细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定

Biochemistry

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Summary

该协议描述了一种基于荧光波动光谱的方法来研究介导细胞相互作用的蛋白质之间的相互作用,直接定位在细胞连接中的蛋白质。我们提供有关仪器校准、数据采集和分析的详细指南, 包括对可能的文物来源的更正。

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Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

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Abstract

各种生物过程涉及细胞间的相互作用, 通常由蛋白质介导, 蛋白质在相邻细胞之间的界面上相互作用。有趣的是, 只有少数检测能够在活细胞中直接间接探测这种相互作用。在这里, 我们提出了一个检测方法, 以测量在邻近细胞表面, 在细胞接触表达的蛋白质的结合。该检测包括两个步骤: 混合表达与不同荧光蛋白融合的感兴趣蛋白质的细胞, 然后使用共聚焦激光扫描显微镜在细胞触点进行荧光波动光谱测量。我们通过测量淀粉样癌前吸附蛋白 (aplp1) 在细胞连接点上的相互作用, 在生物相关环境中证明了这种检测方法的可行性。我们提供了使用基于荧光的技术 (扫描荧光相关光谱、互相关数和亮度分析) 和所需的仪器校准进行数据采集的详细协议。此外, 我们还讨论了数据分析中的关键步骤, 以及如何识别和纠正外部、虚假信号的变化, 例如由于光漂白或细胞运动而产生的变化。

一般情况下, 该检测方法适用于细胞接触时、相同或不同类型细胞之间的任何同型或异型蛋白质相互作用, 可在商业共聚焦激光扫描显微镜上实施。一个重要的要求是系统的稳定性, 这需要足以探测感兴趣的蛋白质在几分钟内的扩散动力学。

Introduction

许多生物过程发生在细胞相互作用的部位,例如细胞粘附1、23、细胞融合4和细胞识别5。这类事件在多细胞生物的发展和细胞细胞交流 (例如免疫反应期间) 中尤其重要。这些过程通常由蛋白质介导, 这些蛋白质被定位在表面,在相邻细胞的质膜 (pm), 并在细胞接触时进行特定的相互作用, 这些相互作用在空间和时间上得到精确的调节。在许多情况下, 这些相互作用是直接的同型或异型蛋白质-蛋白质-蛋白质反式相互作用, 但也可能涉及离子或配体作为细胞外链接剂 1。虽然具有根本的重要性, 但缺乏直接在活细胞的本地环境中探索这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的检测方法。许多方法要么需要细胞破坏 (例如生化检测, 如共同免疫沉淀6)、固定 (例如,一些超分辨率光学显微镜和细胞的电子显微镜)联系人 7), 或非特异性,例如,聚合/粘附检测8,9。为了解决这一问题, 在荧光共振能量传递 (fret)10或荧光互补11的基础上, 实现了荧光技术。然而, 为了在荧光体之间实现足够小的距离, 这些方法需要在蛋白质10的细胞外侧贴上荧光标签, 这可能会干扰反式相互作用。

在这里, 我们提出了一种替代荧光为基础的检测蛋白质相互作用在细胞接触。这种方法结合了荧光相关的方法 (扫描荧光相关光谱 (sfccs), 相关的数字和亮度 (ccn & amp; b)) 和混合细胞表达融合结构的蛋白质兴趣,例如,粘附受体。两个相互作用细胞中的研究受体被标记为两个光谱分离的荧光蛋白 (fp), 从细胞内侧 (见图 1a)。

所采用的方法是基于对荧光融合蛋白通过共聚焦激光扫描显微镜焦体积扩散运动引起的荧光波动的统计分析。更详细地说, 该分析探讨了在细胞细胞接触时两个相邻的 pm 中感兴趣的蛋白质的共同扩散。如果这些蛋白质经历反式相互作用, 这些反式复合物将携带荧光蛋白在两个光谱通道中发射, 从而导致两个发射体的相关荧光波动。另一方面, 如果没有结合发生, 面对 pm 的蛋白质数量波动将是独立的, 不会造成相关的波动。采集可以通过两种方式进行: 1) sfccs 基于跨细胞接触的线形扫描, 并在接触区域的位置有效地探测相互作用。通过荧光波动的时间分析, sfccs 还提供动力学信息,蛋白质复合物的扩散系数;2) ccn & amp; b 基于对在细胞接触区域获得的一系列图像的像素化分析。它有能力探测和绘制整个接触区域 (在一个焦平面上) 的相互作用, 但不提供动力学信息。这两种方法都可以与分子亮度的分析相结合,单个扩散蛋白质复合物在时间单位中发出的平均荧光信号, 从而提供蛋白质复合物的化学计量估计。细胞联系人。

在本文中, 我们提供了详细的协议样品制备, 仪器校准, 数据采集和分析, 以执行所提出的检测在商业共聚焦激光扫描显微镜。实验可以在任何配备光子计数或模拟探测器的仪器上进行, 也可以在高数值孔径的目标上进行。我们进一步讨论了协议的关键步骤, 并为导致人工制品事实信号波动的几个过程提供了校正方案,例如探测器噪声、光漂白或细胞运动。该检测最初是为探测粘附细胞之间的相互作用而开发的, 可针对悬浮细胞进行改性, 或适用于模型膜系统,例如巨大的单形囊泡 (guv) 或巨大的质膜囊泡 (gpmv), 从而允许定量的相互作用在不同的脂质环境或在没有一个有组织的细胞骨架12,13

扫描荧光相关光谱是荧光相关光谱14的一个修正版本, 是专门为探测脂膜15中的慢扩散动力学设计的。它是基于垂直于 pm 包含感兴趣的荧光蛋白的线扫描采集。为了探测两个不同标记的蛋白质物种的相互作用, 利用两条激光线和两个光谱分离荧光检测窗口, 在两个光谱通道中进行采集。由于 pm 中蛋白质的缓慢扩散动力学 (D≤~1 μm2/),可以通过将激发方案从一行到15号线交替来进行无交叉对话的测量。分析从: 1) 基于 ~ 1000 线的块平均的侧向细胞运动的对齐算法校正, 2) 用最大荧光信号确定位置, 即每个块中的 pm 位置和 3) 移位所有块到一个共同的起源12,15, 分别在每个通道。然后, 通过从所有对齐线 (中心±2.5) 之和的高斯拟合中选择中心区域来执行与 pm 相对应的像素的自动选择。信号在每条线路中的集成产生膜荧光时间序列f ( t) 在每个通道 (g = 绿色通道, r = 红色通道)。请注意, 像素大小必须足够小,例如, & lt;200 nm, 以重建点传播函数的形状并找到其中心, 对应于 pm 的位置。在存在大量光漂白的情况下, 每个通道中的荧光时间序列可以用双指数函数建模, 然后用以下公式进行校正:16

Equation 1.   (2)

需要注意的是, 与未校正的 f (t) 获得的参数估计相比, 该公式有效地纠正了从f (t)c相关分析中获得的振幅和扩散时间。然后, 计算荧光信号的自相关和互相关函数 (acfss/ccf):

Equation 2, (2)

Equation 3, (3)

其中f i = fi(t)- Image 1 fi (t)Image 2i = g, r。

然后将二维扩散模型安装到所有相关函数 (cfs) 上:

Equation 4.  (2)

