Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

Immunology and Infection

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Summary

ICP0는 HSV-1 감염 중 핵-세포질 전을 겪 습. 이 이벤트의 분자 메커니즘은 알 수 없습니다. 여기는 HSV-1 감염, 양적 분석 ICP0 전 미래 기계 론 적인 연구에 대 한 기초를 낳는 ICP0 운동 척도를 도구로 confocal 현미경의 사용에 설명 합니다.

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Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

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Abstract

포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1)의 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0) 링 타입 E3 유비퀴틴 리가 포함 하는 즉시 초기 단백질이입니다. 그것은 호스트 제한 요인 및 후속 바이러스 유전자 활성화 proteasomal 저하에 대 한 책임입니다. ICP0 정식 핵 지 방화 순서를 (NLS)에 포함 되어 있습니다. 그것은 합성 드 노 보 직후 핵을 입력 하 고 핵에 주로 그 반대로 호스트 방어 기능을 실행. 그러나, 나중에 감염, ICP0에서에서 발견 된다 전적으로 세포질, 핵-세포질 전 HSV-1 감염 시의 발생을 제안. 아마도 ICP0 전 다른 감염 단계에서의 subcellular 위치 그것의 기능을 조절 하는 ICP0 수 있습니다. 생물 학적 기능 및 규제 메커니즘 ICP0 핵-세포질 전 좌의 윤곽을 그리 다, 위해 우리는 HSV-1 감염 시 ICP0 매매 모니터링 하는 immunofluorescent 현미경 검사 법 방법 수정. 이 프로토콜 immunofluorescent 얼룩, confocal 현미경 이미징, 그리고 핵 세포질 배급 분석을 포함 한다. 이 프로토콜의 목표는 정상 상태 confocal 이미지가 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 운동의 양적 문서로 시간 코스에 적응. 우리가 제안 하는이 방법은 양적 라이브 이미징 기술을 사용 하지 않고도 다른 바이러스 또는 세포질 단백질의 핵 세포질 지역화 분석에 일반화 될 수 있다.

Introduction

포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1) 다양 한 포진 labialis, 생식 기 포진, 각 막 실질 염, 뇌염 등 심각한 herpetic 질병에 약한 원인. 일단 감염, 바이러스는 중추 신경에 평생 잠복 감염을 설정 합니다. 때때로, 바이러스 열 병, 스트레스, 면역 억제1, 재발 성 헤 르 페 스 감염에 지도 등 다양 한 이유로 다시 활성화 될 수 있습니다. 감염 된 세포 단백질 0 (ICP0)는 주요 바이러스 레 귤 레이 터 모두 용균성 및 잠재 HSV-1 감염에 대 한 중요 한 이다. 그것은 다운스트림 바이러스 유전자를 통해 counteracting 호스트 내장/타고 난 항 바이러스 방어2,3transactivates. ICP0는 E3 유비퀴틴 리가 활동을, 프로테아좀 종속 저하3에 대 한 몇 가지 셀 요소를 대상으로 하고있다. 그것은 또한 그들의 활동을 규제 하 고 이후에 호스트 항 바이러스 제한3오프셋 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. ICP0는 감염 진행3,,45다른 subcellular 구획에서 찾을 알려져 있다. 단백질은 잔류물 500 5066에 위치한 리/아르기닌 풍부한 핵 지 방화 신호 (NLS) 있다. 초기 HSV-1 감염에 드 노 보 합성 시 ICP0 핵으로 즉시 가져옵니다. 처음 감지 동적 핵에 구조 나 핵 도메인 10 (ND10)7. 유비퀴틴 E3 리가 활동 ICP0 ND10 주최자 단백질, promyelocytic 백혈병 (PML) 단백질 및 단백질 얼룩 덜 룩 한 100 kDa (Sp100)8,,910의 저하를 트리거합니다. 주최자 단백질의 손실 후에 ND10 핵 시체는 분산 하 고 ICP0 전체 핵4,11을 채우기 위해 확산.

흥미롭게도, 바이러스 성 DNA 복제의 개시 후 ICP0는 핵에서 사라집니다. 그것은 전적으로 HSV-1 감염4,12에 핵-세포질 전 좌의 발생을 제안 하는 세포질에서 발견 된다. DNA 복제의 요구는 HSV-1 ICP04,12의 세포질 전 촉진에 늦게 바이러스 성 protein(s)의 잠재적인 참여를 의미 합니다. 분명히 공간 일시적인 패션에 다양 한 세포질 통로에 그것의 상호 작용을 조절 하는 ICP0 힘을 실어주 고 ICP0 감염 시 다른 구획 사이에서 매매 하 고 따라서 좌표 벌금의 여러 기능 사이의 균형 조정 용균성 및 잠재 HSV-1 감염13. 더 나은 이해 ICP0 많은 용균성 감염에 걸쳐 ICP0 기능 도메인의 조정, 하 우리는 신중 하 게 동적 ICP0 전12의 분자 기초 해 부. 기계 연구 이전에 보고 된12를 실시, 우리 confocal 현미경 다른 감염 상태에서 ICP0 subcellular 지 방화를 시각화 하는 immunofluorescent 착 방법을 적용 했습니다. 우리는 또한 핵 세포질 배급 ICP0의 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하는 양적 프로토콜을 개발 했습니다. HSV-1에 감염 된 세포의 인구는 감염 단계에 걸쳐 표로 하 고 다른 생 화 확 적인 치료12에서 ICP0 운동의 동향을 분석 했다. 여기 우리는 상세한 프로토콜 감염 HSV-1에에서는 문서 ICP0 전 좌를 설명합니다. 이 메서드는 핵 세포질 전 라이브 이미징 기법으로 인해 적용 되지 않습니다 때 라이브 이미징 하는 대신 봉사 할 수 있는 다른 바이러스 또는 세포질 단백질에 대 한 공부를 하는 일반적인 방법으로 채택 될 수 있는 제안 방법, 신호 강도, 또는 단백질 풍부 라벨 같은 문제.

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Protocol

1. 셀 시드 및 바이러스 감염

  1. 바이러스 감염 하기 전에 20-24 h, 5 x 104 인간 배아 폐 (헬) 섬유 아 세포 세포 또는 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 소 보충 4 잘 11 m m 정열된 슬라이드에 검사할 수 다른 셀의 씨앗 혈 청 (FBS))입니다. 5% 이산화탄소 (CO2) 37 ° C에 세포를 품 어.
    참고: 각 잘 있어야 한다 70-80% 셀 confluency 감염의 시간에서.
  2. 다음 날, 성장 매체를 제거 하 고 4-10 pfu/셀의 범위에 매체-199에 바이러스가 세포를 감염. 1 시간 37 ° c.에 대 한 바이러스에 감염 된 세포를 품 어 인큐베이션 기간 동안 슬라이드를 떨고 계속.
  3. 1 h 부 화 후 중간-199를 제거 하 고 보충 성장 매체.
    참고:이 단계에서 또는 바이러스 성 흡수 전에 다른 감염 단계 방해 하는 마약을 추가할 수 있습니다.
  4. 다양 한 길이의 감염 기간에 대 한 5% CO2 와 37 ° C에서 바이러스에 감염 된 세포를 품 어.

2. 고정 및 Permeabilization

  1. 적절 한 감염 시 신속 하 게 3 회 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 감염 된 세포를 세척 하 고 200 μ 4 %paraformaldehyde 갓 PBS에서 준비의 추가. 셀 paraformaldehyde 셀에 각 잘 해결 하기 위해 상 온에서 8-10 분을 품 어.
  2. Paraformaldehyde 발음 하 고 3 번에 대 한 PBS의 200 μ와 우물을 씻어. 완전히 3rd 세척 후 PBS 발음.
  3. 5-10 분에 대 한 세포를 permeabilize 잘 각에 0.2% 비 이온 계면 활성 제의 100 μ를 추가 합니다.
  4. 비 이온 계면 활성 제를 발음 하 고 3 번에 대 한 PBS의 200 μ와 우물을 씻어.

3. immunofluorescent 얼룩

  1. 완전히 PBS 발음에 각 잘 차단 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBS에서 5% 말 혈 청)의 200 μ를 추가 하 고 1 시간을 위한 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.
  2. 1 차적인 항 체 (토끼 안티 ICP0 polyclonal 항 체12)의 실험적 결정된 농도 블로킹 버퍼에 추가 하 고 기본 항 체 또는 4 ° C에서 2 시간에 대 한 실 온에서 하룻밤 사이 품 어.
  3. 블로킹 버퍼 3 번 10 분 부 화를 씻어. 알 렉 사 594 활용 된 염소 항 토끼 이차 항 체 (1:400 차단 버퍼에 희석)를 추가 하 고 슬라이드 1 시간 실 온에서 품 어. 다음 10 분 간격 3 시간 차단 버퍼와 슬라이드를 씻어.
  4. 마지막으로 잔여 BSA와 말 혈 청을 제거 하는 PBS 한번 슬라이드 세척.
  5. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 슬라이드 마운트 coverslip 투명 매니큐어를 사용 하 여 함께 인감을 함께 antifade 장착 매체의 한 방울을 추가 합니다.

4. confocal 영상

  1. Confocal 현미경으로 설정 파장 590-650 nm에서 알 렉 사 594 및 410-520 nm DAPI. 1024 x 1024에서 이미지 형식과 8 높은 해상도 이미지의 선 평균을 선택 합니다.
  2. 4 잘 슬라이드 confocal 현미경 아래에 각 잘 분석. 그림 1그림 2에서 같이 100 X 목표 아래 대표 셀 이미지를 취득 합니다.
  3. 많은 수의 셀을 계산, 40 X 목표 아래 연속 필드의 이미지 걸릴.
    참고: 5-10 이미지를를 각 감염의 각 시간 지점에서 200 개 이상의 감염 된 세포를 축적 필요 합니다.
  4. 각 실험에 비교할 수 모든 샘플 필요에 대 한 지속적인 confocal 매개 변수와 함께 사진을 찍으십시오.

5. 핵 세포질 분포 분석

  1. 오픈 프로젝트 confocal 응용 프로그램 소프트웨어와 함께입니다. 세포 ICP0의 핵 세포질 배급에 대 한 표로 될 필요가 이미지를 선택 합니다.
  2. 상단 메뉴에서 "수량" 탭을 클릭 하 고 도구 메뉴에서 "ROIs 정렬"을 선택 합니다.
  3. 상단 메뉴에서 "선 그리기"를 선택 하 여 분석할 셀에서 세로 선을 그립니다.
    참고: 히스토그램 ICP0와 DAPI 라인 형광 강도 보여주는 표시 됩니다. 히스토그램, 블루 라인 DAPI 픽셀 나타내고 빨간색 라인 ICP0 픽셀을 나타내는 반면 핵의 경계를 표시.
  4. 배경 얼룩을 바탕으로, 각 실험에서 ICP0 subcellular 분포 분석 ICP0 강도 대 한 일정 한 임계값을 설정 합니다.
    1. 에 exemplified 그림 2, 빨간 신호에 평균 하는 경우 핵 지역에서 임계값 미만 이지만 파란색 경계를 넘어 임계값 이상, 주로 세포질에 있는 빨간 신호를 분류.
    2. 빨간 신호가 핵에 걸쳐 고 파란색 신호의 경계를 넘어 임계값 이상 경우 핵 및 세포질 지역화로 빨간 신호 그룹.
    3. 만약 빨간 신호는 핵에서 임계값 이상 이지만 평균 아래 파란색 신호의 경계 밖에 서, 핵 지역화로 빨간 신호를 그룹화 합니다.
  5. 다른 감염 시간과 시간 (그림 3)에 따라 ICP0 움직임을 설명 하기 위해 막대 그래프에 플롯에서 각 샘플에서 200 개 이상의 감염 된 세포를 평면.

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Representative Results

분자 및 ICP0 HSV-1 감염 시 밀매의 생물 학적 기능을 이해 하기 우리는 다른 감염 단계에서 ICP0 subcellular 분포를 분석 하는 immunofluorescent 현미경 메서드를 사용 합니다. 그림 1 에서는 감염 진행으로 독특한 ICP0 지역화와 함께 대표적인 셀. ICP0의 핵-세포질 전 계량, 감염 된 세포를 세 그룹으로 분류 하 여 핵 상대적인 ICP0 분포 분석: 핵 지역화, 세포질 지역화, 그리고 핵 및 세포질 지역화 ( 그림 2)입니다. ICP0 감염 시 매매에 필요한 요소를 이해 하려면 다른 감염 단계에서 야생 유형 또는 돌연변이 HSV-1에 ICP0 움직임 추적 합니다. 그림 3 에 감염의 다른 시간 지점에서 ICP0의 subcellular 배포에 대 한 집계 결과의 예가 나와 있습니다.

Figure 1
그림 1: HSV-1 감염 시 ICP0의 동적 매매. 헬 셀 4 잘 슬라이드에 프로토 타입 HSV-1 (스트레인 F) 10 pfu/셀에 감염 되었습니다. 1, 5, 9 h 게시물 감염 (hpi)에서 셀 고정, permeabilized, 토끼 안티-ICP0와 마우스 안티 PML 1 차 항 체 반응 그리고 안티 토끼 알 렉 사 594 활용을 위한 알 렉 사 488-cojugated 반대로 마우스 2 차 항 체 반응 아래 100 X 목표 이미지입니다. Promyelocytic 백혈병 (PML) 단백질 5와 9 hpi PML 저하 감염 때문에 사라집니다 ND10 핵 기관에 대 한 마커 단백질 역할을 합니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: ICP0 subcellular 분포의 분석. 왼쪽된 패널: confocal 현미경으로 대표적인 셀 관심 (ROI) 영역을 정의 하는 셀에 걸쳐 그려진 경도 선 표시 확대 됐다. 오른쪽 패널: 투자 수익에 형광 픽셀 농도 ICP0와 DAPI 개별 셀에 대 한 정량 되었고 confocal 응용 프로그램 소프트웨어에 의해 히스토그램으로 그림. 임의의 임계값 (녹색 선) 배경 얼룩을 반영 하도록 설정 되었습니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 야생-타입 subcellular 분포의 비율 및 C 터미널 잘린 ICP0. 헬 셀 야생-타입 ICP0를 포함 하는 재조합 형 바이러스에 의해 감염 되었다 (ICP0 WT) C 터미널 잘린 ICP0 또는 (ICP0 C-잘라내기) 4 pfu/셀. 표시 시간 점에서 셀 스테인드 되었고 위에서 설명한 대로 분석. 200 개 이상의 셀 ICP0 위치에 대 한 표로 않는다 했다. 포함 하는 핵, 세포질, 세포 또는 핵 + 세포질 ICP0의 비율 스프레드시트 계산 소프트웨어와 함께 구성 했다. 이 표시는이 메서드를 사용 하 여 확인 했습니다 ICP0 C-말단에 ICP0 핵-세포질 전 필요한 도메인으로 모범적인 실험입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 HSV-1 ICP0의 핵-세포질 전 공부에 사용 되었습니다. ICP0는 HSV-1 감염 (그림 1) 동안 subcellular 밀매를 겪 습. 아마, ICP0 다른 위치에서 다른 기능을 수행 하기 위해 다양 한 셀 통로와 상호 작용 합니다. 미세 조정 인간의 호스트13투쟁에서의 여러 기능을 ICP0 수 있습니다. 그러나, ICP0 공간 일시적인 방식 다중 기능을 조정 하는 방법 안 되어 잘 공부 했다. 위에서 설명한 형광 현미경 검사 법 프로토콜, 우리 ICP0 핵-세포질 전 좌의 분자 기준 분석을 시작 했다. 지금, 우리 ICP0의 C-터미널 식별이 전 좌에 대 한 중요 한 필수 요소로 35 아미노산. C-말단의 부재, ICP0은 내 감염 (그림 3)에 걸쳐 핵 제 지. 우리는 또한 발견 하는 ICP0 E3 리가 종속 핵 보유 힘은 핵-하-세포질 지연 전 U2OS 셀12. 또한, 우리는 ICP0 C-말단 그리고 늦게 바이러스 성 단백질의 표정 핵 보유를 극복 하 고 세포질 전12촉진에 협력을 발견 했다. 현재, 우리는 ICP0 핵-세포질 전 좌에 늦게 바이러스 성 단백질에 대 한 화면에이 프로토콜을 사용 하는.

프로토콜 감염 HSV-1에에서 ICP0의 동적 밀매 공부를 처음 개발 되었다. HSV-1 감염 초기에 그림 1에서 같이 ICP0 셀룰러 제한적인 요인의 몇 가지 주요 구성 요소 및 ND10 구성 요소 예: PML 및 Sp1008, 저하는 ND10와 colocalized 이다. ND10 주요 성분, 타락 후 ICP0 확산 핵 전역과 감염에, ICP0는 세포질에 translocated. 있기 때문에 ICP0 거쳐 감염 시 드 노 보 합성, 초기 단백질 abundancy 매우 낮습니다 다음 강력한 바이러스 합성 신속 하 게 애매 한 단일 분자를 사용 하 여 추적을 어렵게 만드는 어떤 개별 분자의 운동 라이브 이미징 기술입니다. 따라서, 우리가 의도적으로 하지 않기로 라이브 이미징 사용. 대신, 우리는 HSV-1에 감염 된 세포의 인구에 ICP0 시간적 움직임 추적에서 잘 우리를 역임 다른 감염 지점에서 정상 상태 ICP0 지역화 연구 위의 프로토콜을 채택 했다.

Confocal 분석에 높은 신호-배경 비율, 2 개의 중요 한 단계는이 프로토콜의 젖은 벤치 부분에서 주목할 만한. 첫째, 4 잘 정열된 슬라이드 여러 샘플 하나의 단일 슬라이드에 처리 될 수 있습니다. 그것은 크게 바이러스와 항 체 같은 귀중 한 시 약의 사용을 저장합니다. 그러나, 각 잘에서 개최 볼륨 너무 작습니다, 있기 때문에 잔여 버퍼 완전히 버퍼 변경 시 허가 이후 시 방해 수 있습니다. 따라서, 각 버퍼 스위치에 철저 한 포부 새로운 버퍼를 추가 하기 전에 필요 합니다. 둘째, 우리의 경험을 바탕으로, 셀 가교와 막 침투성의 정도 형광 신호의 선명도 대 한 중요 한. Paraformaldehyde와 비 계면 활성 제 치료에 대 일 분의 경험적 번호를 설정 했습니다. 우리는 훨씬 더 긴 또는 짧은 10 분 신호-배경 비율을 줄일 수 있는 보다 그 시간을 발견. 이전 연구12에서 뿐만 아니라 그림 1그림 2에서 같이, 우리의 실험에서 얻은 이미지는 맑은. 핵 경계를 명확 하 게 설명 하는 저명한 파란 신호 ICP0의 subcellular 분포를 결정 하는 열쇠입니다. 이 프로토콜의 계산 부분에서 하나의 중요 한 단계는 배경 제거를 일정 한 임계값을 설정 하입니다. 높은 신호 대 배경 비 성공적인 얼룩 낮은 임계값 줄 및 더 나은 신호 대비에 열쇠 이다. 그러나, 동일한 실험에서 모든 샘플에 대 한 일정 임계값을 유지은 ICP0의 양적 설명서에 대 한 기초 이다 (그림 2그림 3).

프로토콜 또한 subcellular 인신 매매 다른 바이러스 또는 세포질 단백질을 위해 적합 한 라이브 이미징 방법 결여 될 때 공부 하는 일반 도구로 사용할 수 있습니다. 라이브 이미징 기술, 셀 셀 신진 대사 상태14,15을 유지 하기 위해 최적의 생리 환경에 유지 됩니다. 라이브 셀 이미징에 대 한 기본적인 요구 사항 형광 태그16대상 단백질을 융합 하 여 얻을 수 있는 대상 단백질을 붙일 인지는 fluorophore 제공 분자 특정 대상 단백질17에 대 한 활용 . 두 경우 모두 문제 대상 단백질 속성을 변경 하는 형광 태그의 융합 또는 fluorophore 활용된 분자 세포 막을 교차 하는 어려움 상승 수 있습니다. Photobleaching는 과정에서 세포 손상을 일으키는 라이브 이미징18추가 관심사 이다. 따라서, 라이브 이미징의 한계를 극복 하기 위해 새로운 전략 기술 개발의 국경 계속. 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 적절 한 라이브 이미징 메서드를 사용할 수 없는 경우 대체 도구 역할을 할 수 있는 정상 상태 공초점 이미지의 시간적 분석을 제공 합니다. 방법은 간단 하 고 신뢰할 수 있는입니다. 최소 배경 가진 단백질 subcellular 지 방화의 명확한 검색을 제공합니다. Confocal 소프트웨어를 사용 하 여, 우리 양적 세포 인구에서 대상 단백질의 다른 배급을 가진 셀의 비율을 분석 하 고 다른 세포 단계에서 대상 단백질의 움직임을 문서 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

우리는 금융 지원을 해 서울에 게 수 여 하는 NIH 보조금 (RO1AI118992) 감사 합니다. 우리는 기술 지원에 대 한 웨인 주립 대학에서 현미경, 이미징 & Cytometry 리소스 (MICR) 핵심 시설을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10x) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

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References

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