CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

Cancer Research
JoVE Journal
Cancer Research
AccessviaTrial
 

Summary

여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kueberuwa, G., Zheng, W., Kalaitsidou, M., Gilham, D. E., Hawkins, R. E. A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells. J. Vis. Exp. (140), e58492, doi:10.3791/58492 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

CD19 공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 놀라운 임상 성공 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) andnon-Hodgkin 림프 종 (NHL)에 대 한 두 번째 세대 공상 항 원 수용 체 (자동차)의 승인을 주도하 고 있다. 필드의 초점은 이제 덜 인상적 완전 한 응답 속도 관찰 된다 다른 혈액 악성 종양에서 이러한 성공을 모방에 있습니다. 자동차 T 세포 또는 다른 치료 modalities의 공동 관리의 엔지니어링 추가 다른 암 설정에서 성공적인 치료에 장애물 극복 성공적으로 수 있습니다.

우리는 따라서 다른 CD19 자동차 T 세포의 전 임상 테스트 수행할 수 있는 모델을 제시. 이 테스트 B-세포 림프 종 모델 결과 일반적으로 유익한 자동차 T-세포 치료 될 것.

이 프로토콜을 사용 마우스의 재현 생산 MP71 retroviral 구조와 pCL 에코 포장 플라스 미드 retroviral 입자 분 비의 컬렉션 뒤 같은 E 프로듀서 셀 칼슘 인산 염 transfection 통해 자동차 T 세포와 재조합 인간 fibronectin 조각 및 원심 분리를 사용 하 여 변환입니다. Retroviral 변환의 유효성 검사 및 확인 대상 림프 종 세포 vivo ex, cytometry, luminometry 및 효소 연결 된 immunosorbent 사용 죽 차 T 세포 수의 시험 (ELISA), 또한 설명.

프로토콜 테스트 차 T 세포 vivo에서 lymphoreplete에 고 lymphodepleted syngeneic 마우스, 베어링 설립, 조직 림프 종 같습니다. 안티-암 활동 vivo에서 생물 발광 및 질병 진행에 의해 모니터링 됩니다. 우리 때 1세인트 또는 lymphodepleting 사전 및 자동차 T를 활용 하 여 장기 remissions 달성 하는 쥐의 소수와 함께 2 세대 자동차 설립된 B-세포 림프 종의 근절의 전형적인 결과 보여 셀 lymphoreplete 쥐에 IL-12를 표현입니다.

이러한 프로토콜은 다른 추가 수정, 차 T 세포의 조합 및 다른 치료제와 CD19 차 T 세포를 평가 하는 데 사용 하거나 다른 대상 항 원에 대 한 자동차 T 세포의 사용을 위해 적응 수 있습니다.

Introduction

공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 CD19 치료에 놀라운 임상 성공을 보이고 있다+ 재발된 급성 림프 구성 백혈병1 과 axicabtagene tisagenlecleucel의 승인에 지도 하는 악성 종양 진보적인 큰 B-세포 비 Hodgkin 림프 종2 2017에 대 한 ciloleucel.

암과 질병의 진행 및 치료 메커니즘 모두에서 면역 체계 사이 상호 작용의 중요성은 점점 더 인식된3,4,되 고5. 예, 그것은 잘 종양 microenvironment (TME) 면역 세포6,,78의 이펙터 기능을 억제할 수 있는 요인으로 맞이 하 게 됩니다 문서화. 또는 생 면역 세포와 epitope 확산 못쓰게 종양 퇴치 및 장기 저항 종양 도전9,10키 수 있습니다. 이러한 현상의 둘 다 면역 체계가 부족 xenogeneic 모델에서 평가할 수 없습니다. 마찬가지로, 유전자 변형 단백질을 이용 하 여 시스템 epitope11,12확산에 필요한 면역 관용을 깨는 도전을 정확 하 게 반영 하지 않습니다. 따라서, 완전 한 기능 면역 체계와 syngeneic 모델은 암 질병 진행 및 면역 치료제의 이러한 중요 한 측면을 모델링을 위한 파라마운트.

자동차 T-세포 치료의 중요 한 경고 lymphodepleting 사전 조절 치료 성공13,14필요 하다는 것 이다. 이것은 일반적으로 자동차 T 세포15,16의 주입 전에 화학요법을 투여 하 여 환자에 달성 된다. 표준 방법으로 환자의 설정에서 사용 하는 lymphodepletion를 모방 하기 위해 우리 관리 5 Gy 총 몸 방사선 조사 (TBI) 마우스 베어링 조직의 A20 B-세포 림프 종 치료 차 T 세포의 이전 lymphodepletion를 달성 하기 위해.

Lymphodepleting 사전 컨디셔닝 대부분의 환자에 대 한 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 화학요법 에이전트와 함께 제공 되는 독성의 낮은 성능 상태 환자 차 T-세포 치료 받을 수 있습니다 의미 합니다. Lymphodepletion에 대 한 부적격 환자를 나타내는 테스트 시스템을 만들려면, 우리는 우리가 자동차 T-세포 림프 종 치료 모델 lymphoreplete syngeneic 마우스 모델 설립. 이 모델에서 차 T 세포 내에서 IL-12의 분 비의 성공률와 함께 설립된 림프의 박멸 이어질 수 살펴보았습니다 ~ 2517. 또한, 우리는 내 생 면역 세포 암 퇴치에 참여 했다 보였다.

여기 우리가 자세히 설명 마우스 자동차 T 세포의 생산을 위한 프로토콜 syngeneic 쥐 및 또는 lymphodepleting 사전 컨디셔닝의 사용 없이 차 T 세포 림프 종 치료에 림프 종 설립. 이 다른 transgenes 차 T 세포를 테스트 하는 다른 에이전트와 자동차 T 세포의 조합 연구 또는 림프 종에 대 한 다른 입양 세포 치료 또는 immunotherapy 전략의 사용에 대 한 사용할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 실험 연구 지침에 대 한 동물 (과학적인 절차) 행위 1986의 후원 및 영국 조정 위원회에서 실시 했다. 모든 동물 연구 CRUK-맨체스터 연구소에서 실시 되었고 로컬 동물 복지에 의해 승인 하 고 윤리 검토 바디 (CRUK MI AWERB).

1입니다. 준비

  1. Maxiprep pMP71 retroviral 플라스 미드 및 pCL 에코 레트로 바이러스 포장 플라스 미드18구성 합니다.
    참고: pMP71 mCherry와 FMDV2A 시퀀스를 구분 하는 자동차를 인코딩합니다. 이것은 다른 retroviral 구문으로 상호 교환 이다. pCL-에코 개 그, 유류 및 ecotropic 봉투 단백질을 인코딩합니다.
  2. RPMI 1640 매체, FCS 10%, 1 %100 x 페니실린-스-글루타민 (PSG)를 사용 하 여 마우스 T 세포 배양에 대 한 완전 한 T 세포 매체 (TCM)을 준비 합니다.
    참고: 솔루션에 들어 있는 100 IU/mL 페니실린, 스의 100 µ g/mL와 L-글루타민의 2 mM), 50 μ M β-mercaptoethanol 및 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES).
  3. A20 셀 RPMI 1640, 10% FCS 0.05 m m β-mercaptoethanol 37 ° C, 5% CO2에서 문화.
  4. 문화 완전 한 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) (10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 2 m L-글루타민, 1 μ g/mL puromycin 및 10 μ g/mL blasticidin m과 DMEM) 37 ° C에서 플래티넘-E (같은-E) 셀 5 %CO2.
    참고: 같은 E 셀 293T 세포에서 파생 되 고 개 그, 유류 및 ecotropic 봉투 retroviral 단백질을 표현 한다.
  5. 미디어 솔루션 1과 transfection 직전 2 transfection를 준비 합니다. 솔루션 1 (pH 7.9) DMEM + 10 %FCS + 25mm HEPES, 솔루션 2 (pH 7.1) DMEM + 25mm HEPES 포함을 포함 준비.
  6. 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 희석 하 여 10 μ g/mL 재조합 인간 fibronectin 조각 솔루션을 준비 하 고 사용까지-20 ° C에서 저장.
  7. 멸 균 (재조합 인간 fibronectin 조각 제외)를 사용 하 여 이전 0.2 μ m 필터를 통해 모든 미디어를 필터링 합니다.

2. T 세포의 retroviral 변환

  1. Transfection에 대 한 제 1 일: 준비
    1. 씨앗 7.5 x 106 플래티넘-E (같은-E) 세포가 완전 한 DMEM의 18 ml에서 15 cm2 조직 문화 요리에서 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
  2. 제 2 일: Transfection 같은 E retroviral 포장 셀 라인의
    1. Pcl-에코 패키징 벡터 DNA, 플라스 미드 DNA 인코딩 retroviral 자동차 구조 및 15 cm2 접시 당 3 mL transfection 솔루션 2의 최종 볼륨을 1 M CaCl2 의 150 μ 페 수를 39.6 μ g의 20.4 μ g을 준비 합니다. 10 s와 5 분을 위한 나머지와 동
    2. 15 cm2 요리에서 DMEM 미디어를 제거 하 고 transfection 솔루션 1의 12 mL를 바꿉니다.
      주의 미디어를 변경할 때 15cm2 접시 중앙에 건조 수 있습니다. 이 transfected 같은 E 셀의 실질적인 죽음을 발생할 수 있습니다. 신속 하 게 작업 하 고 한 번에 단지 1-2 판에서 미디어를 제거 합니다.
    3. 3 mL transfection 솔루션 각 접시에 걸쳐 drop-wise, 균등 하 게2 각 15 cm2 접시를 DNA와 CaCl를 포함 하는 2을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 하룻밤에 10 미 품에 대 한 측면으로 부드럽게 바위 접시.
  3. 제 3 일: 준비 포함 하는 바이러스의 변환에 대 한 표면에 뜨는
    1. 18 mL transfected 플레이트-E 셀의 미디어 중 완료 및 인큐베이터 돌아가기 교체 합니다.
      주의 때 변경 미디어 15 cm2 접시 중앙에 건조 수 있습니다. 이 transfected 같은 E 셀의 실질적인 죽음을 발생할 수 있습니다. 신속 하 게 작업 하 고 한 번에 단지 1-2 판에서 미디어를 제거 합니다.
  4. 주 3: 격리 및 생체 외에서 활성화 마우스 비장 T 세포의
    1. 파 킨 슨 병 외. 여 앞에서 설명한 6 8 주 오래 BALB/c 마우스에서 spleens 제거 19 그들에 젖어 살 균, 얼음 처럼 차가운, 50 mL 원뿔 튜브에 PBS.
    2. 족집게를 사용 하 여 전송 하는 비장 1.5 mL microcentrifuge 튜브 하 고 최소한의 힘으로는 방 앗 공이 사용 하 여 균질.
    3. 1000 μ 피 펫을 사용 하 고 ~ 100 μ m 기 공 셀 스 트레이너 포함 5 mL PBS 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 50 mL 튜브에 부착 된 homogenate 전송 800 μ PBS. 추가 spleens에 대해 2.4.2 단계를 반복 합니다. 튜브 당 3 spleens 초과 하지 마십시오.
      주의 왼쪽에 서 하는 경우 필터를 통해 전달 하는 Splenocytes 덩어리를 형성할 수 있다. 수동으로 소용돌이 친다 튜브를 간헐적으로 응집 하는 셀을 피하기 위해 여러 spleens 처리 하는 경우. 셀 스 트레이너에 조각 남은 수 수 추가 으깬에서 최소한의 힘을 사용 하 여 5 mL 주사기 플런저를 사용 하 여.
    4. 최대 20 mL PBS와 함께 톱. 20 mL 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 밀도 그라데이션 미디어 (자료 테이블)의 20 mL에 부드럽게 레이어. 아니 브레이크 적용으로 20 분 대 한 800 x g에서 결과 중첩된 정지 원심
    5. 살 균 파스퇴르 피 펫 및 50 mL 튜브에 사용 하 여 인터페이스 계층에서 세포를 수확. 최대 50 mL PBS와 10 분 동안 800 x g에서 원심 분리기 세척 탑. 상쾌한 삭제 하 고 다시 완전 한 중에 셀을 일시 중단.
    6. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
    7. 30 ng/mL 안티-CD3ε 항 체와 완전 한 중에 5 x 106 셀/mL의 농도에서 세포 문화 (145-2 C 11 복제), 30 ng/mL 안티 CD28 항 체 (클론 37.51), 100 U/mL 재조합 인간 일리노이-2와 2 ng/mL 재조합 murine 일리노이-7. 적절 한 크기의 조직 배양 플라스 크를 사용 하 여 셀 수확의 볼륨에 대 한.
      참고: -항 원 제시 세포 CD3, CD28 항 체에 의해 T 세포 활성화에 필요한 정화 T 세포를 사용 하는 것은 항 체, 코트 접시 필요한 경우 또는 자석 구슬 (테이블의 재료)를 사용 하 여
    8. 37 ° C, 5% CO2 하룻밤에 마우스 splenocytes를 품 어.
  5. 변환에 대 한 접시의 주 3: 준비
    1. 10 μ g/mL 재조합 인간 fibronectin의 2 mL와 코트 비 조직 문화 6 잘 플레이트 그리고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
  6. 제 4 일: 변환 마우스 T 세포의
    1. 신선한 비 조직 문화 6 잘 플레이트를 코팅된 접시에서 재조합 인간 fibronectin 조각을 전송. 변환의 2 라운드에 4 ° C에서 하룻밤이 번호판을 품 어.
    2. 원래 재조합 인간 fibronectin 조각 코팅 접시의 각 잘 하 중의 2 개 mL를 추가 하 고 일반적인 바인딩 차단 하 실 온에서 30 분 두고.
    3. 15 cm 조직 문화 요리에 완전 한 TCM의 18 mL 바꿀 transfected 같은 E 셀에서 상쾌한 포함 하는 레트로 바이러스를 수확.
      주의 같은 E 셀의 건조 하지 않도록 신속 하 게 작동 합니다.
      참고: Transfection의 성공 확인할 수 있습니다이 단계에서 형광 현미경 검사 법에 의해 형광 표식 유전자 mCherry (그림 1) 등을 활용 하는 경우.
    4. 레트로 바이러스를 포함 하는 상쾌한 세포 파편을 제거 하 0.45 μ m 필터를 통해 필터링. 재조합 인간 fibronectin 조각 코팅 6 잘 플레이트에서 TCM를 제거 하 고 필터링 된 레트로 바이러스 포함 된 상쾌한 또는 각 잘 2.5 mL을 추가 (사용 중 모의 transfection 완료). 레트로 바이러스 또는 모의 미디어의 추가 관해서는 각 잘 레이블.
    5. 실 온에서 30 분 동안 1200 x g에서 격판덮개 원심
    6. 플레이트, 회전 하는 동안 활성화 된 T 세포를 수집 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 계산.
      1. 변환의 5 mL/총에서 5 x 106 활성화 splenocytes와 함께 수행 됩니다. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 별도 튜브에 모의/변환에 대 한 splenocytes의 필요한 수를 작은.
      2. 다시 일시 중단 단계의 2.6.4 필터링 된 레트로 바이러스 포함 된 상쾌한의 2.5 mL 당 5 x 106 세포의 밀도에서 splenocytes 또는 TCM 부정적인 컨트롤. 재조합 인간 일리노이-2 (hIL-2) 및 재조합 마우스 일리노이-7 (밀-7)에 추가 200 IU/mL와 4 ng/mL의 최종 농도 각각.
    7. 2.6.5 단계의 완료에 원심 분리기에서 6 잘 플레이트를 수집 하 고 적절 한 우물 잘/5 mL의 최종 볼륨을 확인 하 고 100 U/mL hIL-2와 2 ng/mL 밀-7의 최종 농도에 2.5 mL/잘 다시 중단된 splenocytes를 추가.
    8. 실 온에서 90 분 동안 1200 x g에서 격판덮개 원심 원심, 후 37 ° C, 5% CO2 하룻밤에 접시를 품 어.
  7. 제 5 일: 변환의 2 라운드
    1. 이 다시 사용 될 수 있다 격판덮개에서 재조합 인간 fibronectin 조각을 수집 합니다. 2.6.5 2.6.2-단계를 반복 합니다.
    2. 플레이트, 회전 하는 동안 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 변환의 라운드 1st 에서 세포를 수집 합니다. 2 mL PBS와 각 잘 린스, 소용돌이 각 우물에 나머지 셀을 수집 합니다.
      참고: 다시 sedimented 셀을 일시 중단 하는 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 별도 튜브에 각 제어/변환 그룹을 수집 합니다.
    3. 5 분 다시 중단 셀 변환 200 IU/mL 일리노이-2와 4 ng/mL 일리노이-7의 당 2.5 mL에 대 한 500 x g에서 원심 분리기 튜브. 2.6.8 2.6.7-단계를 반복 합니다.
    4. 원심 분리기에서 셀을 제거 하 고 37 ° C, 5% CO2 단계 2.7.2-2.7.3로 불리고 수집 4 헤 셀에서 품 어.
    5. 셀의 개수, 5 분 동안 500 x g에서 원심 및 1 x 106 셀/mL 100 U/mL hIL-2, 2ng/mL의 조밀도에 완전 한 중에 다시 중단 밀-7. 적절 한 크기의 문화 플라스 크를 전송 및 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
    6. 100U/mL hIL-2, 2ng/mL를 포함 하는 신선한 TCM 미디어 추가 밀-7 매 2 일 셀 밀도의 1 x 106 셀/mL를 유지.
      참고: 수확된 splenocytes 세포 유형의 다양 한 포함 되어 있습니다. 이러한 문화 조건 하에서 비 T 세포는 2-3 일에 걸쳐 죽어. 후 ~ 세포 배양, 4 일 T 세포의 수는 일반적으로 수확된 splenocytes의 총 수에 해당 일 0에.

3입니다. 변환 효율의 측정

  1. 하루 4 게시물 변환에서 불리고 또는 비 불리고 T 세포 (약 3 × 105 셀)의 샘플을 수집 합니다. 5 분 동안 500 x g에 세포 현 탁 액을 원심, 삭제는 상쾌한 PBS 한번 수송과 세포를 세척 하 고 다시 원심.
  2. 삭제는 상쾌한 고 적당 한 아민 반응 염료 (예를 들어, 라이브/죽은 얼룩, 1에서 100 희석) 잘 당 포함 된 PBS의 100 μ를 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 15 분 동안 품 어.
  3. PBS로 두번 워시 5 분 삭제는 상쾌한 500 x g에서 원심 및 FACS 버퍼 (1 100 희석)를 차단 하는 Fc 수용 체에 대 한 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체를 포함의 50 μ와 품 어. 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
  4. 직접 추가 하는 반대로 마우스 CD4-BV786 및 CD8-BV711 항 체 (FACS 버퍼에서 1 μ/잘의 최종 농도)를 포함 하는 마스터 믹스를 얼룩이 지는 항 체의 50 μ. 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 3.3 세척 단계를 반복 합니다. 다시 1 %PFA 버퍼에 셀을 일시 중단 하 고 유지는 cytometry 분석까지 4 ° C에서 어둠 속에서.
  5. C d 4와 CD8 하위 집합 및 각각 (그림 2) 게이팅 자동차 식의 표식으로 BV711, BV785 및 mCherry 형광을 사용 하 여 해당 적합 cytometer로 세포를 분석 합니다.

4. 체 외에서 유효성 검사의 자동차 T 세포 활동

  1. Syngeneic 씨 대상 CD19+ 종양 세포 또는 100 μ에서 1 x 104 의 세포의 조밀도에 luciferase 식 없이 96 잘 U-하단에 TCM/잘 조직 문화 접시.
  2. 1 x 104 CD19 자동차 T 세포/잘 100 μ/잘 대상 (E:T) 비율 1: 1의 이펙터를 달성의 볼륨에 추가 합니다.
    참고: E:T 비율을 설립 해야 합니다 각 자동차에 대 한 생성 하 고 대상 셀 라인.
  3. 혼자 사용 T 세포와 부정적인 컨트롤로 혼자 종양 세포와 T 세포 phorbol myristate 아세테이트 (PMA)에 의해 자극된 (50 ng/mL)와 인터페론 감마 (IFNγ) 릴리스에 대 한 긍정적인 컨트롤로 ionomycin (1 μ g/mL). 37 ° c, 5% CO2 16-24 h에 대 한 공동 문화 세포.
  4. 공동 문화, 다음 5 분 동안 500 x g에서 격판덮개 원심 고 추가 IFNγ 및 IL-12 p 70 ELISA 분석에 대 한 상쾌한을 수집 합니다.
    참고: 이-80 ° c.에 저장 될 수 있다
  5. 다시 소 (1.5 mg/mL의 최종 농도)를 포함 하는 PBS의 100 μ에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 37 ° c.에서 10 분에 대 한 번호판을 품 어 그런 다음 적당 한 루미 노와 각 우물에서 발광을 측정 합니다.
    참고: 노출 시간 셀 라인을 밀도 최적화 해야 합니다. 대표 결과 그림 3a에 표시 됩니다. 자동차 T 세포의 세포 독성 전 비보 표현 루시페린을 공동 문화에 의해 셀 라인 대상 항 원 표현으로 수정할 수 있습니다. 자동차 T 세포 표적 세포를 죽 일, 소 출시, 따라서 luminometry 신호 감소 셀 죽으로 상관 된다. 비 불리고 셀 종종 긴 인큐베이션 기간 동안 특히 대상 세포 생존 능력에 영향을 가질 수 있습니다. 제조업체의 ELISA 프로토콜에 따라 상쾌한 murine IFNγ 및 IL-12 p 70의 농도 측정 합니다. 대표 결과 (그림 3b3c)에 표시 됩니다. 셀 라인 표현 대상 항 공동 문화 차 T 세포의 전 비보 활성화 ELISA를 사용 하 여 표면에 뜨는 내용을 분석 하 여 분석 될 수 있습니다. 대상 셀에 자동차 T 세포의 비율 및 공동 문화 기간 각 자동차 구조, 대상 셀 라인 및 분석에 대 한 낙관 되어야 한다. PMA와 ionomycin 치료 T 세포와 대응 하는 그들의 능력의 품질을 확인 하는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.

5. 평가 쥐에서 제 암 성 활동

  1. 프로토콜 1
    1. 100 mg/kg 정 맥 (IV) 배달 cyclophosphamide의 6-8 주 BALB/c 마우스에 수행 합니다. 중요 한 lymphodepletion17 (그림 4) 없이 종양 engraftment을 수 있습니다.
      참고: A20을 설정 림프 종 차선 포획 률 2 개월 이상 걸릴 수 있습니다. 이 림프 종 세포의 배달에 앞서 1 일 cyclophosphamide의 사용에 의해 향상 될 수 있습니다. Lymphoreplete 마우스를 공부 하기 위하여 lymphodepletion를 일으키는 원인이 되기 없이 림프의 효율성을 높일 수 있는 cyclophosphamide의 복용량 파악.
    2. 다음 날, 정 맥 (IV) 주입에 의해 쥐로 5 x 105 syngeneic A20 B-세포 림프 종 세포 luciferase 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하도록 수정 100 µ L를 주사.
    3. 허용 조직의 림프 종에 대 한 개발 하 쥐 ~ 17 일.
    4. 30 mg/mL 소의 이미지는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 100 μ의 복 (IP)를 주입 하 여 조직의 림프의 존재를 확인 합니다.
      1. 구분 기호를 사용 하 여 인접 한 쥐로 신호 넘침을 방지. 관심의 일정 한 크기의 영역으로 복 부 측에 1 분 동안 쥐를 노출 합니다.
      2. 광자 (p/s) 당으로 상대 빛 단위 (RLU)를 표시 합니다. 설정, 각 종양 모델에 대 한 낙관 한다 사용 하 여 종양의 조기 발견을 선택할 수 있습니다 하지만 리드 하지 않습니다 채도 종양 도달 끝점으로 노출.
      3. 한 상수와 각 마우스에 대 한 기록 총 RLU 관심 영역 크기. (그림 5a 그리고 b).
    5. 주사 설립 베어링 lymphoreplete 쥐로 IV 주입에 의해 1 x 106 차 T 세포의 단 하나의 복용량 림프 종.
      참고: (중요 한) 레벨을 주입 해야 합니다 설립 각 자동차 자동차 T 세포에서 발생 하는 모든 가능한 독성 특징은 해결 될 수 있도록 복용량 단계적 확대 일정을 사용 하 여 구성. 반대로 마우스 CD19 자동차 T 세포 독성을 표시 하지 않습니다, 비록 자동차 T 세포 증가 예상치 못한 독성에 줄 수 있습니다. 여러 자동차 구조 및 변환 효율성은 동일, 관리 하는 T 세포의 총 수 유지 되어야 한다 동등한 셀 준비로 T 세포 transduced 비 추가.
    6. 30 mg/mL 소의 이미지는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템 (그림 5 c)를 사용 하 여 매주 100 μ의 IP 주사를 통해 질병의 진행을 모니터링 합니다.
    7. 밀접 하 게 독성의 징후에 대 한 마우스를 모니터 하 고 모든 고통을 발생할 수 전에 뒷 다리 마비 (HLP) 또는 병 적인 종양 짐의 초기 징후를 보여 주는 모든 마우스를 안락사.
      참고: A20 림프 종에서 독성은 meninges의 종양 내 습을 통해 뒷 다리 마비를 포함할 수 있습니다. 변경 된 걸음 걸이의 이른 표시를 정기적으로 확인 합니다. 마찬가지로, 변경 된 동작에 의해 표시 된 불편으로 이어질 수 있는 큰 IP 종양이 발생할 수 있습니다.
    8. 60-100 일 (그림 5 d)에 대 한 쥐의 생존을 모니터링 합니다. 실험의 결론에 따라 일정-1 방법으로 안락사를 수행 합니다.
  2. 프로토콜 2
    1. 6 8 주 오래 된 BALB/c 마우스를 꼬리 정 맥 주사로 100 μ에 PBS의 마우스 당 200 밀리 그램/kg cyclophosphamide를 제공 합니다.
    2. 다음 날, 5 x 105 syngeneic A20 B-세포 림프 종 세포 100 μ PBS 통해 꼬리 정 맥 주입에서 luciferase GFP를 표현의 주사.
    3. 허용 조직의 림프 종에 대 한 개발 하 쥐 ~ 7-14 일
    4. 30 mg/mL 소의 이미지는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 100 μ의 IP 주입 하 여 조직의 림프를 확인 합니다.
    5. Lymphodepletion 5 Gy 총 몸 방사선 조사 (TBI) 0.02 Gy/min에서 수행 합니다.
      참고: 자동차 T-세포 치료를 받고 환자 크게 adoptively의 engraftment를 증가 하는 자동차 T 세포의 관리 차 T 세포를 전송 하기 전에 lymphodepletion를 달성 하기 위해 식이요법의 범위를 받 다. 이 총 몸 방사선 조사 (TBI) (그림 6)와 쥐에서 복제 될 수 있습니다.
    6. 다음 날, PBS 통해 꼬리 정 맥 주입 베어링 쥐로 설립 종양의 100 μ에서 1 x 106 차 T 세포를 주사.
    7. 7 일 후 꼬리 정 맥 출혈을 통해 혈액 샘플을 수집 합니다.
    8. 각 혈액 샘플을 붉은 세포 세포의 용 해 버퍼를 추가 다음 섹션 3에에서 설명 된 대로 cytometry에 대 한 준비. Cytometry (그림 2)에 의해 순환에서 차 T 세포 지 속성을 분석 합니다.
      참고: Cytometry 직전 세 구슬의 추가의 혈액 밀리 리터 당 차 T 세포의 수의 결심을 허용 한다.
    9. 단계 5.1.5-5.1.8 (그림 7)에서 설명한 대로 질병 진행을 모니터링 합니다.

Representative Results

T 세포의 고효율 변환에 대 한 신선한 retroviral 입자를 얻을 필요가 있다. PMP71 레트로 바이러스 플라스 미드 pCL 에코 프로듀서 플라스 미드와 같은 E 셀 라인의 transfection retroviral 입자의 분 비 세포 표면에 뜨는에 상승을 제공합니다. MCherry, 같은 형광 표식 유전자는 레트로 바이러스에서 인코딩된 때 성공적인 transfection 형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 확인할 수 있습니다. Transfected 같은 E 셀에서 상쾌한 바이러스를 포함 하는 T 세포를 통해 2 라운드 스핀 fection fibronectin 조각 코팅 접시에 transduce 데 사용 됩니다. 4 일 게시 cytometry 통해 변환 변환의 효율성을 확인할 수 있습니다. 성공적으로 불리고 셀 레트로 바이러스 (그림 2)에서 인코딩 표식 유전자를 표현 한다. 변환 효율성 범위에서 ~ 50-90% 효율을 1 세대 수용 체와 ~ 차 10-40% 가까이 retroviral 포장 용량 구성. 마커 유전자 발현 성공적인 retroviral 변환 보여줍니다, 그것은 그들의 표면에 그 표현 대상 항 원 세포와 매력적인 시 자동차 T 세포의 기능을 보여 최고. 대상 셀 라인 표현 luciferase 수정 직접 차 T 세포 (그림 3A)에 의해 셀 죽 일 정도의 테스트 luciferase 분석 실험에 사용할 수 있습니다. 대상 셀, ELISA, 정한 공동 문화 시 자동차 T 세포에서 이펙터 cytokines의 방출 자동차 T 세포 세포 독성 (그림 3B3c)의 간접 측정으로도 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 생산 하는 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종 (주입 정 맥), 1 일 5 x 105 A20 셀 (그림 4)의 IV 주입 전에 cyclophosphamide의 100mg/kg 복용량을 설정 하 여 lymphoreplete 마우스에 평가할 수 있습니다. 소 및 이미지 캡처 vivo에서 생물 발광 영상을 사용 하 여 IP 주입 종양 부담 (그림 5A-C)에 걸쳐 지속적인 투자 수익 및 노출 시간을 사용 하 여 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 자동차 T 세포 표현 IL-12 수정 lymphodepleting 사전 마우스 (그림 5D)의 약 25%에서 질병-무료 생존을 주는 조건으로 조직의 림프를 근절 할 수 있다. Lymphodepleting 늘어진, 5 달성 Gy TBI 자동차 T 세포의 4 행정에 앞서 1 일 크게 향상 engraftment (그림 6). 이 모델에서는 1 세대 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종, 일반적으로 유도 하는 쥐 (그림 7)의 100%의 질병-무료 생존을 근절 할 수 있다.

Figure 1
그림 1입니다. 같은 E 셀의 성공적인 transfection 확인. 같은 E 셀 retroviral 자동차 구조 및 pMP71와 pcl 에코 포장 벡터 플라스 미드 DNA 페. 성공적인 transfection mCherry 형광 표식 유전자의 표현에 의해 표시 됩니다. A) 밝은 분야 현미경 검사 법, B) 형광 현미경 검사 법 및 C) 병합 된 이미지 표시 됩니다. 확대 = 50 X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. Cytometry에 의해 변환 효율 결정. Cytometry 하루 4 게시물 변환, 좀비 UV 라이브/죽은, mCherry, BV711를 사용 하 여 마우스 T 셀의 변환 효율을 결정 하는 데 사용은 하 고 라이브의 검출에 대 한 BV785, 자동차 건설, c d 4와 CD8 세포, 각각. 대표적인 결과 A) 비 불리고, B) mCherry.αmCD19.mCD3z와 C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 1의 게이팅 함께 표시 됩니다) Singlets 2) 라이브 셀 3) CD4, CD8 4)와 5) 자동차를 표현 하는 mCherry 긍정적인 세포의 평가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 자동차 T-세포 활동의 유효성 검사. ΑmCD19 차 T 세포 표현 luciferase 수정 A20 림프 종 세포와 공동 경작 했다 (1 x 104: 1 x 104) 16 h U-하단 96 잘 접시에 대 한. 후 공동 문화, 셀 했다 수송과, 그리고 상쾌한 수집. A) 셀 다시 PBS에 중단 되었고 luminometry 대상 셀의 가능성을 평가 하는 데 사용 되었다. 공동 문화에서 상쾌한 IFNγ (B) 및 IL-12 (C)의 존재에 대 한 평가 했다. 대상 셀에 자동차 T 세포의 비율 및 공동 문화 기간을 최적화 해야 합니다 각 자동차에 대 한 생성 하 고 대상 셀 라인. PMA와 ionomycin 치료 T 세포와 그들의 능력 세포 응답의 품질을 확인 하는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. p < 0.001)입니다. 이 그림은17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. A20 림프 종 lymphodepletion 없이 설정. Cyclophosphamide는 lymphodepletion를 일으키는 원인이 되기 없이 림프 종 유도의 효율성을 높일 수 있습니다. A) cyclophosphamide의 100 mg/kg의 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트. 오차 막대 표시 SD B) 4 배달 cyclophosphamide의 날-1 염 분 100 mg/kg의 하루는 루미 노를 사용 하 여 측정 하는 0에서 5 x 105 A20 셀 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 림프 종 부담. 쥐의 C) 생존 B). 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 2-웨이 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. * * p < 0.01, * * * p < 0.001). 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. 림프 종 및 생존 모니터링. A20 림프 luciferase 표현 베어링 마우스 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사를 받을 고는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있었다. A) 마우스 복 부 측에 1 분 동안 노출 되었고 즉시 이미지 시체 (B)의 양쪽에 대 한 종양 중 선택 등을 성을 상실. C) lymphodepletion 없이 다양 한 αmCD19 자동차 T 세포를 받는 BALB/c 마우스의 림프 종의 대표적인 결과. 오차 막대 표시 SEM. D) 같은 쥐의 생존 율. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6입니다. Lymphodepletion의 효과입니다. A) 0.02 Gy/분;의 복용량 비율 5 Gy TBI를 받은 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트 오차 막대 표시 양방향 ANOVA sd. 통계 분석. p < 0.05 * * p < 0.01, * * * p < 0.001. B) CD4의 모니터링+ 와 CD8 cytometry mCherry 마커 유전자 7 일 게시물 관리에 대 한에 의해 쥐의 말 초 혈액에서+ 차 T 세포. 오차 막대 표시 sd. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7입니다. Lymphodepleting 사전 조화 차 T 세포 활동. 일반적인 결과 전날 차 T-셀 관리 5 Gy TBI의 영향을 보여주는. A)vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사 후 쥐의 이미징의 이미징 및 (B) 그래픽 표시. 오차 막대 표시 SEM. C) 같은 쥐의 생존. 이 그림은 수정 된 fromKueberuwa 그 외 여러분 되었습니다. 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

Syngeneic 마우스 모델 그대로 면역 시스템을 유지 하면서 질병 진행 및 치료의 테스트 수 있습니다. 이것은 파라마운트 immunotherapeutic 에이전트에 대 한 특히에서 면역 체계와 상호 작용 하는 치료에 관해서입니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 작업 흐름, 첫 번째 자동차를 표현 하기 위해 마우스 T 셀을 수정 하 고 유전자. 이 변환의 유효성 검사 개시 7 일 필요합니다. 자동차 T 세포의 생산을 수 반하는 생쥐에서 조직의 림프의 설립이 이다. 자동차 T 세포 생산 실패 하거나 품질 되 고 부족, 거기 아니다 일반적으로 충분 한 시간 전에 마우스 대체 전지를 생산 하는 림프 종에 굴복 해야 합니다. 따라서 연구팀은 정확 하 게이 모델을 사용 하 여 성공적으로 치료 관리에 대 한 자동차 T 세포의 생산을 시간 순서 종양 투약 하 고 질병 진행 연구를 수행 하는 중요 한 이다.

낮은 T-셀 변환 효율에 대 한 일반적인 이유는 프로듀서 셀, 일반적으로 불 쌍 한 플라스 미드 순도 또는 transfection 미디어의 pH의 부정확 한 결정으로 인 한 가난한 transfection 효율 포함 되어 있습니다. 가난한 transfection T-셀 변환 효율 제한으로 전체 프로토콜 함께 진행 하기 전에 프로듀서 셀 transfection 효율을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나 재조합 인간 fibronectin 조각 수집 될 수 있으며 다시 사용 하는,-20 ° C에, 감소 된 변환 효율성에 여러 동결 해빙 결과 저장. 마우스 spleens 후 컬렉션은 또한 높은 얻는 것이 중요의 신속한 처리 가능한 T 세포의 생성 합니다.

여기에 설명 된 프로토콜 A20 셀 luciferase 표현 활용을 주목 한다. 이것은 선호 생물 발광 영상으로 조직의 종양 부담을 측정 하는 능력을 제공 합니다. 그러나, 기능적인 면역 체계의 존재 luciferase 응답 결과 왜곡 수 있습니다. 이전 마커 transgenes17에 쥐를 살아 나 기의 면역 반응을 테스트 했습니다. 그것은 이러한 면역 세포에 의해 종양 퇴치에 중요 한 역할을 재생 하지 않는 유효성을 A20 셀 transgenes의 무료를 사용 하 여 주요 실험을 복제 열쇠입니다.

임상 에이전트 사용 vivo에서 면역 결핍 생쥐에서 하실 수 있습니다, 하는 동안 마우스 암 세포에 대 한 마우스 자동차 T 세포를 사용 하 여 우리가 치료 효능 또는 질병 진행에 면역 체계의 기여를 평가 수 있습니다. 이 프로토콜 B-세포 림프 종 또는 IL-12 여기에 설명 된 대로의 분 비 등 추가 수정와 다른 자동차를 대상으로 하는 자동차의 전 임상 평가 위해 활용 될 수 있습니다. 그것은 그 면역 세포 사이 상호 작용 syngeneic 마우스 모델에서 평가 될 수 있습니다, 하지만 그들은 수 있습니다 하지 정확 하 게 정리 vivo에서인간 상호 작용을 언급 해야 합니다. 특히의, 인간 및 마우스 자동차 구조는 다운스트림 결과;에 달라 집니다. T 세포의 성장 위한 최적 활성화 및 셀 문화 조건에 다른20, 대상 항 식의 조직 분포 인간과 쥐 사이 다를 수 있습니다 및 경험 있는 독성 근본적으로 다를 수 있습니다. 그러므로 전 비보 및 결과 승산이 xenogeneic 모델 활용 필수적 이다.

요약 하자면, syngeneic lymphodepleted 및 lymphoreplete 모델의 림프 종 환자와 이전 항 암 치료/방사선 치료 없이 정리. 이 다양 한 새로운 면역 치료 대리인의 오는 파도와 중요 한 치료 전략의 테스트 수 있도록 임상 설정을 모방 하는 모델 시스템을 제공 합니다.

사전 컨디셔닝의 사용, 그것은 모든 마우스는 일반적으로 림프 종 선택을 취소 표시 됩니다. 와 최대 90% 완료 응답 속도 인간에서는, 이것은 대표입니다. 그러나 CD19 차 T-세포 치료에 대 한 도전을 relapses 관찰의 높은 주파수를 방지에 경첩 것입니다, 그는 종종 CD19. Relapses 하지 관찰 되었습니다이 모델에서, 그리고 종종 100 일 넘어. 병원에서 본 relapses 모방 수정 CD19 차 T-세포 치료의 미래 과제 도울 수 있었다.

Disclosures

데이비드 Gilham 차 T 세포의 생산에서 포함 되는 Celyad에 대 한 작동 합니다. 작가의 나머지가 없다 공개 수 있습니다.

Acknowledgments

우리는이 연구 (그랜트 13031)와 CRUK 맨체스터 생물 자원 단위, 이미징 및 cytometry 및 분자 생물학 핵심 시설이이 작업을 지원 하기 위한 자금에 대 한 Bloodwise를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Appleton Woods FC121
0.45 µm syringe filter Appleton Woods FC122
1.5ml pestle and microtube VWR 431-0098
100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) Gibco 10378016
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350-010
Blasticidine S hydrochloride Sigma- Aldrich 15205
Bottle Top Filter (0.2 µm) Scientific Laboratory Supplies FIL8192
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100759 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7
Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100552 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5
Calcium chloride dihydrate Sigma- Aldrich C7902
Cell counting beads – CountBright absolute counting beads Molecular Probes C36950
Cell Strainer 100μm VWR 734-0004
Cyclophosphamide Monohydrate Merck 239785-1GM
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose Sigma Aldrich D6546
Dynabeads Gibco 11131D
Ficoll Paque Plus GE Healthcare GE17-1440-03 Sold by Sigma- Aldrich
Flow cytometer - LSR Fortessa x20 BD Biosciences 658222R1
Foetal Bovine Serum Gibco 10270
Haemacytometer Appleton Woods HC001
HEPES solution Sigma- Aldrich H0887 
IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit Invitrogen 88-7121-76
IL2, Proleukin Novartis PL 00101/0936
in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system Bruker T149094
Ionomycin Calcium Salt Sigma- Aldrich I0634
Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit BioLegend 423114 1 in 100 staining dilution
Luminometer - Lumistart Omega BMG Labtech 415-301
Murine IFN-γ ELISA kit Diaclone 861.050.010
Paraformaldehyde Sigma- Aldrich 16005
pCL-Eco Novus Biologicals NBP229540
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma- Aldrich P8139
Platinum E cell line Cell Biolabs RV-101 (RRID:CVCL_B488)
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294 Clone  37.51
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε BD Biosciences 553057 Clone  145-2C11 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Biosciences 553142 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2
Puromycin Dihydrochloride Sigma- Aldrich P8833
Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent TaKaRa T100B
Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) BioLegend 577806
Red cell lysis buffer eBioscience 004-4333-57
RPMI 1640 Medium Lonza BE12-167F
Trypsin - EDTA solution Sigma- Aldrich T3924 
XenoLight D-Luciferin Perkin Elmer 122799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
  2. Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
  3. Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35, (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
  4. Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, (1), 79 (2017).
  5. Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
  6. Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
  7. Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29, (3), 233-240 (2006).
  8. Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
  9. Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
  10. Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3, (6), 731-733 (2011).
  11. Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75, (1), 5-10 (2015).
  12. Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6, (7), 833-852 (2014).
  13. Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29, (15_suppl), 2534 (2011).
  14. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118, (18), 4817 (2011).
  15. Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
  16. Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6, (32), 33961-33971 (2015).
  17. Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
  18. Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14, (12), 1155-1168 (2003).
  19. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
  20. Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics