Vitro Tahlil türleri çalışmak için toplama Tau Protein ve uyuşturucu tarama

Neuroscience
 

Summary

Bu el yazması açıklanan tau toplama tahlil vivo içinde tau misfolding ve toplama beklenen özelliklerini taklit eder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Toplama tau protein ve eşleştirilmiş helisel filamentlerin oluşumunu bir Alzheimer hastalığı ve diğer tauopathies özelliğidir. Nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili diğer proteinler karşılaştırıldığında, bildirilen vitro toplama kinetik tau protein için nispeten yüksek bir çeşitlilik sunan daha az tutarlı. Burada tau misfolding ve toplama içinde vivoile ilişkili beklenen adımları taklit eden bir vitro toplama tahlil gelişimini açıklar. Tahlil de N-terminal asidik ekler gibi dört Mikrotubul bağlayıcı etki alanları (MBD) içeren uzun tau izoformu (huTau441) kullanır. Vitro toplama heparin eklenmesi tarafından tetiklenir ve sürekli thioflavin T floresans 96 iyi Mikroplaka kartvizitlere izledi. Tau toplama tahlil farklı wells, deneysel çalışır ve protein toplu işlemleri arasında son derece tekrarlanabilir. Toplama tau de novo fibriler yapıların oluşumu tohum çok verimli PHF benzeri morfoloji yol açar. Tau misfolding ve toplama mekanizması eğitim uygulaması ek olarak, geçerli tahlil tau patogenezi ile engelleyebilir uyuşturucu süzmek için güçlü bir araçtır.

Introduction

Alzheimer hastalığı histopathologically toplanan amiloid beta1 ekstraselüler senil plak birikimi tarafından tanımlanan bir yıkıcı nörodejeneratif hastalığıdır ve hücre içi neurofibrillary düğüm içeren toplanan hyperphosphorylated tau protein2. Fizyolojik tau monomeric ve altı benzersiz izoformlarının içeren 0-2 olarak sunulan N terminal ekler ve alternatif uçbirleştirme ve ortalama 2-3 fosforilasyon kaynaklanan 3 ya da 4 Mikrotubul bağlayıcı etki alanları3,4 . Bu hyperphosphorylation, misfolding ve fibrillary yapıları içine kendini toplama olarak patolojik olarak değerlendirildi çılgın bireyler5,6tau patogenezinde temel unsuru teşkil inanılıyor.

Toplanan neurofibrillary tau düğüm bir hallmark sadece reklam için aynı zamanda da lobar dejenerasyonu (FTLD), Pick hastalığı, ilerici supranuclear palsi (PSP), fronto-geçici demans (FTD) ve birincil dahil olmak üzere diğer tauopathies vardır yaşa bağlı tauopathy (bölüm)2. Biyokimyasal açıdan, tau misfolding ve toplama mekanizması anlama reklam ile ilgili patolojik işlemlerin ışık ve diğer tauopathies. Bilimsel yönü yanı sıra, sağlam vitro toplama deneyleri uyuşturucu adaylar7,8,9,10ile taranması için değerli araçlardır. Bu tau toplama bir çekirdekleşme bağımlı polimerizasyon süreci (NDP)11,12,13,14izler inanılıyor. .NET Framework kinetik sigmoidal ve hızlı enerjik yokuş aşağı toplama işlemi tarafından izlenen bir enerjik olumsuz çekirdekleşme adım ile başlar.

Prion protein, amiloid beta ve α-synuclein, dahil olmak üzere diğer amyloidogenic proteinler aksine tau kendiliğinden fizyolojik koşullar altında toplamak değil ve hatta aşırı pHs veya yüksek sıcaklık için toplama15sigara elverişli. Bunun en hydrophylic etkileşimleri tau toplama arabiriminde mevcut nedeni olabilir. Ancak, tau olarak verimli bir şekilde indükleyicileri heparin16 veya diğer polyanions17,18 gibi kullanıldığında fizyolojik konsantrasyonları toplar.

Vitro tau toplama deneyleri ayarlamak için önceki çabaları tau misfolding ve toplama ayrıntılarını üzerine biraz ışık, ama ne vivo içinde tau toplama kinetik inanılan taklit eden kısa geldiler. Çoğu durumda, tau toplama kinetik tau çekirdekleşme ile ilişkili başlangıç gecikme aşama eksik oldu. Bu çok yüksek tau protein konsantrasyonları, kullanmanın sonucu başlangıç tau protein hazırlıklar toplamları varlığı ve/veya kullanımı ile çok daha yüksek toplama eğilimi daha fazla fizyolojik tam uzunlukta tau tau parçalarının olabilir protein19,20,21,22,23. Ayrıca, önceki çalışmalarda tekrarlanabilirlik ve tau toplama kinetik sağlamlık yönünü ele vermedi.

Burada, bir çekirdekleşme bağımlı polimerizasyon temel özelliklerinin bir üstel büyüme aşaması gelir tau çekirdekleşme karşılık gelen bir başlangıç gecikme faz ile taklit eden bir sağlam vitro tau toplama tahlil açıklayın. Ayrıca, oluşturulan rekombinant tau toplamları doğada fibriler ve son derece yüksek bir tohumlama etki gücüne sahip. Tahlil de tau gruplar arasında son derece tekrarlanabilir ve değerli bir araç toplama inhibitörleri için ekran temsil eder.

Protocol

1. reaktif hazırlık

  1. Reaksiyon arabellek
    1. Reaksiyon arabellek hazırlamak: 0,5 mM PBS, TCEP kuru toz eriterek tarafından pH 6.7 TCEP (MW 286.65 g/mol =) PBSstock çözümünde, pH 7.4.
      Not: Toplama çalışmaları katıldı içeren vahşi türü tau protein kullanarak köprü nedeniyle TCEP varlığıdır. Geçerli iletişim kuralı ' TCEP sadece 6,7 7,4 PBS pH ayarlamak için kullanılır ve herhangi bir redoks reaksiyonları düzenleyen hiçbir rol oynar.
    2. İyice karıştırın ve bir steril 0,22 mikron gözenek boyutu PES membran filtreden çözüm filtre.
    3. Aliquot ve-80 ˚C mağazasında.
    4. Bankta çözülme ve RT kullanmadan önce stabilize.
  2. huTau441
    1. HuTau441 (için protein ifade ve arıtma bakın Apetri ve ark. kaldırmak 24) üzerinden-80 ˚C dondurucu.
    2. Bankta çözülme ve oda sıcaklığında (RT) equilibrate.
    3. Tüp hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için 20-25 ˚C'de 12.000 x g, 5 min için protein hisse senedi ile spin.
    4. 280 huTau441by emme konsantrasyonu ölçmek 0.31 mL mg-1cm-1 bir tükenme katsayısı kullanarak nm
  3. Thioflavin T
    1. ThT kuru toz 10 mg çözülerek 500 mikron thioflavin T (ThT) hisse senedi çözüm hazırlamak (MW 318.86 = g/mol) 35 mL tepki arabelleği.
    2. İyice, girdap maksimum hızda 20 saniye için 3 kez karıştırın ve çözüm steril 0,22 mikron gözenek boyutu PES membran filtre ile filtre.
    3. 411 ölçülerde emme tarafından konsantrasyonu belirlemek 22.000 M-1 cm-1 bir tükenme katsayısı kullanarak nm ve ThT konsantrasyonu 500 mikron için ayarlayın. Işıktan korunan RT, saklayın. Taze 2 ayda hazır olun.
  4. Heparin
    1. Taze 55 mikron heparin çözüm HMW heparin kuru toz 1 mg çözülerek hazırlamak (MW = 17-19 kDa) 1 mL tepki arabelleği, RT.
    2. Girdap 2 5 saniye boyunca zaman ve şiddetle çalkalanır.
    3. Çözüm bir steril 0.20 mikron gözenek boyutu PES membran filtreden (şırınga) filtre.

2. sürekli modu ThT toplama tahlil bir Multi-Mode Mikroplaka Okuyucu

Not: ThT boya huTau441 toplama kinetik sürekli modunda (otomatik ölçüler) izlemek için tepki eklenir. Her ne kadar reaksiyon düzenli bir yer tarafından takip edilebilir geleneksel bir küvet kullanarak işlemi el ile doğa Frekans ölçümleri sınırlar ve kaydedilen kinetik eğrileri doğruluğunu ödün vermez. Bu nedenle, bir otomatik çok modlu Mikroplaka Okuyucu kullanılır.

  1. Enstrüman kurmak
    1. Bilgisayar ve Multi-tarz Mikroplaka Okuyucu açın. 10 dakika boyunca stabilize ekipman izin.
    2. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı başlatmak ve bir protokol hazırlamak.
      1. İletişim kuralı türü seçin: Standart Protokolü (veri azaltma yapılır bağımsız olarak her plaka için).
      2. Sıcaklık 37 ˚C ayarladığınızda ve protokol devam etmeden önce preheatment.
      3. Kinetik Çalıştır ayarlayın: çalışma süresi 50 h / ölçüm aralığı: 15 dak.
      4. 425 BGBM (3 mm) sürekli modunda, sallayarak yörünge ayarlayın.
      5. Okuma yöntemi seçin: floresan yoğunluğu bitiş noktası/kinetik - Monochromators boyları: uyarma 440 nm (20 nm bant genişliği) / optik emisyon 485 nm (20 nm bant genişliği) - konum: Top - Normal okumak hız - okumak Yükseklik: 4.50 mm
      6. Oluşturulan iletişim kuralını kullanarak Çalıştır başlatın. Deney adı, yeni oluşturulan dosya hedefini seçin ve istenilen sıcaklığa önceden equilibrate araç sağlar.
  2. Spontan huTau441 dönüşüm
    1. Reaksiyon örnek bir 1,5 mL Tüp hazırlayın. Kullanım 200 μL mix tepki ve en az 4 çoğaltır başına (reaksiyon Cilt 4 için çoğaltır = 800 μL).
    2. (Halinde 4 çoğaltır) 800 μL tepki örnek 15 mikron huTau441, 8 mikron heparin ve 50 mikron içeren hazırlamak ThT. protein tepki arabellek ile karıştırma başlayın heparin ve ThT ekleyip karıştırın de yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından. Reaktif toplama için belirtilen sipariş saygı.
    3. Örnekleri 12.000 x g ve hava kabarcıkları ortadan kaldırmak 5 min için 25 ˚C spin.
    4. Reaksiyon örneği 96-şey Mikroplaka kuyuda başına 200 μL dağıtmak (96-şey siyah sağlam Mikroplaka, iyi hacimli 360 μL, düz dipli). Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.
    5. Mikroplaka buharlaşma önlemek için mühür.
    6. Çok modlu Mikroplaka Okuyucu Mikroplaka yerleştirin ve ölçümler başlar.
    7. Deney tamamlanması sonra plaka donanımları kaldırın ve verileri bir veri işleme yazılımı verin.
  3. Kalite kontrol dönüşüm, tohum toplama ve depolama.
    1. Mühürleyen plaka kaldırmak ve 1,5 mL tüpler içinde farklı çoğaltır Havuzu. Yukarı ve aşağı toplama daha önce 2 kez pipetting tarafından toplanan örnek Wells karıştırın. Toplamları kuyunun üzerinde mevduat eğilimindedir.
    2. 1.5 mL 5 kere yukarı ve aşağı pipetting tarafından tüp ve 10-20 μL (daha fazla ayrıntı Apetri vd görmek için AFM göre toplamları çözümlemek için bir mika yüzey üzerinde dağıtmak karışımı iyice içinde 24).
    3. Toplamları 1 saat 1,5 mL tüp 20.000 x g ve 4 ˚C iplik tarafından hasat. Toplamları bir Pelet oluştururlar.
    4. Ayrı ve süpernatant içine toplamları (daha fazla bilgi görmek Apetri ve ark. için başarılı bir dönüşüm gösteren örnek monomeric tau yokluğu onaylamak için S-MALS tarafından analiz 24).
    5. İlk huTau441 protein konsantrasyonu ve numune hacmi gösteren kalan toplamları (Pelet) içeren 1,5 mL tüp etiketleyin. Ek agrega donma ve-80 ˚C saklamak.
  4. Numaralı seribaşı tepki
    1. HuTau441 toplamları-80 ˚C dondurucudan kaldırın. Reaksiyon arabellek hacmi (ilk numune hacmi) etiketinde belirtilen ve dik Resuspend için toplamları 5 8 kere için yukarı ve aşağı pipetting tarafından stabilize tüp izin ekleyin.
    2. Toplanan örnek solüsyon içeren temizleyicide. Bir 200 μL örnek (15 mikron huTau441) için solüsyon içeren bir 1/8" microtip kullanarak buza temizleyicide (100 μL üzerinden 10 mL) 15 toplam süre için s 1 s bakliyat ve duraklar 2 kullanarak % 30 genlik (sonicator 250 Watt), s. RT için örnek yeniden equilibrate
      Not: Tau liflerinde homojen nüfusu 20-50 nm24uzunlukları ile istihdam sonication koşulları yol.
    3. Reaksiyon örnek 1,5 mL tüpler hazır olun. Kullanım 200 μL mix tepki ve en az 4 çoğaltır başına (reaksiyon Cilt 4 için çoğaltır = 800 μL).
    4. 15 mikron huTau441, 8 mikron heparin ve 50 mikron içeren 800 μL tepki örnek hazırlamak ThT. protein tepki arabellek ile karıştırma başlayın heparin ve ThT ekleyip karıştırın de yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından. Reaktif toplama için belirtilen sipariş saygı.
    5. Örnekleri 12.000 x g ve hava kabarcıkları ortadan kaldırmak 5 min için 25 ˚C spin.
    6. Reaksiyon örneği 96-iyi (96-şey siyah sağlam Mikroplaka, iyi hacimli 360 μL, düz dipli) bir kuyu başına 200 μL dağıtmak. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.
    7. İyice ön şekillendirilmesi fibriller örnek tekrarlayan yukarı ve aşağı (5 kez) pipetting homojenize ve her şey tohumlar istenen yüzdesine karşılık gelen tutarı ekleyin. Bir 200 μL de toplam hacmi için ön şekillendirilmesi tohum ek 2 μL %1 (v/v) olduğunu. Mix tarafından yukarı ve aşağı pipetting 3 kez kuyuya eklerken ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.
    8. Mikroplaka buharlaşma önlemek için mühür.
    9. Çok modlu Mikroplaka Okuyucu Mikroplaka yerleştirin ve ölçümler başlar.
    10. Plaka donanımları kaldırın ve verileri elektronik tabloya verme.

Representative Results

Rekombinant huTau441 C291A ve C322A mutasyonlar ve N-terminal onun C-terminal C-Etiketler ifade ve daha önce saf içeren açıklanan24. HuTau441 toplu işlemleri son derece saf olarak görüntülenmeyecektir SDS-sayfa ve hemen hemen % 100 S-MALS (Şekil 1) tarafından değerlendirilmesi gibi monomeric. 15 µM huTau441 toplama 8 µM HMW heparin eklenmesi tarafından indüklenen ve tepki sürekli bir multimod Mikroplaka Okuyucu kullanarak ThT floresans tarafından izledi. Uyarma dalga boyu 440 yapıldı nm (bant genişliği 20 nm) emisyon 485 ölçüldü ise nm (bant genişliği 20 nm). Tahlil sonuçları 10 bireysel kuyulardan neredeyse ayırt edilemez (Şekil 2A) olmak ile son derece tekrarlanabilir. ThT olumlu huTau441 agrega türleri morfoloji sonra 50 h AFM tarafından değerlendirildi. Toplanan hutau441 fibriler yapıları farklı uzunlukta bildirilen ex vivo türleri morfoloji için (2B rakam) benzer homojen bir karışımıdır. Ayrıca, son tepki karışımı monomer, S-MALS ölçümleri (Şekil 2C) tarafından gösterildiği gibi tam bir dönüşüm içine agrega düşündüren içermiyor. HuTau441 toplama bağımsız deneysel ishal kinetik benzer sigmoidal eğrileri ve ayırt edilemez gecikme ve büyüme aşamalarına (Şekil 3) tarafından vurguladı çok benzer. Protein farklı toplu işlemleri kullanıldığında tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde korunur (Şekil 4). Ayrıca, önceden huTau441 toplamları tau monomer alımı ve de novo tau toplamları oluşumu inducing çok verimlidir. Ön şekillendirilmesi tau toplamları %0.0025 (v/v) düşük miktarda çekirdekleşme ve tetikleyici nesil de novo liflerinde (Şekil 5) atlamak yeteneğine sahiptir.

Figure 1
Şekil 1: rekombinant huTau441 monomeric ve son derece saf. A) Moleküler Ağırlık standart protein merdiven (içinde kDA) dahil olmak üzere 4-%12 SDS-sayfa jel koşullara denaturing altında saflık değerlendirme (Lane 1); akışı son C-etiket benzeşme arıtma adım (2 yolu); sütun yıkama kesir (Lane 3), (Lane 4) önce huTau441 protein tepe eluted ve ara belleği boşaldıktan sonra sırasıyla (Lane 5), Döviz). B) huTau441 S-MALS analizi. Protein > %99,9 51 kDa molar kütlesi ile monomeric olarak gösterir ve toplamları veya parçaları içermez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: rekombinant huTau441 agregasyon son derece tekrarlanabilir ve kantitatif fibriler yapılara yol. A) heparin kinetik 96 iyi Mikroplaka biçiminde ThT floresans tarafından sürekli takip huTau441 toplama indüklenen. HuTau441 ve heparin konsantrasyonları 15 µM ve 8 µM, sırasıyla vardır. 10 bireysel eğriler aynı Mikroplaka on Wells aynı protein toplu dönüşüm karşılık gelen ve 14,2 bir (SD ile) ortalama gecikme faz tarafından karakterize ± 0,38 h ve t50 18.8 ± 0.40 h. kinetik veri ile 5-parametre logisti ile donatılmış c eğrisi üst asimptot doğrusal bir düşüş ile. Gecikme faz ve t50 doğrusal regresyon tarafından öngörülen değerleri arasında tarafından hesaplanan. Gecikme faz ThT floresans sinyalinin % 3 artış temel alınarak hesaplanır. Eğri uydurma ve Özet istatistikleri IBM SPSS İstatistik sürüm 20.0.0.2 kullanarak elde edilir. B). Tau toplamları göstermek PHF benzeri türleri morfoloji AFM düşsel vasıl 50 h; gösterildiği gibi C). monomeric huTau441 S-MALS analizi (t = 0 h) ve süpernatant tepki bitiminde tepki karışımı (t = 50 h). 50 h saat noktada tepki karışımı 20.000 X g ve 4 ˚C ve S-MALS üzerinde enjekte sonuçlandı süpernatant 1 h için centrifuged. Monomer tepe kaybolması tau tam toplama onaylar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: tau toplama tahlil bağımsız deneysel çalıştırma arasında yüksek tekrarlanabilirlik gösterir. Spontan huTau441 toplama huTau441 protein ve aynı toplu işlem iki bağımsız deneylerde toplanan dört bireysel kinetik izlerini iki aynası. HuTau441 ve heparin konsantrasyonları 15 µM ve 8 µM, sırasıyla vardır. Kinetik karakterizedir (SD ile) ortalama gecikme faz 12,2 ± 0,18 h ve t50 17,8 ± 0,8 h (1 çalıştırın) ve 11,6 ± 0,52 h ve t50 17,8 ± 0.23 h (2) çalıştırmak, anılan sıraya göre. Kinetik veri üst asimptot doğrusal bir düşüş ile 5-parametre lojistik eğri ile takıldı. T50 doğrusal regresyon tarafından öngörülen değerleri arasında tarafından hesaplanan. Gecikme faz ThT floresans sinyalinin % 3 artış temel alınarak hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: tau toplama tahlil huTau441 protein farklı toplu işlemleri arasında yüksek tekrarlanabilirlik gösterir. Her panel dört belirli huTau441 toplu işlemine karşılık gelen çoğaltır gösterir. Her toplu iş iş toplama bağımsız denemeler izledi. HuTau441 ve heparin konsantrasyonları 15 µM ve 8 µM, sırasıyla vardır. Toplu işlemleri (SD ile) ortalama gecikme faz 15,3 ± 0,38 h ve t50 21,1 ± 0,46 h (toplu 1); ile karakterizedir dört bireysel tau karşılık gelen toplama kinetik gecikme faz 12.5 ± 0,07 h ve t50 19,8 ± 0.34 h (toplu 2); Faz 15.1 ± 0.34 h ve t50 21.9 ± 0,86 h (toplu 3) lag ve faz 11,5 ± 0.29 h ve t50 17,8 ± 0.29 h (toplu iş 4), sırasıyla lag. Kinetik veri üst asimptot doğrusal bir düşüş ile 5-parametre lojistik eğri ile takıldı. Gecikme faz ve t50 doğrusal regresyon tarafından öngörülen değerleri arasında tarafından hesaplanan. Gecikme faz ThT floresans sinyalinin % 3 artış temel alınarak hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ön şekillendirilmesi hutau441 toplamları var yüksek aktivite tohumlama. Tohum başlatmak için sonicated tau toplamları monomer hutau441 için eklenmiştir. Kırmızı, mavi, her rengin farklı kinetik eğrilerinin eklenen tohum farklı miktarını temsil eder: %1,25, % 0.63, %0.31, %0.16, %0,08, %0,04, %0.02, % 0,01, %0,005 ve %0.0025 (v/v), anılan sıraya göre. Spontan hutau441 çevrimi siyah olarak temsil edilir. Tüm koşulları içinde quadruplicate test edildi. Tohumlar belirli bir konsantrasyon ile ilişkili dört kinetik çoğaltır son derece tekrarlanabilir ve çoğu durumda ayırt edilemez. Hutau441 ve heparin konsantrasyonları 15 µM ve 8 µM, sırasıyla vardır. Önceden biçimlendirilmiş sonicated fibriler yapıları az miktarda ek spontan değişme içinde gözlenen ilk gecikme faz ortadan kaldırır ve etkisi tohum miktarı ile orantılıdır. Kırmızıdan maviye gözlenen t50 (t50 spont.conv-t50 tohum) 18.9, 18,40, 17,8, 17.3, 16.6, 16.1, 15,4, 14.7, 14.2 ve 13,7 saat, sırasıyla farktır. Spontan hutau441 çevrimi bir ortalama t50 itibaren 19.85 tarafından (SD ile) karakterizedir ± 0,54 h. kinetik veri ile üst asimptot doğrusal bir düşüş ile 5-parametre lojistik eğri ile donatılmış. t50 doğrusal regresyon tarafından öngörülen değerleri arasında tarafından hesaplanan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Çok sayıda çabalarına rağmen tau toplama kinetik literatürde bildirilen tarih eksikliği tekrarlanabilirlik istenen seviyeye ve/veya bir çekirdekleşme bağımlı polimerizasyon19,20,21 özellikleri , 22 , 23 , 25. bu kez bir gecikme faz, verimsiz tohum ve tau toplamları fibriler sigara doğası eksikliği tarafından vurgulanmaktadır. Bu eksiklikler nedeni değişebilir ve alt-optimal tau protein kalite (parçalanma, varlığı toplamları, düşük saflık, vs.), protein ve reaktifler ve/veya deneysel koşullar inducing seçimi içerir. Başka bir karışıklık faktör Intra - oluştururlar veya Inter tau toplama arabirimi iki sistein artıkları - redoks çevre ve etkiler tau toplama verimliliğini bağlı olarak moleküler disülfür köprü. Çoğu yaklaşımlar reaktifler DTT veya TCEP gibi azaltarak azaltılmış formları sistein kalıntıları korumak için kullanılmış ve böylece tekrarlanabilirlik25düzeylerini artırmak. Ayrıca, tau tükenme katsayısı hangi bir protein konsantrasyonu doğru ölçümler zorluklar yol açar çok düşüktür.

Özellikle birkaç parametreleri ve biz tau protein için sağlam, tekrarlanabilir ve temsilcisi toplama profil için çok önemli olarak kabul kalite öznitelikleri üzerinde duruldu: Intra - olasılığını ortadan kaldırarak ve Inter-moleküler disülfür oluşumu, bir son derece saf tau monomer üreten ve konsantrasyonu tayini doğruluğunu geliştirmek. Bu reaktif ile ilgili sorular biz en iyi tahlil gelişimi için kritik olarak kabul potansiyel ilgi noktalarıdır. Bu sorunlara yönelik olarak tam uzunlukta huTau441 iki mutasyonlar, C291A ve C322A ve N - ve C-terminal Etiketler ile ifade edildi. Mutasyon sistein kalıntıları Aksi takdirde çok zor disülfür köprü denetlemek ayrıcılıklarına tau protein üzerinde çok az etkisi vardır. Protein nispeten kısa N ve C terminali Etiketler ile ifade çok yüksek saflıkta, bütünlüğü ve monomer içerik için yol açan bir iki adım benzeşme arıtma protokolü takip izin verdi. Ayrıca, biz protein yok olma katsayısı arttı ve çok daha doğru konsantrasyon ölçümleri24izin bir F8W mutasyon tanıttı.

Yüksek kaliteli protein reaktifler kullanmanın yanı sıra, diğer tahlil parametreleri de optimize. En iyi tau: heparin oranı tespit doğrultusunda önceden yayınlanmış çalışmaları26olan 0,5 (M/M) yanında olmak. Ayrıca, mekanik ve optik enstrümantal ayarlarını tekrarlanabilirlik ve optimum parametreleri bir dereceye kadar üreticiye bağlı olarak farklı olabilir emin olmak büyük önem taşımaktadır.

Bu tahlil açıklanan tau toplama reklam tau patogenezi ile ilişkili olan ve tauopathies ilgili özellikleri gösterir. Süreci yüksek enerji çekirdeği oluşumu için karşılık gelen bir başlangıç gecikme aşaması ile başlar ve karşılık gelen bir hızlı büyüme aşaması fibriller büyüme için gelir. Öteleme süresini kapsayan geniş bir tohum konsantrasyonları (Şekil 5) hala çok uzun süre protein yıkımı ve/veya non-spesifik toplama kaçınılması böylece tohumlama işlemi (Şekil ayrıntılı olarak incelemek için geniş bir pencere açmak için yeterince uzun 2). huTau441 gibi özünde düzensiz bir protein için uzun dönem-in zaman fizyolojik koşullarına maruz kaldığında bu ikincil olaylar özellikle olabilir. PHFs morfoloji reklam hastaların beyin izole ve monomeric tau işe ve de novo için dönüştürme çok verimli elde edilen tau toplamları görüntüleme toplamları, tohum olarak adlandırılan bir süreç oluşturulur. Tahlil kinetik eğrileri wells, deneysel çalışır ve protein toplu işlemleri arasında neredeyse ayırt edilemez olmak son derece tekrarlanabilir. Sadece en uzun tau izoformu, huTau441, geçerli tahlil odaklanır, ancak uygulama adapte edilebilir tau (Ameijde ve ark., Acta Neuropathologica iletişim, basında) diğer formları dönüşüm eğitim için Ayrıca, bu sağlar Mekanik çalışmaları tau izoformlarının etkileşimi üzerinde duruldu ve muhtemelen nerede 3R ve 4R izoformlarının burada tau patoloji esas olarak içeren PHFs ve PICK hastalığı veya da demans yoksa reklam patogenezinde tau arasındaki farklar ışık 3R ve 4R tau izoformlarının, sırasıyla27.

Tahlil çok yüksek tekrarlanabilirlik okuyucular belirli laboratuvar ayarlarına göreli kolaylıkla uygulamak izin vermelidir. Tahlil ne vivo içinde misfolding ve tau agregasyon inanılıyor taklit eder, tau patogenez ve bu ışık tutacak mekanik çalışmalar etkinleştirme ilaç adaylarının süzmek için değerli bir araç teşkil eder ve onların girişim değerlendirmek Patogenez işleminin farklı adımları ile.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Hector Quirante ifade ve huTau441, arınma için Hanna Inganäs ve mükemmel teknik destek için Margot van Winsen ve Martin Koldijk veri analizi için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362, (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9, (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17, (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251, (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88, (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12, (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6, (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10, (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44, (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287, (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39, (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47, (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383, (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399, (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150, (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41, (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37, (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52, (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52, (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6, (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285, (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9, (4), 681-693 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics