बेमिसिया टेबासी की तेजी से पहचान के लिए एक पाश मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (लैंप) परख

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Summary

इस कागज बेमिसिया टेबासी के लिए एक तेजी से पहचान परख पाश पर आधारित इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (चिराग) प्रौद्योगिकी के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । प्रोटोकॉल ंयूनतम प्रयोगशाला प्रशिक्षण की आवश्यकता है और कर सकते हैं, इसलिए, पर लागू किया जा साइट ऐसे बंदरगाहों और हवाई अड्डों के रूप में संयंत्र के आयात के लिए प्रवेश के अंक पर ।

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Blaser, S., Diem, H., von Felten, A., Gueuning, M., Andreou, M., Boonham, N., Tomlinson, J., Müller, P., Utzinger, J., Frey, B., Frey, J. E., Bühlmann, A. A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci. J. Vis. Exp. (140), e58502, doi:10.3791/58502 (2018).

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Abstract

ह्वाइटफ्लाई बेमिसिया टेबासी (Gennadius) काफी महत्व के एक इनवेसिव कीट है, दुनिया भर के कई देशों में सब्जी और सजावटी फसलों के उत्पादन को प्रभावित । गंभीर उपज नुकसान सीधे खिलाने के कारण होते हैं, और भी अधिक महत्वपूर्ण बात यह भी अधिक से अधिक १०० हानिकारक संयंत्र रोगजनक वायरस के संचरण के द्वारा । अंय इनवेसिव कीट के लिए के रूप में, वृद्धि हुई अंतरराष्ट्रीय व्यापार अपनी मूल सीमा से परे क्षेत्रों को बी टेबासी के फैलाव की सुविधा । ऐसे बंदरगाहों और हवाई अड्डों के रूप में प्रवेश के अंक पर संयंत्र आयात उत्पादों के निरीक्षण कर रहे हैं, इसलिए, एक महत्वपूर्ण रोकथाम के उपाय के रूप में देखा । हालांकि, कीट हमलों के खिलाफ रक्षा के इस अंतिम पंक्ति केवल प्रभावी है अगर संदिग्ध कीट नमूनों के लिए तेजी से पहचान के तरीके आसानी से उपलब्ध हैं । क्योंकि विनियमित B. टेबासी और संगरोध स्थिति के बिना निकट रिश्तेदारों के बीच रूपात्मक भेदभाव गैर वर्गीकरण के लिए मुश्किल है, एक तेजी से आणविक पहचान परख पाश के आधार पर-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन ( लैंप) तकनीक विकसित की गई है । इस प्रकाशन उपंयास परख के विस्तृत प्रोटोकॉल तेजी से डीएनए निष्कर्षण, सेट दीपक प्रतिक्रिया के ऊपर का वर्णन है, साथ ही साथ इसकी व्याख्या को पढ़ने के बाहर है, जो एक घंटे के भीतर बी टेबासी नमूनों की पहचान की अनुमति देता है की रिपोर्ट । विशिष्ट बी टेबासी के पता लगाने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में, विकसित विधि एक परख में पूरे टेबासी प्रजातियों परिसर लक्ष्य । इसके अलावा परख के लिए पर लागू होने के लिए डिज़ाइन किया गया है संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा ंयूनतम प्रयोगशाला प्रशिक्षण के साथ सीधे प्रवेश के अंक पर । पूरी तरह से मांयता प्रयोगशाला के तहत प्रदर्शन किया और साइट पर शर्तों को दर्शाता है कि रिपोर्ट दीपक परख एक तेजी से और विश्वसनीय पहचान उपकरण है, टेबासी के प्रबंधन में सुधार ।

Introduction

ह्वाइटफ्लाई बेमिसिया टेबासी (Gennadius) एक इनवेसिव कीट सजावटी पौधों, सब्जियों, अनाज फलियां, और कपास1,2सहित कई आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों की उपज को प्रभावित कीट है । इसके अलावा प्रत्यक्ष फ्लोएम के माध्यम से की वजह से नुकसान खिला, homopteran प्रजातियों के पत्तों और फलों की सतहों पर हनीड्यू की बड़ी मात्रा के उत्सर्जन से अप्रत्यक्ष रूप से पौधों को नुकसान पहुंचाता है, साथ ही साथ कई संयंत्र रोगजनक वायरस1 के संचरण द्वारा , 3 , 4. हाल ही में आनुवंशिक mitochondrial जीन cytochrome सी oxidase 1 (सीओआई) के डीएनए दृश्यों की तुलना अध्ययनों से पता चला है कि बी टेबासी एक प्रजाति के जटिल है कम से ३४ morphocryptic प्रजातियों3,4। इस परिसर में दो अत्यधिक इनवेसिव और हानिकारक सदस्य, मध्य पूर्व और एशियाई लघु क्षेत्र, साथ ही साथ के रूप में अच्छी तरह से भूमध्य क्षेत्र से उद्भव क्ष प्रकार, अंतरराष्ट्रीय व्यापार के माध्यम से विश्व स्तर पर फैलाया गया है । संयंत्र उत्पादों के साथ गतिविधियों, विशेष रूप से टूम1,5,6के परिवहन द्वारा । अपनी दुनिया भर में कीट की स्थिति के कारण, प्रकृति और प्राकृतिक संसाधनों के संरक्षण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संघ (आईयूसीएन) सूचीबद्ध B. टेबासी "दुनिया के १०० सबसे आक्रामक विदेशी प्रजातियों में से एक के रूप में" और प्रजातियों के परिसर के सदस्यों द्वारा विनियमित जीवों हैं कई देशों1,3,4

यूरोपीय संघ (ईयू) में, B. टेबासी संयंत्र स्वास्थ्य निर्देश 2000/29/चुनाव आयोग अनुलग्नक 1AI में गैर यूरोपीय संघ के देशों और यूरोपीय संघ के भीतर इसके प्रसार से एक संगरोध जीव जिसका परिचय के रूप में सूचीबद्ध है4पर प्रतिबंध लगा दिया । संगरोध जीवों के प्रसार के खिलाफ एक आवश्यक रोकथाम उपाय (पोएस) हवाई अड्डों और बंदरगाहों7,8के रूप में प्रवेश के अंक पर संयंत्र लदान का निरीक्षण है । मामले में एक संगरोध जीव पाया जाता है, राष्ट्रीय संयंत्र संरक्षण संगठन (NPPO) आरोप में या तो खारिज या उपचार (विनाश सहित) द्वारा कार्रवाई लेता है पीड़ित लदान9। हालांकि, अधिकारियों के आयात का निरीक्षण अक्सर वर्गीकरण विशेषज्ञता को सही ढंग से कीट प्रजातियों के विश्व व्यापार9के साथ जुड़े की विशाल रेंज की पहचान नहीं है । विशेष रूप से अपरिपक्व जीवन चरणों की पहचान (जैसे, अंडे और लार्वा) अलग रूपात्मक कुंजी के बिना गैर के लिए लगभग असंभव है वर्गीकरण8,9,10। नतीजतन, ंयूनतम देरी के साथ संगरोध उपायों के कार्यांवयन को सक्षम करने के लिए, वहां विकल्प के लिए एक की जरूरत है, पर तेजी से साइट पहचान परख9

एक उंमीदवार विधि पाश मध्यस्थता इज़ोटेर्माल डीएनए प्रवर्धन (लैंप) तकनीक है कि हाल ही में संयंत्र रोगजनकों की पहचान के लिए एक उपयुक्त प्रौद्योगिकी हो दिखाया गया है11,12,13। दीपक अत्यधिक विशिष्ट है क्योंकि विधि छह अलग डीएनए लक्ष्य14दृश्यों को पहचानने कम दो प्राइमरी जोड़े का उपयोग करता है । Bst डीएनए पोलीमरेज़ के डीएनए किनारा विस्थापन गतिविधि के कारण, दीपक प्रतिक्रियाओं इज़ोटेर्माल शर्तों के तहत किया जाता है14. इसलिए, पारंपरिक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के विपरीत-परख के आधार पर वहां एक थर्मल साइकिल चालक13,14के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । पीसीआर पर एक और लाभ आधारित परख डीएनए निकालने में संभावित अवरोधकों के खिलाफ अपने लचीलापन है, एक डीएनए शुद्धीकरण13कदम की जरूरत को दरकिनार । प्रोटोकॉल की गति और सादगी के कारण, दीपक भी एक पोर्टेबल, बैटरी संचालित वास्तविक समय का पता लगाने डिवाइस8,15का उपयोग कर साइट पर शर्तों के तहत किया जा सकता है ।

एक चिराग परख टेबासी8के लिए एक पर तेजी से साइट पहचान विधि के लिए मांग के जवाब में बनाया गया था । व्यापक उद्देश्य के लिए एक प्रोटोकॉल है कि संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा सीमित प्रयोगशाला प्रशिक्षण के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है विकसित किया गया था । एक मजबूत ध्यान केंद्रित किया गया था, इसलिए, गति और प्रोटोकॉल की सादगी के अनुकूलन पर सेट । जबकि मौजूदा नैदानिक परीक्षणों में आम तौर पर टेबासीके एक या कई प्रकार की पहचान के लिए विकसित किया गया है, उपंयास लैंप परख पूरे टेबासी प्रजातियों परिसर8,16,17 शामिल ,18. स्पष्ट आनुवंशिक के भीतर taxon विविधता की समस्या परिसर के विभिंन प्राइमर सेट के संयोजन का उपयोग करके हल किया गया था और पतित प्राइमर8के आवेदन । उपंयास बी टेबासी दीपक परख इस तरह से है कि प्राइमरों mitochondrial सीओआई8जीन के 3 ' अंत में एक टुकड़ा लक्ष्य में बनाया गया है । यह जीन पशु नैदानिक परख के लिए एक उपयुक्त लक्ष्य प्रस्तुत करता है क्योंकि यह क्षेत्रों बंदरगाहों पर्याप्त एक विशिष्ट प्रजातियों के लिए नैदानिक संवेदनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए संरक्षित है, जबकि काफी निकट संबंधित जीवों19के बीच भेदभाव, 20. इसके अलावा, सीओआई जीन अक्सर जनसंख्या आनुवंशिक अध्ययन में एक आनुवंशिक मार्कर के रूप में और डीएनए barcoding विश्लेषण में एक हस्ताक्षर अनुक्रम के रूप में प्रयोग किया जाता है, खुले स्रोत डेटाबेस में कई डीएनए अनुक्रम प्रविष्टियों में ऐसे GenBank और बोल्ड 21 के रूप में जिसके परिणामस्वरूप ,22. इसके अलावा टेबासीसे सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सीओआई अनुक्रम, बारीकी से संबंधित प्रजातियों से सीओआई अनुक्रम (Aleurocanthus एसपीपी. [n = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, बेमिसिया एसपीपी. [n = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes बबूल, और Trialeurodes एसपीपी. [N = 4]) इस अध्ययन के प्राइमर डिजाइन में शामिल किए गए थे और silico8 में नैदानिक संवेदनशीलता और विशिष्टता का आकलन करते थे .

विधि की सटीकता के कारण, इसकी गति (< 1 h) और प्रोटोकॉल की सादगी, परख के लिए साइट पर आवेदन जब एक स्विस पो8पर आयात नियंत्रण प्रक्रिया के भाग के रूप में लागू करने के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है ।

Protocol

1. तैयारी

  1. क्षारीय डीएनए निष्कर्षण समाधान के aliquots की तैयारी ।
    1. ६०० µ एम पोटेशियम हीड्राकसीड (कोह) और 2 µ एम Cresol लाल के साथ पूरक आणविक ग्रेड पानी का उपयोग क्षारीय डीएनए निष्कर्षण समाधान का एक शेयर का उत्पादन ।
      चेतावनी: KOH एक मजबूत पानी में घुल आधार है । फैल से बचें, और त्वचा और आंख से संपर्क करें ।
    2. (1.1.1 चरण में तैयार) क्षारीय डीएनए निष्कर्षण समाधान के 30 µ एल वितरण ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में और 4 डिग्री सेल्सियस पर aliquots की दुकान ।
      नोट: 1 वर्ष के भीतर aliquoted डीएनए निष्कर्षण समाधान का उपयोग करें ।
  2. B. टेबासी सकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण (पीएसी) तैयार कर रहा है ।
    1. पैदा दीपक लक्ष्य डीएनए टुकड़ा की पीसीआर amplicons ।
      नोट: सामान्य पीसीआर सिद्धांतों और प्रथाओं में एक परिचय23Lorenz द्वारा दिया जाता है ।
      1. संश्लेषित या प्राप्त प्राइमरों C1-J-२१९५ (5 '-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 ') और TL2-N-३०१४ (5 '-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ′) mitochondrial सीओआई जीन24,25का एक टुकड़ा बढ़ाना ।
      2. तालिका 1में बताए अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें । डीएनए निकालें का प्रयोग करें (चरण २.१ देखें) डीएनए के रूप में एक संदर्भ बी टेबासी नमूना टेंपलेट ।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, यह पीएसी के लिए बी टेबासी डीएनए निकालने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर संभव है ।
      3. कार्यक्रम एक थर्मल साइकिल चालक निंनलिखित शर्तों का उपयोग: ९५ ° c पर 15 मिनट; ४० एस के ४५ चक्र ९५ ° c, 15 एस पर ४५ ° c, ६० एस से ६० डिग्री सेल्सियस पर रैंप, ७२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट; ७२ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
      4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक पीसीआर क्लीन अप किट का उपयोग कर पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद साफ और आणविक ग्रेड पानी में अंतिम उत्पाद elute ।
      5. डीएनए intercalating डाई के साथ एक वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद के डीएनए एकाग्रता को मापने के लिए और एक एकाग्रता के लिए आणविक ग्रेड पानी के साथ पतला 1 एनजी/µ एल स्टोर पतला पीसीआर प्रवर्धन -20 डिग्री सेल्सियस पर पीएसी स्टॉक समाधान के रूप में उत्पाद ।
        नोट: 1 वर्ष के भीतर पीएसी स्टॉक समाधान का उपयोग करें ।
      6. पीएसी स्टॉक समाधान अनुपूरक (चरण 1.2.1.5 में तैयार) के साथ ०.६ µ m KOH और 5 x 10 की एकाग्रता के लिए आणविक ग्रेड पानी के साथ पतला-3 एनजी/µ एल 4 डिग्री सेल्सियस पर उत्पाद की दुकान ।
        नोट: अगले स्टेप में बताए गए रेडी-टू-फीमेल बी टेबासी लैंप किट की तैयारी के लिए 5 एच के अंदर पीएसी का प्रयोग करें ।
  3. तैयार करने के लिए उपयोग बी टेबासी लैंप किट (20 इकाइयों के लिए प्रोटोकॉल) की तैयारी
    1. दो 4-ट्यूब लैंप स्ट्रिप्स में 8-ट्यूब लैंप स्ट्रिप्स कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें ।
    2. लेबल 4-ट्यूब लैंप स्ट्रिप्स की ट्यूबों चित्रा 1में दिखाया योजना के अनुसार ।
    3. तैयार बी टेबासी लैंप रिएक्शन mastermix (८० प्रतिक्रियाओं के लिए प्रोटोकॉल) ।
      1. जोड़ें ११९५.१ µ एल तैयार करने के लिए उपयोग GspSSD इज़ोटेर्माल मास्टर मिश्रण (युक्त GspSSD पोलीमरेज़, pyrophosphatase, मैग्नीशियम सल्फेट, deoxynucleotides, डबल किनारा बाध्यकारी डीएनए बंधन डाई) और बी µ लैंप प्राइमर मिश्रण के ७१७.४ टेबासी एल एक 2 मिलीलीटर के लिए microcentrifuge ट्यूब. संक्षेप में भंवर और नाड़ी केंद्रापसारक ।
      2. औषधालय २२.५ µ l of B. टेबासी लैंप रिएक्शन mastermix (चरण 1.3.3.1 में तैयार) 4-ट्यूब लैंप स्ट्रिप्स के प्रत्येक ट्यूब में (चरण 1.3.1 में तैयार) और नाड़ी केंद्रापसारक ।
    4. भंवर टेबासी लैंप पीएसी (चरण १.२ में तैयार) जल्दी और नाड़ी केंद्रापसारक । फिर, एक 4-ट्यूब लैंप पट्टी के "पीएसी" के साथ लेबल ट्यूब में २.५ µ एल जोड़ें (चित्रा 1) ।
    5. ढक्कन बंद करें और-20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार करने के लिए उपयोग B. टेबासी लैंप किट इकाइयों की दुकान ।
      नोट: 1 वर्ष के भीतर उनका उपयोग करें ।

2. पर साइट लैंप विश्लेषण

  1. डीएनए निष्कर्षण
    1. उपयोग बाँझ toothpicks ०.५ एमएल microcentrifuge डीएनए निष्कर्षण समाधान के 30 µ l युक्त ट्यूबों में कीट नमूनों हस्तांतरण (1.1.2 चरण में तैयार) ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कीड़ों निष्कर्षण समाधान में डूब रहे हैं ।
    2. एक thermomixer (३०० rpm) में ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूनों की मशीन । संक्षेप में भंवर और नाड़ी केंद्रापसारक ।
  2. B. टेबासी दीपक परख
    1. गल एक तैयार उपयोग बी टेबासी लैंप किट चरण १.३ में तैयार किया । भंवर जल्दी और नाड़ी केंद्रापसारक ।
      नोट: प्रत्येक किट के साथ, यह या तो दो अलग नमूनों का परीक्षण करने के लिए या डुप्लिकेट में एक नमूना के डीएनए निकालने का विश्लेषण करने के लिए संभव है.
    2. नमूना डीएनए निकालने के २.५ µ एल जोड़ें (२.१ चरण में तैयार) "एस 1" और "S2" के लिए तैयार करने के लिए उपयोग बी टेबासी दीपक किट (चित्रा 1) में लेबल ट्यूबों ।
    3. शुद्ध alkaline डीएनए निष्कर्षण समाधान के २.५ µ एल जोड़ें (धारा १.१ में तैयार) लेबल ट्यूब में नकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण के लिए "एनएसी" (चित्रा 1) ।
    4. भंवर तैयार करने के लिए उपयोग बी टेबासी लैंप किट जल्दी और नाड़ी केंद्रापसारक ।
    5. दीपक विश्लेषण डिवाइस में तैयार करने के लिए उपयोग B. टेबासी लैंप किट डालें (वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माप के साथ) या एक वास्तविक समय पीसीआर मंच और ६० मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक इज़ोटेर्माल डीएनए प्रवर्धन विश्लेषण प्रदर्शन ।
    6. ९८ ° c करने के लिए एक बाद में ठंडा कदम (०.०५ डिग्री सेल्सियस के रैंप दर के साथ) और वास्तविक समय में प्रतिदीप्ति को मापने, जबकि डीएनए प्रवर्धन उत्पादों के पिघलने तापमान को मापने ।
  3. चिराग परख पढ़ें-बाहर
    1. मांय दीपक पढ़ें बाहर मैंयुअल रूप से इस प्रकार है ।
      1. यदि डीएनए प्रवर्धन नमूना और पीएसी के लिए मापा गया, कोई डीएनए प्रवर्धन एनएसी के लिए मापा गया था, और प्रवर्धन उत्पादों के एनीलिंग तापमान ८०.० और ८५.५ डिग्री सेल्सियस के बीच थे, सकारात्मक रूप में चिराग परिणाम पर विचार (2 चित्रा) ।
      2. यदि नमूनों के लिए कोई डीएनए प्रवर्धन (यानी, ट्यूब एस 1 और S2 लेबल) लेकिन पीएसी और एनएसी तो नकारात्मक (चित्रा 2) के रूप में दीपक परिणाम पर विचार के लिए ।
      3. यदि डीएनए प्रवर्धन नमूनों के लिए मापा गया था, लेकिन इसी प्रवर्धन उत्पादों के एनीलिंग तापमान सीमा ८०.० \u2012 ८५.५ डिग्री सेल्सियस के बाहर थे, और/या पीएसी कोई डीएनए प्रवर्धन दिया, और/एनएसी एक डीएनए प्रवर्धन दिया, के रूप में दीपक परिणाम पर विचार अमांय (चित्र 2) ।
    2. वैकल्पिक, दीपक मांय पढ़ें बाहर दीपक मांयता आवेदन (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग कर ।
      1. लक्ष्य प्रजातियों को परिभाषित करने और परीक्षण नमूनों की संख्या को परिभाषित । क्लिक करें "जनरेट रिपोर्ट" बटन ।
      2. स्थानांतरण पढ़ें बाहर (डीएनए प्रवर्धन हां/नहीं, एनीलिंग तापमान प्रवर्धन उत्पाद, पीएसी और एनएसी के परिणाम) पर साइट दीपक विश्लेषण डिवाइस या रीयल-टाइम पीसीआर से संबंधित इनपुट क्षेत्रों के लिए मांयता आवेदन की । सत्यापन का परिणाम तुरंत डेटा दर्ज करने के बाद प्रदर्शित किया जाता है ।

Representative Results

टेबासी दीपक परख, नियमित रूप से स्विस आयात नियंत्रण प्रक्रिया के पाठ्यक्रम में अवरोधक कीट नमूनों की मांयता के दौरान8विश्लेषण किया गया । नमूनों आठ विभिंन देशों से उत्पंन (कैनरी द्वीप, डोमिनिकन गणराज्य, इजरायल, मलेशिया, मोरक्को, सिंगापुर, थाईलैंड, और वियतनाम) और बी टेबासी की आनुवंशिक विविधता यूरोपीय पोएस8में पाया प्रतिबिंबित । सभी दीपक परिणाम पार डीएनए barcoding8द्वारा मांय थे ।

८० नमूनों की कुल से दीपक ने विश्लेषण किया, ७५ नमूनों (९३.८%) सही ढंग से बी टेबासी के रूप में पहचाने गए थे (सच-सकारात्मक), दो नमूनों (२.५%) सही ढंग से नहीं किया जा रहा b. टेबासी (ट्रू-निगेटिव) के रूप में पहचान की गई, और तीन नमूनों (३.८%) गलत तरीके से नहीं किया जा रहा बी टेबासी (झूठी नकारात्मक) (तालिका 2)8के रूप में पहचान की गई । सही-नकारात्मक परिणाम दो Trialeurodes vaporariorum नमूनों से उत्पंन, उच्च जोखिम में एक गैर विनियमित प्रजातियों संयंत्र उत्पादों के लिए पोएस में बी टेबासी के साथ भ्रमित हो8। इन परिणामों के आधार पर, नैदानिक सटीकता के निम्न माप की गणना की गई: परीक्षण विशिष्टता (true-ऋणात्मक दर), १००%; परीक्षण संवेदनशीलता (true-धनात्मक दर), ९६.२%; परीक्षण दक्षता (सही परीक्षण परिणाम का प्रतिशत), ९६.३% (तालिका 2)8. जब विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता का आकलन (जांच सीमा), B. टेबासी दीपक परख सफलतापूर्वक तीन तकनीकी प्रतिकृतियां (तालिका 3) भर में १०० fg/µ एल करने के लिए पतला नमूना डीएनए परिलक्षित ।

परख (N = 13) का एक सबसेट पर के तहत प्रदर्शन किया गया था स्विस पो ज्यूरिख हवाई अड्डे पर संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा तैयार उपयोग बी टेबासी दीपक किट8का उपयोग करके । जब संदर्भ प्रयोगशाला में क्रॉस-मान्य, ऑन-साइट परीक्षण से सभी परिणाम सही पाए गए थे (परीक्षण दक्षता = १००%)8. पर साइट लैंप परख प्रदर्शन का आकलन, सकारात्मक समय (एक सकारात्मक परिणाम उपलब्ध था जब तक औसत समय) ३८.४ ± १०.३ मिनट (मतलब ± मानक विचलन)8था । एक प्रतिनिधि डीएनए प्रवर्धन भूखंड और इसी एनीलिंग एक बी टेबासी लैंप विश्लेषण से व्युत्पंन पर साइट शर्तों के तहत प्रदर्शन किया चित्र 3 ए और बीमें दिखाए जाते है इस उदाहरण में, नमूना एक और दो सही तरीके से टेबासी के रूप में पहचाने गए डीएनए प्रवर्धन द्वारा संकेत के रूप में लगभग 30 मिनट (3डी) लगभग ८२ डिग्री सेल्सियस (चित्र बी) में अपेक्षित एनीलिंग तापमान के साथ एक साथ ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में वर्णित एक तैयार करने के लिए उपयोग बी टेबासी लैंप किट के प्रयोगात्मक सेट अप के दृश्य । s, नमूना 1; S2, नमूना 2; पीएसी, सकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण; एनएसी, नकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: लैंप पठन-आउट मांयता स्कीमा । पीएसी: सकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण; एनएसी: नकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए प्रवर्धन भूखंड (क) और एनीलिंग व्युत्पंन (बी) के एक टेबासी लैंप विश्लेषण पर साइट शर्तों के तहत प्रदर्शन किया । प्रतिदीप्ति सापेक्ष तीव्रता इकाइयों में मापा गया । ग्रीन लाइन, 1 नमूना; ऑरेंज लाइन, नमूना 2; ब्लू लाइन, नकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण (एनएसी); लाल रेखा, सकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण (पीएसी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

घटक स्टॉक का. अंतिम प्रतिक्रिया. प्रति प्रतिक्रिया मात्रा
Taq पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स 2x 1x 10 µ l
प्राइमरी C1-जम्मू-२१९५ २० µ मी ०.४ µ m ०.४ µ l
प्राइमरी TL2-एन-३०१४ २० µ मी ०.४ µ m ०.४ µ l
आणविक ग्रेड पानी - - ८.२ µ l
डीएनए टेम्पलेट - - 1 µ l

तालिका 1: पीसीआर रिएक्शन mastermix के लिए तैयार B. टेबासी सकारात्मक प्रवर्धन नियंत्रण. घटक और एक पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए आवश्यक सांद्रता । अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 20 µ एल प्राइमर अनुक्रम 1.2.1.1 में दिखाया जाता है ।

एन NTP एनFP एनतमिलनाडु Nएफ एन सेन (%) एसपीई (%) EFF (%)
८० ७५ 0 2 3 ९६.२ १०० ९६.३

तालिका 2: B का परिणाम टेबासी दीपक परख मान् यता । N, विश्लेषण की संख्या; NTP, सही-सकारात्मक परिणामों की संख्या; एनFP, झूठे-सकारात्मक परिणामों की संख्या; एनतमिलनाडु, सच-नकारात्मक परिणामों की संख्या; Nएफएन, झूठी-नकारात्मक परिणामों की संख्या; सेन, नैदानिक संवेदनशीलता; एसपीई, नैदानिक विशिष्टता, EFF, परीक्षण दक्षता ।

सीडीएनए (fg/µ एल) एनपीआर टीपी मिनट
(± एसडी मतलब)
टी (° c)
(± एसडी मतलब)
1 x 105 3 ३३.५ ± २.९ ८१.३ ± ०.१
1 x 104 3 ३०.७ ± १.१ ८१ ± ०.०
1 x 103 3 ४०.४ ± ३.९ ८१.१ ± ०.१
1 x 102 3 ५०.७ ± १.६ ८१.१ ± ०.१
1 x 101 0 - -
1 x 100 0 - -

तालिका 3: विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता (का पता लगाने सीमा) बी टेबासी दीपक परख । प्रत्येक कमजोर पड़ने triplicates में परीक्षण किया गया । सीडीएनए, प्रतिक्रिया प्रति डीएनए एकाग्रता; Nपीआर, सकारात्मक प्रतिकृति की संख्या; टीपी, एक सकारात्मक परिणाम जब तक समय उपलब्ध था; टी, एनीलिंग तापमान; एसडी, मानक विचलन ।

Discussion

सही समय देरी के बिना संभावित हानिकारक जीवों की पहचान करने की क्षमता कीट प्रजातियों9,10,26के प्रबंधन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा तेजी से किया जा रहा है, संयंत्र आयात उत्पादों के लिए, एक आदर्श कीट पहचान विधि पर प्रदर्शन करने के लिए सरल होना चाहिए-पोएस8,26पर साइट । यह कागज बी टेबासी, एक संगरोध कीट अक्सर यूरोपीय सीमाओं पर बाधित जीव की तेजी से पहचान के लिए एक उपंयास दीपक परख के प्रोटोकॉल की रिपोर्ट (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-report _2016. pdf).

नैदानिक परीक्षण के विकास के पीछे तर्क के लिए एक आसान-प्रोटोकॉल का पालन करें, जो संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षकों द्वारा संयंत्र आयात नियंत्रण प्रक्रिया के दौरान किया जा सकता है ंयूनतम प्रयोगशाला प्रशिक्षण के साथ डिजाइन किया गया था । आदेश में साइट पर परीक्षण करने के रूप में तेजी से और संभव के रूप में सरल, प्रोटोकॉल दो भागों में विभाजित है, तैयार करने के लिए उपयोग किट और दीपक परख के वास्तविक प्रदर्शन की तैयारी । पहला भाग एक बाहरी प्रयोगशाला में किया जा सकता है ताकि संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षक डीएनए निष्कर्षण और दीपक परख पर साइट पर प्रदर्शन कर सकते है केवल एक ही pipetting कदम के साथ ।

हालांकि केवल एक कदम, तरल की छोटी मात्रा pipetting कम या कोई प्रयोगशाला अनुभव के साथ उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस समस्या को हल करने के लिए, एक डाई (cresol लाल) निष्कर्षण समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है ताकि ऑपरेटर नेत्रहीन छोटी राशि की पुष्टि कर सकते हैं (यानी, डीएनए की २.५ µ एल) सही ढंग से संबंधित ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है. प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण सरलीकरण मांयता आवेदन के रूप में यह दीपक की एक विश्वसनीय व्याख्या की सुविधा है पढ़ें बाहर (पूरक फ़ाइल 1) ।

उपंयास बी टेबासी दीपक परख प्रयोगशाला और पर साइट के तहत मांयता दी गई है कीट8स्विट्जरलैंड के नियमित रूप से आयात नियंत्रण प्रक्रिया के दौरान बाधित नमूनों का परीक्षण करके । कुल में, तीन महाद्वीपों, अफ्रीका, यूरेशिया, और उत्तरी अमेरिका से ८० नमूनों, दीपक द्वारा विश्लेषण किया गया । ८० नमूनों में से, केवल तीन (३.८%) थे गलत पहचान (झूठी नकारात्मक)8। झूठे-नकारात्मक नमूनों के प्राइमरी टारगेट डीएनए जुगाड़ का विश्लेषण करते समय यह पाया गया कि वे नए बी. टेबासी haplotypes थे जो अब तकनहीं बताए गए हैं. इन परिणामों के आधार पर, B. टेबासी लैंप प्राइमर सेट संशोधित किया गया है और8सफलतापूर्वक पुन: मान्य ।

किसी भी डीएनए प्रवर्धन की एक प्रमुख सीमा-दीपक सहित विधि आधारित है कि वे केवल पूर्व की पहचान परिभाषित लक्ष्य डीएनए8,27अनुक्रम । प्राइमरी लक्ष्य अनुक्रम में पाए जाने वाले आनुवंशिक रूपांतर का एक व्यापक ज्ञान इसलिए8,27नैदानिक शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, इस तरह की जानकारी अक्सर बहुत सीमित है, विशेष रूप से नए उभरते कीट प्रजातियों8के मामले में । हालांकि दुर्लभ, झूठी-नकारात्मक परिणाम लक्ष्य अनुक्रम में उत्परिवर्तनों की वजह से8उंमीद कर रहे हैं । वर्तमान टेबासी दीपक परख, इस समस्या के लिए एक समाधान के मामले में एक डीएनए barcoding आधारित प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन है, एक रणनीति पो ज्यूरिख हवाई अड्डे पर इस नैदानिक परीक्षण के कार्यांवयन के पाठ्यक्रम में महसूस किया8। यहां, सभी लैंप-नकारात्मक परिणाम एक बाहरी प्रयोगशाला8में डीएनए barcoding द्वारा फिर से विश्लेषण किया गया । मामले में एक उपंयास कीट अभी तक वर्णित नहीं haplotype का सामना करना पड़ा है, चिराग प्राइमरों barcoding प्रक्रिया8में उत्पंन डीएनए अनुक्रम का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है । इस प्रकार, एक नकारात्मक लैंप परिणाम के मामले में गति के परिणामस्वरूप नुकसान अधिकतम निदान इस दो चरण प्रक्रिया8में सुनिश्चित सटीकता के लिए क्षतिपूर्ति है ।

सेट अप एक पो पर वर्तमान लैंप परख के लिए लागत लगभग USD २५,००० हैं । दीपक परीक्षणों की बढ़ती संख्या के साथ संयंत्र कीट के लिए विकसित (जैसे, Erwinia amylovora, Flavescence dorée, और Guignardia citricarpa), इस तरह के एक बार निवेश उचित13,15 प्रतीत होता है, 28. हालांकि, प्रोटोकॉल संभावित रूप से आगे भी इन लागत को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, डीएनए निष्कर्षण चरण के लिए ९५ ° c यहां इस्तेमाल किया थर्मामीटर मिक्सर एक कम महंगा पानी स्नान के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, या वास्तविक समय लैंप डिवाइस में सीधे इस कदम के प्रदर्शन से । इसके अलावा, भंवर पर मिश्रण कदम शायद मैन्युअल ट्यूबों झाड़ना द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और डीएनए हस्तांतरण कदम में pipettor बाँझ टीका छोरों की जगह हो सकती है.

टेबासी और सामांय में कीट प्रजातियों की एक तेजी से पहचान के लिए भविष्य में सुधार एक पर साइट अनुक्रमण दृष्टिकोण है कि पोएस पर डीएनए barcoding विश्लेषण करने की अनुमति होगी के एक कार्यांवयन हो सकता है । इस तरह के एक कार्यांवयन के लिए एक होनहार उंमीदवार प्रणाली ट्विटर अनुक्रमण प्रौद्योगिकी है । दरअसल, प्रौद्योगिकी हाल ही में सफलतापूर्वक एक पर साइट डीएनए barcoding के लिए एक rainforest8,29,30की जैव विविधता का आकलन प्रयास में कार्यांवित किया गया है । एक पर साइट डीएनए barcoding पहचान प्रणाली पूरी तरह से लक्षित नैदानिक परीक्षणों और उनके सत्यापन के विकास के लिए की जरूरत को बदल सकते हैं । इसके अलावा यह कीटनाशक प्रतिरोध जीन8के रूप में कीट विशेषताओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी इकट्ठा करने की अनुमति देता है । फिर भी, जब तक उपंयास अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों नियमित रूप से लागू किया जाएगा, B. टेबासी लैंप परख एक तेजी से (< 1 ज) और सटीक पहचान विधि का प्रतिनिधित्व करता है ।

Disclosures

लेखक माइकल Andreou OptiGene लिमिटेड के एक शेयरधारक है कि रिएजेंट और इस लेख में इस्तेमाल किया उपकरणों का उत्पादन है । दूसरे लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia घुड़साल, डैनियल Frei, Elisabeth रज़ावी, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun, और स्वेन Moeller के सत्यापन में भाग लेने के लिए टेबासी दीपक परख के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B. tabaci LAMP primer mix OptiGene Ltd. on request For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Centrifuge MiniSpin Eppendorf AG 5452000010 For several centrifugation steps
Cresol red (red dye) Sigma-Aldrich Corp. 114472 Component of
DNA extraction solution
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf AG 5382000015 For DNA extraction
Genie II (on-site LAMP analysis device) OptiGene Ltd. Genie® II For LAMP analysis
Genie Strips (8-tube LAMP strips) OptiGene Ltd. OP-0008-50 For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
HotStarTaq Master Mix Qiagen AG 203443 For generation of positive
amplification control
Labcycler (Thermocycler) SensoQuest GmbH,
distributed by Witec AG
011-103 For DNA extraction
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix OptiGene Ltd. ISO-001LNL For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Mini centrifuge Labnet Prism Labnet International Inc. C1801 For several centrifugation steps
NucleoFast 96 PCR Marcherey-Nagel GmbH 743500.4 For clean-up of positive
amplification control
Potassium hydroxide solution Sigma-Aldrich Corp. 319376 Component of
DNA extraction solution
Qbit Fluorometer 3 Thermo Fisher Scientific Corp. Q33226 For measuring DNA conentration
of positive control
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 For clean-up of positive
amplification control
Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) Eppendorf AG 0030 121.023 For DNA extraction
Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) Eppendorf AG 0030 120.094 For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Wood Toothpicks VWR International LLC 470226-594 For DNA extraction
Vortex-Genie 2 (Vortex) Scientific Industries Inc. SI-0236 For several mixing steps

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References

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