Vivo में एक विधि माउस रक्त-वृषण बाधा अखंडता का अध्ययन करने के लिए

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Developmental Biology

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Summary

यहां, हम परीक्षण में inulin-FITC इंजेक्शन द्वारा रक्त वृषण बाधा अखंडता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस vivo विधि में कुशल रक्त-वृषण बाधा अखंडता है कि आनुवंशिक और पर्यावरणीय तत्वों से समझौता किया जा सकता है अध्ययन करने के लिए है ।

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Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

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Abstract

शुक्राणुजनन नलिकाओं के सेमिनीफेरस वृषण में परिपक्व शुक्राणु में spermatogonia का विकास होता है. इस प्रक्रिया Sertoli सेल जंक्शनों द्वारा रक्त-वृषण बैरियर (BTB) है, जो स्तनधारी शरीर में सबसे तंग ऊतक बाधा है और दो डिब्बों, एक बेसल और एक सेमिनीफेरस में adluminal उपकला पृथक्करण द्वारा समर्थित है । BTB अर्धसूत्रीविभाजन में रोगाणु कोशिकाओं के लिए एक अद्वितीय microenvironment बनाता है I/II और spermatids के माध्यम से शुक्राणु में postmeiotic spermiogenesis के विकास के लिए । यहां, हम एक विश्वसनीय परख का वर्णन vivo मेंमाउस वृषण के BTB अखंडता पर नजर रखने के लिए । एक बरकरार BTB ब्लॉक FITC के प्रसार-संयुग्मित inulin बेसल से शिखर सेमिनीफेरस के नलिकाओं डिब्बे के लिए । इस तकनीक जीन उंमीदवारों, वायरस, या पर्यावरणीय विषालु है कि BTB समारोह या अखंडता को प्रभावित कर सकते है अध्ययन के लिए उपयुक्त है, एक आसान प्रक्रिया के साथ और वैकल्पिक तरीकों की तुलना में शल्य चिकित्सा कौशल की एक ंयूनतम आवश्यकता ।

Introduction

स्तनधारी शुक्राणुजनन एक उच्च संरचित प्रक्रिया है कि spermatocytes के माध्यम से अगुणित शुक्राणु में बँटवारा, अर्धसूत्रीविभाजन, और spermiogenesis, जो दौरान नाटकीय के माध्यम से स्व-नवीकरण और भेदभाव spermatogonial शामिल माना जाता है जैव रासायनिक और रूपात्मक परिवर्तन होते हैं । विकासशील रोगाणु कोशिकाओं को उत्तरोत्तर लुमेन की ओर सेमिनीफेरस tubule के आधार से पहुंचाया जाता है । यह प्रक्रिया रोगाणु कोशिकाओं और Sertoli कोशिकाओं1,2के बीच सेल सेल संपर्कों द्वारा विनियमित है । सन्निकट Sertoli कक्ष BTB सेमिनीफेरस tubule के आधार के पास स्थित है जो प्रपत्र । BTB शारीरिक रूप से एक बेसल और एक adluminal डिब्बे में उपकला विभाजित । चरणों के दौरान आठवीं-ग्यारहवीं उपकला चक्र की, preleptotene/leptotene spermatocytes बेसल डिब्बों से BTB भर में विस्थापित, adluminal डिब्बों में प्रवेश3. इसलिए, BTB के समारोह अर्धसूत्रीविभाजन और spermiogenesis4,5,6के पूरा होने के लिए एक immunoprivileged microenvironment प्रदान करना है । अन्य रक्त ऊतक अवरोधों (जैसे, रक्त मस्तिष्क बाधा) है कि केवल तंग जंक्शनों (TJs) से बना रहे हैं के विपरीत, BTB चार विभिन्न जंक्शनों (TJs, ectoplasmic विशेषज्ञता, अंतर जंक्शनों, और मध्यवर्ती रेशा आधारित द्वारा बनाई गई है desmosomes) Sertoli कोशिकाओं के बीच1,7.

कई अध्ययनों का इस्तेमाल किया है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, वायरस के संक्रमण, और पर्यावरण विषालु BTB अखंडता7,8,9के तंत्र की जांच करने के लिए । BTB व्यवधान बिगड़ा शुक्राणुजनन और उपप्रजनन या बांझपन लाती है । BTB गठन और अखंडता Sertoli8कोशिकाओं के बीच संपर्कों से प्रभावित होने की पुष्टि की गई है के बाद से, एक इन विट्रो मॉडल अलग Sertoli कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति पर आधारित BTB अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस मॉडल सही BTB गतिशीलता में vivoकी नकल नहीं कर सकता । इसके अलावा, कोई ऐसी सह Sertoli कोशिकाओं के साथ रोगाणु कोशिकाओं की संस्कृति के रूप में स्थापित किया गया है BTB10,11के सभी प्रासंगिक संरचनात्मक और कार्यात्मक घटकों को प्रतिबिंबित करने में सक्षम ।

सामांय में, vivo BTB अखंडता परख में आमतौर पर ऐसे ईज़ी लिंक Sulfo-एन एच एस-नियंत्रण-बायोटिन और FITC-संयुग्मित inulin (inulin-FITC) के रूप में छोटे अणुओं, पर आधारित हैं । आम तौर पर, बेसल डिब्बे से बायोटिन या inulin-FITC का प्रसार BTB संरचना द्वारा अवरुद्ध है । इसलिए, हम नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में BTB क्षति की सीमा का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग करने में सक्षम हैं । जबकि BTB कैडमियम क्लोराइड (CdCl2)12के साथ उपचार के रूप में कुछ प्रकार की उत्तेजनाओं के साथ समझौता किया जा सकता है, BTB छोटे अणुओं, जो अंततः संकेतक के रूप में adluminal डिब्बे में प्रवेश करने के लिए सुलभ हो जाता है ।

vivo BTB अखंडता परख में एक जल्दी jugular नस में बायोटिन या inulin-FITC इंजेक्शन शामिल है, जो शल्य चिकित्सा शामिल है, और आक्रामक, जटिल है, और समय लेने वाली । इसके अलावा, रिपोर्टर पदार्थ परिसंचरण के माध्यम से पूरे शरीर के माध्यम से फैलाना, सेमिनीफेरस नलिकाओं में बायोटिन या inulin-FITC की स्थानीय एकाग्रता सीमित है । इसके अलावा, प्रणालीगत जोखिम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं । यहां, हम एक सरल और vivo BTB अखंडता परख एक interstitium के वृषण में inulin-FITC के एक छोटे aliquot के प्रत्यक्ष इंजेक्शन को सक्षम करने में प्रभावी वर्तमान । फ्लोरोसेंट लेबलिंग विधि का प्रयोग, धुंधला प्रक्रिया सुविधाजनक है, के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं । यहां, फ्लोरोसेंट डाई वृषण में प्रवेश करने की प्रक्रिया visualized है ।

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Protocol

सभी प्रदर्शन पशु प्रयोगों नानजिंग चिकित्सा विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है । पुरुष C57BL/6 चूहों नियंत्रित photoperiod शर्तों के तहत रखा गया था और भोजन और पानी के साथ आपूर्ति की गई ।

1. तैयारी

  1. Microinjection केशिकाएं
    1. क्रमशः एक बाहरी व्यास, भीतरी डायमीटर, और १.० मिमी, ०.८ मिमी, और १०.० सेमी की लंबाई के साथ microinjection केशिकाओं का उपयोग करें ।
    2. एक केशिका खींचने (आंकड़ा 1a) के साथ कांच केशिकाओं खींचो । परीक्षण और उपयोग किया जा रहा है कि केशिका खींचने की मशीन के आधार पर सेटिंग्स समायोजित करें ।
    3. टिप पर एक ५०-µm व्यास की केशिकाओं प्राप्त करने के लिए उपयोग करने के लिए संदंश के साथ पिपेट सुझावों को तोड़ने.
      नोट: युक्तियां वृषण घुसना करने के लिए बहुत लंबा हो सकता है ।
    4. एक micropipette बेवलर (चित्रा 1C) का उपयोग करके एक 30 ° कोण में टिप पैनापन ।
  2. अभिकर्मकों
    1. तैयार 1% pentobarbital सोडियम: भंग pentobarbital सोडियम १०० 10 मिलीलीटर में मिलीग्राम फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) (कदम 2.3.3).
    2. तैयार 10 मिलीग्राम/एमएल inulin-FITC: भंग inulin-FITC 1 mg में १०० μL के पंजाबियों (step 2.1.6).
    3. तैयार 4% paraformaldehyde: विच्छेदन paraformaldehyde (पीएफए) पंजाब के १०० मिलीलीटर में 4 ग्राम (कदम 2.3.3) ।
    4. 30% सुक्रोज तैयार करें: पंजाब के 10 मिलीलीटर (step 2.3.4) में सुक्रोज 3 जी भंग ।
    5. ०.१% कैडमियम क्लोराइड तैयार करें: कैडमियम क्लोराइड भंग 10 पंजाबियों (2.1.1 कदम) के 10 मिलीलीटर में मिलीग्राम.

2. विधियाँ

  1. संज्ञाहरण और सर्जरी की तैयारी
    1. 8-सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों का वजन और CdCl2की आवश्यक खुराक की गणना । चूहों के एक समूह का इलाज (n = 3) CdCl2 के साथ (5 मिलीग्राम/kg बीवीएससी, आईएफसआई) सर्जरी से पहले 3 डी के लिए । नियंत्रण के रूप में पंजाबियों के साथ 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों (एन = 3) के एक अन्य समूह समझो ।
    2. बाँझ सिरिंज, सुई, कैंची, और संदंश का उपयोग करके अपूतित शर्तों के तहत सर्जरी प्रदर्शन.
    3. संज्ञाहरण काम समाधान हौसले से तैयार । संज्ञाहरण की आवश्यक खुराक है ७० मिलीग्राम pentobarbital सोडियम/किलो के शरीर के वजन । औसत पर, एक वयस्क C57BL/6 चूहे की उंर के 8 सप्ताह में वजन ~ 25 जी, जो 1% pentobarbital सोडियम के १७५ μL से मेल खाती है (१.७५ मिलीग्राम प्रति माउस) ।
      नोट: pentobarbital सोडियम बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में भंग कर रहा है. समाधान उपयोग किए जाने से पहले ०.२२ um फ़िल्टर इकाई द्वारा फ़िल्टर किया जाता है ।
    4. ७५% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा के लिए क्षेत्र को साफ और एक साफ ऊतक तौलिया के साथ क्षेत्र को कवर ।
    5. थर्मोस्टेट हीटर पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित ।
    6. सर्जरी के दिन inulin-FITC कार्य समाधान (10 मिलीग्राम/एमएल) तैयार करें ।
  2. सर्जिकल प्रक्रिया
    1. 8-सप्ताह पुराने C57BL/6 पुरुष चूहों का वजन और संज्ञाहरण की आवश्यक खुराक की गणना ।
    2. 1-मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग कर pentobarbital सोडियम की एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन. माउस को साफ पिंजरे में रखें ।
    3. आंख पलटा प्रतिक्रिया और माउस की सांस लेने के पैटर्न का निरीक्षण करने के लिए पुष्टि करें कि यह पूरा संज्ञाहरण के तहत है ।
      नोट: आमतौर पर, 10-15 मिनट की जरूरत है जब तक माउस गहरा anesthetized है, पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया और धीमी गति से, स्थिर श्वास के रखरखाव की कुल कमी के साथ ।
    4. आपरेशन क्षेत्र के लिए माउस ले जाएं और संज्ञाहरण (चित्रा 2a) के दौरान सूखापन से बचने के लिए एक नम ऊतक कागज के साथ अपनी आंख क्षेत्र को कवर किया ।
    5. एक हजामत बनाने का स्थान के साथ अपने पेट के बाल दाढ़ी और ७५% इथेनॉल के साथ सर्जरी क्षेत्र को संक्रमित ।
    6. तेज कैंची के साथ, एक 1 सेमी त्वचा preputial ग्रंथियों के ऊपर चीरा करने के लिए पेट की दीवार को बेनकाब करना । छोटे संदंश के साथ पेट की दीवार उठा और पेरिटोनियल गुहा (चित्रा बी) को बेनकाब करने के लिए एक ०.५ सेमी चीरा बनाते हैं ।
    7. अधिवृषण और वृषण के आसपास वसा पैड के लिए खोज करने के लिए संदंश का प्रयोग करें । ध्यान से वसा पैड बाहर खींचने के लिए संलग्न वृषण स्पष्ट रूप से बेनकाब (चित्रा 2c और 2d) । आमतौर पर, एक समय में एक वृषण पर काम करते हैं ।
      नोट: फैट पैड को छूने से बचें और हाथों से वृषण ।
    8. वसा पैड और वृषण (चित्रा 2c) के नीचे एक कागज (व्यास में 9 सेमी) रखें ।
    9. inulin-FITC को एक microinjection पिपेट में इंजेक्ट करें और इसे micromanipulator यूनिट (चित्रा 1 डी) से कनेक्ट करें । धीरे से microinjection पिपेट को tunica albuginea के तहत डालें और μL-inulin के FITC (फिगर interstitium और वृषण) के कुल 20 2E में से एक-एक कर के 2F को लोड करें ।
      नोट: ध्यान रहे कि microinjection पिपेट को आगे बढ़ने से दबाना ।
    10. वृषण (चित्रा 2g) में inulin-FITC के मूवमेंट पर नजर रखें ।
    11. तुरंत वृषण को इंजेक्शन के पूरा होने के बाद उदर गुहा में वापस डाल दिया ।
    12. contralateral वृषण पर कार्यविधि को दोहराएँ । इस वृषण को नियंत्रण के रूप में पंजाब के 20 μL के साथ इंजेक्ट है ।
    13. एक शल्य टांका के साथ त्वचा को बंद करें और एक थर्मोस्टेट हीटर (आंकड़ा 1b) के एक गर्मी पैड के लिए माउस को स्थानांतरित । एक खुराक की 1 मिलीग्राम एनाल्जेसिक (buprenorphine) प्रति 1 किलो के शरीर के वजन के माध्यम से चमड़े के नीचे इंजेक्शन ।
  3. परीक्षाओं और जमे वर्गों की कटाई की तैयारी
    1. ४० मिनट इंजेक्शन के बाद, पशु देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार ग्रीवा विस्थापन द्वारा प्राप्तकर्ता माउस euthanize ।
    2. testes इकट्ठा करने के लिए तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें । किसी भी रक्त संदूषण को दूर करने के लिए एक आइस-कोल्ड पंजाब के 1 मिलीलीटर में tests रखें ।
    3. 4% paraformaldehyde (पीएफए) ४ ° c में tests 12-24 h के लिए 4% पीएफए त्यागें और कमरे के तापमान पर 1% पंजाबियों के १.५ मिलीलीटर के साथ ऊतक 3x धो लो ।
    4. 30% सुक्रोज में ऊतक रात भर निर्जलीकरण । एंबेडिंग फ्रेम में वृषण रखो और इष्टतम काटने तापमान यौगिक (OCT) के साथ ऊतक कवर । oct जम जाने के बाद, oct के साथ एंबेडिंग फ़्रेम भरें ताकि पूरे वृषण oct के साथ कवर किया जा सके ।
    5. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat में testes के 5-माइक्रोन-मोटी, जमे हुए पार वर्गों कट और उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड का पालन करते हैं ।
      नोट: शुष्क बर्फ में एम्बेडेड ऊतकों को काटने के लिए कठोरता में वृद्धि हो सकती है ।
  4. छवि मांगपत्र
    1. स्लाइड्स को किसी humidified बॉक्स में रखें । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड गर्म ।
    2. कमरे के तापमान पर Tris-बफर खारा (टीबीएस) के साथ 3x वर्गों धो लो ।
    3. हवा-अंधेरे में 5 मिनट के लिए सूखी । धूल से मुक्त कागज के साथ किसी भी अवशिष्ट टीबीएस पोंछ ।
    4. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ पार वर्गों को कवर । उल्टे coverslip को एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें ।
    5. एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण । 20X आवर्धन की कुल चमकीले फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के लिए आम तौर पर पर्याप्त है ।

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Representative Results

प्रायोगिक सेट-अप BTB अखंडता परख प्रदर्शन के लिए चित्रा 1में दिखाया गया है । खींचो और एक केशिका खींचने और micropipette बेवली, क्रमशः (चित्रा 1a और 1C) के साथ microinjection केशिकाओं पैनापन । microinjection के लिए थर्मोस्टेट हीटर और उपकरण चित्र 1b और 1 डीमें सचित्र हैं ।

चित्रा 2 inulin-FITC के इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण कदम के कुछ प्रदर्शित करता है । उपयोग कैंची एक छोटा सा चीरा करने के बाद माउस पूरा संज्ञाहरण आया है (चित्रा 2a और बी b). माउस वृषण उजागर और एक microinjection पिपेट (चित्रा 2c 2 जी) का उपयोग कर फ्लोरोसेंट डाई के साथ इंजेक्शन है ।

चित्रा 3 एक अध्ययन के ठेठ छवियों को प्रदर्शित करता है vivo परख में एक पर आधारित BTB अखंडता का आकलन । CdCl2-उपचार समूह में चूहों 3 दिनों के लिए CdCl2 (5 मिलीग्राम/kg बीवीएससी, आईएफसआई) की एक तीव्र खुराक के साथ इंजेक्ट कर रहे हैं । inulin के प्रसार-बेसल डिब्बे से FITC नियंत्रण समूह में BTB संरचना द्वारा अवरुद्ध है, जबकि BTB निर्माण क्षतिग्रस्त है और inulin में प्रतिदीप्ति उपकला के शिखर के डिब्बे में (ग्रीन सेमिनीफेरस) मार्ग CdCl2 -उपचार समूह । सफेद लाइन क्षेत्रों दूरी तहखाने झिल्ली (चित्रा 3ए) से inulin द्वारा कूच संकेत मिलता है । BTB क्षति की हद तक दूरी से निर्धारित होता है । एक अंडाकार लुमेन के लिए, त्रिज्या सबसे कम और बेसल डिब्बे से सबसे लंबी दूरी के tubule के केंद्र के लिए औसत है । हम BTB क्षति की सीमा के एक सूचकांक के रूप में इस तरह के एक अनुपात का उपयोग करें:
Equation
यहां, डीInulin दूरी बेसल डिब्बे और डीत्रिज्या से Inulin द्वारा कूच है वही सेमिनीफेरस tubule (चित्र बी) की त्रिज्या है । बरकरार BTB Rictorfl/+ चूहों में बाधा पार inulin के प्रसार शिखर डिब्बे में प्रवेश के लिए ब्लॉक । इसके विपरीत, Rictorcko चूहों एक समझौता BTB inulin प्रसार की अनुमति (आंकड़ा 3सी) है ।

Figure 1
चित्रा 1: माउस वृषण मध्यवर्ती microinjection के लिए उपकरण । () एक ऊर्ध्वाधर केशिका खींचने के साथ कांच केशिकाओं खींचो । () यह पैनल थर्मोस्टेट हीटर को दिखाता है. () युक्तियां micropipette बेवलर का उपयोग कर तेज कर रहे हैं । () microinjection के लिए इकाई एक microinjection पंप और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप भी शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक चूहे में vivo वृषण मध्यवर्ती microinjection कार्यवाही के प्रतिनिधि छवियाँ. () यह पैनल एक शेविंग द्वारा पेट के बालों को हटाने का पता चलता है । () इस पैनल पेरिटोनियल गुहा को बेनकाब करने के लिए ०.५ सेमी पेट की दीवार चीरा से पता चलता है । () वसा पैड बाहर खींच स्पष्ट रूप से संलग्न वृषण बेनकाब करने के लिए । () यह पैनल वृषण और अधिवृषण की स्थिति को दिखाता है. () यह पैनल microinjection पिपेट की स्थिति को दिखाता है. () microinjection पिपेट को वृषण के interstitium में डालें । () यह पैनल वृषण के interstitium में एक सफल इंजेक्शन के साथ एक वृषण दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक अध्ययन vivo कार्यात्मक परख में एक पर आधारित BTB अखंडता का आकलन करने के लिए । वयस्क पुरुष चूहों (n = 3 दोनों उपचार समूह और नियंत्रण समूह में) CdCl2 के साथ इलाज कर रहे हैं (5 मिलीग्राम/kg बीवीएससी, आईएफसआई) 3 दिनों के लिए (उपचार समूह) या पंजाब के साथ 3 दिनों के लिए इलाज (नियंत्रण समूह). Inulin-FITC (green प्रतिदीप्ति) नियंत्रण समूह में सेमिनीफेरस tubule के आधार के निकट स्थित है, जबकि Inulin-FITC BTB-उपचार समूह में CdCl2 भर में एक मार्ग आरंभ करता है. () इस पैनल में, सफेद रेखा खंडों दूरी inulin-FITC आक्रमण संकेत मिलता है । पैमाने सलाखों के 20 माइक्रोन हैं । () BTB अखंडता की परख से डेटा इस हिस्टोग्राम है, जो दूरी दिखाने के inulin (डीinulin) द्वारा कूच एक ही tubule के त्रिज्या बनाम (डीत्रिज्या) में दिखाया जाता है । ८० नलिकाओं बेतरतीब ढंग से चुने गए हैं. P < ०.००१ (छात्र का t-test) । () BTB अखंडता Rictorcko चूहों के परीक्षण में समझौता किया है. में Rictorcko माउस नलिकाओं, inulin सेमिनीफेरस उपकला के अंदर गहरी प्रवेश, tubule लुमेन तक पहुँचने. पैमाने सलाखों ५० माइक्रोन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

शुक्राणुजनन सेमिनीफेरस उपकला में जगह लेता है और एक उच्च आदेश दिया और गतिशील प्रक्रिया है कि रोगाणु कोशिकाओं और दैहिक कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जाताहै (जैसे , Sertoli कोशिकाओं)13. BTB संरचना, जो Sertoli कोशिकाओं द्वारा निर्मित है, सेमिनीफेरस उपकला को एक बेसल और एक शिखर डिब्बे में विभाजित करती है । meiotic और अगुणित रोगाणु कोशिकाओं के विकास शिखर डिब्बे जो एक प्रतिरक्षा बाधा14रूपों में होता है ।

BTB समारोह विषालु द्वारा या सेल जंक्शनों के गठन में शामिल जीन में दोषों के कारण समझौता किया जा सकता है, पुरुष बांझपन के लिए अग्रणी । आदेश में BTB अखंडता की जांच करने के लिए, एक इन विट्रो Sertoli सेल संस्कृति प्रणाली स्थापित किया गया है कि कार्यात्मक उपकला है कि बारीकी से vivo15में BTB नकल बनाने में सक्षम है । इस में इन विट्रो प्रणाली Sertoli सेल जंक्शनों की संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक सरल मॉडल प्रदान करता है । हालांकि, Sertoli कोशिकाओं वृषण से अलग और इन विट्रो में संस्कृति पशु आयु और कोशिका घनत्व15,16के संबंध में सीमित हैं । इसके अलावा, Sertoli कोशिकाओं की शुद्धता और ultrastructures नकल उतार BTB सुविधाओं की उपस्थिति17निगरानी की जानी चाहिए । अधिक महत्वपूर्ण, BTB संरचना और अखंडता भी रोगाणु कोशिकाओं और Sertoli कोशिकाओं के बीच बातचीत की आवश्यकता है, के रूप में BTB दोषों10,18,19के साथ रोगाणु कोशिका विशिष्ट नल उत्परिवर्ती चूहों के अध्ययन से स्पष्ट है । इस प्रकार, एक सह बनाने के Sertoli कोशिकाओं के साथ रोगाणु कोशिकाओं में recapitulating के प्रयोजन के लिए इन विट्रो में BTB के सभी महत्वपूर्ण vivo समारोह में11,20चुनौतीपूर्ण रहता है ।

इस प्रोटोकॉल inulin-FITC, जो चेन एट अल द्वारा एक प्रक्रिया से संशोधित किया गया था इंजेक्शन द्वारा vivo में BTB अखंडता का आकलन करने की एक विधि का वर्णन है । 21. प्रोटोकॉल पुरुष चूहों के संज्ञाहरण का वर्णन करता है, पेरिटोनियल गुहा के जोखिम, वृषण के interstitium में डाई के microinjection, परीक्षण कटाई और जमे हुए वर्गों में उंहें काटने, और छवियों के अधिग्रहण । एक सफल समापन के लिए, कई कदम ध्यान दिया जाना चाहिए । सबसे पहले, यह संज्ञाहरण के एक उचित खुराक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि गंभीर रूप से गहरी संज्ञाहरण मौत का कारण हो सकता है । इसके अलावा, इंजेक्शन केशिका की नोक की लंबाई बहुत लंबा नहीं होना चाहिए; अंयथा, पिपेट वृषण घुसना नहीं कर सकता ।

प्रक्रिया यहां प्रस्तुत वायरस, रासायनिक विषालु, या उंमीदवार BTB के विनियमन में शामिल प्रोटीन की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । यह परख संवेदनशील, विश्वसनीय है, और vivo मेंBTB अखंडता की निगरानी के लिए सुलभ है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

इस काम के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास चीन के कार्यक्रम (2016YFA0500902), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४७१२२८, ३१७७१६५३), प्रतिष्ठित युवा विद्वानों (BK20150047), प्राकृतिक विज्ञान के लिए Jiangsu विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया Jiangsu प्रांत की नींव (BK20140897, 14KJA180005) और Jiangsu प्रांत के अभिनव और उद्यमी कार्यक्रम K.Z. को

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

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References

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