在这里, n表示观察体积中荧光蛋白的数量, 每个通道 扩散时间。该模型考虑到在所述的实验设置中, 蛋白质在 pm 中的扩散发生在 x-z 平面上, 这与通常使用的荧光相关光谱 (fcs) 实验在膜探测上的配置形成了对比扩散在共聚焦体积17的 x-y 平面上。腰 w0和结构因子 s, 描述 z, s = w z /w w w w 0 中焦距体积的伸长率 w z, 是通过光谱相似染料和相同光学设置进行的点 fcs 校准测量得到的使用扩散系数d染料现有值:

Equation 5, (5)

其中,染料是染料分子的测量平均扩散时间, 是通过将三维扩散模型拟合到数据中获得的, 同时考虑到所有n分子中的一小部分t向具有时间常数的三胞胎状态:

Equation 6.  (5)

最后, 扩散系数 (d)、分子亮度值 () 和 sfccs 数据的相对相互关系计算如下:

Equation 7, (7)

Equation 8, (8)

Equation 9, (9)

其中g交叉(0) 是互相相关函数的振幅, 是 Equation 14 i 通道中自相关函数的振幅。

相对交叉相关的这一定义,在公式9中使用最大值而不是平均值, 考虑到在不同浓度下存在的两个蛋白质物种的最大配合物数量受到在一个较低的数量存在的物种。

交叉相关数字和亮度基于对图像堆栈中每个像素的荧光强度的时刻分析, 这些像素是在样品中的一个固定位置获得的, 通常由大约100-200 帧组成, 具有两个光谱通道 (g = 绿色通道, r = 红色通道)。从时间均值Image 1 iImage 2 i 和方差Equation 16 , 计算了每个像素和光谱通道 (i = g, r)18中的分子亮度i和数字n i:

Equation 10, (10)

Equation 11.(10)

需要注意的是, 给定的方程适用于真正的光子计数探测器的理想情况。对于模拟检测系统, 适用以下公式 1920:

Equation 12, (12)

Equation 13.  (13)

在这里, s 是检测到的光子和记录的数字计数之间的转换Equation 24因子, 是读出噪声和偏移量是指探测器的强度偏移。一般来说, 对于任何探测器类型, 这些数量都应根据测量探测器的方差作为稳定照明的强度函数进行校准 19,例如, 反光金属表面或干燥的染料溶液。偏移量可以通过测量没有激发光的样品的计数率来确定.通过对检测器关联Equation 25的方差与强度 (i) 图 (i) 进行线性回归, 可以Equation 24确定19:

Equation 14.  (14)

最后, 计算每个像素的互相关联亮度, 并将一般定义为21

Equation 15, (15)

交叉Equation 29方差Equation 30在哪里。

为了过滤长寿命波动, 所有 ccn & amp; b 计算都是在箱车过滤后进行的, 每个像素22独立执行。简单地说, ni i (i = g, r) 和bcc 是在滑动段中计算的,例如, 8-15 帧。这样得到的值可以进行平均, 以获得最终的像素号和亮度值。

肌细胞计量学分析
为了估计细胞接触中蛋白质配合物的化学计量, 可以分别分析 sfccs 或 ccn & amp; b 数据在每个光谱通道中的分子亮度。在 sfccs 中, 每个通道的每次测量都会获得一个亮度值。在 ccn & amp; b 中, 得到了与细胞接触相对应的所有像素的亮度直方图, 平均 (或中值) 可以作为测量的代表性亮度。通过对单体参考进行相同的分析, 可以对所有亮度值进行归一化, 直接获得检测到的蛋白质复合物的平均寡聚状态。在这一点上, 重要的是要纠正存在的非荧光 fp, 这可能会导致低估寡聚状态。这通常是通过使用单色 sfcs 或数字和亮度 (n & amp;b ) 测量同源参考蛋白23、24的亮度来实现的。

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Protocol

1. 样品制备: 细胞混合检测

注: 以下协议描述了粘附细胞的混合过程。对于悬浮培养的细胞, 可以对其进行修饰。

  1. 在转染前一天, 在6孔板上播种适当数量的细胞,例如 800 , 000 hek 293t 细胞 (用 neubauer 计数室计数)。该数字可以根据播种和转染之间的时间进行修改, 并根据其他细胞类型进行调整。要进行基本实验 (感兴趣的蛋白质和负对照), 准备至少4口井。在37°c 培养细胞, 5% co2 在 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 培养基中培养, 辅以胎牛血清 (10%) 和 l-谷氨酰胺 (1%)。
  2. 根据制造商的说明转染电池 (请参阅材料表)。
    1. 要进行基本实验, 在不同的井中转染感兴趣的蛋白质的质粒融合成 "绿色" (例如,单分子增强绿色荧光蛋白 (megfp), 或黄色荧光蛋白 (meyfp)) 或 "红色" (例如, mcherry,或 m基数) 荧光蛋白。
      注: 在此协议中, 我们专注于 aplp1-meyfpaplp1-mcard拨号 12, 以及相应的负控制,例如, myristyyleded-palmityleatedp (myr-棕榈-myyfp) 和-mcardl (myr-palm-md拨号)12。一般来说, 200 纳克-1 微克的质粒 dna 是足够的。高转染效率增加了找到接触中的 "红色" 和 "绿色" 细胞的机会。修改质粒和转染试剂的用量, 优化转染效率。关键:转染细胞时, 细胞融合应在70% 左右。如果细胞过度融合, 转染效率就会下降。如果细胞的融合程度不够, 转染和混合可能会引起压力, 防止许多细胞在混合后适当附着。
  3. 转染后进行细胞混合~4±2小时。
    1. 取出生长介质, 用1毫升 pbs 轻轻清洗每口井, 辅以 mL2 +和 ca2 +。然后, 删除 pbs。(严重)将 pbs 放在良好的边缘, 以防止在洗涤过程中脱离细胞。
    2. 在每口井上加入 ~ 50μl 乙二胺四乙酸 (edta) 溶液, 以促进细胞的分离。在37°c 下孵化 2分钟, 然后, 慢慢侧向晃动6井板, 将细胞分离。
      注: 某些细胞类型可能需要延长孵育时间。
    3. 在每口井中加入950μl 的生长介质, 并通过上下移液几次重新悬浮细胞, 从而将所有细胞从井底分离。(严重)通过目视检查重新挂起后是否没有大型单元格集合来确保单元格正确地重新挂起并相互分离。否则, 混合后将获得许多 "红色"-"红色" 或 "绿色"--接触。
    4. 将一口井 (感兴趣的蛋白质或负对照的蛋白质) 的细胞溶液转移到相应的井,"红色" (例如,转染的 aplp1-mcard开普) 到 "绿色" (例如, aplp1-meyfp 转染) 细胞。通过轻轻向上和向下移液几次混合。然后, 将混合细胞种在35毫米玻璃底盘上 (每道菜1毫升的混合细胞溶液, 加上1毫升的培养基), 并在37°c、5% co2下再培养一天的种子细胞。

Figure 1
图 1.细胞触点扫描荧光相关光谱和互相关数及亮度分析的实验工作流程和原理图表示.样品制备方案: 在转染后混合两个细胞群 (例如, aplp1) 融合在两个光谱不同的荧光蛋白 (mEYFP 和 m码 d纳尔) 中。在显微镜实验中选择了不同转染细胞的接触点。为避免干扰细胞外结合域, 荧光蛋白应融合到细胞内末端的感兴趣的蛋白质。(b) 扫描 fccs (sfccs) 测量在两个光谱通道 (通道1、绿色和通道2、红色) 中垂直于细胞触点。扫描线 (表示为 kymotor) 是对齐的, 膜像素是求和的。然后, 根据强度轨迹fi(t)计算了 acf 和 ccf。acf 以红色和绿色表示。ccf 以蓝色表示。(c) 交叉相关 n & amp; b (ccn & amp; b) 采集结果是三维 (x-时间) 图像堆栈。在细胞间触点周围选择 roi。然后计算每个细胞接触像素中的通道和互相关亮度 (1、2和 bcc) 值。然后将结果可视化为直方图, 将所有选定的像素集中起来。请点击这里查看此图的较大版本. 

2. 样品制备: 交叉相关实验的正控制和亮度分析的同源降维器构造

  1. 种子 600, 000 hek 293t 细胞, 计数与细胞计数房间, 在转染前一天35毫米玻璃底部盘。在 37°c, 5% co2 的完整 dmem 介质 (见步骤 1.1) 中培养细胞一天.
  2. 根据制造商的指示, 用 ~ 250 纳克的质粒 dna 转染细胞。对于正相关控制, 使用编码膜锚定荧光蛋白异二聚体的质粒,例如, myr 棕榈 cherry-megfp 或 myr-palm-cardnal-medynf-fp12对应于感兴趣的蛋白质的 fp。对于亮度校准, 使用编码膜锚定的 fp 单体和与融合在感兴趣的蛋白质的 fp 相对应的同质化体,例如, myr 棕榈-meg-yefp 和 myr 棕榈 ehim-myfp-myyfp 校准亮度分析aplp1-meyfp12
  3. 在37°c 下培养细胞, 在完整的 dmem 介质中培养5% 的 co2 (见步骤 1.1)。

3. 共聚焦激光扫描显微镜: 设置和焦距校准

注: 以下协议是为在本研究中使用的激光扫描共聚焦显微镜上使用 megfp/eyfp 和 mcherymd男男女女进行的实验编写的。光学设置、软件设置 (激光线、双色反射镜、过滤器) 和校准染料的选择可针对其他 flp 和显微镜设置进行修改。

  1. 在实验前至少一小时打开显微镜和激光, 以确保激光的稳定性和温度的平衡。
  2. 在水或 pbs 中制备10-200μl 适当的水溶性荧光染料溶液 (例如见《材料表》 ), 以校准焦点体积, 浓度在 10-50 nm 范围内。
  3. 将染料溶液放在 #1 0.5 的干净35毫米玻璃底盘上,厚度为 0.16-0.19 mm。
    注: 理想情况下, 使用具有低厚度公差的高性能盖板玻璃的盘式,例如0.170±0.005 mm, 允许最佳的环修正 (步骤 3.6)。使用与以后在以下实验中使用的相同类型的菜是很重要的。
  4. 将含有染料溶液的盘直接放在目标上 (最好是水浸, 带 na 1.2), 以确保聚焦到溶液中。或者, 将盘放在样品支架上, 并聚焦到样品中 (例如,在盘底上方 10-20μm)。
    注: 我们不建议使用油的目标, 因为在深入到水样时获得的信号较差。
  5. 设置激励和发射路径,例如,选择488纳米激光、488um/561 纳米二色镜、检测窗口 499-552 nm 和 1 airy 单元 (au) 的针孔尺寸。确保针孔尺寸与将用于互相相关测量的针孔尺寸相同。
  6. 调整针孔位置 (针孔调整) 和目标环, 以最大限度地提高计数率。为此, 转动衣领环, 直到检测到最大计数率。
    注: 衣领环校正考虑到所使用的盖板玻璃的具体厚度。最大限度地提高计数率,收集尽可能多的每个分子的光子, 对于最大限度地提高测量的信噪比 (snr) 至关重要。
  7. 在相同的激光功率下, 执行一系列的点 fcs 测量 (例如,在不同位置进行6次测量, 每次重复 10秒, 即2.5分钟的总停留时间,采样为1μs 的停留时间或更短)测量 (通常约 1%,~ 1-2 微米)。
  8. 拟合三维扩散模型, 包括对数据的三重贡献 (公式 6)。
    注: 通常情况下, 获得的扩散时间约为 30μs, 结构因子约为4-8。
  9. 根据公式 5, 根据所测量的平均扩散时间计算腰围 w0 , 并根据公式5计算所用染料在室温25下扩散系数的公布值。典型值为 200-250 nm。
  10. 如果需要, 使用不同的荧光染料对第二个检测通道重复校准例程 (步骤 3.4-3.9) (例如, 561 nm 激发和561纳米至 695 nm 之间的检测)。保持针孔的位置和大小, 因为它是为第一个检测通道设置的。
  11. 从校准测量中计算分子亮度 (公式 8), 并存储获得的值。
    注: 使用的设置的典型值为~ 8-10khz/分子 (mol) 为 1.8μw 488 nm 励磁功率。低于通常的值可能表示目标上的污垢、设置的不对齐或激光输出减少。使用功率计定期检查和存储目标的激光输出功率。对于不同设置的比较, 利用激发激光功率归一化的分子亮度是评估显微镜性能的最有意义的参数。

4. 扫描荧光交叉相关光谱: 获取

注: 以下协议是为在本研究中使用的激光扫描共聚焦显微镜上使用 megfp/eyfp ("绿色") 和 mchrrymdic设 ("红色") 进行的实验编写的。其他 fp 或显微镜设置的光学设置和软件设置 (激光线、双色反射镜、过滤器) 可能不同。

  1. 设置光学路径,例如 488 nm 和 561 nm 激发和 488m/561 纳米二色反射镜, 针孔上 1 au 488 nm 励磁。为了避免频谱交叉交谈, 选择两个独立的轨道来激发和检测 megfp/日元 (488 nm 激发, 绿色通道) 和 mEGFP/mEYFP (561 nm 励磁, 红色通道) 依次, 并选择开关轨道每条线路。对于检测, 对两个通道都使用适当的过滤器,例如绿色通道中的 499-552 nm 和红色通道的 570-695 nm。
  2. 如果不能进行交替激发, 请使用适当的红色通道滤镜设置, 以最大限度地减少光谱交叉对话 (检测不低于600纳米的 mcherry\ mcarl 荧光)。这可能会减少在红色通道中检测到的光子量, 从而降低信噪比。
  3. 将含有混合细胞的盘放在样品支架上。等待至少 10分钟, 以确保温度平衡, 并减少对焦漂移。
  4. 使用"定位"菜单中的传输光将焦点放在电池上。
  5. 搜索一对相互接触的 "红色" 和 "绿色" 单元格。对于正相关或同二聚体亮度控制 (见第2节), 搜索在两个通道中发出荧光的孤立细胞或在 pm 处的相应同二聚体信号。
    注: (关键)在搜索细胞时尽量减少样品暴露, 以避免预漂白, 这可能会降低相关性26。因此, 以最快的扫描速度和较低的激光功率进行扫描。为了避免探测器在成像强烈表达细胞时饱和, 请在积分模式下进行搜索。但是, 为了最大限度地减少曝光, 在光子计数模式下可以以较低的激光功率进行扫描。
  6. 使用 "裁剪" 按钮选择垂直于细胞触点 (或单个细胞的 pm, 用于正相关或同度亮度控制) 的扫描路径, 如图 1 b2 a所示。
    注: 某些较旧的显微镜不允许任意扫描方向。在这种情况下, 必须定位与扫描方向垂直的方向的细胞触点。
  7. 缩放以实现 50-200 nm 的像素大小, 然后在扫描模式下选择"线条"将帧大小设置为128x1 像素。
    注: 典型的像素大小为160纳米, 对应于大约20μm 的扫描长度。
  8. 扫描速度设置为允许的最大值,例如,每行44.2 微米。
    注: 对于备用激励方案, 这相当于904.45μs 扫描时间,所使用的设置上的 ~ 1000 扫描。扫描速度可以根据感兴趣的蛋白质的扩散系数进行调整。对于膜锚定蛋白, 典型的扩散时间约为10-20 毫秒, 扫描时间应至少小于扩散时间的十倍。较低的扫描速度可能会导致更强的光漂白, 并需要较低的照明能力。或者, 可以在每次扫描之间施加暂停 (例如, 5 毫秒), 以便使用"时间序列" 子菜单中的"间隔" 非常缓慢地扩散配合物。
  9. 选择合适的激光功率,例如, 488 nm ~ 1-2 微米, 561 纳米激发约5-10μw。
    注: 较高的激光功率可提高信噪比, 但可增加光漂白。因此, 应选择激光功率, 使光漂白小于初始计数率的50%。
  10. 周期设置为 100, 000-500, 000。
    注: 扫描的次数,测量的持续时间可能会有所不同: 较长的测量时间将提高信噪比, 并且可能更适合于缓慢扩散的分子, 但是, 细胞的运动和光漂白限制了最大的测量时间。这里提供的数据通常是为了大约 3-6,200, 000-40000 线扫描。
  11. 将探测器设置为光子计数模式。按"启动实验"开始获取。重复步骤 4.5-4.11 以测量另一个单元格。
    注: 建议在不同表达水平上测量每个样品的10-15 个细胞。(严重)避免在高表达水平下检测器饱和。最大计数速率不应超过 ~ 1 mhz。
  12. 如果进行亮度分析以确定寡聚状态, 则根据修改后的步骤4.1-4.11 进行同二聚体亮度校准测量: 分别测量每个荧光蛋白同型二聚体 (在分离细胞中, 使用(并仅在一个光谱通道中执行测量。

5. 扫描荧光交叉相关光谱: 数据分析

注: 以下议定书遵循了前第1215条详细说明的分析程序的实施。软件代码可根据作者的要求提供。

  1. 将原始数据 (例如, cqi) 文件导出到原始数据格式的 rgb tiff 图像中。此文件将包含一个最新图, 其中包含绿色和红色通道数据, 分别位于图像的 g 和 r 通道中。
  2. 使用适当的分析软件导入 tiff 文件, 然后继续进行分析。
    注: 以下步骤 (步骤 5.3-5.7) 分别应用于每个通道:
  3. 通过执行以500-1000 线的块执行分段或移动时间平均值来对齐线条。确定每个块中的膜位置,具有最大计数速率的像素位置。将所有方块移动到相同的侧向位置。此过程可纠正细胞接触的侧向位移,例如, 由于细胞运动。
  4. 总结沿时间轴的所有对齐线, 并使用高斯函数拟合平均强度分布。在存在显著的细胞内背景时, 使用高斯加 sigmoid 函数。将与膜相对应的像素定义为膜位置±2.5 范围内的所有像素, 并汇总每行中这些像素的强度, 为每个时间点 (每行扫描) 获得一个荧光信号值。
  5. 如果需要 (例如,背景和 gt;10 的膜信号), 通过从膜荧光中减去细胞质中的平均像素强度 2.5 (以像素单位为单位), 以1000线的块进行背景校正。选择背景像素时, 请避免使用明亮的细胞内泡。
  6. 如果观察到光漂白, 请应用漂白校正。因此, 将膜荧光时间序列与双指数函数相匹配, 并应用适当的修正公式公式公式公式1 16。
    注: 或者, 基于傅里叶频谱的校正方案可以应用27。(严重)如果存在光漂白但未对其进行校正, 则 cfs 可能会严重扭曲, 并且参数估计可能存在很强的偏差 (例如, 参见图 5e)。
  7. 根据公式2和3计算 acf 和 ccf,使用多tau 算法28。为了提高分析的可靠性并避免人工制品, 请对总测量的10-20 个相等段进行计算。检查每个段中的荧光时间序列和 cfs, 并去除明显扭曲的段 (参见图 4a-4d中的示例)。平均所有非扭曲段。
    注: 此过程可以自动执行, 以避免对数据29的主观偏差。对于非常不稳定的测量具有许多短段可能是有帮助的。但是, 段的长度应至少高于扩散时间的三个数量级, 以避免统计不足采样错误29、3017
  8. 拟合二维扩散模型, 公式 4, 到得到的 cfs。因此, 请将结构因子固定在校准测量中获得的值 (协议第3节)。利用从多个 tau 算法获得的每个数据点的统计权重执行加权拟合, 可以提高拟合的准确性。
  9. 根据公式 7, 使用校准的腰围计算扩散系数。
  10. 通过将每个通道中的平均荧光强度除以相应数量的粒子 (公式 8) 来计算分子亮度。在考虑到非荧光 fp 23 的情况下, 通过相应的单体参考的平均亮度来归一化每个通道中确定的亮度值, 以获得寡聚状态。为此, 通过单色分析确定平均同二聚体亮度值,以计算非荧光 fp 23 的分数。
  11. 根据公式9计算相对的相互关系。

6. 交叉相关数字和亮度: 检测器校准

注: 以下协议提供了有关如何校准检测系统的一般准则。此过程对于模拟检测系统是强制性的, 但在使用真正的光子计数探测器时并不是严格需要的。

  1. 在35毫米玻璃底盘上干燥适当的水溶性染料溶液 (例如见材料)。相应地设置光学路径,488 或 561 nm 激励和检测, 分别为 499-552 nm 或 570-695 nm。
    注: 或者, 可以使用反光金属表面, 而不是干燥的染料溶液, 将金属片直接放在目标的顶部。
  2. 在不同染料浓度或不同激光功率的区域进行单色 n & amp; b 测量。因此, 使用缩放可实现 300 nm 的像素大小,使用 "扫描速度" 设置适当的像素停留时间 (例如, 25μs), 并将"周期"设置为100至200帧。
  3. 将探测器设置为光子计数(如果使用模拟检测进行测量, 则为模拟模式), 然后按"开始实验"开始采集。在零励磁功率下进行测量, 以确定强度偏移。
  4. 绘制像素方差作为所有测量像素的像素强度函数, 并对这些数据进行线性拟合。确定 s 为线性拟合的斜率。根据方程 14, 使用 s 和确定的强度偏移来计算 y 截距的读出噪声。

7. 交叉相关数字和亮度: 获取

  1. 遵循 sfccs 采集协议的步骤4.1-4.4。
  2. 使用"裁剪"在单元格触点 (或用于同源二聚体亮度控制的隔离 pm) 周围选择512x128 像素的帧, 并使用 "缩放" 来实现 50-100 nm 的像素大小。
  3. 使用扫描速度设置适当的像素停留时间,例如, 6.3μs。
    注: 在 n & amp; b 中, 像素停留时间应远远小于感兴趣的蛋白质的扩散时间。如果选择了替代激发方案,例如,切换轨道每条线路, 则两个轨道之间的时间应小于感兴趣的蛋白质的扩散时间。否则, 可检测到的相互关联就会降低。
  4. 将周期设置为100-200 帧。
    注: 较高的帧数将提高信噪比, 但是, 单元格移动可能会限制总测量时间。每帧的扫描时间应远远高于感兴趣的蛋白质的扩散时间。否则, 表观亮度会降低,粒子似乎是不动的。对于非常缓慢地扩散配合物, 在使用时间序列子菜单中的"间隔"在帧之间施加暂停 (例如, 2秒)。
  5. 将激光功率设置为适当的值 (488 nm 的典型值为 ~ 1-2 微米, 561 nm 激发的典型值为 5-10μw)。
    注: 较高的激光功率可带来更高的亮度和更高的信噪比, 同时也增强了光漂白。激光功率应足够高, 以实现至少约 ~ 1 khz\ mol 的检测亮度, 但保持在足够低的水平, 以避免超过10-20 的光漂白。对于 megfp2 或 mcherrymd纳尔, 通常获得的光漂白不到10%。
  6. 将探测器设置为光子计数(如果通过模拟检测进行测量, 则为模拟模式)。按"启动实验"开始获取。
  7. 评估光子计数率。如果细胞接触像素中的计数速率超过 1 mhz, 请降低激光功率或选择表达水平较低的细胞。重复步骤 7.2-7.7。来测量下一对细胞。建议在不同表达水平的每个实验中测量10-15 个细胞。
  8. 如果进行亮度分析以量化低聚, 则根据修改后的步骤 7.1-7.7 进行同型二聚体亮度校准测量: 分别测量每个荧光蛋白同型二聚体 (在分离细胞中, 使用(并仅在一个光谱通道中执行测量。

8. 互相关数字和亮度: 数据分析

请注意:下面的协议遵循前面描述的分析过程1231。根据要求, 作者可以提供软件代码。

  1. 导入原始数据 (例如,可以使用 bio格式32 包导入 csi文件)。平均所有帧, 并选择细胞单元接触周围感兴趣的区域 (roi)。
  2. 执行图像对齐算法33,例如,通过在后续帧中最大限度地利用 roi 之间的空间相关性, 用于任意横向平移, 在两个通道上均值。此过程将纠正细胞的横向运动。
  3. 应用箱车滤清器22 , 以减少外部长寿命波动,例如, 残留细胞运动或背景漂白。或者, 也可以采用去趋势法来纠正光漂白34
    注: 如果不应用分段分析或去趋势分析, 则表观亮度可能会在很大程度上被高估。
    1. 定义滑动段,例如 8到15帧 (例如,帧1到8、2到9等), 并根据每个段中的10、11和15像素计算通道和相关亮度值。如果探测器不是真正的光子计数探测器, 在计算亮度时, 请考虑校准的探测器参数,使用公式12和13。
      注: 计算8到15帧段的亮度值会导致对绝对亮度的低估为 10-20, 对粒子数的估计为10-20。然而, 亮度比 (例如,二聚体和单体亮度) 不受影响, 只要段长度在整个分析过程中保持不变 (未显示数据)。给定段长度的统计误差可以通过模拟来确定, 从而得到纠正。
    2. 在所有段上以像素为位的平均值。在此步骤中, 可以从平均值中删除最高和最低的5% 段亮度值, 也可以排除在强度上显示明显失真的段,例如,由于细胞内囊泡或聚集在这些部分中存在瞬态。像素。
  4. 绘制像素亮度值作为像素强度的函数, 并选择与细胞接触相对应的像素填充。背景像素的强度值非常低。此时, 重新评估最大计数速率。排除计数速率高于 1 mhz 的像素, 以防止堆积效应。
  5. 创建选定细胞接触像素的通道和相关亮度直方图, 并获得 roi 平均亮度值。在考虑到非荧光 fp23 的情况下, 通过相应的单体参考的平均亮度归一化平均通道亮度值, 以获得寡聚状态。因此, 通过单色分析确定平均同二聚体亮度值, 以计算非荧光 fp23的分数。
  6. 如图所示, 绘制通道和互相关亮度图。

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Representative Results

蛋白质-蛋白质相互作用试验的第一次测试,混合表达光谱不同荧光蛋白的细胞, 然后进行 sfcccc/ccn & amp; b 测量 (图 1), 应在预计不会进行的蛋白质上进行。在细胞接触时相互作用 (负对照)。因此, hek 293t 细胞表达了肌动板-棕榈列-老年肌 (myr-palm-myfp) 或-md拨号 fl (myr-palm-meyfp), 并在细胞接触中进行了 sfccs (图 2a)。在理想情况下, 由于 pm 中蛋白质的扩散运动和焦点体积中蛋白质数量的统计变化, 每个通道中的荧光信号应该围绕一个稳定的平均值波动。对于不相互作用的蛋白质, 两个通道的波动是相互独立的, 因此, 光谱相互关系预计将在零左右波动。实际上, 在典型的测量中观察到了接近零的相对相关性 (图 2c)。acf 显示出 ~ 10-20 毫秒的特征衰变时间 (平均相当于 dmyr棕榈 = 1.3 ±0.3μm 2/(平均值±sd, n = 20个细胞)), 如预期的那样, 在 pm 中扩散 myr棕榈-mym-my-fp 和-md归门红,例如, d-my-pallk。= 0.88±0.11μm2/(均值±sem), 基于光漂白 (frap) 实验35后的荧光恢复。值得注意的是, 这些相当缓慢的动力学允许使用交替激励方案,只在绿色和红色激励之间切换, 并检测每条线路, 导致两个通道中的信号之间的延迟约0.5 毫秒, 但抑制光谱交叉交谈。平均而言, 如预期的那样, 负对照 (图 3 e) 的平均平均相关性为 0.08±0.10 (平均值±sd,n= 17个细胞)。

接下来, 采用正相关控制来校准光学设置中可能的最大相关。因此, 膜锚定异质分子没药-mcardinal-myfp 在 hek 293t 细胞中表达, 并在单个细胞上进行 sfccs 测量 (图 2b)。得到的 cf 具有正振幅, 衰变时间与 acf 相似, 再次 ~ 10-20 ms (图 2d)。平均而言, 测量了正极对照 0.96±0.18 (平均值±sd, n = 14个细胞) 的相对相关 (图 3e)。

Figure 2
图 2.扫描荧光相关光谱分析控制测量。(a) 混合 hek 293t 细胞的代表性图像, 表达没药-棕榈-yfpn-mcardl 作为反式相互作用的负控制。黄色箭头指示 sfccs 扫描路径。刻度条是 5μm. (b) hek293t 细胞的代表性图像, 表达没药棕榈树-mcardi-medynf 异质体 (左: 绿色通道, 右: 红色通道) 为正交叉相关控制。黄色箭头指示 sfccs 扫描路径。刻度条为 5μm. (c) 代表 cfs (绿色: 绿色通道 (mEYFP) 中的 acf), 红色: 红色通道中的 acf (m基数), 蓝色: ccf) 在用于负控制的 sFCCS 测量中获得。实线显示二维扩散模型拟合到 cfs. (d) 代表 cfs (绿色: acf 在绿色通道 (meyfp), 红色: acf 在红色通道 (m民防 ar), 蓝色: ccf) 获得的 sFCCS 测量的正控制。实线显示了二维扩散模型与 cfs 的拟合. 请点击这里查看此图的较大版本.

然后, 通过探索淀粉样癌前吸附蛋白 (aplp1) 的反式相互作用, 研究了这种检测方法在生物相关环境中的适用性, 这是一种 i 型跨膜蛋白, 被提议作为神经元粘附受体。为此, aplp1 融合在 hek 293t 细胞中, 与 mEYFP 或 m基数融合。为了排除对细胞外结合域的干扰, fp 被融合到 aplp1 的 c-末端,在细胞内域 (见图 1a)。然后, 对 aplp1-meyfp 和 aplp1-mcardl 表达细胞 (图 3a) 之间的细胞触点进行了 sfccs 测量, 结果产生了 acf 和 cf (图 3c), 提供了有关 aplp1 扩散的信息和互动。观察到 0.45±0.21 (平均值±sdd, n = 17个细胞) 的正相对相关性,一个值明显大于负对照的值 (图 3e)。有趣的是, 平均相对相关性低于正对照 (图 3e), 仅显示部分反式绑定。

最后, 利用该方法表明锌离子有利于增强 aplp1反式结合12,31。通过细胞接触点的 aplp1 簇测量得到的 sfccs cfs (其特点是 aplp1-meyfp 和 aplp1-mcardar 具有强的协同定位, 并在锌离子存在下迅速形成,图 3b)表现出强烈的结果。减少的动力学, 从大衰变时间和大滞后时的振荡可以明显看出 (图 3d)。然而, 对短滞后时间振幅的分析显示, 相对相关性显著增加到0.8 ±0.3 (平均值±sd, n = 17个细胞),约80% 的校准最大值 (图 3e)。由于在有限测量时间内可以检测到的扩散事件数量有限, 因此这种缓慢的动力学会导致相关曲线的严重扭曲 (见图 3d), 从而导致所谓的粒子噪音30。为了准确量化, 最大滞后时间应至少比扩散时间高出3个数量级 (详见先前的评论 3017 )。

进一步分析了 sfccs aplp1 数据的分子亮度, 利用 myr-棕榈阴性对照作为每个通道的单体参考, 并纠正了非荧光蛋白23的含量.在锌离子的加入下, 分子亮度从小低聚物 (~ 二聚体) 显著增加到由每个细胞约10-50 单体组成的较大的多聚体 (图 3f)。因此, 平均而言, 在细胞结合部的整个蛋白质簇中, 平均存在多达 100个 aplp1 单体。

Figure 3
图 3.扫描荧光相关光谱测量细胞触点的 aplp1 相互作用.(A B)hek 293t 细胞在 (a) 和锌离子处理后 30分钟 (b, 不同细胞) 前表达 aplp1-meyfp (绿色)/aplp1-mcard纳尔 (红色) 的代表性图像。黄色箭头指示 sfccs 扫描路径。标度条为 5μm. (c, d) 代表性 cfs (绿色: 绿色通道中的 acf (mEYFP))、红色: 红色通道中的 acf (m基数)、蓝色: 用于 (c) aplp1 的 sFCCS 测量中获得的 aplp1 (c) 离子处理前和 (d)锌离子处理。实线显示了二维扩散模型与 cfs 的拟合. (e) 从负控制 ("负") 的 sfccs 分析、在锌离子的存在和存在下的 aplp1 和正相关的相对相互相关的框图, 以及正相关图。互相关联控制 ("正")。图显示中值和晶须范围从最小值到最大值不等。(f) 在没有锌离子的情况下, 从细胞接触器的 sfccs 分析中得到的绿色通道中归一化分子亮度的箱图 (meyfp)。根据在 hek 293t 细胞中表达的 myr-palm-myfp-myfp 同源二聚体的 sfcs 测量, 修正了非荧光 meyfp 的亮度值, 在相同条件测量了23。图显示中值和晶须范围从最小值到最大值不等。请点击这里查看此图的较大版本.

迄今显示的所有测量都因细胞中发生的额外的虚假波动而得到纠正, 如果不加以考虑, 将使 sfccs 分析具有挑战性。例如, 对于负控制, 如果不应用校正方案, 这些可能会导致假正相互关系。可能严重扭曲 cfs 的两个主要过程是: 1) 由于细胞内囊泡瞬时进入焦体积或膜动力学缓慢而导致的荧光信号不稳定,例如, z 方向漂移, 和 2)光。为了识别瞬态不稳定性, 建议将完整测量划分为10-20 个大小相等的段, 并直观地检查每个段中的强度时间序列和 cfs。图 4说明了此过程, 其中给出了在分析负控制测量时获得的明显扭曲段的示例。瞬态不稳定性 (图 4a, 段1和2的强度跟踪) 可能会导致 ccf 具有负值 (4 b, 段 1) 或高假阳性相关性 (图 4b,段 2)。通常, 这种不稳定性在强度序列中可以看到慢速信号变化 (图 4a)。相应的 cfs 通常强烈偏离大多数段的 cfs,显示, 例如,在 ~ 第二个刻度上, 振幅较高, 衰变时间要慢得多 (见图 4b-4d).建议从分析中删除这些片段, 并通过平均所有非扭曲段 (cfs 不偏离大多数 cfs 的段) 来计算最终的 cfs。接口 (1) 反复检查段, 2) 从平均值中删除明显扭曲的段, 3) 检查剩余段的 cfs 与未删除的段的更新平均 cfs。通过应用此过程, 部分扭曲的长测量 (图 5a), 显示缓慢衰减 (损坏) cfs (图 5b) 被成功地纠正, 有意义的相关曲线被修正(图 5c)。一般情况下, 此校正过程可以自动化29, 避免用户的目视检查, 这可能容易产生主观偏差。与基于强度的过滤方法相比, 36 在这种方法中, 测量的小箱是根据其强度与完整测量的平均强度进行比较的, 如果超过阈值参数, 则将其删除, 所述过程不依赖于外部参数, 并且对次要的不稳定性也很敏感。

为了补偿光漂白, 采用了所描述的数学校正公式1。通常情况下 , 光漂白可以通过荧光信号的指数衰减来识别 (图 5d) , 控制 cfs , cfs 显示在 ~ 最小尺度上的假阳叉相关和衰变时间 ( 参见典型的曲线形状 )图5e)。校正过程恢复了未变形的 cfs (图 5f)。如前所述, 单个测量中的类似强度变化也可能是由 pm 运动引起的,例如 z漂移或大型缓慢移动的结构。然而, 如果在所有测量中出现类似的指数衰变, 光漂白将是最有可能的来源。一般情况下, 校正方案可以结合起来,例如强度滤波、基于 cf 的滤波和进一步的方法, 如基于傅里叶变换的频率空间中慢速信号变化的滤波。

Figure 4
图 4.扫描荧光相关光谱测量负相关控制的分段分析.(a) 两个不同时间段的绿色 (f1) 和红色通道 (f2) 的荧光强度 (每个测量在20个段中分析, 每个时间段都有 20秒), 通过负控制的 sFCCS 测量得到。(b) 20个段中每个部分的国家合作框架。第1段和第2段的国家合作框架分别以红色和橙色突出显示。(C, D)绿色 (c) 和红色 (d) 通道中的每个段的 acf。段1和2的 acf 分别以红色和橙色突出显示。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.细胞触点扫描荧光相关光谱测量中的扰动, 以负相关控制为例.(a) 绿色 (f1) 和红色通道 (f2) 的样本测量的全荧光时间序列。实线红线表示每个通道中时间序列的双指数拟合。(B C)cfs (绿色: 绿色通道中的 acf, 红色: 红色通道中的 acf, 蓝色: ccf) 显示在 a 中的荧光时间序列, 由 (b) 将整个测量关联或 (c) 将20个段分别关联并平均扭曲最少cfs ~ 80% (绿色通道) 和 ~ 50% (红色通道) 段。实线表示二维扩散模型与数据的拟合。(d) 全荧光时间序列和双指数拟合 (实线红线) 测量, 其特征是绿色 (f1) 和红色通道 (f2) 的大量漂白。()cfs (绿色: 绿色通道中的 acf, 红色: 红色通道中的 acf, 蓝色: ccf) 显示在 d 中的荧光时间序列, 计算由 (e) 关联整个测量或 (f) 应用漂白校正, 公式 1, 关联20段的平均平均扭曲最小的 cfs 约 90% (两个通道) 的段。实线表示二维扩散模型与数据的拟合。请点击这里查看此图的较大版本.

作为 sfccs 的一种互补方法, ccn & amp; b (图 1c) 可用于检测细胞混合后的蛋白质-蛋白质相互作用。与 sfccs 不同的是, ccn & amp; b 不提供有关蛋白质动力学的信息, 但允许在一个焦平面上测量整个细胞细胞接触的反式相互作用。用 50μm zncl2处理前后对 aplp1 样品以及负没药控制进行了测量。这些测量对细胞运动非常敏感, 特别是对于经过锌离子处理的样品, 需要较长的采集时间, 以考虑 aplp1 簇的缓慢动力学。因此, 实现了图像对齐算法, 以纠正细胞33的横向运动。此外, 还采用了箱车滤波器 22 (8 帧箱尺寸, ~ 5秒) 来消除测量信号的低频波动。此过程与 n & amp; b 分析中使用的其他筛选器非常相似, 这些筛选器涉及局部平均37或去趋势18, 34, 但保留原始数据不变, 即像素是独立处理的, 并且没有信号的平均或减法。此过程有效地抑制长寿命波动的时间尺度比盒子大小 22更长。在这种数据分析之后, 通过将所有细胞接触像素集中在一个互相关联的亮度直方图中, 对所有样本的相关亮度值进行比较。对于在没有锌离子的情况下的 aplp1 (图 6a6A), 观察到平均 bcc为 0.688±0.004 (平均±sem, n = 18个细胞)。锌离子添加后 (图 6b6e), bcc值增加到 0.266±0.006 (平均值±sem, n = 19个细胞)。对于负控制 (图 6c6f), 检测到较低的平均相关亮度 (bcc = 0.022±0.002, 平均±sem, n = 26个单元格)。为了估计细胞接触下 aplp1 复合物的化学计量, 利用没药-meyfp 的平均值对 aplp1-myfp 进行了归一化, 并对非荧光的含量进行了校正蛋白质23。与 sfccs 数据一致, 在没有锌离子的情况下, 亮度分布围绕一个与二聚体相对应的值 (图 6g), 表明平均为2:2 的化学计量。锌离子处理后, 归一化亮度强烈转移到较大的值, 范围从 ~ 10 到 ~ 60 (图 6h),至少10:10 或更大的化学特征, 也与 sFCCS 数据吻合良好。

Figure 6
图 6.细胞触点上 aplp1 相互作用的相互相关的数量和亮度测量.(A-C)aplp1-meyfp 和 aplp1-mcardl 之间的细胞触点的代表性 ccn & amp; b 图像帧, 表示 hek 293t 细胞没有 (a), 并与锌离子 (b) 或没棕榈率-meifp 和 myr-palm-mEYFP 表示细胞为阴性互相关联控制 (c)。刻度条是5微米 (d-f) 间相关亮度 (bcc) 直方图的所有被检测的像素和细胞的 ccn & amp; b 分析获得的细胞细胞接触在 aplp1 样品 (d), 锌处理的 aplp1 样品 (e) 和含有 myr 棕榈和 myr 棕榈 (f) 的样品。(G, H)从相同细胞的亮度分析和用于计算 b cc 的 roi 中获得的绿色通道 (meyfp) 的 aplp1 样品 (g: 无锌离子, h:离子) 的归一亮度直方图。g 中的插入显示在-2 到10的归一化亮度范围内的放大倍率。根据在 hek 293t 细胞中表达的没药-棕榈-meyfp-myfp 同源二聚体的 n & amp; b 测量, 纠正了非荧光 meyfp 的亮度值, 在相同条件下测量23。请点击这里查看此图的较大版本.

为了进行 ccn & amp; b 分析, 应对探测器进行仔细的校准。对于本研究中使用的实验设置, 当在固定样本中分析分子亮度 (即在没有数字波动的情况下) 时, 这种校准的必要性变得很明显。在这种情况下, 根据公式 10, 分子亮度预计为零, 因为方差只能来自探测器噪声。但是, 当分析仅包含 (不移动) 背景像素的 roi (图 7 a 和7b) 时, 确定了 ~ 0.1 cts./(mol x 停留时间) 的正亮度。获得了一个类似的值, 对 hek 293t 细胞进行了 n & amp; b 测量, 这些细胞表示具有不同激光功率的糖基磷脂酰肌醇-樱桃 (gpi-mcherry,图 7c), 并将测量到的分子亮度推断为零激光功率。为了纠正这种情况, 我们对探测器进行了系统的校准, 如以前报告的那样 (见公式 12)19,20。因此, 我们测量了由干荧光染料溶液组成的样品上的检测器计数率的方差, 并确定了参数 s Equation 24和暗计数率偏移量。后者是通过测量激光功率为零的强度获得的, 在我们的情况下, 可以忽略不计。根据方程 14, 我们根据方差图与强度图的线性拟合, 确定了 s = 1.1 的斜率和可忽略不计的读出噪声。然后, 根据公式12和Equation 24 13 19 正确计算分子亮度和数字, 使用确定的值 (s = 1.1, = 0,偏移量 = 0)。或者, 可以应用更多的经验校正方案, 基于这样一个事实,一个超级位方探测器噪声, 即比 poissonian 的镜头噪声大 ~ 10% 的噪声, 也可以解释一个正分子亮度的观察无数字波动的像素。使用此假设, 此类像素中的确定亮度为 ~ 0.1 cts.//(mol x 停留时间) 可被视为恒定亮度偏移, 因此应从用公式10计算的所有亮度值中减去。最重要的是, 在计算亮度比时, 两种描述的方法都会导致相同Equation 24的结果, 只要偏移量可以忽略不计。值得一提的是, 在同一类型的不同显微镜 (同一供应商、同一型号、光子计数模式下的 gaasp 探测器) 中观察到了不同的 s 值, 这突出表明每个设置都需要仔细校准探测器。

影响探测器亮度测量性能的另一个重要参数是检测器的死机时间。正如前面所显示的, 探测器的死机时间可以大大降低检测到的分子亮度, 即使在中等计数速率 (超过 102-103 khz) 38。为了避免这种人工制品, 测量应以更低的计数速率进行, 或者应根据在稀释序列中执行 n & amp; b 或 fcs (例如,缓冲溶液中的 egfp) 中的测量来校准死机时间。然后, 测量的计数率可以使用校准的死时间38进行校正。对于本研究中使用的设置, 在稀释染料溶液中使用 n & amp; b 进行的这种校准显示出稳定的分子亮度值, 计数率为 ~ 0.5 mhz, 相应的死时间为 ~ 6 ns (图 7e)。因此, 可以使用先前公布的修正公式38纠正较高计数速率下的下降, 从而使恒定亮度值达到 ~ 8 khz函 mol。

Figure 7
图 7.用于数字和亮度分析的检测器校准.(a) 来自 hek 293t 细胞的 n & amp; b 测量的代表性图像, 表达了 GPI-mCherry。在背景中选择了 roi (蓝色虚线矩形)。(b) 与a中显示的 roi 相对应的所有像素的像素的像素亮度直方图。将像素亮度直方图与高斯函数拟合得到的平均像素亮度为 ~ 0.1 cts./(mol x 停留时间)。数据是在25μs 像素停留时间内获得的。(c) 通过对在 hek 293t 细胞中表达的 gpi-mcherry 的 n & amp; b 分析得到的分子亮度, 在三种不同的激光功率下测量 (每个6个细胞, 561 纳米激发, 25μs 像素停留时间)。数据显示为平均值±sd。线性回归 (红线) 提供 0.11±0.02 cts./(mol x 停留时间) 的偏移值。(d) 从荧光染料 (在 561 nm 激发的) 的干溶液的 n & amp; b 测量中绘制像素方差作为像素强度的函数, 从样品不同区域的多个测量的所有像素汇集而成。实线红线显示数据的线性拟合, 结果斜率为 1.1, 提供了检测器校准的 s 因子。(e) 分子亮度作为探测器计数率的函数, 从对稀释荧光体溶液的 n & amp; b 测量中获得 (在488纳米时激发)。使用不同的可能值对探测器死机时间应用了先前发布的校正方案38请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

通过这里描述的实验过程, 可以利用荧光波动光谱技术, 即 sfccs 和 ccn & amp; b, 研究细胞接触中的蛋白质-蛋白质-蛋白质反相互作用。这些方法包括对两个光谱分离的 fp 在两个相邻细胞的接触下融合到感兴趣的蛋白质中发出的荧光波动进行统计分析, 每个细胞表达一个或另一个融合蛋白。反式复合物的存在是通过探索蛋白质在相邻的 pm 中的共扩散程度来量化的。除了关于样品制备、数据采集和分析的详细协议外, 本文还为该方法在神经元粘附蛋白 aplp1 上的成功应用提供了实验依据。我们表明, aplp1 在细胞接触中经历了特定的、同型的反式相互作用。此外, 锌离子促进在细胞接触处形成 aplp1 簇, 为反式相互作用提供多价平台, 从而诱导增强的反式结合。

与以前基于破坏性生化方法6检测此类相互作用的检测方法不同, 所提出的方法可以直接在活细胞上进行, 无需固定或分离蛋白质复合物。此外, 它提供分子特异性和信息, 通过检测荧光蛋白基因融合到感兴趣的蛋白质, 而不是以前的定性检测8,9。不同于其他基于荧光的方法, 如 fret10和荧光互补11, 没有要求荧光标签被本地化在细胞外侧 (有可能干扰蛋白-蛋白质相互作用)。然而, 必须指出的是, c 末端 fp 仍可能改变与细胞内成分的结合,例如,调节与细胞骨架相互作用的适配器蛋白。值得注意的是, 该检测方法适用于同型和异型相互作用。

对所提出的分析成功应用的一些要求值得一提。所采用的荧光波动方法基于需要明亮和光稳定单体 fp时间测量, 这是许多红色 fp23 的主要约束因素。尽管所提出的扫描方案特别适合于研究通常参与细胞相互作用的跨膜蛋白的缓慢动力学, 但残留的光漂白仍有可能发生。因此, 我们提出了一个详细的修正方案,一个漂白校正的 sfccs 和箱车过滤器的 ccn & amp; b, 最大限度地减少这种扰动。此外, 我们还讨论了有效纠正其他系统扰动 (如细胞横向运动) 的数值对齐算法, 并提供了消除瞬态不稳定性的指南。这种不稳定的一个主要来源是水泡运输,细胞内的囊泡携带的蛋白质感兴趣的, 短暂地进入焦点体积。虽然情况因案而异, 但这种现象一般会严重干扰数据的采集和分析。然而, 校正算法的应用提高了采集的稳定性, 允许延长测量时间, 以探测特别缓慢的扩散动力学。在这方面, 必须强调, 扩散动力学的存在是该方法发挥作用的必要条件。锌离子介导的 aplp1 聚类分析的例子显示了一个非常缓慢的大型蛋白质复合物 (d 0.001μm 2/) 的例子, 这些复合物将技术推向极限, 并由于大噪声而阻止对潜在动力学进行准确的量化由有限的获取时间30,17

在这方面, 最近在结合 sfcs 和超分辨率方法方面取得的进展,例如扫描刺激的排放耗尽 fcs (sted-fcs), 可能是有益的, 因为它提供的焦点体积较小, 因此有效扩散次数较小, 因此效果扩散次数较小。 ,40。这也有助于解决蛋白质簇的情况下, 在不均匀定位的情况下, 感兴趣的蛋白质在细胞接触, 如在锌存在的 aplp1 观察到。遗憾的是, 扫描 sted-fcs (sted-fcs) 的跨相关实现, 可以直接应用于这里, 由于难以找到适用于双色 sted-fcs 的染料, 目前还没有成功地证明。在动态足够快的情况下 (d≥~ 0.05μm2 2/), sfccs 分析可以量化蛋白质在细胞接触点或 pm12其他区域的扩散.

此外, 还可以对所有数据 (sfccs 和 ccn & amp; b) 进行亮度分析, 从而估计反式蛋白质复合物的化学计量。应该提到的是, 化学计量定量的准确性随着反式中结合的蛋白质的数量而增加 (即,如果只有少量的 cis复合物, 也可能影响亮度的测定)。亮度分析不允许解决不同寡聚状态的混合物,例如, 顺式单体和式四聚体。更广泛地说, 应该注意的是, n & amp; b 不能解决不同的低聚物种的混合物均匀分布在样品中。如果一个像素内存在多个物种, 则将测量一个亮度值 (每个寡聚物种亮度的加权平均值)。观测到的亮度值的统计分布 (例如,在不同的像素内) 并不直接与寡聚物种的相对数量有关。为解决这类混合物, 应采用其他方法 (例如,空间强度分布分析 (spida)41, 光子计数直方图 (pch)42)。同样, sfccs 中光谱相互关系的量化仅为简单的已知化学特征 (例如 1:1 ) 提供了约束和未结合蛋白质分数的准确量化。对于更复杂的化学计量, 必须做出进一步的假设 43.总体而言, 亮度分析仍然是一个强大的实验工具, 如果探测器系统和非荧光 fp 的分数被校准 23, 如协议中所述。

虽然这里介绍的应用集中在粘附细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用上, 但该检测方法可应用于更广泛的样品,例如悬浮液细胞。对于这样的系统, 矫正侧向细胞运动可能特别关键。此外, 它还可以很容易地应用于模型膜系统, 如 guv 或 gpmv, 允许在控制良好的条件下量化分子相互作用,例如,不同的脂质成分或缺乏组织的膜细胞 骨架。当在这种囊泡上执行 sfccs 时, 垂直运动可能会导致额外的信号波动, 但当聚焦在大囊泡时, 可以最小化。在这种情况下, 多种组合很有希望,例如guv-/gpmv 细胞混合12。正如最近的一份出版物所显示的, 免疫突触的形成可以通过这样的系统成功地建模44。因此, 所提出的分析将是有益的研究的大量不同的细胞细胞相互作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

这项工作得到了德国基金254850309的部分支持。作者感谢马德伦·卢克纳对手稿的批判性解读。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

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References

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