Medição não invasiva contínua das atividades cardíaca e comportamental de lagostins

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Behavior

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Summary

Este artigo apresenta um sistema de biomonitorização não invasivo para a gravação contínua e análises das atividades cardíaca e locomotor de lagostas. Este sistema consiste de um sensor ótico infravermelho próximo, um módulo de controle de vídeo e software para avaliar os batimentos cardíacos de lagostins que reflete sua condição fisiológica e caracteriza o comportamento de lagostins durante as flutuações de batimento cardíaco.

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Kuklina, I., Ložek, F., Císař, P., Pautsina, A., Buřič, M., Kozák, P. Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities. J. Vis. Exp. (144), e58555, doi:10.3791/58555 (2019).

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Abstract

Um crustáceo é um organismo aquático pivotal que serve como um prático modelo biológico para estudos comportamentais e fisiológicos de invertebrados e um útil indicador biológico da qualidade da água. Apesar de lagostins diretamente não é possível especificar as substâncias que causam a deterioração de qualidade de água, pode imediatamente (dentro de alguns segundos) avisam os humanos de deterioração de qualidade de água através de alterações agudas em suas atividades cardíacas e comportamentais.

Neste estudo, apresentamos um método não invasivo que é simples o suficiente para ser implementado em várias condições devido a uma combinação de simplicidade e confiabilidade em um modelo.

Esta abordagem, em que os organismos biológicos são implementados em processos de avaliação ambiental, fornece um alarme confiável e oportuno para a alertar e prevenir deterioração aguda de água em um ambiente. Portanto, este sistema não invasivo baseado em lagostas fisiológicas e gravações etológicas parâmetro foi investigada para a detecção de alterações em um ambiente aquático. Este sistema é agora aplicado em uma cervejaria local para controlar a qualidade da água utilizada para a produção de bebidas, mas pode ser usada em qualquer tratamento de água e sistema de abastecimento para avaliação de qualidade de água contínua, em tempo real e para laboratório regular investigações de fisiologia cardíaca de lagostins e comportamento.

Introduction

Objecto de pedidos dos organismos aquáticos, como organismos modelo para várias investigações de laboratório1,2 e como ferramentas para monitorar a qualidade de água industrial e natural/ambiental3,4 , aparenta ser bem estudado. No entanto, este tópico é ainda de notável interesse para os seres humanos, independentemente se eles pertencem à comunidade científica, ou para outras ocupações. Apesar da existência de um número de métodos avançados para o monitoramento de determinados parâmetros (chamados "biomarcadores")5,6,7,8, os requisitos mais importantes para a seleção de um indicador é composto por três fatores simples: (i) simplicidade, (ii) confiabilidade e disponibilidade (iii) geral.

Lagostas, como um representante essencial da fauna de água doce, distingue-se porque é encontrada em todo o mundo, é generalizada e, na maioria dos casos9, tem uma carapaça suficientemente grande e dura apropriada para manipulação. Este crustáceo pertence ao grupo de invertebrados mais elevados que fornecem suficiente desenvolvimento de sistemas fisiológicos vitais e respectivos órgãos enquanto, ao mesmo tempo, manter uma organização relativamente simples10.

Métodos baseados na avaliação da gama de parâmetros biológicos e/ou comportamentais dos lagostins, conforme descrito na literatura científica, contribuíram significativamente para o desenvolvimento de estudos de biomonitorização e lagostins em geral. A maioria dos métodos invasivos disponíveis atualmente para medições de frequência cardíaca de lagostins é baseada em gravações de eletrocardiograma que exigem um procedimento cirúrgico complexo e precisos11,12,13; tais manipulações podem causar stress significativo para e podem exigir adaptação prolongada por lagostim. Além disso, não é conhecido como long um crustáceo pode transportar tais eletrodos e se isso vai muda com êxito enquanto carregava tal penhora. Os métodos não-invasivos descritos baseiam-se em gravações pletismográfico, que são complicadas pela complexidade de hardware e requerem um circuito de condicionamento para filtragem do sinal14 e uma amplificação ou componentes ópticos precisos e caros15 ,16.

Neste estudo, descrevemos uma abordagem que contribui para resultados existentes e oferece novas alternativas para melhorar os procedimentos de medição de frequência cardíaca de lagostins atual. Entre as vantagens, encontram-se (i) um anexo rápido e não invasivo que não requer uma adaptação fisiológica prolongada; (ii) capacidade dos lagostins para transportar o sensor dentro de um período de alguns meses, muda a muda; (iii) o software capaz de monitorização cardíaca em tempo real e atividades comportamentais e a avaliação dos dados obtidos simultaneamente várias lagostas; (iv) um preço baixo de fabricação e simplicidade. O sistema de biomonitorização que descrevemos permite a não-invasivo e contínuo acompanhamento das atividades cardíaca e locomotor lagostins com base nas alterações nas características etho-fisiológicos dos lagostins. Este sistema pode ser facilmente aplicado em exames de laboratório de fisiologia cardíaca de lagostins e/ou a etologia, juntamente com as implementações industriais para controlar a qualidade da água nas instalações de tratamento e abastecimento de água.

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Protocol

1. lagostins seleção

  1. Para aplicar com sucesso a abordagem atual de lagostins, selecionar os respectivos espécimes adultos com tamanhos suficientes de carapaça (que é um comprimento de carapaça de pelo menos 30 mm) para fixação do sensor, visualmente examiná-lo para a ausência de doenças e verificar se eleva ambos queles quando é tocado. Os parâmetros acima mencionados indicam um estado elegível de lagostins saúde.
    Nota: Se várias lagostas são esperadas para ser usado no julgamento e estão expostas às mesmas condições, o grupo experimental deve ser formado com base em vários parâmetros: (i) semelhante peso e comprimento; (ii) taxa de coração comparável; (iii) pronunciada atividade noturna; (iv) consumo de alimentos regular; (v) inter muda período17. Às vezes, é difícil definir se um crustáceo é perto muda pelas medições de frequência cardíaca ou exames visuais ou tátil Portanto, as análises do teor de proteínas totais do lagostim hemolinfa podem ser útil. Conteúdo de proteína deverá ser maior quando o crustáceo é mais perto do que a muda na Inter muda estado18.

2. gravação de comportamento e atividade cardíaca de lagostins

  1. Fim de canaliza medir as taxas de coração de lagostins, preliminarmente prepare o sensor para este procedimento. Antes disso, colocado um crustáceo no tanque com água e deixe aclimatar lá por alguns dias, já que a preparação dos sensor19 também levará alguns dias.
    1. Axialmente casal um IR diodo emissor de luz (LED) com um fototransistor. Anexar o circuito do sensor óptico em uma placa; será necessária uma fonte de alimentação de 5 V. Para a conexão do LED, coloque um resistor de 200 Ω na placa de sensor de IR; para conectar o fototransistor, coloca um resistor de 220 Ω no tabuleiro.
    2. Quando anexado de lagostim, a saída do sensor é modulada pela quantidade de hemolinfa enchendo o músculo cardíaco de lagostins e espalha uma luz incidente do LED. A fim de evitar interferências recíprocas da luz pelo LED iluminado do IR e a luz do coração de lagostins, que é recebido pelo fototransistor, refletida de IR coloca um pequeno muro (0,5 x 1,5 x 4 mm, espessura x altura x largura) de plástico antiestático preto entre o LED e o fototransistor.
    3. Coloque o LED em um pacote à prova d'água e cubra a superfície do sensor com o gel impermeável dieléctrico do lado adjacente à carapaça para a proteção dos componentes eletrônicos de dano potencial (Figura 1). Deixe o gel secar por 3 dias para ganhar suas melhores propriedades protetoras.
    4. Para um sinal analógico, ligar cabos flexíveis finos (cerca de 3 m de comprimento) para o sensor e ligar para o conversor analógico-digital (ADC); a partir disso, um sinal digitalizado vai ser transferido para um computador pessoal através de uma interface USB, em que ponto as informações sobre o crustáceo atividade cardíaca é salvo, analisados em tempo real com um software especial (ver Tabela de materiais) e armazenado para mais análises detalhadas.
  2. Assim que o sensor está preparado, anexá-lo para o crustáceo. Para isso, ligue o computador e executar o software. Determine o número de lagostas deve ser fixado os sensores e a taxa de coração gravada para ser salvas no arquivo data.
  3. Retire as lagostas da água e limpe o seu lado de carapaça dorsal com uma toalha de papel. Enrole a queles e abdômen de lagostim a toalha de papel para evitar quaisquer danos por mão humana e para eliminar o estresse adicional sobre o crustáceo causado por mãos humanas quentes.
    Nota: Não utilize um resfriamento anterior de lagostim no gelo ou no congelador para sua imobilização antes de manipulações com o acessório de sensor. A diferença de temperaturas leva lagostins dorsal superfície pranto que, por sua vez, leva à fixação do sensor não confiável e rápido desprendimento adesivo da carapaça do lagostim.
  4. Prepare uma superfície (ou seja, pegue um pequeno pedaço de plano de plástico ou rasgar um pedaço de fita adesiva e corrigi-lo para uma tabela) e um pedaço de pau para misturar a cola. É necessário pressionar duas gotas pequenas (de um diâmetro de cerca de 0,5 cm) de tubos A e B contendo cola epoxy cola e rapidamente misturá-los.
  5. Anexar o sensor para a carapaça dorsal de lagostins e tentar encontrar o lugar em que a amplitude do sinal cardíaco seria máxima. Segure os lagostins com o sensor em uma mão e, usando a outra mão livre, coloque uma gota de cola misturada em cada um dos quatro fios auxiliares localizados no sensor (corrigi-los entre as etapas 2.1.1 e 2.1.4.). Não mova o sensor pelo menos 5 min até que a cola endurece (o endurecimento da cola depende da temperatura ambiente e umidade).
    Nota: Ao fixar o sensor para a carapaça de crustáceo, examine cuidadosamente a área cardíaca toda do lado de carapaça para definir a área com a melhor amplitude de sinal cardíaco (máxima). Isso vai ajudar o software a fornecer cálculos mais precisos de frequência cardíaca.
  6. Toque a cola usando uma mão livre e se não é pegajosa, colocar o crustáceo sem invólucro com o sensor anexado (Figura 2) para a caixa sem água por mais alguns minutos até que a cola esteja completamente seca.
    Nota: Uma temperatura ideal para manipulação de lagostins e cola varia de 18 a 22 ° C. A estas temperaturas, a cola endurece dentro de 5 a 7 min e está completamente seca dentro de 8 a 10 min. A temperaturas mais baixas, o stress no crustáceo é menos pronunciado; no entanto, a cola precisa de mais tempo para endurecer, cerca de 15 a 20 min sob 15 ° C e 10 ° C, respectivamente. Em temperaturas mais altas, especialmente acima de 25 ° C, a cola endurece dentro de 3 min, mas o crustáceo sofre estresse muito mais; Portanto, tente minimizar a exposição do crustáceo para condições extremas, sem água.
  7. Antes de voltar a lagosta no tanque, mergulhe seu cefalotórax a água várias vezes com curtos intervalos de alguns segundos para permitir uma descarga do ar acumulado nas brânquias, e deixe a lagosta na água para cerca de 1 h para remover quaisquer produtos químicos em excesso. Após este processo está completo, liberar as lagostas na água e deixe que se aclimate por uma a duas semanas sob condições experimentais, dependendo os índices fisiológicos observados. Troca de água ideal durante os períodos de aclimatação é todos os dias.
    Nota: Características de lagostins que têm aclimatados e estão em um estado saudável incluem cardíaco circadian pronunciado e atividades locomotoras, consumo regular de alimentos e gastar mais luz do dia em um abrigo especializado (se fornecido).

3. câmera e configuração do Software

  1. Inicie o software; a câmera de vídeo automaticamente irá acender.
  2. Selecione uma opção de deteção de movimento, detectar completamente a área de cada tanque na tela e o software iniciará o comportamento de rastreamento e vinculando-o com as gravações de atividade cardíaca.
    Nota: Um módulo de detecção de movimento de lagostins consiste em uma câmera de vídeo que controla o comportamento do lagostim abaixo do tanque e o software que combina o comportamento com atividade cardíaca. Os dados do módulo são usados para facilitar o processamento de dados de atividade cardíaca mais preciso, eliminando os períodos em que o crustáceo demonstra alta atividade locomotiva. Movimentos de lagostins súbita (ou seja, uma reação de fuga ou iniciação de alimentação) podem resultar em oscilações ou picos de curto prazo em sinais cardíacos que podem reduzir a precisão dos cálculos de intervalo cardíaco.

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Representative Results

Como resultado, obtivemos uma combinação de lagostins atividades cardíacas e comportamentais, gravadas e salvas em um arquivo de formato txt (Figura 3). Além do número de lagostas experimentais, a data e a taxa de amostragem, o arquivo consiste de três colunas: (1) o tempo contínuo no formato hh; (2) a taxa de coração automaticamente calculada em batimentos por minuto; (3) a locomoção registrado como ausência (0) ou presença (1) de qualquer movimento. Quando o crustáceo era inativo, zero foi atribuído à célula responsável pelo movimento, e quando ele se mudou, então número um apareceu na respectiva célula. Quando gravar continuamente, o arquivo de dados foi criado automaticamente todos os dias às 00:00 (12:00 AM). Foi crucial incluir locomoção, uma vez que pode ter causado as alterações no ritmo cardíaco (Figura 4). Após 10 s, um odor de comida (larvas de Chironomidae branqueados, filtrados e diluídos) foi entregue no tanque contendo o crustáceo, usando uma bomba peristáltica. Às 14 s, o crustáceo reconheceu o estímulo e sua taxa de coração diminuíram ligeiramente devido à resposta so-called do orientador. Após 20 s, a frequência cardíaca aumentada, resultando em uma diminuição em intervalos cardíacos. Em 26 s, o crustáceo mudou-se em direção a fonte de estímulo, e ambos a excitação fisiológica causada pelo odor de comida e a iniciação de locomoção resultou em um aumento substancial de frequência cardíaca. Em 37 s, também houve evidência de movimento abrupto de lagostas. Além disso, locomoção poderia ter contribuído substancialmente para o aumento de frequência cardíaca durante reações do lagostim a certos estímulos (Figura 5). Um crustáceo perturbado normalmente tem um aumento no ritmo cardíaco, como pode ser visto durante o intervalo de 30 a 40 min com locomoção ocasional. No entanto, durante o intervalo de 45 a 50 min, a locomoção é muito mais pronunciada. Esta locomoção contribuíram para uma taxa de coração que é significativamente maior do que a observada durante o período, com diminuição da locomoção. Se os dados do arquivo são transferidos para outro aplicativo ou o algoritmo de programação acima é usado, os dados que contém apenas a atividade cardíaca de lagostim poderiam ser obtidos e tratados posteriormente, se necessário (Figura 6). A taxa de coração de lagostins imperturbável é caracterizada por uma amplitude monotónica da curva de batimentos cardíacos e por aproximadamente igual cardíacos intervalos entre cada pico cardíaco.

A fim de analisar os padrões de comportamento de lagostins (distância tais como passado, preferência de uma certa área na velocidade tanque ou arena e locomoção), seria possível trocar a câmera atual com uma câmera de vídeo padrão com uma lente grande-angular plana, como o câmera usada atualmente não faz uma gravação, mas apenas controla a locomoção. Alternativamente, uma gravação com qualquer um dos aplicativos on-line para a captura de um vídeo da tela pode ser usada.

Figure 1
Figura 1 : Não invasiva optoelectronic infravermelho sensor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Sinal de lagostins, leniusculus de Pacifastacus, segurando o sensor na sua carapaça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Um exemplo de arquivo de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Batimentos cardíacos lagostins durante a mudança de normal a perturbado condições quando exposto a odores de alimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Taxa de coração e atividades de locomoção de um crustáceo inalterado (0 – 30 min) e perturbado (30 a 60 min) condições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Taxa de coração imperturbável lagostins. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Tem sido amplamente sugerido que a medição de certos parâmetros fisiológicos (tais como o coração ou a taxa de ventilação ou ambos) é um método mais confiável para gravação de reações de lagostins que a avaliação das respostas comportamentais que não ocorrem sempre imediatamente11. No entanto, é evidente que a abordagem mais eficiente para avaliar as reações de lagostins reais às mudanças ambientais é a combinação de atividade cardíaca e gravações de comportamento desde que torna possível ver as razões que justificam a pulsação de lagostins alterações e ou não ocorrem como resultado de alterações químicas no ambiente do ambiente ou por causa de iniciação de locomoção. Durante o monitoramento da qualidade de água, é crucial eliminar todas as influências externas sobre as alterações nos marcadores fisiológicos de lagostins, incluindo movimentos abruptos que têm efeitos crescentes sobre a taxa de coração, mas não apresentam um alarme para o sistema de Biomonitoramento.

Outra possibilidade para facilitar uma avaliação mais preciso e informativo do batimento cardíaco são os cronotrópicos e análises de inotrópicos parâmetro de lagostins atividades cardíacas principalmente relacionadas com formas específicas em lagostas sinais cardíaca19. Tais análises confirmaram que, mesmo quando os batimentos cardíacos alterados apenas algumas batidas por minuto, alguns dos parâmetros secundários podem indicar mudanças significativas em lagostas atividades cardíaca19.

Apesar do número de benefícios em usar a abordagem descrita, pesquisa em torno de monitoramento lagostins mudou-se em direção a uma absoluta minimização de manipulações de lagostins tátil. O recentemente desenvolvido sistema sem contacto20, a eliminação dos sensores e seus respectivos fios significa que as lagostas de qualquer tamanho podem ser usadas para o processo de controlo. Também é possível manter várias lagostas em uma área experimental, uma vez que a ausência de quaisquer fios impede o fio de enrolamento e restrições à circulação de lagostas. O crustáceo levará apenas dois pequenos pedaços de fita de altamente reflexivo, o que indica sua área cardíaca. Estes pedaços de fita podem ser anexados de lagostim mesmo após pós muda alguns dias. Lagostins cardíacas atividades e comportamentos são gravados pela câmera de vídeo e analisados em tempo real pelo software de coordenação. Juntamente com outros avanços técnicos, a abordagem modificada causará uma diminuição significativa do preço do sistema de monitoramento devido a limitada de hardware.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado pelo Ministério da educação, juventude e esportes do n ° República Tcheca-projetos "CENAKVA" CZ.1.05/2.1.00/01.0024 e 'CENAKVA II ' não. LO1205 sob a sustentabilidade nacional programa I, pela Agência de Grant da Universidade da Boêmia do Sul em České Budějovice (012/2016/Z) e pela Agência de Grant da República Checa (n º 16-06498S)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR LED diode KINGBRIGHT ELECTRONIC KP-3216F3C
Phototransistor EVERLIGHT ELPT15-21C
Resistor ROYAL OHM 0805S8J0201T5E
Resistor ROYAL OHM 0805S8F2200T5E
Capacitor KEMET C0805C334K5RACTU
Cable TECHNOKABEL FTP KAT.5E 4X2X0,14C
Connector HARTING 21348100380005
Connector HARTING 21348000380005
Dielectric gel KRAYDEN Sylgard 535
Analogue-to-digital convertor TEDIA UDAQ-1416CA
Glue KUPSITO.SK 7338723044
Kinect video camera ABCSTORE.CZ GT3-00002
Analysis software University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, Institute of Complex Systems Link to the software: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring
User name: frov
Password: CF2018

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