2 mL.
    4. Redde vektoren ved 3 sykluser av frysing (i flytende nitrogen) og tining (i et vannbad 37 ° C).
    5. Spinn på 10 min 5000 x g på 4 ° C.
    6. Mens sentrifugering, forberede to like CsCl trinn forløpninger:
      1. Først som de lave faser, legge 3 mL 1.41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, variant C) i ultracentrifuge rør. Merk nivået av de lave faser på røret før du legger den øvre fasen.
      2. Nøye stable den øvre fasen av 5 mL av 1.27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, variant C) av veldig sakte pipettering 5 mL volumet langs veggene av røret til de lave faser.
        Merk: Siden under kobling en høy konsentrasjon av TCEP kunne reagere med maleimide rester av malPEG-750 og føre til redusert kopling effektivitet, rensing av CsCl trinn gradering må utføres allerede under en redusert TCEP konsentrasjon.
    7. Laste nedbryting på graderingen som CsCl [enten like deler nedbryting på begge forløpninger eller, i tilfelle en lav vektor avkastning (se ovenfor), laste nedbryting på bare én kolonne], og fylle begge graderinger like til toppen med annonsen buffer + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variant B).
    8. Juster vekten av motsatt rør til en 0.0 g vekt.
    9. Ultracentrifuge for 2t 176,000 x g på 4 ° C.
    10. Med en klemme, fikse ultracentrifugation røret til et stativ, forlater området rundt lavere fase nivå merket tilgjengelig. Plass svanehals lampen over røret. Rundt merke, på grensen mellom de nedre og øvre fasene, skal et distinkt band (vektor virions) vises (figur 3A-3 C).
    11. Samle vektorer av punktering røret med en nål og håper vektor bandet sprøyter til. Overføre samlet vektor virions til en 15 mL tube.
      Merk: Svakere band over annonsen vektor bandet inneholder ufullstendig vektor partikler og bør unngås for aspirasjon. Celle rusk og grønn fluorescerende protein (EGFP) av EGFP-uttrykke Ad-vektorer samler i den øvre delen av ultracentrifuge tube (se figur 3A og 3B). Dette og følgende til kopling (trinn 3.2.16) skal utføres raskt, som vektorer er nå fornuftig å disulfide bånd på grunn av den lave TCEP konsentrasjonen.
    12. For å beregne mengden av kopling substrat nødvendig for effektiv komplett binding av underlaget alle cystein rester i vektor utarbeidelse, måle OD260:
      1. Ifølge protokollen beskrevet av Kratzer og Kreppel38, vortex en blanding av 10 µL av samlet vektor virions, 89 µL annonse bufferen og 1 µL av 10% SDS. Som Tom sonde, vortex 99 µL av Ad-buffer og 1 µL av 10% SDS.
      2. Hvis du vil denature virions, ruge både på 56 ° C i 10 min.
      3. Bestemme OD260.
      4. Beregne fysiske vektor titer per µL hjelp av følgende ligning: OD260 x faktor på fortynning x empirisk bestemt utryddelse koeffisient av annonsen (1,1 x 109 vektor partikler = 1 OD260 enhet/µL). Derfor en målt OD260 av 1,36 av en vektor utvannet 1:10, beregner til: 1,36 x 10 x 1.1 x 109 = ca 1,5 x 1010 vektor partikler/µL.
        Merk: Denne titer er bare en grov estimering; men er det nøyaktig nok for stoichiometric beregningene skissert nedenfor.
    13. Avhengig av proteinet endret av innføring av en cystein og bestemme mengden av kopling substrat (i gram) for en effektiv kobling reaksjon, i henhold til følgende generelle ligningen: Virus titer x volum x antall cysteinene x av moiety x Molekylær vekt moiety / 6,022 x 1023 = gram av underlaget.
      Merk: I denne ligningen: 1) virus titer titer/µL, bestemmes av OD260 som beskrevet ovenfor, 2) volum kontoer for volumet i µL av håpet vektor brukes i kopling reaksjonen, 3) antallet cysteinene er antall proteiner som cystein rester ble introdusert per vektor partikkel, 4) av moiety er faktoren moiety overflødig nødvendig for en effektiv kobling reaksjon (50 x) og 5) molekylvekt av moiety må innføres som Da (ikke kDa).
    14. Løse ferske mengden sammensatte (eller mulig beløpet) behov i det aktuelle løsemiddelet.
      Merk: Som kobling substrat nødvendig er lav og vanskelig å veie men dyre, veie minimalt med sammensatte mulig og oppløse den i et passende konsentrasjon skal kopling reaksjonen.
    15. Overføre vektor løsningen til en passende størrelse tube (f.eks 2 mL tube) og legge det beregnede beløpet av sammensatte lagerløsning til vektor.
    16. Bland forsiktig løsningen av overhead rotasjon 1t ved romtemperatur.
    17. Fyll opp vektor løsningen 6 mL totale volumet med Ad-buffer (pH 7.6, variant A).
      Merk: Dette trinnet må utføres før løsningen brukes til trinn forløpningen slik at vektor løsningen, som inneholder CsCl fra første trinn graderingen, har en tetthet under 1.27 g/mL.
    18. I andre CsCl striper trinnet, rense vektor fra Ureagert koblingen moiety:
      1. Forberede to like CsCl trinn forløpninger ved å utføre følgende trinn for hver: 1) nedre fase: 3 mL 1.41 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer (pH 7.6, variant A), 2) merke nivå lavere fase på røret før lasting øvre fase, og 3) øvre fase : 5 mL av 1.27 g/cm3 ρCsCl i Ad-buffer (pH 7.6, variant A).
        Merk: Etter koblingen har funnet sted, buffere uten TCEP brukes som ingen gratis thiol grupper skal nå vises på vektor-capsids.
      2. Last nedbryting på graderingen som CsCl og fylle begge graderinger like til toppen med Ad-buffer (pH 7.6, variant A).
      3. Juster vekten av motsatt rør til en 0.0 g vekt.
    19. Ultracentrifuge for 2t 176,000 x g på 4 ° C.
    20. Like før slutten av ultracentrifugation, equilibrate en PD-10 kolonne 5 ganger med 5 mL av Ad-buffer (pH 7.6, variant A).
    21. Som i trinn 3.2.10, rette ultracentrifugation røret å stå forlate området rundt lavere fase nivå merke tilgjengelig. Plass svanehals lampen over røret. Igjen, rundt grensen mellom nedre og øvre fasene, en distinkt band (vektor virions) skal være synlig (Figur 3 c).
    22. Samle vektorer av punktering røret med en nål og håper vektor bandet i en sprøyte, og overføre vektoren slik 15 mL. Pass på å samle virions både gradient rør sammen som et totalvolum på 2,5 mL eller mindre. Hvis et mindre volum er samlet, fyll for å få en 2,5 mL totale volumet med annonsen buffer (variant A).
    23. Laste det 2,5 mL på equilibrated PD-kolonnen. Kast gjennomflytsenhet.
    24. Legge 3 mL annonse buffer (variant A) på kolonnen og samle gjennomflytsenhet (inneholder renset vektor-virions).
    25. Legge til glyserol (333 µL) å få en endelig konsentrasjon på 10% og deler inn i passende dele (f.eks 400 µL hver), og inkluderer en aliquot av 20 µL for titer vilje ved OD260 måling.
    26. Lagre vektor løsningen på-80 ° C.
    27. Bestemme titer av vektor ved å måle den OD260 20 µL vektor løsning, 79 µL av Ad-buffer (variant A) og 1 µL av 10% SDS som beskrevet i trinn 3.2.12. Som et tomt, kan du bruke 79 µL av Ad-buffer (variant A), 10 µL 10% glyserol og 1 µL av 10% SDS.
    28. Beregne vektor titer som: OD260 x faktor på fortynning x 1,1 x 109 vektor partikler/µL.
      Som forberedt i trinn 3.2.27, beregne: OD260 x 5 x 1,1 x 109 vektor partikler/µL

4. verifisering av kopling SDS-side:

Merk: Hvis forbindelser med tilstrekkelig høy molekylvekt brukes for kopling til Ad virions, kobling kan verifiseres av polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). Vellykket kobling skal deretter resultere i en endring av protein bandet tilsvarer modifisert annonse virion protein, sammenlignet med proteinet i uendret Ad virion (se Figur 4).

  1. Ifølge den beregnede titer av vektor (trinn 3.2.28), separat 1-2 x 1010 vektor partikler SDS-side (8%).
  2. Utvikle gel av sølv flekker av gel39 å oppdage selv svak protein band:
    1. Klargjør buffere sølv flekker (beløpene som trengs til 100 mL bufferen er angitt i parentes):
      1. Forberede buffer 1 ved å blande 38 mL ddH2O, 50% MeOH (50 mL av 100 MeOH), 12% AcOH (12 mL av 100% AcOH), og 0.0185% HCHO (50 µL av 37% HCHO).
      2. Forberede buffer 2 ved å legge til 50% EtOH (50 mL av 100% EtOH) til 50 mL av ddH2O.
      3. Forberede buffer 3 ved å legge 0.127 finans Na2S2O3 (12.744 mg) 100 mL ddH2O.
      4. Forberede buffer 4 ved å legge til 2 finans AgNO3 (0.2 g) og 0.0185% HCHO (50 µL av 37% HCHO) til 100 mL ddH2O.
      5. Forberede buffer 5 ved å legge til 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185% HCHO (50 µL av 37% HCHO), og 2,5 mg/L Na2S2O3 (0.256 mg) ddH2O å få en siste volum 100 mL.
      6. Forberede buffer 6 ved å blande 38 mL ddH2O, 50% MeOH (50 mL av 100% MeOH), og 12% AcOH (12 mL av 100% AcOH).
      7. Forberede buffer 7 ved å blande 60 mL ddH2O, 30% MeOH (30 mL av 100% MeOH), og 10% glyserin (10 mL av 100% glyserin).
      8. Forberede buffer 8 ved å blande 10% glyserin (10 mL av 100% glyserin) med 90 mL ddH2O.
  3. Utføre sølv flekker
    1. Fastsette gel i buffer 1 for 30 min.
    2. Vask gel i buffer 2 i 15 min.
    3. Pretreat gel i bufferen 3 for 1 min.
    4. Vask gel 3 ganger i ddH2O for 20 s.
    5. Impregner gel i bufferen 4 for 20 min.
    6. Vask gel 2 ganger i ddH2O for 20 s.
    7. Utvikle gel i bufferen 5 til band er synlig (10 å 10 min).
    8. Vask gel 2 ganger i ddH2O i 2 minutter.
    9. Stoppe utviklingen i bufferen 6 for 5 min.
    10. Spare gel i bufferen 7 for 20 min.
    11. Lagre gel i buffer 8.
      Merk: Kopling effektivitet kan bestemmes av densitometric kvantifisering av modifisert og uforandret bånd til målrettet capsomere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser eksempler cytopathic effekt (CPE) på 293 (HEK 293) celler som angir vellykkede vektor produksjon. Celler skal vise morfologi (figur 2C) 40 – 48 timer etter vaksinering med virus vektoren. Det riktige timepoint for høsting er avgjørende for ikke å miste viruspartikler av cellen lyse og hindre oksidasjon av genetisk introdusert thiol grupper. Hvis vektor partikler slippes til medium av cellen lysis, genetisk introdusert thiols vil nesten umiddelbart bli oksidert og det vil bli vanskelig å rense og kjemisk endre dem.

Figur 3 viser eksemplarisk CsCl band. Formålet med usammenhengende CsCl striper før kjemisk endring er å fjerne mobilnettet rusk fra viruspartikler. Modifikasjonen selv kan da finne sted i CsCl. Andre banding etter kjemisk endring tjener til å fjerne et overskudd av (Ureagert) kopling moiety. Av notatet, en vellykket endring av viruset ikke kan ses i forløpningen og krever ytterligere molekylær analyse, ideelt ved SDS-side.

Figur 4 viser vanlige eksempler på vellykkede kapsid modifikasjoner. De fleste moieties koblet til bestemte capsomeres vil endre kjører virkemåten til respektive capsomeres i SDS-side. Direkte sammenligning med en endret kontroll, suksess for kobling kan bekreftes, og densitometric analyse kan hjelpe bestemme total kopling effektivitet (prosent av skiftet og unshifted band for den endrede capsomere).

Figure 1
Figur 1: kombinert genetiske og kjemiske kapsid modifikasjoner av adenovirus vector capsids aktiverer kovalente feste skjerming polymerer og målretting ligander. Cystein rester er genetisk introdusert på valgte, løsemiddel-utsatt kapsid ledd av adenovirus vector capsids å utstyre vektor partikler med nye kjemiske reaktivitet. Vektorer kan produseres ved hjelp av konvensjonelle produsent celler og protokoller. Etter produksjon endres genetisk introdusert cystein rester spesielt og covalently med thiol-reaktive kopling moieties (ligander, skjerming polymerer, karbohydrater, små molekyler, fluorescerende fargestoffer, osv.). For kopling, kan maleimide-aktivert forbindelser (som danner stabile thioether obligasjoner med vektor partikkel overflaten) eller pyridyldisulfide derivater (som danner bioresponsive disulfidbroer) anvendes. Etter kopling, blir vektorer renset ved usammenhengende CsCl striper for å fjerne Ureagert overflødig koblingen moieties. PEG, polyetylenglykol (skjerming polymer); L, ligander (avledet fra et bredt spekter av stoff klasser); -SH, thiol funksjonaliteten til genetisk introdusert cystein rester. Bruke denne teknologien, et definert antall molekyler covalently kan kobles til vektor-capsids, og et nøyaktig utvalg av webområdet koblingen er mulig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Cytopathic Virkning vektor komponentoversikten. Konvensjonelle produsent celler (her, 293-HEK celler) kan brukes til produksjon av genmodifiserte vektorer før kjemisk endring. CPE viser den beste timepoint å høste celler. (A) celler to timer etter infeksjon, (B) celler 24 timer etter infeksjon, og (C) celler 40 timer etter smitte før høsting. Skalere barer = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksemplarisk resultatene av CsCl graderinger. CsCl fargeovergangar før (A, B) og etter (C) kjemisk endring. (A) en adenovirus vektor er bundet av usammenhengende CsCl tetthet gradert sentrifugering. Den øvre fasen grønn siden vektoren vises bærer en hCMV-arrangøren-drevet uttrykk kassett for EGFP. Vector virion er bundet som et enkelt, hvite band i nedre tredjedel av røret. De to mindre bandene (over) stammer fra ufullstendig partikler, som ikke skal hentes. (B) en cystein-bærende EGFP-uttrykke annonse vektor før kjemisk endring. (C) samme vektor etter endring. Bandet i nedre tredjedel av røret samles og renset ved en avsalting kolonne. Penn merket i B og C merker grensen mellom de to tettheter og kan identifisere plasseringen av vektor bandet som skal samles. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: SiIver-farget SDS-side å vurdere kopling effektivitet. MW markør i lane 1. En vektor med cysteinene introdusert i capsomeres penton base, og hexon ble igjen uendret (lane 2) eller endret med maleimide-aktivert pinne (polyetylenglykol) med en molekylvekt av 5 kDa (lane 3). Både hexon og penton base viser et skifte i SDS-side, indikerer vellykket endring av > 90% av monomerer per kapsid. En vektor med en cystein rester i hexon var igjen uendret (lane 4), endret 5 kDa pinne (lane 5) eller 20 kDa pinne (lane 6). Det bør bemerkes at større skifte av hexon bandet er på grunn av høyere molekylvekt av de 20 kDa PEG, sammenlignet med 5 kDa pinne (lane 5). Gel viser spesifisitet og effektiviteten av koblingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Effektiviteten som de genetisk introdusert cysteinene kan bli kjemisk endret er vanligvis 80-99%, og enkelte variabler påvirke dette effektivitet. Først er det viktig at de genetisk introdusert cysteinene ikke gjennomgår tidlig oksidering. Samtidig er godt beskyttet i å redusere miljøet produsent cellene, er det obligatorisk å gi et ikke-oksidativ miljø etter frigir vektor partikler fra produsent cellene og under kjemisk endring. Dette reduserer reagenser kan brukes i konsentrasjoner fra 0,1-10 mM, og det er nødvendig å bruke redusere reagenser som ikke inneholder thiol grupper som ville lett reagere med maleimide-aktivert forbindelser. Andre når du bruker maleimide-aktivert forbindelser, bør pH under kopling reaksjonen ikke overstige 7.35, siden en pH på større enn 7.4 kan redusere spesifisiteten av reaksjonen. Tredje, i alle fall Amin-fri buffere (f.eks HEPES, PBS) bør brukes for reaksjonen. Av notatet, kan cystein rentebærende vektor partikler renses dobbel CsCl striper som beskrevet, og deretter lagret i HEPES/10% glyserol før kjemisk endring. I dette tilfellet, 0.1-1 mM TCEP skal brukes en redusert reagens, eller helst vektorer bør lagres på en argon atmosfære. Fylt med Argon plast krukker med lokk kan brukes til dette formålet. I tillegg er endringen effektivitet påvirket av etter diameteren på sammensatt koblet til capsids og området som den kombinert. Mange capsomeres som kan tjene som mål for spesifikk geneti-kjemisk endring finnes i kapsid som trimers (fiber, hexon) eller pentamers (penton base). Derfor avhengig av genetisk introdusert cystein, kan et moiety molekyl koplet til en monomer sterically hindre koblingen av et annet molekyl til den nærliggende monomer. Dette bør vurderes når du velger ideelle områder for geneti-kjemiske kapsid modifikasjoner.

For å lette feilsøking, kan noen problemer oppstå når du følger protokollen beskrevet. Første, lav vektor gir (under 10.000 vektor partikler per produsent celle) kan skyldes suboptimal infeksjon produsent celler. 100-300 MOI bør ideelt sett brukes for infeksjon av produsent celler. Vær oppmerksom på at både for høy og for lav vektor beløp for inoculum generere suboptimal avkastning. Det er ideelt til passering produsent celler dagen før infeksjon. Andre, smeary band i CsCl graderingene kan vises. Den hyppigste årsaken smeary utseendet på band i CsCl graderingene er en pH på CsCl løsninger som for surt. Redusere reagensen TCEP er svært sure, og må være forsiktig å justere pH før lasting vektoren på gradient, siden adenovirus vektorer lett oppløsning i en syrlig miljø. Tredje, lav kopling effektivitet (< 80% av kopling) er hyppigste resultatet av urene vektor preparater og/eller tidlig oksidasjon av thiol grupper på vektor overflaten. Urenheter kan oppdages av SDS side og sølv flekker. I tilfelle som betydelig urenheter oppstår skal vektor produksjon startes. I tillegg kan lav kopling effektivitet være forårsaket av gratis ikke-vector thiols i reaksjonen. Derfor anbefales det ikke å bruke ß-mercaptoethanol eller dithiothreitol som reduserer reagenser, siden begge inneholder gratis thiol grupper. Av notatet, velge løsemiddel-tilgjengelige nettsteder å innføre cystein rester som kan lett bli endret, skal crystal strukturer brukes; ellers, cysteinene vil ikke være tilgjengelig kobling partneren. Tidlig oksidasjon av thiols på vektor overflaten kan unngås ved å bruke strenge argon og/eller TCEP.

Til slutt, feil stoichiometric beregninger kan også føre til lav kopling effektivitet. Eksemplet nedenfor er ment å illustrere generiske formelen presentert ovenfor og lette stoichiometric beregningene. I eksemplet er en cystein introdusert i hexon capsomere. Titer vektor partikler etter den første CsCl trinn gradient rensing bestemmes 1,5 x 1010 vektor partikler per µL, og kopling moiety, malPEG-750 brukes. Hver vektor kapsid inneholder 720 hexon proteiner (240 trimers), så titer av cysteinene per µL derfor summerer 720 x 1,5 x 1010 = 1.08 x 1013 cysteinene/µL. For å endre 1,5 mL av vektor partikler, totalt 1.62 x 10 må16 cysteinene være reagert med kopling moiety. For å nå effektiv kobling, en 50 x molar overskudd av koblingen sammensatte til summen av cystein rester anbefales: 1.62 x 1016 x 50 = 8.1 x 1017 molekyler av malPEG-750 er nødvendig å effektivt til 1,5 x 1016 cysteinene av 1,5 mL vektor løsning renset ved første CsCl trinn graderingen. MalPEG-750 utstillinger en molekylvekt på 750 Da; derfor veie 6.022 x 1023 molekyler av malPEG-750 750 g. Derfor, for effektiv kobling av 1.62 x 1016 cystein rester i 1,5 mL vektor løsning med en 50 x overskudd av malPEG-750, 8.1 x 1017 molekyler av malPEG-750 = (750 x 8.1 x 1017) / (6,022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg malPEG-750 kreves.

Metoden presentert utfyller og overskrider metoden for vektor PEGylation. Konvensjonelle, Amin rettet vektor PEGylation tillater ikke områdespesifikke feste skjerming eller rettet mot moieties, mens geneti-kjemiske kopling teknologien presentert her kan brukes nøyaktig knytte moieties til adenovirus vektor overflater på definerte posisjoner og i definerte kopi tall. Derfor er det egnet for både beskyttelse og målretting adenovirus vektor partikler.

Av notatet, kan denne protokollen også brukes for en konvensjonell Amin-rettet PEGylation av annonsen vektorer nevnt ovenfor. I så fall utelates redusere reagensen TCEP fra bufferne. Antall tilgjengelige Amin grupper pr. partikkel kan anses å være 18 000 for stoichiometric beregninger, og typisk molar utskeielser av Amin-reaktive kopling moieties er 20-100 fold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 3-35 (2003).
  2. Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
  3. Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
  4. van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
  5. Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
  6. Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
  7. Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
  8. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  9. Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
  10. Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
  11. Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
  12. Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
  13. Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
  14. Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
  15. Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
  16. Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
  17. Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
  18. Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
  19. Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
  20. Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
  21. Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
  22. Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
  23. Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
  24. Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
  25. Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
  26. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  27. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  28. Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
  29. Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
  30. Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
  31. O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
  32. Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
  33. Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
  34. Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, (11), 1813-1824 (2008).
  35. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  36. Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
  37. Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
  38. Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. Clifton, NJ. 377-388 (2017).
  39. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics