Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

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Developmental Biology

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Summary

여기, 선물이 testes에 눌린 FITC를 주입 하 여 혈액 고환 방 벽 완전성을 평가 하는 프로토콜. 이것은 유전과 환경 요소에 의해 손상 될 수 있습니다 혈액 고환 방 벽 무결성 공부 효율적인 vivo에서 방법.

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Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

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Abstract

Spermatogenesis는 고환의 seminiferous tubules에서 성숙한 정 충으로 spermatogonia의 개발 이다. 이 과정은 Sertoli 세포 접합 혈액 고환 방 벽 (도 서 구매), 포유류 몸에 있는 가장 단단한 조직 장벽 이며 2 개의 구획로 기초는 adluminal seminiferous 상피를 분리에 의해 지원 됩니다. 웨스트가 감수 분열 생식 세포에 대 한 독특한 microenvironment 만듭니다 I / II와 spermiogenesis 통해 정 충으로 postmeiotic spermatids의 개발에 대 한. 여기, 우리가 마우스 고환에서 vivo에서의 서 구매 무결성을 모니터링 하는 데 신뢰할 수 있는 분석 결과 설명 합니다. 그대로 웨스트가 seminiferous tubules의 꼭대기 구획에는 기저에서 FITC 활용 눌린의 확산을 차단합니다. 이 기술은 유전자 후보, 바이러스, 또는 서 구매 기능 또는 무결성, 쉬운 절차와 다른 방법에 비해 수술 능력의 최소한의 요구 사항에 영향을 미칠 수 있는 환경 유독 공부 위해 적당 하다.

Introduction

포유류 spermatogenesis spermatogonial 자체-갱신 및 감 별 법 spermatocytes 통해 유사 분열, 감수 분열, 그리고 spermiogenesis를 통해 단일 정 충에는 극적인 고도로 구조화 된 과정으로 간주 됩니다. 생화학 및 형태학 상 변화 발생합니다. 개발 생식 세포는 루멘으로 seminiferous 관의 기지에서 점차적으로 이송 됩니다. 이 프로세스는 세균 세포와 Sertoli 세포1,2사이 세포 세포 접촉에 의해 통제 된다. 인접 한 Sertoli 세포 형성 seminiferous 관의 기지 근처에 있는 서 구매. 도 서 구매 실제로 나눕니다 상피는 기저 및 adluminal 구획. 8 조-IX 상피 주기의 단계 preleptotene/leptotene spermatocytes 기저 구획에서도 서 구매, adluminal 구획3입력에 걸쳐 마이그레이션합니다. 따라서,는 서 구매의 함수 감수 분열 및 spermiogenesis4,,56의 완료에 대 한 immunoprivileged microenvironment를 제공 하는. 다른 혈액 조직 장벽 (, 혈액-뇌 장벽)만 꽉 접합 (TJs)으로 구성 된, 달리는 서 구매 (TJs, ectoplasmic 전문화, 간격 접속점, 그리고 중간 필 라 멘 트에 기초를 둔 4 명의 다른 접합에 의해 형성 된다 desmosomes) 사이 Sertoli 세포1,7.

많은 연구는 사용 유전자 변형 마우스, 바이러스 감염, 환경 유독 웨스트가 무결성7,,89의 메커니즘을 조사 하. 도 서 구매 중단 장애인된 spermatogenesis subfertility 또는 불 임 유도합니다. 생체 외에서 모델 격리 Sertoli 세포의 기본 문화에 따라 사용 되었습니다 이후 웨스트가 형성 및 무결성 확인 되었습니다 Sertoli 세포8사이 접촉에 의해 영향을 받을, 웨스트가 연구. 그러나,이 모델에는 웨스트가 역학 비보모방 정확 하 게 수 없습니다. 또한, Sertoli 세포와 생식 세포의 이러한 공동 문화는 모든 관련 구조 및 기능 구성 요소 웨스트가10,11의 반영의 능력으로 설립 되었습니다.

일반적으로, vivo에서 웨스트가 무결성 분석 실험 일반적으로 EZ-링크 Sulfo NHS LC 비오 틴 등 FITC 활용 눌린 (눌린 FITC) 작은 분자에 근거한 다. 일반적으로, biotin 또는 기초 구획에서 눌린 FITC의 보급도 서 구매 구조에 의해 차단 됩니다. 따라서, 우리는이 메서드를 사용 하 여 제어 그룹에 비해 웨스트가 손상의 정도 평가 하기 위해 수 있습니다. 도 서 구매는 특정 유형의 카드뮴 염화 (CdCl2)12, 치료 등의 자극으로 손상 될 수 있습니다 동안 웨스트가 된다 결국 지표로 adluminal 구획을 입력 작은 분자에 액세스할 수 있습니다.

초기 vivo에서 웨스트가 무결성 분석 결과 포함 biotin 또는 눌린 FITC는 수술를 포함 하 고 침략 적, 이며 복잡 한, 시간이 걸리는 경 정 맥에 주입 됩니다. 게다가, 기자 물질 순환을 통해 몸 전체를 통해 확산로 비오 틴 또는 seminiferous tubules에 눌린 FITC의 현지 농도 제한 됩니다. 또한, 조직의 노출 수 면역 반응을 유도 하 고 있다. 여기, 우리는 간단 하 고 효과적인 vivo에서 웨스트가 무결성 분석 결과 고환의 interstitium에 눌린 FITC의 작은 약 수의 직접 분사를 사용 현재. 형광 라벨 메서드를 사용 하 여 얼룩 과정이 편리 하 고, 2 차 항 체는 필요 하지 않습니다 으로입니다. 여기, 형광 성 염료는 고환 입력의 과정은 시각.

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Protocol

모든 수행된 동물 실험 난징 의학 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. 남성 C57BL/6 마우스 제어 photoperiod 조건 하에서 유지 했다 그리고 음식과 물을 함께 제공 했다.

1입니다. 준비

  1. Microinjection 모 세관
    1. 외경, 내부 직경와 1.0 m m, 0.8 m m와 10.0 c m, 길이 microinjection 모세를 각각 사용 합니다.
    2. 모 세관 끌어당기는 사람 (그림 1A)와 유리 모 세관을 당겨. 테스트 하 고 사용 되는 모 세관 끌어당기는 기계에 따라 설정을 조정 합니다.
    3. 사용 하는 끝에 50 µ m 직경의 모 세관을 가져오는 집게와 피 펫 팁을 휴식.
      참고: 도움말은 고환에 침투 하는 너무 오래 있을 수 있습니다.
    4. Micropipette beveler (그림 1C)을 사용 하 여 30 ° 각도에서 팁을 선명 하 게.
  2. 시 약
    1. 1 %pentobarbital 나트륨 준비: pentobarbital 나트륨 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (단계 2.3.3) 10 mL에 100mg을 디졸브.
    2. 10 mg/mL 눌린 FITC 준비: 눌린 FITC PBS (단계 2.1.6)의 100 μ 1 mg을 디졸브.
    3. 4 %paraformaldehyde 준비: paraformaldehyde (PFA) 4g PBS (단계 2.3.3) 100 mL에 녹.
    4. 30% 자당 준비: 자당 10 ml PBS (2.3.4 단계)의 3 세대 분해.
    5. 0.1% 카드뮴 염화 물 준비: 카드뮴 염화 PBS (2.1.1 단계) 10 mL에 10 mg을 디졸브.

2입니다. 방법

  1. 마 취와 presurgery 준비
    1. 그리고 8 주 된 C57BL/6 남성 마우스 무게 CdCl2의 필요한 복용량을 계산. 쥐의 그룹 치료 (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg 들어, i.p.) 수술 전에 3 d. 8 주 된 C57BL/6 남성 생쥐의 또 다른 그룹 치료 (n = 3) 컨트롤로 PBS를 가진.
    2. 멸 균 주사기와 바늘가 위, 집게를 사용 하 여 무 균 조건 하에서 수술을 수행 합니다.
    3. 갓 마 취 작업 솔루션을 준비 합니다. 마 취의 필요한 복용량은 체중의 pentobarbital 나트륨/kg의 70 mg 이다. 평균적으로, 나이의 8 주에는 성인 C57BL/6 마우스 무게 175 μ 1 %pentobarbital 나트륨 (마우스 당 1.75 m g)에 해당 하는 25 g.
      참고: pentobarbital 나트륨 살 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 녹입니다. 솔루션으로 필터링 되는 0.22 um 사용 되기 전에 필터 단위.
    4. 75% 에탄올과 수술에 대 한 영역을 청소 하 고 깨끗 한 조직 수건으로 그 지역을 커버.
    5. 서 모스 탯 히터를 켜고, 37 ° c 온도 조정
    6. 수술 당일에 눌린 FITC 작업 솔루션 (10 mg/mL)를 준비 합니다.
  2. 외과 절차
    1. 8 주 된 C57BL/6 남성 마우스 무게 하 고 마 취의 필요한 복용량을 계산.
    2. Pentobarbital 나트륨 1 mL의 멸 균 주사기를 사용 하 여의 복 주사를 수행 합니다. 깨끗 한 새 장에 마우스를 유지.
    3. 눈 반사 반응과 완벽 한 마 취 다는 것을 확인 하는 마우스의 호흡 패턴을 관찰 합니다.
      참고: 일반적으로 10-15 분 필요까지 마우스는 깊이 취, 느리고, 꾸준한 호흡의 유지 보수와 발가락 핀치 응답의 총 부족 합니다.
    4. 작업 영역에 마우스를 이동 하 고 마 취 (그림 2A) 동안 건조를 방지 하는 촉촉한 티슈로 그 눈 영역을 커버.
    5. 그것의 복 부 머리는 면도기로 면도 하 고 수술 지역 75% 에탄올으로 소독.
    6. 날카로운가 위, 복 벽을 노출 preputial 동맥 위에 1 cm 피부 절 개를 확인 합니다. 작은 집게로 복 벽을 들어올리고 노출 복 막 구멍 (그림 2B)에 0.5 c m 절 개를 하 게 합니다.
    7. 집게를 사용 하 여 지방 패드 epididymis 고환 주위에 대 한 검색. 밖으로 명확 하 게 연결 된 고환 노출 지방 패드를 조심 스럽게 빼냅니다 (그림 2C2D). 일반적으로, 한 번에 하나의 고환에서 작동 합니다.
      참고: 지방 패드와 고환 손으로 만지지 마십시오.
    8. 뚱뚱한 패드와 고환 (그림 2C) 밑에 종이 (지름에서 9 c m)를 배치 합니다.
    9. Microinjection 피 펫에 눌린 FITC를 주입 하 고 micromanipulator 단위 (그림 1D)에 연결 합니다. 부드럽게 tunica albuginea 아래 microinjection 피 펫을 삽입 하 고 (그림 2E2F) 고환의 interstitium에 눌린 FITC의 20 μ의 총을 로드.
      참고: 신중 하 게 그것을 이동 하지 않으려면 microinjection 피펫으로 우울.
    10. (그림 2G) 고환에 눌린 FITC의 움직임을 모니터링 합니다.
    11. 바로 넣어는 고환 다시 복 부 캐비티에 주입의 완료 후에.
    12. Contralateral 고환에서 절차를 반복 합니다. 이 고환은 PBS의 20 μ와 제어로 주입 됩니다.
    13. 피부 외과 봉합 사를 닫고 서 모스 탯 히터 (그림 1B)의 열 패드를 마우스를 이동 합니다. 피하 주사를 통해 몸 무게 1 킬로그램 당 진통제 (buprenorphine)의 1 밀리 그램의 복용량을 관리 합니다.
  3. 수확 하는 고환과 냉동된 섹션 준비
    1. 주입 후 40 분 동물 관리에 따르면 자 궁 경부 전위에 의해 받는 사람 마우스를 안락사 하 고 지침을 사용 합니다.
    2. 날카로운가 위를 사용 하 여 testes를 수집. 모든 혈액 오염 제거를 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 testes를 놓습니다.
    3. 4 12-24 h. 삭제 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 testes 수정 %PFA 및 세척 조직 3 실 온에서 1 %PBS 1.5 mL x.
    4. 하룻밤 30% 자당에서 조직 탈수. 포함 하는 프레임에는 고환을 넣고 커버 최적의 절삭 온도 복합 조직 (10 월). OCT, 냉동 후 채울 포함 프레임 10 월 전체 고환 10 월 커버 될 수 있다 그래야.
    5. -20 ° C에서 cryostat에 testes의 5 μ m 두께, 냉동 횡단면을 잘라내어 현미경 슬라이드를 준수 하자.
      참고: 드라이 아이스에서 포함 된 조직 거 절단 강성을 증가할 수 있습니다.
  4. 이미지 요청
    1. 슬라이드는 습도 상자에 놓습니다. 10 분 동안 실내 온도에 슬라이드 따뜻한.
    2. 섹션 3을 씻어 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 실 온에서 x.
    3. 어둠 속에서 5 분 건조. 먼지가 종이 어떤 잔여 TBS를 닦아내십시오.
    4. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 크로스 섹션 커버. 거꾸로 coverslip 현미경 슬라이드에 배치 합니다.
    5. Confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 20 배 확대의 총은 일반적으로 밝은 형광 신호를 탐지 하는 데 충분 합니다.

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Representative Results

도 서 구매 무결성 분석 결과 수행 하기 위한 실험 설정 그림 1에 표시 됩니다. 고 각각 모 세관 끌어당기는 사람와 micropipette beveler microinjection 모 세관을 선명 하 게 (그림 1A1c). 서 모스 탯 히터 및 microinjection에 대 한 장비는 그림 1B1 D에 나와 하 고 있습니다.

그림 2 눌린 FITC의 주입에 대 한 주요 단계 중 일부를 표시합니다. 가 위를 사용 하 여 마우스 완전 마 취 (그림 2A2B) 받은 후 작은 절 개를. 마우스 고환 노출 이며 microinjection 피 펫 (그림 2C - 2 G)을 사용 하 여 형광 염료를 주입.

그림 3 비보에 분석 결과에 따라도 서 구매 무결성을 평가 하는 연구의 전형적인 이미지를 표시 합니다. 쥐 CdCl2-3 일 동안 CdCl2 (5 mg/kg 들어, i.p.)의 급성 복용량 주입 치료 그룹. 눌린 FITC 기저 구획에서의 확산에 CdCl2에서에서 seminiferous 상피의 꼭대기 부분으로 제어 그룹, 웨스트가 건설 손상 동안에 눌린 (그린 형광) 구절도 서 구매 구조에 의해 차단 -치료 그룹. 화이트 선 세그먼트는 눌린 지하실 멤브레인 (그림 3A)에서 여행 하는 거리를 나타냅니다. 웨스트가 손상의 범위는 거리에 의해 결정 됩니다. 타원형 루멘에 대 한 반지름 이며 짧은의 평균 기저 구획에서 가장 긴 거리는 관의 센터에. 이러한 비율 웨스트가 손상의 정도 대 한 인덱스로 사용합니다.
Equation
여기, D눌린 눌린 기저 구획에서 여행 하는 거리 이며 D반지름 은 동일한 seminiferous 관 (그림 3B)의 반지름입니다. 에 그대로 웨스트가 Rictorfl / + 마우스 입력 꼭대기 구획 장벽을 가로질러 눌린의 확산을 차단. 반면, Rictorcko 쥐 눌린 확산 (그림 3C) 허용 손상된 웨스트가 있다.

Figure 1
그림 1: 마우스 고환 중간 microinjection 장비. (A) 풀 유리 수직 모 세관 끌어당기는 사람와 모 세관. (B)이이 패널 히터 서 모스 탯을 보여줍니다. (C) 팁 micropipette beveler를 사용 하 여 날카롭게 된다. (D) microinjection에 대 한 단위에는 microinjection 펌프 및 스테레오 현미경 포함 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 대표 이미지는 vivo에서 고환의 간 질 성 microinjection 절차의 마우스에. (A)이이 패널은 면도기에 의해 복 부 머리의 제거를 보여줍니다. (B)이이 패널에는 0.5 cm 복 벽 절 개를 노출 복 막 구멍을 보여 줍니다. (C) 풀 지방 밖으로 명확 하 게 연결 된 고환 노출 패드. (D)이이 패널 epididymis 고 고환의 위치를 보여준다. (E)이이 패널 microinjection 피 펫의 위치를 보여준다. (F) 삽입 하는 고환의 interstitium에 microinjection 피 펫. (G)이이 패널에는 고환은 고환의는 interstitium에 성공적인 주입으로 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 웨스트가 무결성을 평가 하는 연구는 vivo에서 기능 분석 결과에 따라. 성인 남성 쥐 (n = 처리 그룹과 통제 그룹에 3) CdCl2 (5 mg/kg 들어, i.p.) 3 일 (대우 그룹)에 대 한 치료 또는 PBS로 3 일 (제어 그룹)에 대 한 치료. 눌린 FITC (그린 형광)는 눌린 FITC CdCl2 처리 그룹에서도 서 구매를 통해 통행을 시작 하는 동안 컨트롤 그룹에서 seminiferous 관의 기지 근처에 위치 해 있습니다. (A)이이 패널에 흰색 선 세그먼트 거리 눌린 FITC 침공 나타냅니다. 스케일 바 20 μ m입니다. 도 서 구매 무결성 분석 실험에서 (B) 데이터에에서 표시 됩니다이 히스토그램 눌린 (D눌린) 여 주행 거리를 표시 하는 동일한 관 D (Radius) 반지름. 80 tubules 무작위로 선택 됩니다. P < 0.001 (학생의 t-테스트). (C)는 웨스트가 무결성 Rictorcko 쥐의 고환에 손상 됩니다. Rictorcko 마우스 tubules는 눌린 관 루멘을 도달 seminiferous 상피 깊숙한 침투. 눈금 막대는 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Spermatogenesis seminiferous 상피에서 고은 체세포와 생식 세포에 의해 경 세 되 매우 정렬 된 동적 과정 이다 (예를 들어, Sertoli 세포)13. Sertoli 세포 구성, 웨스트가 구조가 나눕니다 seminiferous 상피는 기저와 꼭대기 구획. Meiotic 및 단일 세균 세포의 개발은 면역 장벽14을 형성 하는 꼭대기에 발생 합니다.

유독 하거나 세포 접합, 남성 불 임에 이르는의 형성에 관여 하는 유전자 결함 때문도 서 구매 기능을 손상 수 있습니다. 웨스트가 무결성을 검사 하기 위하여는 시험관에 는 밀접 하 게 형성 기능 상피의 수 있는 Sertoli 세포 문화 시스템 설립 되었습니다15 vivo에서도 서 구매를 싫어 하지. 이 체 외에 시스템 구조 Sertoli 세포 접합의 기능을 공부 하 고 간단한 모델을 제공 합니다. 그러나, Sertoli 세포 고환에서 격리 되며 경작에 생체 외에서 동물 나이 및 셀 밀도15,16에 관하여 제한. 또한, Sertoli 세포의 순도 흉내 낸 웨스트가 기능 해야 하는 ultrastructures의 존재17을 모니터링 합니다. 더 중요 한, 웨스트가 구조와 무결성 필요 생식 세포와 Sertoli 세포, 세균 세포 특정 웨스트가 결함10,,1819null 돌연변이 생쥐의 연구에서 분명 간의 상호 작용 합니다. 따라서,도 서 구매의 모든 중요 한 비보에 기능 업과의 목적 유지 도전11,20에 체 외 세포 Sertoli 세균 세포의 공동 문화 만들기.

이 프로토콜 눌린-FITC, 첸 그 외 여러분 에 의해 프로시저에서 수정 된을 주입 하 여도 서 구매 무결성에서 vivo에서 평가 하는 방법을 설명 합니다. 21. 남성 쥐, 복 막 구멍의 노출, 고환, testes를 수확 하 고 냉동된 섹션, 그리고 이미지의 수집으로 그들을 절단의 interstitium에 염료의 microinjection의 마 취는 프로토콜에 설명 합니다. 성공적인 완료에 대 한 몇 가지 단계를 지적 한다. 첫째, 심각 하 게 깊은 마 취 사망을 일으킬 수 있기 때문에 마 취의 적절 한 복용량을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 주사 모 세관의 끝의 길이 해서는 안됩니다 너무 오래; 그렇지 않으면, 피펫으로 고환에 침투 수 없습니다.

여기에 제시 된 절차는 바이러스, 화학 유독, 또는 서 구매의 규칙에 관련 된 후보 단백질의 역할을 분석 하는 데 활용할 수 있습니다. 이 분석 결과, 신뢰성, 민감한 이며 웨스트가 무결성 비보를 모니터에 액세스할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 작품은 고유 영 학자 (BK20150047), 자연 과학에 대 한 국가 키 R & D 프로그램의 중국 (2016YFA0500902), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31471228, 31771653), 강 소 과학 재단에 의해 지원 되었다 장쑤 성 (BK20140897, 14KJA180005)와 K.Z.에 소성의 혁신적이 고 기업 프로그램의 기초

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

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References

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