In Vitro Analys för att studera sammanläggning av Tau-Protein- och drogkontroll

Neuroscience
 

Summary

Tau aggregering analysen beskrivs i detta manuskript härmar de förvänta funktionerna i vivo Skellefteåsjukan tau och aggregering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sammanläggning av tau-protein och bildandet av Parade spiralformade filament är ett kännetecken för Alzheimers sjukdom och andra tauopathies. Jämfört med andra proteiner som är associerad med neurodegenerativa sjukdomar, rapporterade in vitro- aggregering kinetiken för tau-protein är mindre konsekvent presenterar en relativt hög variabilitet. Här beskriver vi utvecklingen av en in vitro- aggregering analysmetod som härmar de förväntade stegen i samband med tau Skellefteåsjukan och aggregation i vivo. Analysen använder den längsta tau isoform (huTau441) som innehåller både N-terminala sura skär samt fyra mikrotubulära bindande domäner (MBD). In vitro- aggregering utlöses genom tillsats av heparin och följs kontinuerligt av Tioflavin T fluorescens i 96 väl mikroplattan format. Tau aggregering analysen är mycket reproducerbara mellan olika brunnar, experimentell körningar och partier av proteinet. Aggregeringen leder till tau PHF morfologi som är mycket effektiv i sådd bildandet av de novo fibrillar strukturer. Förutom sin ansökan för att studera mekanismen för tau Skellefteåsjukan och aggregering, är aktuella analysen ett robust verktyg för screening av läkemedel som kan störa patogenesen av tau.

Introduction

Alzheimers sjukdom är en förödande neurodegenerativ sjukdom som definieras histopatologiskt av ansamling av extracellulära senila plack av aggregerade Amyloid beta1 och intracellulära neurofibrillära trassel som innehåller aggregerade hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiska tau är monomer och presenterade som sex unika isoformer som innehåller 0-2 N terminal skär och 3 eller 4 mikrotubulära bindande domäner3,4 uppkommer alternativ splitsning och ett genomsnitt på 2-3 phosphorylations. Det tros att hyperphosphorylation, Skellefteåsjukan och själv aggregering i fibrillary strukturer utgör nyckelelementen i tau patogenes, bedömdes patologiskt i dementa personer5,6.

De aggregerade neurofibrillära tau tovor är ett kännetecken inte bara för AD, men också för andra tauopathies, däribland frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Picks sjukdom, Progressiv Supranukleär pares (PSP), fronto-temporal demens (FTD) och primär åldersrelaterade tauopathy (del)2. Från en biokemisk synvinkel, förstå mekanismen av tau Skellefteåsjukan och aggregering kunde belysa patologiska processer i samband med AD och andra tauopathies. Förutom den vetenskapliga aspekten finns robust in vitro- aggregering analyser värdefulla verktyg för screening av drogen kandidater7,8,9,10. Det tros att sammanläggning av tau följer en kärnbildning beroende polymerisation process (NDP)11,12,13,14. NDP kinetik är sigmoidal och börjar med ett energetically unfavorable kärnbildning steg följt av en snabb energiskt utförsåkning aggregering process.

Till skillnad från andra amyloidogenic proteiner, inklusive prionproteinet, beta-amyloid och α-synuclein, tau spontant samlade inte under fysiologiska betingelser och även extrema pHs eller höga temperaturer är icke-främjar för sammanläggning15. Detta beror troligen på de hydrofila interaktionerna i gränssnittet tau aggregering. Dock aggregerar tau effektivt vid fysiologiska koncentrationer när inducerare såsom heparin16 eller andra polyanions17,18 används.

Tidigare insatser för att ställa in vitro- tau aggregering analyser har kasta lite ljus på detaljerna tau Skellefteåsjukan och aggregering, men de kom kort att härma vad som tros vara i vivo tau aggregering kinetik. I de flesta fall saknades de tau aggregation kineticsen den inledande lag fasen är associerad med tau kärnbildning. Detta kan ha varit följden av med mycket hög tau protein koncentrationer, förekomsten av aggregat i Start tau protein förberedelserna och/eller användning av tau fragment med mycket högre aggregeringsnivå benägenhet än den mer fysiologiska full längd-tau protein19,20,21,22,23. Dessutom upp tidigare studier inte den reproducerbarhet och robusthet aspekt av tau aggregation kinetics.

