Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Green, T. R., Ortiz, J. B., Harrison, J. L., Lifshitz, J., Rowe, R. K. Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains. J. Vis. Exp. (139), e58513, doi:10.3791/58513 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Histología e inmunohistoquímica son métodos de rutina de análisis para visualizar la anatomía microscópica y localizar proteínas en tejido biológico. En neurociencia, así como una plétora de otros campos científicos, se utilizan estas técnicas. Inmunohistoquímica puede hacerse en tejido deslizante montado o secciones flotan libremente. Preparación de muestras de diapositivas es un proceso intensivo de tiempo. El siguiente protocolo para una técnica, llamada el Megabrain, reduce el tiempo necesario para montaje y criosección tejido cerebral hasta un 90% mediante la combinación de varios cerebros en un solo bloque congelado. Además, esta técnica reduce la variabilidad entre rondas, en un gran estudio histoquímico de la coloración. La técnica actual se ha optimizado para el uso de tejido cerebral de roedor en el análisis de immunohistochemical aguas abajo; sin embargo, puede aplicarse a distintos campos científicos que utilizan cryosectioning.

Introduction

Aquí, presentamos el protocolo para un nuevo método, que llamamos Megabrain, convertido a criosección roedor múltiples cerebros al mismo tiempo para los procedimientos de inmunohistoquímica aguas abajo. Un Megabrain permite la producción de diapositivas individuales que contienen tejido de múltiples animales. Esta técnica ha sido optimizada para cortar secciones coronales de hemisferios de rata adulta 9 o 5 cerebros completos adulto, al mismo tiempo. Por lo tanto, la técnica es más aplicable en los estudios de immunohistochemical grandes o en otros análisis realizados en tejido de cerebro montada diapositiva de una cohorte grande de animales.

Immunohistochemistry implica el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas de interés para entender y caracterizar su expresión y cambios celulares en el tejido específico1,2,3. El uso de la inmunohistoquímica es frecuente en la investigación de la neurociencia, entre otras disciplinas científicas, ayudando en la comprensión celular y molecular del cerebro4. Estudios a gran escala con muchos animales y secciones del cerebro pueden ser intensivo de tiempo y recursos. Como tal, existe una razón multifacético detrás del desarrollo de lo Megabrain: reducir el tiempo dedicado cryosectioning, montaje y tinción de tejidos, mientras que, en consecuencia, menos reactivos. Además, la capacidad de agilizar el proceso y varios cerebros en el mismo la mancha redonda ayuda a aliviar parte de la variabilidad entre lotes, una limitación de inmunohistoquímica3la coloración. Además, seccionar un Megabrain es una alternativa de ahorro de tiempo al seccionamiento cerebros de roedores congelados individuales y permite la comparación rápida de tejido entre animales o incluso grupos de tratamiento por técnicas de microscopía.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se ha optimizado la técnica Megabrain con todo y hemiseccionada cerebros de varones adultos de ratones C57Bl65, ratas Sprague-Dawley juvenil y ratas Sprague-Dawley adultas que fueron perfundido con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) seguido de transcardially de paraformaldehído al 4%6. Resultados similares se pueden lograr en otras cepas de ratón y rata, en ambos sexos y diferentes edades. El estudio para generar datos para este manuscrito utilizado ratas Sprague-Dawley juvenil y fue aprobado por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Arizona, y animales de experimentación fueron atendidos según la guía para el cuidado y uso de laboratorio Los animales7.

1. crioprotección de cerebros perfundidos

  1. Siguiente éxito transcardial perfusión6, recoger el cerebro completo6,8 de los animales y después arreglar colocando en un frasco de 25 mL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 24 h.
    PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es un fijador de tejido tóxico; Manéjela con cuidado. Transferencia de paraformaldehido en un contenedor de residuos específicamente etiquetado que identifica su concentración y el volumen dentro de una campana de humos químicos y luego almacenar en el gabinete hasta eliminados por seguridad química o bien de residuos químicos con personal capacitado.
  2. Transcurrido 24 h, en una campana de humos, quitar cerebros de paraformaldehído al 4% con una espátula. Transferir el cerebro en un frasco de aproximadamente 20 mL de solución de sacarosa al 15% en solución salina tamponada con Tris de 1 x (TBS), hasta que cerebro se hunde hasta el fondo de la cubeta (aproximadamente 24 h).
  3. A continuación, transferir el cerebro a un frasco de aproximadamente 20 mL de solución de sacarosa al 30% en 1 x TBS, hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo de la cubeta (aproximadamente 24-48 h).

2. cerebro congelación

  1. Coloque un vaso de precipitados de vidrio de 500 mL en una cama de hielo seco en un cubo de hielo. Verter 300-400 mL de isopentano (2 metil-butano) en el vaso de vidrio.
  2. Permitir que la temperatura de isopentano para llegar a entre-45 ° C y -50 ° C. Vigilar de cerca y mantener este rango de temperatura con un termómetro, manteniéndola constante durante todo el procedimiento. Asegúrese de que las lecturas de temperatura se toman desde el centro de la solución y no tocar la parte inferior o lateral del vaso.
  3. En el Banco, llenar una desechable incrustar molde (véase la lista de materiales) aproximadamente 1/2 lleno de temperatura óptima de corte (OCT; véase Tabla de materiales) compuesto. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire en los PTU. Si hay burbujas de aire Retire con una espátula o con aguja.
  4. Retire el primer cerebro del frasco de sacarosa al 30% con una espátula. En este punto, o bien congelar cerebros total o hemisect, dependiendo del diseño del estudio.
    1. Para hemiseccionada cerebros, utilice una cuchilla nueva para hacer un corte limpio a través del tejido para separar los hemisferios. Si no es necesario para el estudio, quite el cerebelo y bulbos olfativos en esta etapa. Si el cerebelo es necesaria para el estudio, se sugiere cortar un área plana en la parte posterior del cerebro para ayudar al cerebro en pie directamente en el molde. Si el estudio requiere sólo de una región localizada del tejido, puede utilizarse una matriz de cerebro de roedor para bloquear el cerebro basado en coordenadas conocidas.
  5. Dar cerebros un numérico sistema. Dibujar un diagrama como se muestra en la figura 1. Escriba el número del primer cerebro para colocar en el molde de Megabrain en la posición 2, dejando la posición 1 como un espacio en blanco para facilitar la rápida identificación de la orientación en la que los cerebros fueron congelados.
  6. Usando fórceps romos o pinzas, recoger el cerebro para colocarse en la posición 1. Oriente el cerebro con la parte a cortar primero hacia arriba. Baje el cerebro en el OCT en la ubicación adecuada, utilizando las pinzas para ajustar su posición hasta que se encuentra de forma independiente.
  7. Repita los pasos 2.3 – 2.5 para los cerebros/hemisferios quedan congelados en las posiciones 3 – 10. Evite colocar cerebros/hemisferios en un diseño simétrico.
  8. Revisar todos los 9 cerebros en el molde de Megabrain. Una vez que los cerebros están de pie, vertical y correctamente orientado en el OCT (como se muestra en la figura 2B), añadir más OCT al molde (hasta que se cubran la parte superior de los cerebros). Una vez más, asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire visible en los PTU.
  9. Use las pinzas para sostener la esquina del molde, asegurando que el fórceps no se sumerja parcialmente en el OCT (Figura 3A). Teniendo cuidado de mantener el nivel de molde, coloque el molde en isopentano (-45 ° C a-50 ° C) para que la parte inferior tercera del molde se sumerge. Mantenerla aquí para permitir que las burbujas de los PTU a la superficie y lejos de los tejidos (figura 3B).
  10. Después de 30 s, menor el molde entero en el isopentano y el lanzamiento de las pinzas, dejando el Megabrain sumergido durante al menos 3 minutos (figura 3). Asegurar ese molde se mantiene a nivel, para cerebros permanecen verticales y equidistantes (figura 3D).
  11. Después de 3 minutos, uso las pinzas para quitar el molde que contiene el congelado, OCT había incrustado cerebros (figura 3E) del isopentano.
  12. Inmediatamente, envuelva el molde y su contenido en papel de aluminio y etiqueta con el número de animales o identificación de Megabrain. Toque el Megabrain congelado como con moderación posible para evitar descongelar el tejido.
  13. Este Megabrain se puede transferir a un congelador de-20 ° C y almacenado por un mínimo de 24 h.
    Nota: Protocolo puede hacer una pausa aquí y el Megabrain puede almacenarse congelados hasta que cryosectioning.

3. preparar el Megabrain para secciones en criostato

  1. Ajustar la temperatura de criostato a-19 ° C. Asegúrese de que se alcanza esta temperatura antes de continuar. A lo largo de secciones, asegurar que la temperatura se mantiene entre-18 ° C y -20 ° C.
  2. Tomar el Megabrain del congelador de-20 ° C y colocar en el criostato. También, colocar un plato de las dimensiones de tamaño adecuado y dos pinceles de punta finas en el criostato. Deje el Megabrain y el mandril en el criostato para por lo menos 15 minutos llegar a la temperatura del criostato.
  3. Adecuadamente diapositivas de etiqueta con el número de identificación de Megabrain y el número de diapositiva. Coloque estas diapositivas sobre una diapositiva más caliente (35-45 ° C).
  4. Desenvuelva el Megabrain del papel de aluminio. Utilice una cuchilla para cortar verticalmente las esquinas del molde para permitir la fácil remoción del bloque de OCT del molde (Figura 4A).
  5. Distribuir una capa delgada (aproximadamente 3 mm de espesor) de OCT en el portabrocas.
  6. Rápidamente, con mínimo contacto entre los dedos y el OCT, coloque el Megabrain en la tirada, en la orientación deseada. Pinzas grandes pueden utilizarse también para este paso para minimizar la descongelación. Antes de empezar sección, dejar el Megabrain montado tirada en el criostato para 15 – 20 minutos permitir que la OCT se congele completamente.
  7. Una vez que se ha congelado la capa base de PTU, aplique una capa gruesa de 2 mm OCT alrededor de los lados de lo Megabrain y que corra por los lados en el portabrocas. Esto ayuda a asegurar el Megabrain para el mandril. Otra vez, antes de continuar, deje el mandril Megabrain montado en el criostato para 15 – 20 minutos permitir que la OCT se congele.
  8. Utilice una cuchilla de afeitar para quitar cualquier exceso OCT desde los lados o la parte inferior de la tirada (Figura 4B).

4. Cryosectioning el Megabrain

  1. Antes de comenzar, asegúrese de que un vaso de precipitados que contiene al menos 20 mL 1 x PBS es accesible.
  2. Coloque el portabrocas, montado con el Megabrain, en la cabeza del mandril en el criostato (Figura 4B).
  3. Establecer el criostato para cortar en el espesor deseado. La metodología actual se ha optimizado para 10 μm a 50 μm secciones.
  4. Recortar el OCT y el tejido como sea necesario para llegar a la región del cerebro deseada para la recogida de tejido (figura 4).
  5. Cuando esté listo para recoger el tejido, baje la placa estabilizadora hasta que quede en el escenario y girar el mango de criostato para tomar una sola sección. Lentamente Levante la placa estabilizadora, teniendo cuidado que el Megabrain seccionado no está conectada a la placa estabilizadora y no se caiga la etapa figura 4).
  6. Suavemente utiliza los pinceles para desenrollar la sección Megabrain hasta que está mintiendo en la etapa de criostato (figura 5A). (Si es necesario, mantenga el OCT plana usando los pinceles para evitar balanceo).
  7. Quitar la corredera de diapositiva más caliente y pase la diapositiva, la cara de etiqueta hacia abajo, sobre la sección de Megabrain en la etapa que permite la sección se adhiera al portaobjetos.
  8. Aplique una gota de 1 x PBS a cada sección de tejido en la diapositiva rápidamente y no permita que estos se sequen hasta que han cepillado planos (ver paso 4.9).
  9. Utilizar un pincel de punta fino en PBS 1 x a Cepille cualquier burbuja en el tejido y desdoblar el tejido por lo que está mintiendo completamente en la diapositiva (figura 5B). Tenga cuidado de no cambiar la posición de las secciones de la cerebral y perder así la posición relativa de las otras secciones de tejido. Manipular el tejido con cuidado para evitar desgarros. Mantener las secciones de la cerebral fuera de los bordes de la diapositiva, como espacio periférico se requiere para una aplicación de lápiz PAP en algunos protocolos de tinción y cubreobjetos.
  10. Colocar el portaobjetos sobre la diapositiva más cálido y seco durante 45 minutos cubierta según sea necesario para evitar que el polvo de colocar en el tejido. Una vez secas, guardar las diapositivas en a-80 ° C hasta su uso posterior.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Un resultado positivo para este procedimiento es tejido que se encuentra en la diapositiva, sin burbujas ni lágrimas, en la orientación en que fueron congelados. Las secciones de tejido son uniformemente aparte y fácilmente identificable debido a la buena colocación del cerebro en el OCT y la notación buena como se demuestra en la figura 1. Asumiendo que el tejido cerebral fue recogido de animales de una edad similar, y que el tejido fue alineado en los PTU, secciones recogidas en una diapositiva deben representar un plano coronal similar, permitiendo la comparación de las regiones del cerebro entre los animales. Siempre que el tejido ha congelado, congelación mínimo artefacto, tinción H & E puede llevarse a cabo para evaluar la calidad de crioprotección9. Inmunohistoquímica puede llevarse a cabo como se demuestra con la tinción se muestra en la figura 6.

Figure 1
Figura 1: esquema representativo de un diseño sugerido de Megabrain. Esto demuestra la notación de posición de los tejidos procedentes de animales diferentes 9. El sistema está diseñado como lo demuestra; sin embargo, puede utilizarse cualquier sistema de numeración. 'X' representa el espacio en blanco diseñado para mostrar claramente la orientación en que se congeló el tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: incorrecta y correctamente posicionados cerebros en molde. (A) hemisferios mal alineados en OCT de la parte superior y lateral del cerebro. (B) hemisferios del cerebro bien alineados en OCT de la parte superior y lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: etapas de cerebro congelación. Megabrain (A) antes de ser sumergida en isopentano de-45 ° C. Megabrain (B) cuando se sumergió en isopentano. Megabrain (C) completamente sumergida en isopentano. (D) Megabrain en isopentano, demostrando que el cerebro debe permanecer vertical y equidistante uno del otro durante este proceso. (E) Megabrain A congelar en un molde de incrustación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: principales etapas en el corte un Megabrain. Megabrain (A) de incrustar el moho en criostato. (B) Chuck montado con Megabrain. (C) ajustado Megabrain. Sección de Megabrain (D) en la etapa de criostato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: sección de pre- y poste-montada Megabrain. Megabrain congelado (A) sección (40 μm) en la etapa de criostato. (B) portaobjetos de vidrio montaron con tejido de Megabrain. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: inmunohistoquímica de una diapositiva de Megabrain teñidas con Iba1. (A) tejido tomado de una muestra de Megbrain uniforme coloración entre distintos cerebros en un estudio. (B) 20 x microscopio imágenes de la región de Corteza somatosensorial barril del campo (S1BF) de cada cerebro montado, mostrando constante ionizado molécula del adaptador de enlace de calcio 1 (Iba1) tinción de microglia entre cerebros. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Durante este procedimiento, debe considerar que la temperatura de lo Megabrain y sus alrededores debe ser constantemente monitoreada para evitar descongelar y volver a congelar el tejido. El cerebro puede sólo retirarse del congelador de-20 ° C hasta a 3 veces cada vez que se toca y de izquierda en el criostato, con una temperatura fluctuante más cálida, el tejido se descongela y refreezes, causando una jalea como textura y tejido anormal integridad10. Por lo tanto, es óptimo para cortar el Megabrain todos a la vez.

Crioprotección y fijación del tejido son piezas claves de este protocolo para minimizar la formación de cristales de hielo, reducir el crecimiento microbiano externo y detener reacciones enzimáticas, así preservando la integridad de tejido10. Si el cerebro no es cryoprotected con sacarosa, agua dentro del tejido puede formar cristales de hielo durante el proceso de congelación, que destruya el tejido y provocar agujeros a la forma. Mientras que sugerimos diluciones seriadas de la sucrosa en TBS, cerebros pueden colocarse directamente en sacarosa al 30% durante un período prolongado (48-72 horas) lograr similar crioprotección. Sin embargo, se recomienda que las soluciones de sacarosa se hacen con TBS. variaciones como el uso de PBS o agua se traducirá en pobre crioprotección de los Megabrain y calidad pobre del tejido. Tinción de hematoxilina y eosina (H & E) puede utilizarse para evaluar la calidad de la crioprotección y consecuente congelación artefacto11. Calidad de buen tejido (con agujeros mínimos) es esencial en los estudios histológicos, ya que los orificios pueden perturbar la Unión de anticuerpos así como la reducción de la integridad del tejido de las células con procesos finos, que pueden afectar el análisis de algunas manchas. Evitar la colocación simétrica de cerebros, porque esto puede causar confusión cuando se trata de identificar el animal del que se obtuvo cada cerebro.

La técnica actual se ha optimizado para las secciones coronales; sin embargo, fácilmente puede ser adaptado para cortar secciones sagitales y transversales. Estas modificaciones de corte requerirá la correspondiente variación de la colocación de cerebro en pasos de 2.5 a 2.7. Cabe señalar que estas adaptaciones pueden reducir el número de cerebros que pueden caber en un molde de incrustación.

Una modificación clave de esta técnica es el espacio en blanco en el número de posición 1 (como se muestra en la figura 1). Este espacio está diseñado para permitir la fácil identificación de la orientación de Megabrain y por lo tanto, identificar el animal asociado a cada cerebro.

Esta técnica se ha modificado para permitir que el tejido de un mayor número de animales a ser congelado y cortar simultáneamente en el Megabrain. El tamaño del cerebro de roedor depende de sexo, edad y especie puede variar el número de cerebros que encajan en el molde. No se aconseja para segregar diferentes edades, sexos o grupos de tratamiento en Megabrains separado. Aunque esto puede asegurar la uniformidad de tamaño, puede también aumentar la parcialidad y subjetividad durante proyección de imagen y análisis. Además, es inevitable variación entre diapositivas en immunohistochemistry en cualquier protocolo, que podría conducir a inconsistencia de tinción entre los grupos de edad/sexo.

Se utilizó un plato rectangular, más grande, en lugar de una circular, que proporciona mayor apoyo detrás del Megabrain.

Como el molde y su contenido era de un volumen más grande que el de un cerebro singular en un molde de OCT, más tiempo se debe congelar el cerebro en el isopentano. A través de ensayo y error, se determinó un periodo de tiempo que congelación de buena calidad (3,5 minutos). El Megabrain puede dejarse en el isopentano por más tiempo; sin embargo, la temperatura debe mantenerse en el rango de-45 ° C a-50 ° C para evitar agrietarse los PTU.

Como hay muchos pedazos separados de tejido en la diapositiva de Megabrain, es posible que tejido puede secarse y por lo tanto ser más frágil durante el cepillado. Para combatir este problema, se debe poner una gota de PBS en cada sección del cerebro individual para mantenerlo húmedo hasta que es pulido hacia fuera.

La técnica de hemisecting el cerebro, un estudio en el que es necesario, es fundamental para obtener buenos resultados. Cuando hemisecting el cerebro, es importante que esta bisección se hace precisamente para asegurar que todas las regiones del cerebro están intactas con el hemisferio correcto. Si el cerebelo o bulbos olfativos no son relevantes para el estudio, pueden ser quitados. Eliminar este 'exceso' de tejido reduce la cantidad de tejido que va a necesitar recortarse cuando cryosectioning. Eliminar el cerebelo permite el cerebro resistir más fácilmente en los PTU antes de congelarlos.

Mientras que ser cepillados hacia fuera, mantenga las secciones de tejido del borde de la diapositiva. Esto permite que una línea de pluma del PAP, una barrera hidrofóbica, que rodean el tejido, que es un requerimiento de algunos protocolos de inmunohistoquímica. Además, se necesita espacio para cubreobjetos.

Si el hemisferio cerebral cae o se inclina durante el Megabrain de congelación, las secciones no será Co cepillo. Un resultado similar puede resultar si un cerebro es más grande que los demás en una sola Megabrain. Para superar esto, se pueden seleccionar más diapositivas a la mancha donde el brain(s) en cuestión está en el área apropiada de interés.

Una limitación de esta técnica es que como todo el tejido congelado en un bloque de OCT; Si hay error técnico, tales como una mala congelación a una temperatura incorrecta, entonces será el tejido de múltiples animales afectados (5-9 cerebros animales en vez de sólo 1). Esto es más de un problema al usar el cerebro completo y no hemiseccionada secciones, porque el hemisferio restante puede ser congelado y seccionado por separado para obtener las secciones deseadas.

Otra limitación de este método es que al ajustar el criostato para cortar el Megabrain, debe adoptar un enfoque más adecuado. Esto es debido a todos los cerebros están en ángulos ligeramente distintos entre sí, considerando que este no es un tema al seccionar un cerebro singularmente congelado. Los efectos de esta pueden ser minimizados durante la congelación asegurándose de que los cerebros son vertical y de un tamaño similar.

Uno de los mayores beneficios de esta técnica sobre congelación de cerebro singularmente es que acorta el tiempo total empleado en congelación y cerebros de corte hasta un 90%, si 9 se cortan al mismo ritmo como 1 cerebro. La otra ventaja clave de esta técnica es que permite a un menor número de diapositivas que contienen tejido de los animales requeridos para teñirse. Esto aumenta la confiabilidad y uniformidad de la coloración de immunohistochemical, puesto que todas las diapositivas se tiñen en la misma ronda. Puede haber incompatibilidad entre diapositivas manchadas al mismo tiempo, pero un Megabrain puede permitir varios cerebros de estudio ser representado en una sola diapositiva, reduciendo la variabilidad y aumentar la validez del análisis. Tener coloración constante es una ventaja clave en cualquier estudio histológico y una gran importancia de la utilización de esta técnica. Por último, menos diapositivas también incurran en los costos de suministro.

Esta técnica podría ser fácilmente modificada para cortar secciones sagital de un cerebro de roedor. También podría ser adaptado para su uso en cryosectioning el tejido de diferentes modelos animales y diferentes tipos de tejido, como muestras del músculo o del hígado. Adaptaciones al protocolo tendría que hacerse, incluyendo optimización de la cantidad de soluciones utilizado, tamaño de la hoja/de la etapa criostato y el volumen del molde de incrustación.

Esta técnica también podría ser adaptada para técnicas de flotación libres, donde el protocolo seguiría siendo la misma hasta el paso 4.6. En este paso, cerebro tendría que ser separado y levantado en pocillos separados de la placa para teñirse. Cuidado extra tendría que tenerse no confundir las rebanadas de cerebro en el proceso de clasificación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen ninguna revelación.

Acknowledgments

Fondos de apoyo de la misión de PCH apoyó la investigación en este manuscrito. Los autores desean agradecer a Daniel Griffiths por tomar las imágenes utilizadas en las figuras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) Fisher Scientific 14-373-65
Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Fisher Scientific 18-41
Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-128
Fisherbrand 20 mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap Fisher Scientific 03-337-23
Sucrose, poly bottle 2.5 kg Fisher Scientific S2-212 Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up.
2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical Fisher Scientific O3551-4
PYREX Tall-Form Beakers Fisher Scientific 02-546E
Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50 to +50 °C) Fisher Scientific 13-201-642
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q
STANLEY Razor Blade Grainger 4A807
Edge-Rite Microtome blades Fisher Scientific 14-070-60
Microscope slides (1" frost) - white Fisher Scientific 22-034-979
Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2 Fisher Scientific 70-013-032 Dilute to 1X  before use
15 piece fine paint brushes Amazon B079J12ZRV
PAP pen abcam ab2601
Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. Electron Microscopy Sciences EMS065

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56, (3), 201-221 (2008).
  2. Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology? Pathologica. 87, (3), 300-309 (1995).
  3. Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49, (4), 406-410 (2006).
  4. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  5. Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
  6. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  7. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8, (6), e1000412 (2010).
  8. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40, (2), 53-57 (2011).
  9. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).
  10. Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15, (5), 475-483 (2017).
  11. Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20, (1), 5-13 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics