Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

Environment
 

Summary

Este trabalho relata o protocolo para um ensaio de identificação rápida por Bemisia tabaci baseado na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por laço (lâmpada). O protocolo exige formação mínima do laboratório e pode, portanto, ser implementado no local nos pontos de entrada para as importações de vegetais como os portos e aeroportos.

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Blaser, S., Diem, H., von Felten, A., Gueuning, M., Andreou, M., Boonham, N., Tomlinson, J., Müller, P., Utzinger, J., Frey, B., Frey, J. E., Bühlmann, A. A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci. J. Vis. Exp. (140), e58502, doi:10.3791/58502 (2018).

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Abstract

A mosca branca Bemisia tabaci (Genádio) é uma praga invasora de considerável importância, afetando a produção de plantas ornamentais e produtos hortícolas em muitos países ao redor do mundo. Rendimento de graves perdas são causadas por alimentação directa e mais importante ainda, também pela transmissão de mais de 100 vírus patogénicos de plantas nocivas. Quanto a outras pragas invasoras, aumento do comércio internacional facilita a dispersão de b. tabaci para áreas além de sua área nativa. Inspecções de planta importar produtos nos pontos de entrada como os portos e aeroportos são, portanto, vistos como uma medida importante de prevenção. No entanto, esta última linha de defesa contra invasões de pragas só é eficaz se os métodos de identificação rápida para espécimes de insetos suspeitos estão prontamente disponíveis. Porque a diferenciação morfológica entre o regulamentado b. tabaci e parentes próximos, sem estatuto de quarentena é difícil para não-taxonomistas, um ensaio de rápida identificação molecular baseado o (amplificação isotérmica mediada por laço Tecnologia de iluminação) foi desenvolvida. Esta publicação informa o protocolo detalhado do descrevendo rápida extração de DNA romance ensaio, set-up da reação da lâmpada, bem como a interpretação de sua leitura, que permite a identificação de espécimes de b. tabaci dentro de uma hora. Comparado aos protocolos existentes para a detecção de específico de b. tabaci biótipo, o método desenvolvido visa toda a espécie b. tabaci complexo em um ensaio. Além disso, o ensaio é projetado para ser aplicado no local pelos inspectores de saúde planta com treinamento mínimo laboratório diretamente nos pontos de entrada. Validação completa realizada em laboratório e condições no local demonstra que o ensaio de lâmpada relatado é uma ferramenta de identificação rápida e confiável, melhorando a gestão de b. tabaci.

Introduction

A mosca branca Bemisia tabaci (Genádio) é uma praga de insetos invasora que afetam o rendimento de muitas culturas economicamente importantes, incluindo plantas ornamentais, legumes, leguminosas para grão e algodão1,2. Ao lado de danos causados pelo floema-alimentação directa, a espécie homopteran prejudica plantas indiretamente pela excreção de grandes quantidades de melão nas superfícies de folhas e frutos, bem como pela transmissão de inúmeras plantas vírus patogénicos1 , 3 , 4. estudos genéticos recentes comparando sequências de DNA do gene mitocondrial citocromo c oxidase 1 (COI) revelaram que a b. tabaci é uma espécie complexa de pelo menos 34 espécies de morphocryptic3,4. Dois membros altamente invasivos e prejudiciais dentro deste complexo, biótipo B proveniente do Médio Oriente e a região da Ásia menor, bem como biotipo Q originárias da região mediterrânea, tem sido dispersados globalmente através de negociação internacional atividades com produtos vegetais, particularmente pelo transporte de plantas ornamentais1,5,6. Devido ao seu status de pragas em todo o mundo, a União Internacional para a conservação da natureza e dos recursos naturais (UICN) listados b. tabaci como um dos "100 do mundo piores espécies exóticas invasoras" e membros das espécies complexas são organismos regulamentados por muitos países1,3,4.

Na União Europeia (UE), b. tabaci consta a planta saúde da Directiva 2000/29/CE anexo 1AI como um organismo de quarentena, cuja introdução de países terceiros e sua divulgação no seio da UE são proibidos4. Uma medida de prevenção essencial contra a proliferação de organismos de quarentena é a inspeção de embarques de planta nos pontos de entrada (Poe), tais como aeroportos e portos marítimos de7,8. No caso encontra-se um organismo de quarentena, a organização nacional de proteção de planta (NPPO) no comando leva ação por rejeitar ou tratamento (incluindo destruição) da expedição infestadas.9. No entanto, oficiais, inspecionando as importações, muitas vezes não têm o conhecimento taxonômico para identificar com precisão a vasta gama de espécies de pragas associadas a comércio global9. Especialmente a identificação dos estágios imaturos de vida (por exemplo, ovos e larvas) sem chaves morfológicas distintas é praticamente impossível por não taxonomistas8,9,10. Consequentemente, para permitir a implementação de medidas de quarentena com atraso mínimo, há uma necessidade de ensaios alternativos, rápida identificação no local9.

Um método de candidato é a mediada por laço isotérmico DNA amplificação (lâmpada) tecnologia que recentemente foi mostrada para ser uma tecnologia apropriada para a identificação de agentes patogénicos de plantas11,12,13. LÂMPADA é altamente específica, pois o método utiliza pelo menos dois pares de cartilha reconhecendo seis distintas DNA alvo sequências14. Devido à atividade de deslocamento de strand DNA do polymerase do DNA de Bst , reações de lâmpada são executadas sob condições isotérmicas14. Portanto, em contraste com convencionais cadeia da polimerase (PCR)-baseado em ensaios lá não é nenhuma necessidade para um termociclador13,14. Outra vantagem sobre ensaios baseados em PCR é sua resiliência contra potenciais inibidores no extracto de DNA, contornando a necessidade de uma purificação de DNA passo13. Devido a velocidade e a simplicidade do protocolo, lâmpada mesmo pode ser realizada em condições no local usando um portátil, bateria conduzido dispositivo de detecção em tempo real8,15.

Um ensaio de lâmpada foi projetado em resposta à procura de um método de identificação rápida no local para b. tabaci8. O objectivo primordial era desenvolver um protocolo que pode ser realizado por inspetores de saúde planta com treinamento de laboratório limitado. Um forte foco foi, portanto, definir sobre a otimização de velocidade e simplicidade do protocolo. Enquanto os testes de diagnóstico existentes geralmente têm sido desenvolvidos para a identificação de um ou vários biótipos de b. tabaci, o romance ensaio de lâmpada abrange toda a b. tabaci espécies complexas8,16,17 ,18. O problema da diversidade do complexo pronunciado genético dentro-táxon foi resolvido usando combinações de moda diferente da primeira demão e a aplicação de primers degenerados8. O romance ensaio de lâmpada de b. tabaci é projetado de tal forma que as primeiras demão alvo um fragmento na extremidade 3' do gene mitocondrial COI8. Este gene apresenta um alvo apropriado para ensaios de diagnóstico animal porque ele abriga regiões conservadas suficiente para assegurar uma sensibilidade diagnóstica para uma determinada espécie, ao discriminar suficiente entre estreitamente relacionados com organismos19, 20. Além disso, o gene COI é muitas vezes usado como um marcador genético em estudos de genética de população e como uma sequência de assinatura em análises de DNA barcoding, resultando em inúmeras entradas de sequência de DNA em bancos de dados de código aberto como GenBank e bold (realce)21 ,22. Ao lado as sequências COI publicamente disponíveis de b. tabaci, COI sequências de espécies estreitamente relacionadas (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaee Bemisia spp. [N = 4]) foram incluídos no projeto da primeira demão deste estudo e utilizados para avaliar o diagnóstico sensibilidade e especificidade em silico8 .

Devido a precisão do método, sua velocidade (< 1 h) e a simplicidade do protocolo, o ensaio foi mostrado para ser apropriado para a aplicação no local quando implementado como parte do processo de controle de importação em um suíço POE8.

Protocol

1. preparações

  1. Preparar alíquotas de solução alcalina de extração de DNA.
    1. Produzir um estoque de solução de extração de DNA alcalina usando água molecular grau suplementada com 600 µM de hidróxido de potássio (KOH) e 2 µM vermelho de Cresol.
      Cuidado: KOH é uma base forte, dissolvida em água. Evite derramamentos e pele e olhos.
    2. Dispense a 30 µ l de solução de extração de DNA alcalina (preparada na etapa 1.1.1) em tubos de 0,5 mL microcentrifuga e armazenar as alíquotas a 4 ° C.
      Nota: Use a solução de extração de DNA aliquotada dentro de 1 ano.
  2. Preparando o controle de amplificação positiva de b. tabaci (PAC).
    1. Gere o PCR amplicons do fragmento de DNA alvo da lâmpada.
      Nota: Uma introdução em práticas e princípios gerais da PCR é dada por Lorenz23.
      1. Sintetizar ou obter os primers C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') e TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 '), amplificar um fragmento do mitocondrial COI gene24,25.
      2. Configure a reação de PCR conforme descrito na tabela 1. Use o extrato de DNA (ver passo 2.1) de uma amostra de b. tabaci referência como modelo de DNA.
        Nota: Opcionalmente, é possível extrair a b. tabaci DNA para o PAC usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Programar um termociclador usando as seguintes condições: 15 min a 95 ° C; 45 ciclos de 40 s a 95 ° C, 15 s a 45 ° C, mais de 60 anos de rampa s a 60 ° C, 2 min a 72 ° C; 7 min a 72 ° C; manter a 4 ° C.
      4. Limpe o produto de amplificação do PCR usando um kit de limpeza comercial do PCR de acordo com o protocolo do fabricante e eluir o produto final em água de grau molecular.
      5. Usar um kit comercial com corante intercalante de DNA para medir a concentração de DNA do produto de amplificação da PCR de acordo com as instruções do fabricante e diluir com água da classe molecular a uma concentração de 1 ng / µ l. loja a amplificação por PCR diluída produto como solução das ações do PAC a-20 ° C.
        Nota: Utilize a solução-mãe de PAC dentro de 1 ano.
      6. Complementar a solução estoque PAC (preparada na etapa 1.2.1.5) com 0,6 µM KOH e diluir com água da classe molecular a uma concentração de 5 x 10-3 ng / µ l. armazenar o produto a 4 ° C.
        Nota: Use o PAC até 5 horas para a preparação de ready-to-use b. tabaci lâmpada kits de descrito na próxima etapa.
  3. Preparando ready-to-use o kit de lâmpada de b. tabaci (protocolo para 20 unidades)
    1. Uso de tesouras para cortar tiras de 8-tubo da lâmpada em duas tiras de lâmpada de 4 tubos.
    2. Rotule os tubos das tiras 4-tubo da lâmpada de acordo com o esquema mostrado na Figura 1.
    3. Prepare-se b. tabaci lâmpada reação mastermix (protocolo para 80 reações).
      1. Adicionar 1195.1 µ l do ready-to-use GspSSD isotérmico mestre mix (contendo polimerase GspSSD, pyrophosphatase, sulfato de magnésio, desoxinucleótidos, tintura de ligação de DNA de ligação dupla vertente) e 717.4 µ l do mix de primer b. tabaci lâmpada para um 2 mL tubo de microcentrifugadora. Brevemente centrífuga vortex e pulso.
      2. Dispense a 22,5 µ l de reação de b. tabaci lâmpada mastermix (preparado na etapa 1.3.3.1) em cada tubo das tiras de lâmpada de 4 tubos (preparado no passo 1.3.1) e centrífuga de pulso.
    4. Vórtice da b. tabaci lâmpada PAC (preparado na etapa 1.2) rapidamente e pulso centrifugar. Em seguida, adicione 2,5 µ l no tubo rotulado com "PAC" de cada tira de lâmpada de 4 tubos (Figura 1).
    5. Tampas de perto e loja do ready-to-use b. tabaci lâmpada kit unidades a-20 ° C.
      Nota: Usá-los dentro de 1 ano.

2. no local da lâmpada análise

  1. Extração de DNA
    1. Use palitos estéril para transferir os espécimes de insetos para tubos de microcentrifuga de 0,5 mL contendo 30 µ l de solução de extração de DNA (preparada na etapa 1.1.2).
      Nota: Certifique-se que os insetos estão imersos na solução de extração.
    2. Incube as amostras por 5 min a 95 ° C, em um thermomixer (300 rpm). Brevemente centrífuga vortex e pulso.
  2. Ensaio de lâmpada de b. tabaci
    1. Kit de lâmpada de b. tabaci descongelar um ready-to-use preparado na etapa 1.3. Vórtice rapidamente e centrífuga de pulso.
      Nota: Em cada kit, é também possível para testar dois espécimes diferentes ou para analisar o extrato de DNA de uma amostra em duplicado.
    2. Adicione 2,5 µ l de extracto de DNA amostra (preparado no passo 2.1) para os tubos rotulados "S1" e "S2" de ready-to-use kit de lâmpada de b. tabaci (Figura 1).
    3. Adicione 2,5 µ l de pura solução alcalina de extração DNA (preparada na seção 1.1) no tubo rotulado "NAC" para o controle de amplificação negativa (Figura 1).
    4. Vórtice o ready-to-use lâmpada de b. tabaci kit rapidamente e centrífuga de pulso.
    5. Inserir o ready-to-use lâmpada de b. tabaci kits para o dispositivo de análise de lâmpada (com medição de fluorescência em tempo real) ou uma plataforma PCR em tempo real e realizar uma análise de amplificação de DNA isotérmica a 65 ° C por 60 min.
    6. Medir as temperaturas de fusão de produtos de amplificação de DNA por aquecimento até 98 ° C com uma etapa de resfriamento subsequente (taxa de rampa de 0,05 ° C/s) a 75 ° C, durante a medição de fluorescência em tempo real.
  3. Leitura do ensaio de lâmpada
    1. Valide a leitura de lâmpada manualmente como segue.
      1. Se amplificações do DNA foram medidas para a amostra e o PAC, sem amplificação do DNA foi medida para o NAC, e a temperatura do recozimento dos produtos de amplificação foram entre 80,0 e 85,5 ° C, considere os resultados da lâmpada como positivo (Figura 2).
      2. Se não houver nenhuma amplificação de DNA para as amostras (ou seja, tubos rotulados S1 e S2) mas para PAC e NAC, então, considerar o resultado da lâmpada como negativo (Figura 2).
      3. Se a amplificação do DNA foi medida para as amostras, mas as temperaturas de recozimento dos correspondentes produtos de amplificação foram fora do intervalo de \u2012 80,0 85,5 ° C, e/ou PAC não deu nenhuma amplificação de DNA, e/ou NAC deu uma amplificação de DNA, considerar o resultado de lâmpada que INVÁLIDO (Figura 2).
    2. Opcionalmente, valide a leitura de luz usando o aplicativo de validação de lâmpada (arquivo suplementar 1).
      1. Definir as espécies-alvo e definir o número de amostras analisadas. Clique no botão "gerar relatório" .
      2. Transferir a leitura (Sim/Não, amplificação de DNA recozimento produto de amplificação de temperatura, os resultados do PAC e NAC) do dispositivo de análise no local da lâmpada ou plataforma PCR em tempo real para os campos de entrada correspondentes a aplicação de validação. O resultado da validação é exibido imediatamente depois de inserir os dados.

Representative Results

Durante a validação do ensaio da lâmpada de b. tabaci , espécimes de insetos interceptados no decorrer do processo de controle de importação regular de suíço foram analisadas8. Os espécimes originou-se de oito países diferentes (Ilhas Canárias, República Dominicana, Israel, Malásia, Marrocos, Singapura, Tailândia e Vietnã) e refletem a diversidade genética de b. tabaci encontrado no Europeu POEs8. Todos os resultados de lâmpada foram validados pelo DNA barcoding8Cruz.

De um total de 80 espécimes analisados pela lâmpada, 75 espécimes (93,8%) foram corretamente identificados como b. tabaci (verdadeiro-positivos), dois espécimes (2,5%) foram corretamente identificados como não sendo b. tabaci (verdadeiro-negativos) e três amostras (3.8%) foram erroneamente identificado como não sendo b. tabaci (falso-negativos) (tabela 2)8. Os resultados negativos corrigir originados dois espécimes de Bemisia Resumo , uma espécie de não-regulamentadas de alto risco deve ser confundida com a b. tabaci em POEs para plantam produtos8. Com base nestes resultados, foram calculadas as seguintes medições de acurácia diagnóstica: teste de especificidade (taxa de verdadeiro-negativo), 100%; teste de sensibilidade (taxa de verdadeiro-positivos), 96,2%; teste de eficiência (porcentagem de resultados de teste correto), 96,3% (tabela 2)8. Ao avaliar a sensibilidade analítica (limite), o ensaio de lâmpada de b. tabaci com sucesso amplificado DNA de amostra diluída a 100 fg / µ l em três repetições de técnicas (tabela 3).

Um subconjunto dos ensaios (N = 13) foi realizada em condições no local, o aeroporto de Zurique suíço POE por inspetores de saúde planta usando o ready-to-use lâmpada de b. tabaci kits8. Quando Cruz-validada em laboratório de referência, todos os resultados dos testes no local foram encontrados para ser correto (teste de eficiência = 100%)8. Avaliar o desempenho da lâmpada no local, o tempo médio para positivo (tempo até que um resultado positivo estava disponível) foi de 38,4 ± 10,3 min (média ± desvio-padrão)8. Uma trama de amplificação de DNA representativa e a correspondente derivada de recozimento de uma lâmpada de b. tabaci análise realizada sob condições no local são mostrados na Figura 3A e B. Neste exemplo, a amostra 1 e 2 foram corretamente identificados como b. tabaci indicado pela amplificação do DNA após cerca de 30 min (Figura 3A), juntamente com as altas temperaturas do recozimento esperadas a cerca de 82 ° C (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: visualização da montagem experimental de um pronto para usar o kit de lâmpada de b. tabaci descrito no protocolo. S1, amostra 1; S2, amostra 2; PAC, controle de amplificação positiva; NAC, controle de amplificação negativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de validação lâmpada de leitura. PAC: controle amplificação positiva; NAC: controle de amplificação negativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: DNA amplificação trama do (A) e recozimento derivado (B) de uma análise de b. tabaci lâmpada realizado sob condições no local. Fluorescência foi medida em unidades de intensidade relativa. Linha verde, a amostra 1; linha laranja, amostra 2; linha azul, controle de amplificação negativa (NAC); linha vermelha, controle de amplificação positiva (PAC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente de Conc. de estoque Reação final conc. Volume por reação
Taq polimerase Master Mix 2 x 1 x 10 Μ l
Primeira demão C1-J-2195 20 ΜM 0,4 ΜM 0,4 Μ l
Primeira demão TL2-N-3014 20 ΜM 0,4 ΜM 0,4 Μ l
Água de grau molecular - - 8.2 Μ l
Modelo de DNA - - 1 Μ l

Tabela 1: preparação de mastermix de reação de PCR para o B. tabaci controle de amplificação positiva. Componentes e concentrações necessárias para configurar uma reação de PCR. O volume final da reação é de 20 µ l. sequências de Primer são mostradas em 1.2.1.1.

N NTP NFP NTN NFN SEN (%) SPE (%) FEP (%)
80 75 0 2 3 96.2 100 96.3

Tabela 2: Resultados do B. tabaci Validação do ensaio de lâmpada. N, o número de análises; NTP, número de resultados verdadeiro-positivos; NFP, número de resultados falso-positivos; NTN, número de resultados negativos verdadeiro; NFN, número de resultados falso-negativos; SEN, sensibilidade diagnóstica; SPE, especificidade diagnóstica, FEP, teste de eficiência.

CDNA (fg / µ l) NPR TP (min)
(média ± DP)
T (° C)
(média ± DP)
1 x 105 3 33,5 ± 2,9 81.3 ± 0.1
1 x 104 3 ± 30,7 1.1 81 ± 0,0
1 x 103 3 40,4 ± 3,9 81,1 ± 0.1
1 x 102 3 50,7 ± 1.6 81,1 ± 0,1
1 x 101 0 - -
1 x 100 0 - -

Tabela 3: sensibilidade analítica (limite) da B. tabaci ensaio lâmpada. Cada diluição foi testada em triplica. CDNA, a concentração de DNA por reação; NPR, número de positivo de Replica; TP, tempo até um resultado positivo estava disponível; TA, recozimento a temperatura; SD, desvio-padrão.

Discussion

A capacidade de identificar com precisão os organismos potencialmente prejudiciais sem demora de tempo representa um aspecto crítico para a gestão de pragas espécie9,10,26. Além de ser rápida, para produtos de importação de vegetais, um método de identificação de pragas ideal deveria ser simples para executar no local em POEs8,26. Este trabalho relata o protocolo de um ensaio de lâmpada romance para a identificação rápida de b. tabaci, um organismo de inseto de quarentena frequentemente interceptado nas fronteiras da Europa (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-relatório _2016.pdf).

A lógica por trás do desenvolvimento do teste diagnóstico foi para projetar um protocolo fácil de seguir, que pode ser realizado durante o processo de controle de importação de planta por inspetores de saúde planta com treinamento mínimo de laboratório. Para tornar-se no local de teste como rápida e simples possível, o protocolo é dividido em duas partes, a preparação de um kit de ready-to-use e o desempenho real do ensaio da lâmpada. A primeira parte pode ser feita em um laboratório externo para que o Inspetor de saúde planta possa realizar a extração de DNA e ensaio de lâmpada no local com apenas uma etapa de pipetagem.

Embora apenas um passo, pipetagem pequenas quantidades de líquido podem ser desafiadoras para os usuários com pouca ou nenhuma experiência de laboratório. Para resolver esse problema, um corante (vermelho de cresol) é adicionado à solução de extração para que o operador pode confirmar visualmente que a quantidade pequena (ou seja, 2,5 µ l) de DNA corretamente é transferida para o respectivo tubo. Outra importante simplificação do protocolo é a aplicação de validação como facilita uma interpretação confiável a leitura de lâmpada (arquivo suplementar 1).

O romance ensaio de lâmpada de b. tabaci validado em laboratório e condições no local testando amostras insetos interceptadas durante o processo de controle de importação regular da Suíça8. No total, 80 amostras de três continentes, África, Eurásia e América do Norte, foram analisadas pela lâmpada. Das 80 amostras, apenas três (3.8%) foram erroneamente identificados (falso-negativos)8. Ao analisar as sequências de DNA alvo cartilha dos espécimes falso-negativos, verificou-se que eles eram novos haplótipos de b. tabaci que até agora não foram descritas8. Com base nestes resultados, o lâmpada b. tabaci primer conjunto tem sido modificado e com sucesso re-validado8.

Uma grande limitação de qualquer método baseado na amplificação de DNA incluindo a lâmpada é que eles apenas identificam alvo pré-definido de8,de sequências de DNA27. Um conhecimento abrangente da variação genética encontrada na sequência alvo primário é, portanto, crucial para garantir a acurácia diagnóstica8,27. No entanto, tal informação é frequentemente muito limitada, especialmente no caso dos novos emergentes pest espécie8. Embora raro, resultados falso-negativos causados por mutações na sequência de destino são esperados8. No caso do presente ensaio de lâmpada de b. tabaci , uma solução para este problema é a combinação com uma DNA barcoding tecnologia, uma estratégia realizada durante a execução deste teste diagnóstico para o aeroporto de Zurique POE8. Aqui, todos os resultados negativos da lâmpada re-foram analisados por DNA barcoding em um laboratório externo8. No caso de um romance pragas haplótipo descrito ainda não for encontrado, os primers da lâmpada podem ser modificados usando a sequência de DNA gerada no processo barcoding8. Desse modo, a resultante perda de velocidade em caso de resultado negativo da lâmpada é compensada pelo máximo rigor diagnóstico assegurado neste processo two-stage8.

Os custos de set-up para o ensaio de lâmpada atual em um POE são aproximadamente USD 25.000. Com o crescente número de testes de lâmpada, desenvolvido para pragas de plantas (e.g., Erwinia amylovora, Flavescence dorée e Guignardia citricarpa), um investimento tão único aparece justificado13,15, 28. no entanto, o protocolo potencialmente poderia ser modificado para reduzir esses custos ainda mais. Por exemplo, para a extração de DNA passo a 95 ° C, o misturador de termo utilizado aqui poderia ser substituído por um banho de água a menos caro, ou realizando este passo diretamente no dispositivo de lâmpada de tempo real. Além disso, as etapas de mistura sobre o vórtice provavelmente poderiam ser substituídas por manualmente, passando rapidamente os tubos, e na etapa de transferência de DNA a pipeta pode ser substituída por loops de inoculação estéril.

Futuras melhorias para uma rápida identificação das espécies de b. tabaci e pragas, em geral, podem ser uma implementação de uma abordagem de sequenciamento no local que permitiria realizar análises de DNA barcoding em POEs. Um sistema de candidato promissor para tal implementação é a tecnologia de sequenciamento de nanopore. De fato, a tecnologia tem recentemente sido implementou com sucesso em um esforço de código de barras de DNA no local para avaliar a biodiversidade de uma floresta tropical8,29,30. Um sistema de identificação de código de barras de DNA no local pode substituir completamente a necessidade para o desenvolvimento de testes diagnósticos alvo e sua validação. Também lhe permite coletar informações adicionais sobre características de pragas tais como pesticida de genes de resistência8. No entanto, até tecnologias de sequenciamento de novela vão ser aplicadas rotineiramente, o ensaio de lâmpada de b. tabaci representa uma rápida (< 1 h) e o método de identificação exata.

Disclosures

O autor Michael Andreou é uma acionista da OptiGene Limited que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo. Os outros autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Os autores são gratos a Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun e Sven Moeller para participar na validação do ensaio de lâmpada de b. tabaci .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B. tabaci LAMP primer mix OptiGene Ltd. on request For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Centrifuge MiniSpin Eppendorf AG 5452000010 For several centrifugation steps
Cresol red (red dye) Sigma-Aldrich Corp. 114472 Component of
DNA extraction solution
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf AG 5382000015 For DNA extraction
Genie II (on-site LAMP analysis device) OptiGene Ltd. Genie® II For LAMP analysis
Genie Strips (8-tube LAMP strips) OptiGene Ltd. OP-0008-50 For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
HotStarTaq Master Mix Qiagen AG 203443 For generation of positive
amplification control
Labcycler (Thermocycler) SensoQuest GmbH,
distributed by Witec AG
011-103 For DNA extraction
GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix OptiGene Ltd. ISO-001LNL For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Mini centrifuge Labnet Prism Labnet International Inc. C1801 For several centrifugation steps
NucleoFast 96 PCR Marcherey-Nagel GmbH 743500.4 For clean-up of positive
amplification control
Potassium hydroxide solution Sigma-Aldrich Corp. 319376 Component of
DNA extraction solution
Qbit Fluorometer 3 Thermo Fisher Scientific Corp. Q33226 For measuring DNA conentration
of positive control
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 For clean-up of positive
amplification control
Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) Eppendorf AG 0030 121.023 For DNA extraction
Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) Eppendorf AG 0030 120.094 For preparation of
read-to-use B. tabaci LAMP kit
Wood Toothpicks VWR International LLC 470226-594 For DNA extraction
Vortex-Genie 2 (Vortex) Scientific Industries Inc. SI-0236 For several mixing steps

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References

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