Här beskriver vi ett robust in vitro- tau aggregering test som härmar de viktigaste egenskaperna hos en kärnbildning beroende polymerisation med en inledande lag fasen motsvarar tau kärnbildning följt av en exponentiell tillväxtfas. Dessutom genererade rekombinant tau aggregaten är fibrillar i naturen och har en extremt hög sådd potens. Analysen är mycket reproducerbara också mellan tau batchar och utgör ett värdefullt verktyg att skärmen för aggregering hämmare.

Protocol

1. REAGENSBEREDNING

  1. Reaktion buffert
    1. Förbereda reaktion buffert: 0,5 mM TCEP i PBS, pH 6,7 genom upplösning TCEP torrt pulver (MW = 286.65 g/mol) i PBSstock lösning, pH 7,4.
      Obs: Förekomsten av TCEP är på grund av överbrygga aggregering studier med vildtyp tau-protein som innehåller cysteines. I det nuvarande protokollet, TCEP endast används för att justera pH PBS från 7,4 till 6,7 och spelar ingen roll i regleringen någon redoxreaktioner.
    2. Blanda och filtrera lösningen genom ett membranfilter för sterila 0,22 μm porstorlek storlek PES.
    3. Delprov och store vid-80 ˚C.
    4. Tina på bänken och stabilisera på RT före användning.
  2. huTau441
    1. Ta bort huTau441 (för protein uttryck och rening se Apetri o.a. 24) från-80 ° c frys.
    2. Tina på bänken och temperera vid rumstemperatur (RT).
    3. Snurra röret med protein lager för 5 min vid 12 000 x g vid 20-25 ˚C att eliminera luftbubblor.
    4. Mätning av koncentrationen av huTau441by absorption vid 280 nm med en extinktionskoefficient 0,31 mL mg-1cm-1
  3. Tioflavin T
    1. Förbereda 500 μM Tioflavin T (ThT) stamlösning av upplösning 10 mg av ThT torrt pulver (MW = 318.86 g/mol) i 35 mL reaktion buffert.
    2. Blanda omsorgsfullt, vortex 3 gånger i 20 sekunder vid maximal hastighet och filtrera lösningen genom ett sterilt 0,22 μm porstorlek storlek PES membranfilter.
    3. Bestämma koncentrationen av absorption mätningar på 411 nm med en extinktionskoefficient 22.000 M-1 cm-1 och justera ThT koncentration till 500 μm. Butik på RT skyddas från ljus. Förbereda färska varannan månad.
  4. Heparin
    1. Förbereda färska 55 μM heparin lösning genom upplösning 1 mg av HMW heparin torrt pulver (MW = 17-19 kDa) i 1 mL reaktion buffert på RT.
    2. Skaka kraftigt och vortex 2 gånger i 5 sekunder.
    3. Filtrera lösningen genom ett sterilt 0,20 μm porstorlek storlek PES membranfilter (spruta).

2. kontinuerligt läge ThT Aggregation test på en multi-mode Microplate Reader

Obs: ThT färgämne tillsätts reaktionen att övervaka huTau441 aggregation kinetics i ett kontinuerligt läge (automatiska mätningar). Även om reaktionen kan följas av en regelbunden fluorometer med en konventionell kyvetten, operationen manuell karaktär begränsar frekvensen av mätningar och äventyrar riktigheten av inspelade kinetiska kurvorna. Av den anledningen används en automatisk multi-mode microplate reader.

  1. Instrumentet ställer in
    1. Slå på datorn och multi-mode mikroplattan läsaren. Låt utrustningen stabilisera i 10 minuter.
    2. Starta programvaran och förbereda ett protokoll.
      1. Välj protokolltyp: standardprotokoll (Data minskning utförs självständigt för varje platta).
      2. Ställa in temperaturen vid 37 ˚C och välj preheatment innan du fortsätter protokollet.
      3. Ange den kinetiska kör: kör tid 50 h / Mätintervallet: 15 min.
      4. Ställ in orbital skakar på 425 cpm (3 mm) i kontinuerligt läge.
      5. Välj metoden Läs: fluorescens intensitet Endpoint/Kinetic - Monochromators våglängder: Excitation 440 nm (20 nm bandbredd) / utsläpp 485 nm (20 nm bandbredd) - optik position: Top - Normal läshastighet - Läs höjd: 4.50 mm
      6. Börja kör använda protokollet skapade. Namnge experimentet, välja destination för den nya filen och låta instrumentet före temperera vid önskad temperatur.
  2. Spontana huTau441 konvertering
    1. Förbereda reaktion provet i en 1,5 mL tub. Använd 200 μL mix per reaktion och minst 4 replikat (reaktionsvolym för 4 replikerar = 800 μL).
    2. Förbereda 800 μL reaktion provet (vid 4 replikat) som innehåller 15 μM huTau441, 8 μM heparin och 50 μM ThT. Start genom att blanda proteinet med reaktion bufferten, Lägg till heparin och ThT och blanda väl genom pipettering upp och ner 5 gånger. Respektera den angivna ordningen för reagens tillägg.
    3. Spinna prover på 12 000 x g och 25 ° c i 5 min att eliminera luftbubblor.
    4. Fördela 200 μL av reaktion prov per brunn i 96 brunnar mikroplattor (96 brunnar svart solid mikroplattan, väl-volym 360 μL, platt botten). Undvika att luftbubblor bildas.
    5. Försegla mikroplattan att undvika avdunstning.
    6. Placera mikroplattan i multi-mode microplate reader och starta mätningar.
    7. Efter slutförandet av experiment, ta bort plattan från utrustning och exportera data till en databehandling programvara.
  3. Kvalitetskontroll av konvertering, säd samling och lagring.
    1. Ta bort remsan från plattan och pool replikerar den olika i 1,5 mL rör. Blanda väl aggregerade provet i brunnarna genom pipettering upp och ner 2 gånger innan du samlar in den. Aggregat tenderar att deponera på botten av brunnen.
    2. Blanda noggrant i 1,5 mL röret genom pipettering upp och ner 5 gånger och avstå från 10-20 μL på en glimmer yta för att analysera aggregaten av AFM (för ytterligare detaljer se Apetri et al. ( 24).
    3. Skörda aggregaten genom att snurra 1,5 mL röret på 20 000 x g och 4 ° c i 1 timme. Aggregat bilda en pellet.
    4. Separera och analysera supernatanten med S-MALS bekräfta avsaknaden av monomer tau i provet som anger en lyckad konvertering till aggregat (för ytterligare detaljer se Apetri o.a. ( 24).
    5. Etikett 1,5 mL röret som innehåller de återstående aggregat (pellets) som anger inledande huTau441 proteinkoncentration och provvolymen. Snapin fryser aggregaten och förvaras vid-80 ˚C.
  4. Seedade reaktion
    1. Ta bort huTau441 aggregat från-80 ° c frys. Lägga till volymen av reaktion buffert anges på etiketten (utfallsprov volym) och låt röret stabilisera att RT. resuspendera aggregaten genom pipettering upp och ner 5 till 8 gånger.
    2. Sonikera aggregerade provet. För en 200 μL prov (15 μM huTau441), Sonikera på is med en 1/8 ”microtip (från 100 μL upp till 10 mL) under totalt 15 s med pulser av 1 s och pauser 2 s på 30% amplitud (någon sonikator 250 watt). Re jämvikta prov till RT.
      Observera: De anställda ultraljudsbehandling villkor leda till en homogen befolkning på tau fibriller med längder på 20-50 nm24.
    3. Förbereda reaktion provet i 1,5 mL rör. Använd 200 μL mix per reaktion och minst 4 replikat (reaktionsvolym för 4 replikerar = 800 μL).
    4. Förbereda 800 μL reaktion prov som innehåller 15 μM huTau441, 8 μM heparin och 50 μM ThT. Start genom att blanda proteinet med reaktion bufferten, Lägg till heparin och ThT och blanda väl genom pipettering upp och ner 5 gånger. Respektera den angivna ordningen för reagens tillägg.
    5. Spinna prover på 12 000 x g och 25 ° c i 5 min att eliminera luftbubblor.
    6. Fördela 200 μL av reaktion prov per brunn i 96 brunnar (96 brunnar svart solid mikroplattan, väl-volym 360 μL, platt botten). Undvika att luftbubblor bildas.
    7. Homogenisera grundligt förformade fibrill provet av repetitiva upp och ner pipettering (5 gånger) och lägga till varje brunn det belopp som motsvarar den önskad procentandelen av frön. För en 200 μL väl total volym är 2 μL av förformade utsäde tillägg en 1% (v/v). Mix av pipettering upp och ned 3 gånger när du lägger till brunnen och undvika att luftbubblor bildas.
    8. Försegla mikroplattan att undvika avdunstning.
    9. Placera mikroplattan i multi-mode microplate reader och starta mätningar.
    10. Avlägsna plattan från utrustning och exportera data till ett kalkylblad.

Representative Results

Rekombinant huTau441 som innehåller C291A och C322A mutationer och N-terminala hans och C-terminal C-Taggar var uttryckt och renat som tidigare beskrivs24. HuTau441 partier är mycket ren som visualiseras på SDS-PAGE och nästan 100% monomer enligt bedömning av S-MALS (figur 1). Sammanläggning av 15 µM huTau441 förmåddes genom tillsats av 8 µM HMW heparin och reaktionen följdes kontinuerligt av ThT fluorescens med en multimode microplate reader. Magnetiseringen våglängden var 440 nm (bandbredd 20 nm) medan utsläppen mättes på 485 nm (bandbredd 20 nm). Analysen är mycket reproducerbara, med resultat från 10 enskilda brunnar är praktiskt taget omöjlig att skilja (figur 2A). Morfologier av ThT positiva huTau441 aggregaten bedömdes efter 50 h av AFM. Aggregerade hutau441 är en homogen blandning av fibrillar strukturer av olika längder liknar rapporterade ex vivo morfologier (figur 2B). Slutliga reaktionsblandningen innehåller dessutom inte monomer, vilket tyder på en fullständig omvandling till aggregat som framgår av S-MALS mätningar (figur 2 c). Kinetiken av huTau441 aggregation i oberoende experimentella körningar är mycket lika som understryks av liknande sigmoidal kurvor och omöjlig att skilja eftersläpning och tillväxt faser (figur 3). Den höga graden av reproducerbarhet bibehålls när olika partier av protein används (figur 4). Förformade huTau441 aggregat är dessutom mycket effektivt rekrytera tau monomer och inducera bildandet av de novo tau aggregat. Belopp som är så låg som 0,0025% (v/v) av förformade tau aggregat klarar att kringgå kärnbildning och trigger generation av de novo fibriller (figur 5).

Figure 1
Figur 1: rekombinant huTau441 är monomer och högt rena. (A) renhet bedömning enligt denatureringen villkor på en 4-12% SDS-PAGE gel inklusive molekylär vikt standard protein stege (i kDA) (Lane 1); flöda genom från sista C-tag affinitet reningssteg (Lane 2); kolumnen tvätta bråkdel (Lane 3), eluerat huTau441 protein peak, innan (Lane 4) och efter buffert utbyte (Lane 5), respektive). (B) S-MALS analys av huTau441. Protein visar sig vara > 99,9% monomer med en Molmassa av 51 kDa och innehåller inte aggregat eller fragment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: aggregering av rekombinant huTau441 är mycket reproducerbara och leder kvantitativt till fibrillar strukturer. (A) kinetik av heparin inducerad huTau441 aggregation övervakas kontinuerligt i 96 väl mikroplattan format av ThT fluorescens. Koncentrationer av huTau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. 10 individuella kurvorna motsvarar omvandlingen av samma protein parti i tio brunnar i samma mikroplattan och kännetecknas av en genomsnittlig (med SD) lag fasen av 14,2 ± 0.38 h och t50 18,8 ± 0,40 h. kinetiska data var försedd med en 5-parametern transport c kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. Fördröjning fas och t50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Lag fasen beräknas baserat på 3% ökning av ThT fluorescens signal. Kurva montering och sammanfattande statistik erhålls med hjälp av IBM SPSS statistics version 20.0.0.2. (B). Tau aggregat Visa PHF-liknande morfologier som indikeras av AFM imaging på 50 h; (C). S-MALS analys av monomer huTau441 (t = 0 h) och supernatanten av reaktionsblandningen vid slutförandet av reaktionen (t = 50 h). Vid 50 h tidpunkten var reaktionsblandningen centrifugeras för 1h 20 000 X g och 4 ˚C och resulterade supernatanten injiceras på S-MALS. Försvinnandet av monomer toppen bekräftar komplett sammanläggning av tau. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: tau aggregering analysen visar hög reproducerbarhet mellan oberoende experimentella körningar. De två skärmar av fyra enskilda kinetik spår för spontan huTau441 aggregering samlas i två oberoende experiment använder samma parti av huTau441 protein. Koncentrationer av huTau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. Kinetik kännetecknas av en genomsnittlig (med SD) lag fasen av 12.2 ± 0,18 h och t50 17,8 ± 0,8 h (kör 1) och 11,6 ± 0,52 h och t50 17,8 ± 0,23 h (kör 2), respektive. Kinetiska data var försedd med en 5-parameter logistic kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. T50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Lag fasen beräknas baserat på 3% ökning av ThT fluorescens signal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: tau aggregering analysen visar hög reproducerbarhet mellan olika partier av huTau441 protein. Varje panel visar fyra replikerar motsvarar en specifik huTau441 batchen. Sammanläggning av varje sats följdes oberoende experiment. Koncentrationer av huTau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. Aggregation kinetics motsvarar de fyra individuella tau batchar kännetecknas av en genomsnittlig (med SD) lag fasen av 15,3 ± 0.38 h och t50 21,1 ± 0,46 h (Batch 1); lag fasen av 12,5 ± 0,07 h och t50 19,8 ± 0,34 h (Batch 2); lag fasen av 15,1 ± 0,34 h och t50 21,9 ± 0.86 h (Batch 3) och släpa fasen av 11,5 ± 0,29 h och t50 17,8 ± 0,29 h (parti 4), respektive. Kinetiska data var försedd med en 5-parameter logistic kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. Fördröjning fas och t50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Lag fasen beräknas baserat på 3% ökning av ThT fluorescens signal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: förformade hutau441 aggregat har hög sådd aktivitet. För att initiera sådd, har sonicated tau aggregat lagts till monomeren hutau441. Från rött till blått, varje färg av olika kinetiska kurvorna representerar olika mängden tillsatt frön: 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% och 0,0025% (v/v), respektive. Spontan konvertering av hutau441 representeras i svart. Alla villkor testades i fyra exemplar. De fyra kinetiska replikat som är associerad med en viss koncentration av frön är mycket reproducerbara och i de flesta fall inte särskiljas. Koncentrationer av hutau441 och heparin är 15 µM respektive 8 µM. Tillsats av små mängder av förformad sonicated fibrillar strukturer eliminerar den inledande lag fasen observerats i spontan konvertering och effekten är proportionell mot mängden frön. Från rött till blått, är skillnaden i t50 observerats (t50 spont.conv-t50 sådd) 18,9, 18,40, 17,8, 17,3, 16.6, 16.1, 15,4, 14.7, 14.2 och 13,7 timmar, respektive. Spontan konvertering av hutau441 kännetecknas av en genomsnittlig t50 (med SD) av 19.85 ± 0,54 h. kinetiska data var försedd med en 5-parameter logistic kurva med en linjär minskning av den övre asymptot. t50 beräknades genom interpolering mellan förutsagda värden av linjär regression. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Trots många försök, de tau aggregation kineticsen rapporterats i litteraturen att datum saknas önskad nivå av reproducerbarhet och/eller några av funktionerna en kärnbildning beroende polymerisation19,20,21 , 22 , 23 , 25. Detta framhävs ofta av bristen på en eftersläpning fas, ineffektiva sådd och icke-fibrillar natur av tau aggregat. Orsaken till dessa brister kan variera och inkluderar suboptimala tau proteinkvalitet (fragmentering, förekomsten av aggregat, låg renhet osv.), val av protein och förmå reagenser och eller experimentella förhållanden. En annan komplicerande faktor är två cystein rester ligger runt tau aggregering gränssnittet som kan bilda intra - eller inter - molekylär disulfide broar beroende på redox miljö och påverkar effektiviteten av tau aggregation. I de flesta metoder att minska reagens såsom DTT eller TCEP har använts för att bibehålla cystein rester i reducerade former och därmed öka nivåer av reproducerbarhet25. En extinktionskoefficient Tau är dessutom mycket låg vilket leder till svårigheter med noggranna mätningar av proteinkoncentration.

Vi fokuserade särskilt på några parametrar och kvalitetsattribut som vi ha avgörande betydelse för en robust, reproducerbar och representativa aggregering profil för tau-protein: att eliminera möjligheten av intra - och inter-molekylär disulfid bildande, Generera en högt rena tau monomer och förbättra koncentration beslutsamhet noggrannhet. Alla dessa reagens relaterade frågor är potentiella uppmärksamhet punkter som vi ansåg kritiska för optimal analys utveckling. För att lösa dessa frågor, uttrycktes full längd huTau441 med två mutationer, C291A och C322A, och N - och C-terminal taggar. Mutation av cystein rester har minimal påverkan på tau protein samtidigt som det eliminerar den annars mycket svårt att styra disulfid överbrygga. Uttrycker proteinet med relativt kort N - och C-terminal Taggar tillät oss att fullfölja en två-stegs affinitet rening protokollet vilket ledde till mycket hög renhet, integritet och monomer innehåll. Dessutom presenterade vi en F8W-mutation som ökade extinktionskoefficient av protein och får mycket mer exakt koncentration mätningar24.

Förutom att använda högkvalitativt protein reagenser, var andra assay parametrar också optimerad. Den optimala tau: heparin baserat identifierades för att vara runt 0,5 (M/M) som är i linje med tidigare publicerade studier26. Mekaniska och optiska instrumental inställningar är dessutom avgörande att säkerställa reproducerbarhet och de optimala parametrarna skiljer sig till viss del beroende på tillverkaren.

Sammanläggning av tau som beskrivs i denna analys visar egenskaper som är associerade med tau patogenes i AD och relaterade tauopathies. Processen börjar med en inledande lag fasen motsvarar bildandet av hög energi kärnor och följs av en snabb tillväxtfas som motsvarar till fibrill tillväxt. Lagfasen är tillräckligt lång för att öppna ett brett fönster för att i detalj studera sådd processen som täcker ett brett spektrum av utsäde koncentrationer (figur 5) medan fortfarande inte alltför länge så proteinnedbrytning och/eller icke-specifik aggregering undviks (figur 2). dessa sekundära händelser kan speciellt hända när ett intimt oordnade protein såsom huTau441 utsätts för långa tidsperioder att fysiologiska förhållanden. Erhållna tau aggregat displayen morfologi av PHFs isolerade från hjärnan hos AD patienter och är mycket effektiva i att rekrytera monomer tau och konvertera den till de novo genereras aggregat, en process som kallas sådd. Analysen är mycket reproducerbara, kinetic kurvorna att vara praktiskt taget omöjlig att skilja mellan brunnar, experimentell körningar och protein partier. Även om den aktuella analysen fokuserar endast på den längsta tau isoformen, huTau441, programmet kan anpassas för att studera omvandlingen av andra former av tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikation, i pressen) Dessutom gör det möjligt mekanistiska studier fokuserar på samspelet mellan tau isoformer och eventuellt belysa skillnaderna mellan tau patogenes i AD där både 3R och 4R isoformer är närvarande i PHFs och Picks sjukdom eller Frontotemporal demens där tau patologi innehåller huvudsakligen 3R och 4R tau-isoformer, respektive27.

Mycket hög reproducerbarhet av analysen bör tillåta läsarna att genomföra det med relativ lätthet i sina specifika lab inställningar. Analysens härmar vad som tros vara i vivo Skellefteåsjukan och aggregering av tau, aktivera mekanistiska studier som kommer att belysa tau patogenes och det utgör ett värdefullt verktyg för screening läkemedelskandidater och utvärdera deras inblandning med de olika stegen i processen patogenes.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Hector Quirante för uttryck och rening av huTau441, Hanna Inganäs och Margot van Winsen för utmärkt teknisk support och Martin Koldijk för dataanalys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362, (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9, (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17, (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251, (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88, (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12, (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6, (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10, (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44, (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287, (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39, (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47, (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383, (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399, (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150, (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41, (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37, (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52, (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52, (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6, (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285, (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9, (4), 681-693 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics