Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Biochemistry

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Summary

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

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Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

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Abstract

Una variedad de procesos biológicos implica las interacciones célula-célula, generalmente mediadas por las proteínas que interactúan en la interfaz entre células vecinas. De interés, sólo algunos ensayos son capaces de sondear específicamente tales interacciones directamente en las células vivas. Aquí, presentamos un ensayo para medir la Unión de las proteínas expresadas en las superficies de las células vecinas, en los contactos célula-célula. Este análisis consisten de dos pasos: mezcla de células que expresan las proteínas de interés unida a diversas proteínas fluorescentes, seguido por las medidas de espectroscopia de fluorescencia fluctuación en los contactos de la célula usando un láser confocal de barrido microscopio. Demostramos la factibilidad de este ensayo en un contexto biológico pertinente mediante la medición de las interacciones de la proteína amiloidea del precursor-como 1 (APLP1) a través de las ensambladuras de la célula. Ofrecemos protocolos detallados en la adquisición de datos usando técnicas basadas en fluorescencia (análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia, número de la correlación cruzada y análisis de brillo) y las calibraciones del instrumento requerido. Además, discutimos los pasos críticos en el análisis de datos y cómo identificar y corregir las variaciones de la señal externa, falsas, tales como debido al movimiento de fotoblanqueo o celular.

En general, el análisis presentado es aplicable a cualquier homo - o heterotípicos proteínas interacción en los contactos de la célula, las células de las misma o diferentes tipos y pueden implementarse en un comercial láser confocal de barrido microscopio. Un requisito importante es la estabilidad del sistema, que debe ser suficiente para sondear la dinámica de difusión de las proteínas de interés durante varios minutos.

Introduction

Muchos procesos biológicos ocurren en los sitios de las interacciones célula-célula, por ejemplo, célula adhesión1,2,3, célula fusion4 y reconocimiento celular5. Estos eventos son particularmente importantes durante el desarrollo de los organismos multicelulares y para la comunicación de la célula, por ejemplo, durante la respuesta inmune. Estos procesos son típicamente mediados por las proteínas que se localizan en la superficie, es decir, en la membrana plasmática (PM) de los vecinos de las células y sufren interacciones en el contacto de la célula que son precisamente regulado en espacio y tiempo. En muchos casos, estas interacciones son directo homo - o heterotípicos proteínas trans interacciones, pero pueden también implicar iones o ligandos actuando como enlazadores extracelulares1. Aunque de fundamental importancia, hay una falta de análisis de sondeo estas interacciones proteína-proteína específica directamente en el ambiente natural de las células vivas. Muchos métodos requieren o interrupción de la célula (por ejemplo, ensayos bioquímicos tales como co-inmunoprecipitación6), fijación (por ejemplo, algunas de las técnicas de súper-resolución de microscopía óptica y microscopia electrónica de la célula contacto con7), o son no específicos, por ejemplo, la agregación / ensayos de adherencia8,9. Para resolver este problema, se han implementado técnicas de fluorescencia basada en fluorescencia de resonancia energética transferencia (traste)10 o fluorescencia complementación11. Sin embargo, para lograr distancias suficientemente pequeñas entre fluoróforos, estos métodos requieren etiquetas fluorescentes en el lado extracelular de las proteínas10, potencialmente interferir con las interacciones trans .

Aquí, presentamos un ensayo alternativo basado en la fluorescencia para las interacciones proteína-proteína en los contactos célula-célula. Este enfoque combina enfoques de cross-correlación de fluorescencia (análisis espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (sFCCS), número de la correlación cruzada y brillo (ccN & B)) y la mezcla de células que expresan un concepto de fusión de la proteína de interés, por ejemplo, un receptor de adhesión. Los receptores investigados en las dos células interactuantes están marcados con dos proteínas fluorescentes separadas espectralmente (FPs), desde el intracelular lado (ver figura 1A).

Los métodos empleados se basan en el análisis estadístico de las fluctuaciones de la fluorescencia inducida por el movimiento difusivo de las proteínas fluorescentes de fusión a través del volumen focal de un láser confocal de barrido microscopio. Más detalladamente, el análisis de sondas la difusión conjunta de las proteínas de interés en ambos vecinos PMs en los contactos célula-célula. Si las proteínas se someten a las interacciones trans , estos complejos trans llevará a proteínas fluorescentes emiten en dos canales espectrales, causando fluorescencia correlacionada fluctuaciones de ambos emisores. Por otro lado, si se produce no vinculante, las fluctuaciones del número de proteínas frente a PMs será independientes, no causando fluctuaciones correlacionadas. La adquisición puede realizarse de dos maneras: 1) sFCCS se basa en un análisis en forma de línea a través del contacto célula-célula y efectiva puntas de prueba de las interacciones en un lugar situado en la región de contacto. A través de un análisis temporal de las fluctuaciones de la fluorescencia, sFCCS proporciona también información dinámica, es decir, los coeficientes de difusión de complejos de proteína; 2) ccN & B se basa en un análisis pixel-wise de una secuencia de imágenes adquiridas en las regiones de contacto célula-célula. Tiene capacidad para sondear y mapa interacciones a lo largo de toda la región (en un plano focal) de contacto, pero no proporciona información sobre la dinámica. Ambos métodos pueden combinarse con un análisis de la luminosidad molecular, es decir, la señal de fluorescencia promedio emitida en la unidad de tiempo por solo difunde complejos de proteína y, así, proporcionar estimaciones de la estequiometría de los complejos de proteína en contactos de la célula.

En este artículo, le ofrecemos protocolos detallados para la preparación de la muestra, calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis realizar el ensayo presentado en un comercial láser confocal de barrido microscopio. Los experimentos pueden realizarse en cualquier instrumento equipado con conteo de fotones o detectores analógicos y un objetivo con alta apertura numérica. Además discutir pasos críticos del protocolo y proporcionar esquemas de corrección para varios procesos causando fluctuaciones de señal artefactual, p. ej., detector ruido, movimiento fotoblanqueo o celular. Originalmente desarrollado para probar las interacciones entre las células adherentes, el ensayo puede ser modificado para que las células de suspensión, o adaptados a los sistemas modelo de membranas, por ejemplo, propiedades gigantes vesículas (2.fino) o plasma gigante vesículas de membrana (GPMVs), que permite la cuantificación de las interacciones en entornos diferentes lípidos o en la ausencia de un citoesqueleto organizado12,13.

Análisis de espectroscopia de fluorescencia de la correlación cruzada es una versión modificada de la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia14 y fue diseñado específicamente para sonda lenta dinámica difusión en membranas de lípidos15. Se basa en una adquisición de exploración de línea perpendicular a la PM que contiene las proteínas fluorescentes de interés. Para probar las interacciones de dos especies de proteínas diferentemente etiquetadas, la adquisición se realiza en dos canales espectrales usando dos líneas láser y dos ventanas de detección de fluoróforos espectralmente separados. Debido a la dinámica de la difusión lenta de las proteínas en el PM (D≤ ~ 1 μm2/s), puede realizarse una medición libre de charla Cruz alternando el esquema de excitación de la línea a la línea15. El análisis comienza con: 1) un algoritmo de alineamiento corregir para el movimiento lateral de la célula basado en block-wise con un promedio de ~ 1000 líneas, 2) determinación de la posición con fluorescencia máxima señales decir, el PM posición, en cada bloque y cambio de 3) de todos los bloques a un común origen12,15, por separado en cada canal. A continuación, una selección automática de píxeles correspondiente a la PM se realiza seleccionando la región central de un ajuste gaussiano de la suma de todas las líneas alineadas (es decir, centro ± 2.5σ). Integración de la señal en cada línea produce la membrana fluorescencia serie f (t) en cada canal (g = green canal, r = canal rojo). Nota que el tamaño del pixel ha de ser pequeño, por ejemplo, < 200 nm, para reconstruir la forma del punto de difundir la función y encontrar su centro, correspondiente a la posición de la PM. En presencia de fotoblanqueo substancial, la serie de tiempo de fluorescencia en cada canal puede modelada con una función doble exponencial y luego corregir con la fórmula siguiente:16

Equation 1.    (1)

Es importante tener en cuenta que esta fórmula corrige eficazmente las amplitudes y tiempos de difusión obtenidos del análisis de correlación de f (t)c, en comparación con las estimaciones del parámetro que se obtendría de la no corregida f (t). Entonces, las funciones de auto - y la correlación cruzada (ACFs / CCFs) de la fluorescencia señales se calculan:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

donde δF = F(t) - Image 1 F(t)Image 2 y = g, r.

Un modelo de difusión bidimensional entonces se acopla a todas las funciones de correlación (SFC):

Equation 4.   (4)

Aquí N denota el número de proteínas fluorescentes en el volumen de observación y τd el tiempo de difusión para cada canal. Este modelo toma en cuenta que en la configuración experimental descrita, difusión de proteínas en la PM se presenta en el plano x-z, en contraste con la configuración de uso general de correlación de fluorescencia espectroscopia (FCS) experimentos en las membranas de sondeo difusión en el plano x-y del confocal volumen17. La cintura w0 y el factor de estructura S, describiendo la elongación wz del volumen focal en z, S = wz/w0, se obtienen de una medida de calibración punto de FCS realizada con tintes espectral similares y misma configuración óptica utilizando valores ya están disponibles para el coeficiente de difusión Dtinte:

Equation 5, (5).

donde τd, tinte es el tiempo medido medio difusión de las moléculas de colorante, de un modelo de difusión tridimensional de los datos, teniendo en las transiciones de la cuenta de una fracción T de todas las moléculas de N a una Estado triplete con una constante de tiempo ττ:

Equation 6.   (6)

Por último, coeficientes de difusión (D), los valores de brillo molecular (ε) y la relativa correlación cruzada de datos sFCCS (rel.cc.) se calculan como sigue:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

donde GCruz(0) es la amplitud de la función de correlación cruzada y Equation 14 es la amplitud de la función de autocorrelación en el -ésimo canal.

Esta definición de la relativa correlación cruzada, es decir, utilizando máximo en lugar de decir en la ecuación 9, toma en cuenta que el número máximo de conjuntos de dos especies de proteínas presentes en diferentes concentraciones se ve limitado por la especies presentes en un número inferior.

Brillo y el número de la correlación cruzada se basa en un análisis del momento de la intensidad de fluorescencia para cada píxel de una pila de imagen adquirida con el tiempo en una posición fija en la muestra, por lo general consisten en ~ 100-200 marcos, con dos espectral canales () g = green canal, r = canal rojo). De la media temporal Image 1 IImage 2i y varianza Equation 16 , el brillo molecular εi y número n se calculan en cada pixel y canal espectral ( = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Es importante tener en cuenta que las ecuaciones dadas se aplican al caso ideal de un verdadero detector de recuento de fotones. Las ecuaciones siguientes aplican para sistemas de detección analógico,19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

Aquí, S es el factor de conversión entre fotones detectados y las cuentas de digitales grabadas, Equation 24 es el ruido de lectura y offset se refiere a la compensación de la intensidad de detector. Por lo general, estas cantidades se deberán calibrar, para cualquier tipo de detector, basado en la medición de la variación del detector en función de la intensidad de iluminación constante19, p. ej., una superficie metálica reflectora o solución colorante seco. El offset puede determinarse midiendo la tasa de conteo para una muestra sin luz de excitación. Realizando una regresión lineal de la varianza asociados detector Equation 25 contra la trama de la intensidad (), S y Equation 24 puede ser resuelto19:

Equation 14.   (14)

Por último, el brillo de la correlación cruzada se calcula en cada pixel y se define en general como21

Equation 15, (15).

donde Equation 29 es la varianza de la Cruz Equation 30 .

Para filtrar las fluctuaciones de larga duración, todos ccN y cálculos de B se realizan siguiendo un furgón filtrado, independientemente para cada pixel22. En Resumen, ni, ε ( = g, r) y Bcc se calculan en desplazamiento de segmentos de p. ej., 8-15 marcos. Los valores así obtenidos pueden ser promediados entonces para obtener el pixel final valores de número y brillo.

Análisis de la estequiometría
Para estimar la estequiometría de los complejos de la proteína en los contactos célula-célula, el brillo molecular puede analizarse por separado en cada canal espectral para la sFCCS o ccN y B los datos. En sFCCS, un valor de brillo se obtiene por medición de cada canal. En ccN y B, se obtiene un histograma de brillo de los píxeles correspondientes al contacto célula-célula y el valor promedio (o mediano) puede utilizarse como brillo representativo para la medición. Por realizar el mismo análisis en referencia monomérica, todos los valores de brillo pueden ser normalizados para obtener directamente el estado oligomérico promedio de los complejos de proteína detectado. En este punto, es importante corregir la presencia de FPs no fluorescente que puede resultar en una subestimación del estado oligomérico. Normalmente esto se realiza midiendo el brillo de un homo dimérico referencia proteína23,24 con sFCS un color o número y el brillo (N & B).

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Protocol

1. Preparación: Célula mezcla ensayo

Nota: El siguiente protocolo describe el procedimiento de mezcla para células adherentes. Puede ser modificada para que las células cultivadas en suspensión.

  1. Un número apropiado de células en una placa de 6 pozos, por ejemplo, 800.000 células HEK 293T (cuentan con una cámara de recuento de Neubauer), un día antes de la transfección de la semilla. El número puede ser modificado dependiendo del tiempo entre siembra y transfección y ajustado para otros tipos de células. Para realizar un experimento básico (es decir, proteínas de interés y control negativo), prepare por lo menos 4 pocillos. Células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2 en medio de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (10%) y L-glutamina (1%).
  2. Transfectar las células según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de materiales).
    1. Para realizar un experimento básico, transfectar, en pozos separados, plásmidos para la proteína de interés unida a un 'verde' (p. ej., monoméricas mayor proteína verde fluorescente (mEGFP), o proteína amarilla fluorescente (mEYFP)) o 'rojo' (por ejemplo, mCherry, o mCardinal) proteína fluorescente.
      Nota: En este protocolo, nos centramos en mEYFP APLP1 y APLP1-mCardinal12y el correspondiente control negativo, por ejemplo, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-Palma-mEYFP) y - mCardinal (myr-palm-mCardinal)12. Por lo general, 200 ng - 1 μg de ADN plásmido son suficientes. Eficiencia de transfección alta aumenta la probabilidad de encontrar células 'rojas' y 'verdes' en contacto. Modificar la cantidad de plásmido y transfección reactivos para optimizar la eficiencia de transfección. Crítica: Confluencia de células debe ser alrededor 70% cuando transfectar las células. Si las células son demasiado confluente, disminuirá la eficiencia de transfección. Si las células no son confluente, transfección y mezcla puede inducir estrés y evitar que muchas células del accesorio apropiado después de la mezcla.
  3. Realizar mezcla de ~4 ± 2 h después de la transfección de la célula.
    1. Retire el medio de cultivo y lave cada bien suavemente con 1 mL de PBS suplementado con Mg2 + y Ca2 +. Luego, retire el PBS. (Crítica) Gota de PBS en borde bien para evitar el desprendimiento de las células durante el lavado.
    2. Añadir 50 μl tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) solución mediante goteo a cada bien para facilitar el desprendimiento de las células. Incubar a 37 ° C por 2 min luego, lentamente agitar la placa de la pozo 6 lateralmente para separar las células.
      Nota: Tiempos de incubación prolongado pueden ser necesarios para algunos tipos de células.
    3. Agregar 950 μl de medio de crecimiento para cada pozo y resuspender las células mediante pipeteo unas veces arriba y abajo de, tal modo separar todas las células desde bien abajo. (Crítica) Asegúrese de que las células se resuspendió correctamente y separadas entre sí por controlar visualmente la ausencia de agregados de células grande después resuspension. De lo contrario muchos contactos 'verdes'-'rojos' o 'verdes'-'rojos' se obtiene después de mezclar.
    4. Transferir la solución de la célula de un pozo (proteína de interés o control negativo) a la correspondiente, es decir, 'rojo' (por ejemplo, transfectada APLP1-mCardinal) 'verde' (p. ej., transfectada APLP1-mEYFP) las células. Mezclar mediante pipeteo suavemente unas cuantas veces hacia arriba y hacia abajo. Entonces, semilla de las células mixtas en platos de fondo de cristal de 35 mm (1 mL de solución de mezclado de la célula por plato), más 1 mL de medio de cultivo y cultura había sembrado células para otro día a 37 ° C, 5% CO2.

Figure 1
Figura 1 . Flujo de trabajo experimental y representación esquemática de análisis espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia y análisis de número y brillo de correlación cruzada en los contactos célula-célula. (A) esquema de preparación de la muestra: dos poblaciones de células transfectadas con la proteína del interés (e.g., APLP1) fusionada a dos proteínas fluorescentes espectralmente distintas (por ejemplo, mEYFP y mCardinal) se mezclan después de transfección. Contactos de células transfected diferentemente son seleccionados en los experimentos de microscopía. Para evitar interferencias con dominios de Unión extracelular, la proteína fluorescente debe ser fusionada a la terminal intracelular de la proteína de interés. (B) exploración FCCS (sFCCS) las medidas son realizada perpendicularmente hasta el contacto de la célula en dos canales espectrales (canal 1, verde y canal 2, rojo). Líneas de exploración (representadas como kymographs) se alinean y suman píxeles de membrana. Luego, se calcula ACFs y MCP de los rastros de intensidad F(t). ACFs se representan en rojo y verde. CCF se representa en azul. Adquisición de (C) correlación cruzada N & B (ccN & B) da como resultado una pila de imagen tridimensional (x-y-tiempo). Un ROI es seleccionado por el contacto célula-célula. Y luego brillo canal y correlación cruzada (ε1, ε2y Bcc) los valores se calculan en cada pixel contacto célula-célula. Los resultados entonces se visualizan como histogramas, agrupación de los píxeles seleccionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

2. Preparación: Control positivo para los experimentos de correlación cruzada y construcción Homo-Dimer para análisis de brillo

  1. 600.000 células HEK 293T, cuentan con un celular con cámara, en los platos de fondo de cristal de 35 mm un día antes de la transfección de la semilla. Cultura de las células a 37 ° C, 5% CO2 en medio DMEM completo (véase el paso 1.1) para otro día.
  2. Transfectar las células con ~ 250 ng de plásmido de DNA según las instrucciones del fabricante. Para el control positivo de la correlación cruzada, utilizar un plásmido de codificación un hetero dímero anclado en la membrana de la proteína fluorescente, por ejemplo, myr-Palma-mCherry-mEGFP o myr-Palma-mCardinal-mEYFP12 correspondiente a los FPs de la proteína de interés. Para la calibración de brillo, utilizar plásmidos codifican tanto una anclada a la membrana monómero FP y homo-dimer correspondiente a los FPs fusionado a la proteína de interés, por ejemplo, myr-Palma-mEYFP y myr-Palma-mEYFP-mEYFP para calibrar el análisis de brillo de MEYFP APLP112.
  3. Cultura de las células a 37 ° C, 5% CO2 en medio DMEM completo (véase el paso 1.1) para otro día.

3. confocal láser microscopía: Instalación y calibración de volumen Focal

Nota: El siguiente protocolo es escrito para los experimentos realizados con mEGFP/mEYFP y mCherry/mCardinal en el láser confocal microscopio utilizado en este estudio. La configuración óptica, la configuración de software (líneas láser, espejos dicroicos, filtros) y la elección de tintes de calibración pueden ser modificadas para otras configuraciones de FPs y microscopio.

  1. Encienda el microscopio y láser por lo menos una hora antes del experimento para asegurar la estabilidad del láser y conseguir el equilibrio de la temperatura.
  2. Preparar 100-200 μL de soluciones adecuado tinte fluorescente soluble en agua (véase la Tabla de materiales por ejemplo) en el agua o PBS para calibrar el volumen focal, con concentraciones entre 10-50 nm.
  3. Coloque las soluciones de tinte en un plato de fondo de la limpieza de 35 mm cristal #1.5, es decir, con un grosor de 0.16-0.19 mm.
    Nota: Lo ideal es utilizar platos con vidrio de cubierta de alto rendimiento con una tolerancia de poco espesor, por ejemplo, 0.170 ± 0.005 mm, permitiendo una corrección óptima cuello de anillo (paso 3.6). Es importante utilizar el mismo tipo de plato ya utilizado más adelante para los siguientes experimentos.
  4. Coloque el plato que contiene la solución de tinte directamente sobre el objetivo (preferiblemente, inmersión en agua, con NA 1.2) para asegurar el enfoque en la solución. Como alternativa, coloque el plato en el portamuestras y el enfoque en la muestra (por ejemplo, 10-20 μm por encima del fondo del plato).
    Nota: No recomendamos usar objetivos de aceite debido a la mala señal obtenida al enfoque profundo en las muestras acuosas.
  5. Configurar la ruta de excitación y emisión, por ejemplo, elegir el láser de 488 nm, espejo dicroico 488/561 nm, detección ventana 499-552 nm y un tamaño de agujero de alfiler de 1 unidad de Airy (AU). Asegúrese de que el tamaño del agujero de alfiler es el mismo que se utilizará en las medidas de correlación cruzada.
  6. Ajuste la posición del agujero de alfiler (ajuste del agujero de alfiler) y el anillo de cuello objetivo para maximizar la tasa de conteo. Para ello, gire el anillo de cuello hasta que se detecta la tasa de conteo máximo.
    Nota: La corrección de anillo collar representa el grosor específico del cubierta de vidrio. Maximizar la tasa de conteo, es decir., que recoge tantos fotones por molécula como sea posible, es fundamental para maximizar la relación señal a ruido (SNR) de las mediciones.
  7. Realizar una serie de mediciones de punto FCS (p. ej., 6 medidas en diferentes lugares, cada uno con 15 repeticiones de 10 s, es decir, 2,5 min tiempo total, muestra con tiempo de permanencia de 1 μs o menos) en el mismo poder de láser utilizado en la correlación cruzada mediciones (típicamente ~ 1%, es decir, ~ 1-2 MW).
  8. Ajustar un modelo de difusión tridimensional incluyendo una contribución de trío (ecuación 6) a los datos.
    Nota: Normalmente, los tiempos de difusión obtenidos son alrededor de 30 μs y el factor de estructura es alrededor de 4-8.
  9. Calcular la cintura w0 del tiempo de difusión promedio medido y publicado los valores para el coeficiente de difusión del colorante usado en temperatura ambiente25 según la ecuación 5. Los valores típicos son 200-250 nm.
  10. Repita la rutina de calibración (pasos 3.4 3.9) con un colorante fluorescente diferente para un segundo canal de detección si es necesario (por ejemplo, 561 nm de excitación y detección entre 570 nm y 695 nm). Mantener la posición del agujero de alfiler y el tamaño como lo fue el primer canal de detección.
  11. Calcular el brillo molecular (ecuación 8) de las mediciones de calibración y almacenar los valores obtenidos.
    Nota: Los valores típicos para la configuración usada son ~8-10 kHz/1,8 μW 488 nm energía de excitación en la molécula (MOL). Inferiores a valores generalmente podrían indicar suciedad en el objetivo, desalineamiento de la instalación o una salida reducida laser. Comprobar y almacenar energías de salida de láser en el objetivo regularmente usando un medidor de potencia. Para la comparación de diferentes configuraciones, brillo molecular normalizada por la potencia del láser de excitación es el parámetro más significativo para evaluar el desempeño del microscopio.

4. Análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia: adquisición

Nota: El siguiente protocolo es escrito para los experimentos realizados con mEGFP/mEYFP ('verde') y mCherry/mCardinal ('rojo') en el microscopio confocal láser utilizado en este estudio. La configuración óptica y la configuración de software (líneas láser, espejos dicroicos, filtros) puede ser diferente para otros montajes FPs o microscopio.

  1. Establecer la trayectoria óptica, por ejemplo, 488 nm y 561 de nm de excitación y un espejo dicroico 488/561 nm, agujero de alfiler en 1 AU para la excitación de nm 488. Para evitar interferencia espectral, seleccione dos pistas separadas para excitar y detectar mEGFP/mEYFP (488 nm excitación, canal verde) y mCherry / mCardinal (561 nm excitación, canal rojo) secuencialmente y seleccione el interruptor de pistas de cada línea. Para la detección, utilizar filtros adecuados para ambos canales, por ejemplo, 499-552 nm en el canal verde y 570-695 nm en el canal rojo.
  2. Si alterna de excitación no es posible, utilice configuración de filtro apropiado para el canal rojo para minimizar la interferencia espectral (es decir, detectar fluorescencia mCherry/mCardinal no por debajo de 600 nm). Esto puede reducir la cantidad de fotones detectados en el canal rojo y así reducir el SNR.
  3. Coloque el plato que contiene las células mezcladas en el portamuestras. Espere al menos 10 minutos para conseguir el equilibrio de temperatura y reducir la deriva de enfoque.
  4. Se centran en las células mediante la transmisión de luz en el menú de localización .
  5. La búsqueda de un par de 'rojo' y una 'verde' de la célula en contacto entre sí. Para el cross-correlación positiva o homo-dimer control de brillo (ver sección 2), buscar una celda aislada emitiendo fluorescencia en canales o la señal respectiva homo-dimer en la PM.
    Nota: (Crítica) minimice muestra la exposición mientras buscaba las células evitar la decoloración, que puede reducir la correlación cruzada26. Por lo tanto, la exploración de la velocidad de escaneo más rápida y potencias de láser de baja. Para evitar la saturación del detector mientras que expresaban fuertemente las células de la proyección de imagen, búsqueda en el modo de integración. Sin embargo, para minimizar la exposición, análisis en menores potencias de láser es posible en modo de conteo de fotones .
  6. Seleccione un perpendicular del camino de exploración contacto célula-célula (o a horas de una sola célula para el control de brillo positivo correlación cruzada o homo-dimer) utilizando el botón de cultivo como se muestra en las figuras 1B y 2A.
    Nota: Algunos microscopios antiguos no permiten direcciones de exploración arbitraria. En este caso, contactos de la célula con una orientación perpendicular a la dirección de análisis debe estar situado.
  7. Zoom para lograr un tamaño de pixel de 50-200 nm y selecta línea de en el Modo Scan. Establecer tamaño del marco 128 pixeles del × 1.
    Nota: Tamaño de píxel típico es de 160 nm, correspondiente a una longitud de la exploración de alrededor de 20 μm.
  8. Establecer velocidad de exploración en el máximo valor permitido, por ejemplo, 472,73 μs por línea.
    Nota: Para un esquema alternativo de excitación, esto corresponde a 954,45 μs tiempo de la exploración, es decir, ~ 1000 exploraciones/s en el programa de instalación utilizado. La velocidad de exploración puede ajustarse según el coeficiente de difusión de la proteína de interés. Para las proteínas ancladas a membrana, tiempos de difusión típicos son alrededor de 10-20 Sra. el tiempo de exploración debe ser por lo menos diez veces menor que los tiempos de difusión. Velocidades de exploración más bajas pueden inducir mayor photobleaching y requerir menores potencias de iluminación. Alternativamente, se puede imponer una pausa, por ejemplo, 5 ms, entre cada exploración muy lentamente difunde complejos utilizando el intervalo en el submenú de Series de tiempo .
  9. Elegir el láser adecuado poderes, por ejemplo, ~ 1-2 MW para 488 nm y ~ 5-10 MW para la excitación de nm 561.
    Nota: Potencias de láser mayores mejoran la SNR, pero aumentan el fotoblanqueo. Por lo tanto, deben ser elegidos potencias de láser que photobleaching es menos del 50% de la tasa de conteo inicial.
  10. Establecer ciclos de 100.000-500, 000.
    Nota: El número de exploraciones, es decir, duración de la medición, puede variar: tiempo de medición mejorará SNR y puede ser más apropiado para difundir lentamente las moléculas, sin embargo, el movimiento de las células y el fotoblanqueo limitan la máxima medida hora. Los datos presentados aquí fueron adquiridos habitualmente ~ 3-6 min, es decir, 200.000-400.000 línea explora.
  11. Establecer detectores en modo de conteo de fotones . Pulse Inicio experimento para empezar la adquisición. Repita los pasos 4,5-4.11 medir otra célula.
    Nota: Se recomienda medir 10-15 células por muestra a nivel de expresión diferente. (Crítica) Evitar la saturación del detector en niveles de alta expresión. La tasa de conteo máximo no debe exceder ~ 1 MHz.
  12. Si se realizan análisis de brillo para determinar los Estados, realizar mediciones de calibración de brillo homo-dimer según pasos modificadas 4.1-4.11: medir cada homo-dimer de la proteína fluorescente por separado (en células aisladas, con Protocolo artículo 2) y realizar mediciones en un canal espectral.

5. Análisis de espectroscopia de correlación cruzada fluorescencia: Análisis de los datos

Nota: El siguiente protocolo sigue una implementación del procedimiento de análisis que se describe detalladamente en anteriores artículos12,15. El código del software está disponible a petición a los autores.

  1. Exportar los archivos de datos (por ejemplo, CZI) a una imagen RGB TIFF en formato de datos raw. Este archivo contendrá un kymograph con el verde y los datos de canal rojo, en el canal llaman G y R de la imagen, respectivamente.
  2. Importar el archivo TIFF con el software de análisis apropiado y proceda a realizar el análisis.
    Nota: Los siguientes pasos (pasos 5.3-5.7) se aplican por separado para cada canal:
  3. Alinee las líneas realizando un promedio de tiempo segment-wise o mover bloques de líneas 500-1000. Determinar la posición de la membrana, es decir, la posición del pixel con la tasa de conteo máximo, en cada bloque. Cambiar todos los bloques en la misma posición lateral. Este procedimiento corrige el desplazamiento lateral del contacto célula-célula, por ejemplo, debido al movimiento de la célula.
  4. En definitiva todas las líneas alineadas a lo largo el eje del tiempo y el perfil de intensidad media usando una función Gaussiana. En presencia de fondo intracelular importante, utilizar un Gaussian más una función sigmoide. Definir los píxeles correspondientes a la membrana como todos los píxeles dentro de ±2.5σ de la posición de la membrana y suma la intensidad de los píxeles de cada línea, obteniendo un valor de señal de fluorescencia individual para cada punto del tiempo (es decir, para cada línea de exploración).
  5. Si es necesario (por ejemplo, fondo > 10% de la señal de la membrana), aplicar una corrección de fondo restando la intensidad promedio de píxeles en el citoplasma multiplicado por 2.5σ (en unidades de píxel) de la fluorescencia de membrana, en bloques de 1000 líneas. Evitar brillantes vesículas intracelulares al seleccionar píxeles del fondo.
  6. Si se observa el fotoblanqueo, aplicar una corrección de decoloración. Por lo tanto, montar la serie de tiempo de fluorescencia de membrana con una función doble exponencial y aplicar la corrección adecuada fórmula, ecuación 116.
    Nota: Alternativamente, Fourier espectro basado en esquemas de corrección pueden ser aplicada27. (Crítica) Si fotoblanqueo está presente pero no corregida para, el CSA puede distorsionarse severamente y parámetros estimados pueden estar sesgados fuertemente (e.g., vea la figura 5E).
  7. Calcule la ACFs y MCP según las ecuaciones 2 y 3 utilizando, por ejemplo, un algoritmo de múltiples-tau28. Para mejorar la fiabilidad de los análisis y evitar artefactos, realizar los cálculos de segmentos iguales de 10-20 de la medición total. Inspeccione la serie de tiempo de fluorescencia y CFs en cada segmento y segmentos claramente distorsionados (ver ejemplos en la Figura 4A- 4D). Promedio de todos los segmentos no-torcido.
    Nota: Este procedimiento puede ser automatizado para evitar un sesgo subjetivo a la información29. Para mediciones muy inestables puede ser útil tener muchos segmentos cortos. Sin embargo, la longitud de un segmento debe ser al menos tres órdenes de magnitud por encima del tiempo de difusión para evitar estadística undersampling errores29,30,17.
  8. Ajustar un modelo de difusión bidimensional, ecuación 4, para el CFs obtenidos. Por lo tanto, fijar el factor de estructura para el valor obtenido en la medida de calibración (Protocolo, artículo 3). La precisión del ajuste puede mejorarse realizando un ajuste ponderado utilizando los pesos estadísticos de cada punto de datos obtenidos del algoritmo de tau múltiples.
  9. Calcular el coeficiente de difusión con la cintura calibrada según la ecuación 7.
  10. Calcular el brillo molecular dividiendo la intensidad de fluorescencia media en cada canal por el número de partículas, ecuación 8. Normalizar el valor de brillo determinado en cada canal por el brillo promedio de la referencia monomérica correspondiente para obtener el estado oligomérico, teniendo en cuenta no fluorescente FPs23. Para ello, determine los valores de brillo medio homo-dimer de análisis de un solo color para calcular la fracción de no fluorescente FPs23.
  11. Calcular la correlación cruzada relativa según la ecuación 9.

6. correlación cruzada número y brillo: calibración del Detector

Nota: El siguiente protocolo provee una guía general acerca de cómo calibrar el sistema de detección. Este procedimiento es obligatorio para sistemas de detección analógicos, pero no es estrictamente necesario cuando se usan detectores cuenta del fotón real.

  1. Seco soluciones adecuado tinte soluble en agua (véase Tabla de materiales por ejemplo) en un plato de fondo de cristal de 35 mm. Establecer la ruta óptica en consecuencia, es decir, 488 o 561 nm de excitación y detección en 499-552 nm o 570-695 nm, respectivamente.
    Nota: Alternativamente, una superficie metálica reflectora puede utilizarse en lugar de soluciones de tinte seca mediante la colocación de la pieza de metal directamente sobre el objetivo.
  2. Realizar mediciones de N & B de un solo color en regiones con concentraciones diferentes de tinte o en potencias de láser diferentes. Por lo tanto, utilizar el Zoom para lograr un tamaño de pixel de 300 nm, escaneo velocidad tiempo de permanencia del píxel apropiado, por ejemplo, 25 μs y ciclos a 100-200 marcos.
  3. Detectores de recuento de fotones (o modo analógico si las mediciones se realizan con detección analógica) y pulse Inicio experimento para empezar la adquisición. Realizar la medida a cero potencia de excitación para determinar el offset de intensidad.
  4. Trama de la varianza de píxeles en función de la intensidad de píxel píxeles medidos todos y realizar un ajuste lineal de estos datos. Determinar S como la pendiente del ajuste lineal. Calcular el ruido de lectura de la intersección, con S y el offset de intensidad determinada según la ecuación 14.

7. correlación cruzada número y brillo: adquisición

  1. Siga los pasos 4.1-4.4 del Protocolo de adquisición de sFCCS.
  2. Usar cultivos para seleccionar un marco de 512 × 128 pixeles alrededor de un contacto de célula (o el PM aislado para el control de brillo de homo-dimer) y Zoom para lograr un tamaño de pixel de 50-100 nm.
  3. Utilice Scan velocidad para establecer tiempo de permanencia del píxel apropiado, por ejemplo, 6,3 μs.
    Nota: En N & B, el tiempo de permanencia del pixel debe ser mucho menor que el tiempo de difusión de la proteína de interés. Si se elige un esquema alternativo de excitación, por ejemplo, cambiar pistas de cada línea, el tiempo entre las dos vías debe ser menor que el tiempo de difusión de la proteína de interés. De lo contrario se reduce la correlación cruzada detectable.
  4. Establecer ciclos en 100-200 marcos.
    Nota: Un número mayor de marco mejorará la SNR, sin embargo, movimiento celular puede limitar el tiempo de medición total. El tiempo de exploración por el marco debe ser mucho mayor que el tiempo de difusión de la proteína de interés. De lo contrario se reduce el brillo aparente, es decir, las partículas parecen estar inmóviles. Para complejos de difusión muy lentamente, imponer una pausa, por ejemplo, 2 s, entre marcos con el intervalo en el submenú de Series de tiempo .
  5. Set láser poderes a valores adecuados (los valores típicos son ~ 1-2 MW de 488 nm y ~ 5-10 MW para la excitación de nm 561).
    Nota: Mayor potencia láser conduce a un mayor brillo y mejor SNR, pero también mayor photobleaching. Potencias de láser deben ser lo suficientemente altos para lograr un brillo detectado de menos ~ 1 kHz/MOL pero mantenerse lo suficientemente bajo como para evitar más de fotoblanqueo de 10-20%. Para fotoblanqueo mEGFP/mEYFP o mCherry/mCardinal, a menos de 10% se obtienen generalmente.
  6. Establecer detectores en conteo de fotones (o modo analógico si las mediciones se realizan con detección analógica). Pulse Inicio experimento para empezar la adquisición.
  7. Evaluar la tasa de conteo de fotones. Si las tasas de conteo de pixeles contacto célula-célula exceden 1 MHz, reducir la potencia del láser o seleccionadas células con bajos niveles de expresión. Repita los pasos 7.2 7.7. para medir el par siguiente de células. Se recomienda medir 10-15 células por experimento en niveles de expresión diferentes.
  8. Si se realizaron un análisis de brillo para cuantificar la Oligomerización, mida la homo-dimer brillo calibración según pasos modificados 7.7 7.1: medir cada homo-dimer de la proteína fluorescente por separado (en células aisladas, con Protocolo artículo 2) y realizar mediciones en un canal espectral.

8. correlación cruzada número y brillo: Análisis de datos

Nota: El siguiente protocolo sigue un procedimiento de análisis anteriormente descritas12,31. El código del software está disponible de los autores a petición.

  1. Importar los datos en bruto (por ejemplo, CZI archivos pueden ser importados usando el paquete de32 Bioformats). Promedio de todos los fotogramas y seleccione una región de interés (ROI) en el contacto célula-célula.
  2. Realizar una imagen alineación algoritmo33, por ejemplo, maximizando la correlación espacial entre ROIs en los marcos posteriores traducciones lateral arbitraria, promediada sobre ambos canales. Este procedimiento corrige para movimiento lateral de las células.
  3. Aplicar un filtro boxcar del22 para reducir fluctuaciones de larga vida extrañas, provenientes de, por ejemplo, movimiento de celular residual o blanqueo de fondo. Como alternativa, puede aplicarse un método robustos para corregir por photobleaching34.
    Nota: Si no hay análisis segment-wise o robustos se aplicación, el brillo evidente puede ser sobreestimado en gran medida.
    1. Definir segmentos deslizantes de, por ejemplo, 8 a 15 fotogramas (por ejemplo, marcos de 1 a 8, 2 a 9 y así sucesivamente) y calcular los valores de brillo de canal y correlación cruzada según las ecuaciones 10, 11 y 15 pixel-wise en cada segmento. Si los detectores no son fotón verdadero contar detectores, considerar los parámetros de detector calibrado en el cálculo de la luminosidad, es decir, utilice las ecuaciones 12 y 13 en su lugar.
      Nota: Calcular los valores de brillo en segmentos de 8 a 15 marcos conduce a una subestimación de 10-20% de la luminosidad absoluta y una sobreestimación de 10-20% de los números de la partícula. Sin embargo, cocientes de luminosidad (por ejemplo, dimer para brillo de monómero) no se ven afectadas, como la longitud del segmento se mantiene constante a lo largo del análisis (datos no mostrados). El error estadístico para una longitud del segmento determinado puede ser determinado a través de simulaciones y así corregido para.
    2. Promedio los valores obtenidos de brillo pixel-wise en todos los segmentos. En este paso, uno puede quitar el 5% más alto y más bajo de los valores de brillo de segmento de la media o excluir segmentos que muestran una clara distorsión de la intensidad, debido a, por ejemplo, una vesícula intracelular o agregado transitorio presente en estos píxeles.
  4. Trazar los valores de brillo del píxel en función de la intensidad del pixel y seleccionar la población de píxeles que se corresponde con el contacto de la célula. Píxeles del fondo tendrán valores de muy baja intensidad. En este punto, volver a evaluar la tasa de conteo máximo. Excluir los píxeles con tasas de conteo por encima de 1 MHz para evitar que se acumulen.
  5. Crear histogramas de brillo de canal y correlación cruzada de las célula píxeles contacto y obtener los valores de brillo de un promedio de retorno de la inversión. Normalizar el valor de brillo del canal promedio por el brillo promedio de la referencia monomérica correspondiente para obtener el estado oligomérico, teniendo en cuenta no fluorescente FPs23. Por lo tanto, determine los valores de brillo medio homo-dimer de análisis de un solo color para calcular la fracción de no fluorescente FPs23.
  6. Para Ilustración, trazar mapas de brillo del canal y correlación cruzada.

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Representative Results

Una primera prueba para el análisis de interacción de proteínas, es decir, mezcla de células que expresan proteínas fluorescentes espectralmente distintas seguidas por sFCCS/ccN y las mediciones de B (figura 1), debe realizarse en las proteínas que no se esperan que interactuar en el contacto célula-célula (es decir, un control negativo). Por lo tanto, se mezclaron células HEK 293T expresando myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-Palma-mEYFP) o - mCardinal y sFCCS se realizó a través del contacto de la célula (figura 2A). En un caso ideal, la señal de fluorescencia en cada canal se supone que fluctúan alrededor de un medio estable, como consecuencia el movimiento difusivo de las proteínas en el PM y las variaciones estadísticas de la cantidad de proteínas en el volumen focal. Para las proteínas que no interactúan, las fluctuaciones en ambos canales son independientes uno del otro y, así, se espera que la correlación cruzada espectral fluctúen alrededor de cero. De hecho, una correlación cruzada relativa cercana a cero fue observada en las medidas típicas (figura 2C). Las ACFs muestran tiempos de decaimiento característico de ~ 10-20 ms (corresponde, en promedio, DPalma myr = 1.3 ± 0.3 μm2/s (media ± SD, n = 20 células)), como era de esperarse para la difusión de myr-Palma-mEYFP y - mCardinal en el PM, por ejemplo, Dmyr-Palma = 0.88 ± 0,11 μm2/s (media ± SEM) basados en recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) experimentos de35. En particular, estas dinámicas bastante lentas permiten el uso de un sistema de excitación alterna, es decir, la conmutación entre detección y excitación rojo verde y solamente cada línea, causando una demora de ms de ~0.5 entre señales en ambos canales, pero suprimiendo interferencia espectral. En promedio, una muy baja correlación cruzada promedio de 0,08 ± 0.10 (media ± SD, n = 17 células) se obtuvo para el control negativo (figura 3E), como se esperaba.

A continuación, un control positivo de la correlación cruzada se utilizó para calibrar la máxima correlación cruzada posible en la configuración óptica. Por lo tanto, la membrana anclada dimer del hetero myr-Palma-mCardinal-mEYFP fue expresado en las células HEK 293T y sFCCS las mediciones se realizaron en las células (figura 2B). El CCFs obtenidos tenían amplitudes positivas y demostraron similares tiempos de decaimiento como las ACFs, otra vez ~ 10-20 ms (figura 2D). En promedio, una relativa correlación cruzada de 0,96 ± 0.18 (media ± SD, n = 14 células) fue medida para el control positivo (figura 3E).

Figure 2
Figura 2 . Análisis de las medidas de control de espectroscopia de correlación cruzada de la fluorescencia. (A) imágenes representativas de mezclado HEK 293T células expresando myr-Palma-mEYFP /-mCardinal como control negativo para interacciones de transporte . La flecha amarilla indica que el sFCCS scan path. Barras de escala son de 5 μm. (B) imágenes representativas de células HEK 293T expresando myr-Palma-mCardinal-mEYFP hetero-dimer (izquierdo: canal verde, derecha: canal rojo) como control positivo de correlación cruzada. La flecha amarilla indica que el sFCCS scan path. Barras de escala son 5 μm. (C) representante CFs (verde: ACF en canal verde (mEYFP), rojo: ACF en canal rojo (mCardinal), azul: CCF) obtenidos en las mediciones de sFCCS para control negativo. Líneas sólidas muestran los ajustes de un modelo de difusión bidimensional al CFs (D) representante CFs (verde: ACF en canal verde (mEYFP), rojo: ACF en canal rojo (mCardinal), azul: CCF) obtenidos en la medición de sFCCS del control positivo. Líneas sólidas muestran los ajustes de un modelo de difusión bidimensional al CFs. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La idoneidad de este ensayo entonces fue investigada en un contexto biológico pertinente mediante el análisis de las interacciones trans de la proteína amiloidea del precursor-como 1 (APLP1), un tipo I proteína transmembrana que se ha propuesto como una adhesión neuronal receptor. Para ello, APLP1 fusionada a mEYFP o mCardinal se expresa en las células HEK 293T. Para excluir interferencias con dominios de Unión extracelular, el FPs fueron fundidos en el c-término de APLP1, es decir, en el dominio intracelular (ver figura 1A). Entonces, sFCCS las medidas se realizaron en contactos célula-célula entre mEYFP APLP1 y APLP1-mCardinal expresando las células (figura 3A), dando por resultado ACFs y MCP (figura 3C) que proporcionan información sobre difusión APLP1 e interacciones. Una positiva correlación cruzada relativa de ± 0.45 0.21 (media ± SD, n = 17 células) fue observada, es decir, un valor significativamente mayor que la del control negativo (figura 3E). Curiosamente, la correlación cruzada relativa media fue más baja que la del control positivo (figura 3E), que indica enlace parcial trans .

Por último, el análisis fue utilizado para demostrar que los iones cinc facilitan mayor APLP1 trans vinculante12,31. SFCCS CFs obtenidos de mediciones a través de clusters APLP1 en los contactos célula-célula (caracterizadas por un fuerte co-localización de APLP1 mEYFP APLP1 mCardinal y formando rápidamente en presencia de iones de zinc, figura 3B) mostraron fuertemente dinámica reducida, como evidente en tiempos de gran decaimiento y las oscilaciones en lag grandes épocas (figura 3D). Sin embargo, el análisis de las amplitudes en tiempos de retardo corto reveló un aumento significativo de la correlación cruzada relativa a 0,8 ± 0,3 (media ± SD, n = 17 células), es decir, ~ 80% de la máxima calibrada (figura 3E). Es de esperar que esta lenta dinámica induce severas distorsiones de las curvas de correlación (ver figura 3D) debido al número limitado de eventos difusas que pueden ser detectados durante el tiempo de medida finita, inducir la partícula llamada ruido30. Para una cuantificación exacta, el tiempo máximo debe ser al menos 3 órdenes de magnitud por encima del tiempo de difusión (ver anterior comentarios30,17 para más detalles).

El brillo molecular de la sFCCS datos APLP1 analizó aún más, utilizando el control negativo de myr-palm como referencia monomérica en cada canal y corrección por la cantidad de proteínas fluorescentes no23. Sobre la adición de iones de zinc, el brillo molecular aumentó significativamente de oligómeros pequeños (~ dímeros) a Multímeros más grandes consisten en ~ 10-50 monómeros en cada célula (figura 3F). Así, en promedio, hasta APLP1 ~ 100 monómeros están presentes en un cluster de toda proteína a través de la Unión de la célula.

Figure 3
Figura 3 . Análisis de las mediciones de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de APLP1 interacciones en los contactos célula-célula. (A, B) Imágenes representativas de células HEK 293T expresando APLP1-mEYFP (verde) APLP1-mCardinal (rojo) antes (A) y 30 min después de cinc tratamiento del ion (B, las células distintas). Las flechas amarillas indican que las sFCCS exploración de caminos. Barras de escala son 5 μm. (C, D) representante CFs (verde: ACFs en canal verde (mEYFP), rojo: ACFs en canal rojo (mCardinal), azul: CCFs) obtenidos en las mediciones de sFCCS para APLP1 (C) antes del tratamiento de iones de zinc y (D) después de tratamiento del ion de zinc. Líneas sólidas muestran ajustes de un modelo de difusión bidimensional a las parcelas CFs. (E) cuadro de correlación cruzada relativa obtienen del análisis de sFCCS de control negativo ("negativo"), APLP1 en ausencia y presencia de iones de zinc y positivo control de correlación cruzada ("positivo"). Parcelas muestran valores medianos y bigotes desde mínimo hasta valores máximos. Caja (F) parcelas de brillo molecular normalizado en canal verde (mEYFP) obtenido del análisis de sFCCS de APLP1 en los contactos célula-célula en ausencia y presencia de iones de zinc. Valores de brillo fueron corregidos para no fluorescente mEYFP basado en mediciones de sFCS de myr-Palma-mEYFP-mEYFP homo-dímeros expresados en las células HEK 293T, medidos bajo las mismas condiciones23. Parcelas muestran valores medianos y bigotes desde mínimo hasta valores máximos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todas las medidas que aparecen hasta ahora fueron corregidas adicional, falsas las fluctuaciones que ocurren en las células que, si no se toman en cuenta, el análisis de sFCCS desafiante. Para el control negativo, por ejemplo, pueden provocar una falso positivo la correlación cruzada, si no hay sistemas de corrección se aplican. Dos procesos principales que pueden distorsionar seriamente el CSA son: 1) inestabilidades en el grabado de la fluorescencia de la señal debido a vesículas intracelulares transitoriamente el volumen focal o lenta dinámica de la membrana, por ejemplo, deriva en la dirección z y 2) fotoblanqueo. Para identificar inestabilidad transitoria, es aconsejable dividir las medidas completas en segmentos de igual tamaños 10-20 y visualmente la serie de tiempo de intensidad y CFs en cada segmento. Este procedimiento se ilustra en la figura 4, que da un ejemplo de segmentos claramente distorsionados obtenidos en el análisis de una medida de control negativo. Inestabilidad transitoria (figura 4A, rastros de la intensidad de los segmentos 1 y 2) puede resultar en un marco de cooperación con valores negativos (figura 4B, segmento 1) o una cross-correlación de falsos positivos alta (figura 4B, segmento 2). Típicamente, tales inestabilidades son visibles en la serie de intensidad como variaciones de señal lenta (figura 4A). El CFs correspondiente normalmente se desvían fuertemente de la CFs de la mayoría de los segmentos, mostrando, por ejemplo, de mayor amplitud y tiempos de decaimiento mucho más lentos en el ~ segunda escala (ver Figura 4B-4D). Se recomienda quitar estos segmentos a partir del análisis y calcular el final CSA promediando todos los segmentos no-torcido, es decir, segmentos caracterizado por CFs no desviándose de la mayoría de los CFs. típicamente, esto se hace en una gráfica eliminación de interfaz examinando 1) iterativamente los segmentos, 2) claramente distorsionado segmentos a partir de la media y 3) inspeccionar el CSA de restantes segmentos respecto de la CFs promedio actualizada de segmentos que no fueron retirados. Mediante la aplicación de este procedimiento, medidas largo parcialmente distorsionadas (figura 5A), mostrando lentamente que se decae (corruptos) CFs (figura 5B) fueron corregidos con éxito y las curvas de correlación significativa fueron recuperados (figura 5C). Generalmente, este procedimiento de corrección puede ser automatizado29, evitando una inspección visual por parte del usuario, que puede ser propenso al sesgo subjetivo. En comparación con la intensidad de base filtración métodos36, en el que se evalúan pequeños contenedores de la medida basado en su intensidad en comparación con la intensidad media de la medida completa y si más de un parámetro umbral, la descrita procedimiento no se basa en parámetros externos y es sensible también a Inestabilidades menores.

Para compensar el fotoblanqueo, se aplicó la corrección matemática descrita, ecuación 1. Por lo general, photobleaching puede ser identificado por un decaimiento exponencial de las señales de fluorescencia (figura 5D), dominando el CFs, que mostrar un falso positivo correlación cruzada y decaimiento veces en el ~ escala de minutos (ver la forma de la curva típica en la figura 5E). El procedimiento de corrección recuperaron el CSA no distorsionada (figura 5F). Como ya se ha mencionado de similar intensidad variaciones dentro de una mediciones pueden ser también causadas por PM movimiento, por ejemplo, z-drift o grandes estructuras móviles poco a poco. Sin embargo, si se decae exponencial similar aparece en todas las medidas, photobleaching será la fuente más probable. En general, pueden combinar esquemas de corrección, por ejemplo, intensidad de filtrado, filtrado de CF base y más métodos tales como Fourier transforma basado en filtrado de las variaciones de señal lenta en frecuencia espacio27.

Figure 4
Figura 4 . Segment-Wise análisis de análisis de mediciones de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia del control negativo de la correlación cruzada. (A) intensidad de fluorescencia verde (F1) y canal rojo (F2) de dos segmentos de tiempo diferentes (cada medición se analizó en 20 segmentos de ~ 20 s cada uno), obtenida de la medición de sFCCS de control negativo. (B) marcos de cooperación de cada uno de los 20 segmentos. El CCFs para segmentos 1 y 2 se destacan en rojo y naranja, respectivamente. (C, D) ACFs de cada segmento en verde (C) y canal (D) rojo. Las ACFs para segmentos 1 y 2 se destacan en rojo y naranja, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Las perturbaciones en el análisis de las mediciones de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia en los contactos célula-célula, ejemplificadas para el control de la correlación cruzada negativa. Series de tiempo de completo de la fluorescencia (A) para una medida ejemplar en verde (F1) y canal rojo (F2). Las sólidas líneas rojas representan un ajuste exponencial doble de la serie de tiempo en cada canal. (B, C) CFs (verde: ACFs en canal verde, rojo: ACFs en canal rojo, azul: CCFs) de la fluorescencia serie de tiempo se muestra en A, calculado por (B) correlacionar la medida entera o (C) la correlación por separado de 20 segmentos y con un promedio de menos distorsionado CFs de ~ 80% (canal verde) y el ~ 50% (canal rojo) de los segmentos. Líneas sólidas representan el ajuste de un modelo de difusión bidimensional a los datos. Series de tiempo completo de la fluorescencia (D) y ajuste exponencial doble (rayas rojas) de medición caracterizado por blanqueo substancial en verde (F1) y canal rojo (F2). (E, F) CFs (verde: ACFs en canal verde, rojo: ACFs en canal rojo, azul: CCFs) las fluorescencia series de tiempo se muestra en D, calculado por (E) correlacionar la medida conjunto o (F) aplicación de la corrección de decoloración, ecuación 1, la correlación de 20 segmentos por separado y un promedio de la CFs menos distorsionado de ~ 90% (ambos canales) de los segmentos. Líneas sólidas representan el ajuste de un modelo de difusión bidimensional a los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como un enfoque complementario a sFCCS, ccN y B (figura 1C) pueden utilizarse para detectar las interacciones proteína-proteína después de la mezcla de la célula. En contraste con sFCCS, ccN y no facilita ninguna información sobre la dinámica de la proteína, pero permite medir las interacciones trans a lo largo del contacto de célula entera en un plano focal. Se realizaron mediciones en muestras APLP1 antes y después del tratamiento con 50 μm vivencias2, así como en el control negativo myr-Palma. Estas mediciones son sensibles a los movimientos celulares, especialmente para cinc ion tratada muestras, que requieren tiempos de adquisición prolongado para tener en cuenta la dinámica lenta de APLP1 racimos. Por lo tanto, se implementó un algoritmo de alineamiento de imagen correcta para el movimiento lateral de las células33. También, un vagón de carga filtro22 (caja de 8 marcos tamaño, ~ 5 s) se aplicó para eliminar las fluctuaciones de baja frecuencia de las señales de medida. Este procedimiento es muy similar a otros filtros utilizados en el análisis N & B local con un promedio de37 o robustos18,34, pero mantiene los datos originales sin modificaciones, es decir, los píxeles se tratan independientemente y no se realiza un promedio o sustracción de las señales. Este procedimiento suprime con eficacia larga duración fluctuaciones en escalas de tiempo más largos que el tamaño de la caja22. Tras dicho análisis de datos, se compararon los valores de brillo de la correlación cruzada para todas las muestras poniendo en común todos los píxeles contacto célula-célula en un histograma de brillo de correlación cruzada. Para APLP1 en ausencia de iones de zinc (figura 6A y 6D), un promedio positivo Bcc de 0.068 ± 0.004 (media ± SEM, n = 18 células) fue observada. Después de la adición de iones de zinc (figura 6B y 6E), el valor decc B aumentado a 0.266 ± 0.006 (media ± SEM, n = 19 células). Para el control negativo (figura 6C y 6F), se detectó un menor brillo promedio de correlación cruzada (Bcc = ± 0.022 0.002, media ± SEM, n = 26 células). Para estimar la estequiometría de los complejos APLP1 de contactos célula-célula, el brillo de APLP1 mEYFP fue normalizado utilizando el valor promedio obtenido para myr-Palma-mEYFP (i.e., el control negativo) y corregida por la cantidad no fluorescente proteínas23. De acuerdo con los datos de sFCCS, la distribución del brillo se centró alrededor de un valor correspondiente a dímeros (figura 6G), en ausencia de iones de zinc, lo que sugiere un promedio de estequiometría 2:2. Después del tratamiento de iones de zinc, el brillo normalizado fuertemente cambiada de puesto a valores más grandes, que van desde aproximadamente 10 a ~ 60 (figura 6H), es decir, stoichiometries de al menos 10:10 o más grande, en buen acuerdo con los datos de sFCCS.

Figure 6
Figura 6 . Las mediciones de brillo y número de correlación cruzada de APLP1 interacciones en los contactos célula-célula. (A-C) Representante ccN & B imagen marcos de contactos célula-célula entre células HEK 293T expresando mEYFP APLP1 y APLP1 mCardinal sin (A) y con el cinc iones (B) o myr-Palma-mEYFP y myr-palm-mCardinal expresando células como negativa control de correlación cruzada (C). Barras de escala son 5 μm. (D-F) histogramas de brillo (Bcc) de la correlación cruzada de píxeles todo examinados y las células obtienen de ccN y B análisis de contactos de la célula-célula en APLP1 muestras (D), tratados con cinc APLP1 muestras () E) y las muestras que contienen myr-Palma-mEYFP y myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Normalizado de histogramas de brillo de APLP1 muestras (G: sin iones de zinc, H: con iones de zinc) para el canal verde (mEYFP) obtenido del análisis de la luminosidad de las mismas células y ROIs utilizados para el cálculo de Bcc. Recuadro g muestra un aumento en la luminosidad normalizado de -2 a 10. Valores de brillo fueron corregidos para no fluorescente mEYFP basado en N & B mediciones de myr-Palma-mEYFP-mEYFP homo-dímeros expresados en las células HEK 293T, medidos bajo las mismas condiciones23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para llevar a cabo el ccN y B el análisis, debe realizarse una cuidadosa calibración de los detectores. Para el montaje experimental utilizado en este estudio, la necesidad de dicha calibración se hizo evidente cuando la luminosidad molecular fue analizada en muestras fijadas (es decir, en ausencia de fluctuaciones del número). En este caso, el brillo molecular se espera que sea cero según la ecuación 10, puesto que la varianza debe originan sólo de ruido del detector. Sin embargo, cuando un ROI que contiene sólo los píxeles de fondo (inmóvil) fue analizado (figura 7A y 7B), se determinó un brillo positivo de ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Se obtuvo un valor similar de rendimiento N y medidas de B de las células HEK 293T que se expresaban glicosilfosfatidilinositol-mCherry (GPI-mCherry, figura 7C) con diversos láser poderes y extrapolando la luminosidad medida molecular a cero energía del laser. Para corregir este efecto, se realizó una calibración sistemática del detector, como previamente divulgados (ver ecuación 12)19,20. Por lo tanto mide la varianza en función de la tasa de conteo del detector en una muestra que consiste en una solución de colorante fluorescente secos y determinado los parámetros S, Equation 24 y el Conde oscuro tipo offset. El último se obtuvo de la medición de la intensidad a cero potencia láser y fue, en nuestro caso, despreciable. De un ajuste lineal de la varianza frente a parcela de intensidad, se determinó, según la ecuación 14, una pendiente de S = 1.1 y un ruido de lectura despreciable. Determinados valores (S = 1.1, Equation 24 = 0, offset = 0) entonces fueron utilizados para calcular correctamente el brillo molecular y número según las ecuaciones 12 y 1319. Alternativamente, se puede aplicar un esquema más empírico de corrección basado en el hecho de que un superpoissonian detector ruido, es decir, ~ el 10% más grande de a Poissonian tiro ruido, también explicaría la observación de un brillo molecular positivo en píxeles sin fluctuaciones del número. Utilizando esta hipótesis, el brillo determinado de ~0.1 cts./(MOL x dwell time) en dichos píxeles puede ser considerado como un brillo constante compensada y por lo tanto debe restarse de todos los valores de brillo calculados con la ecuación 10. Lo más importante, ambos describen enfoques conducen a los mismos resultados en el cálculo de ratios de brillo, mientras que Equation 24 y offset son insignificantes. Cabe mencionar que entre los diferentes microscopios del mismo se observaron valores de S diferentes tipo (mismo vendedor, mismo modelo, GaAsP detectores en modo conteo de fotones), destacando la necesidad de un calibrado cuidadoso detector en cada instalación individual.

Un parámetro más importante que afectan el rendimiento del detector en las mediciones de brillo es el tiempo muerto del detector. Como se ha visto anteriormente, el tiempo muerto del detector puede reducir considerablemente el brillo molecular detectado, incluso a tasas de conteo mediano (por encima de 102-103 kHz)38. Para evitar este artefacto, se deben realizar ya sea medidas en tasas más bajas de la cuenta, o el tiempo muerto debe calibrarse basado en realizar N & B o FCS, en una serie de diluciones de por ejemplo, EGFP en solución tampón. Entonces, tasas de conteo medida pueden corregirse utilizando un calibrado tiempo muerto38. Para la configuración utilizada en este estudio, dicha calibración usando N & B soluciones de tinte diluido reveló valores de brillo molecular estable hasta tasas de conteo de ~0.5 MHz y un tiempo muerto correspondiente de ~ 6 ns (figura 7E). La disminución en las tasas de recuento se puede corregir así mediante el uso de una corrección previamente publicados fórmula38, dando por resultado un valor de brillo constante de ~ 8kHz/MOL.

Figure 7
Figura 7 . Calibración del detector para el análisis del número y el brillo. (A) imagen representativa de mediciones N & B de células HEK 293T expresando mCherry GPI. Un ROI (rectángulo discontinuo azul) fue seleccionado en el fondo. (B) histograma de brillo del píxel de todos los píxeles correspondientes al retorno de la inversión se muestra en A. El brillo del pixel media, obtenido del ajuste el histograma de brillo del píxel con una función Gaussiana, es ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Los datos fueron adquiridos en el tiempo de permanencia de pixel de 25 μs. (C) brillo moleculares obtenido del análisis de N & B de GPI-mCherry expresada en células HEK 293T, medidos a tres potencias de láser diferentes (6 celdas, 561 nm excitación, tiempo de permanencia de pixel de 25 μs). Datos se muestran como media ± SD Una regresión lineal (línea roja) proporciona un valor de compensación de 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) diagrama de variación de píxeles en función de la intensidad del pixel de mediciones N & B de una solución de secado de un colorante fluorescente (emocionado en 561 nm), conjunto de todos los píxeles de varias mediciones en diferentes regiones de la muestra. La línea roja sólida muestra un ajuste lineal de los datos, resultando en una pendiente de 1.1, que el factor S de la calibración del detector. Brillo Molecular (E) en función de la tasa de conteo de detector, obtenidos de mediciones N & B soluciones diluidas fluoróforo (excitó a 488 nm). Un esquema de corrección previamente publicados38 se aplicó utilizando diferentes valores posibles para el tiempo muerto del detector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El procedimiento experimental que se describe aquí permite la investigación de proteínas trans interacciones en los contactos célula-célula, empleando técnicas de espectroscopia fluctuación de fluorescencia, a saber sFCCS y ccN & B. Estos métodos implican un análisis estadístico de las fluctuaciones de la fluorescencia emitida por dos separados espectralmente FPs fusionado a la proteína de interés en un contacto de dos células vecinas, cada una expresando uno o la otra proteína de fusión. La presencia de complejos de trans se cuantifica mediante el análisis del grado de la difusión de proteínas en PMs vecinos. Además de protocolos detallados en preparación de muestras, adquisición de datos y análisis, este artículo provee evidencia experimental de la aplicación exitosa del ensayo en la proteína de adhesión neuronal APLP1. Mostramos que APLP1 sufre específicos, homotípicos trans interacciones en los contactos célula-célula. Además, iones de zinc promueven la formación de clusters APLP1 en los contactos célula-célula que proporcionan una plataforma polivalente para interacciones de transporte y, por lo tanto, inducen mayor trans Unión.

A diferencia de anteriores ensayos para detectar tales interacciones basados en métodos bioquímicos perjudiciales6, el enfoque presentado se puede realizar directamente en las células vivas, sin necesidad de fijación o el aislamiento de complejos de la proteína. Además, proporciona información y especificidad molecular mediante la detección de proteínas fluorescentes genéticamente fusionado a la proteína de interés, a diferencia de anteriores ensayos cualitativos8,9. Diferentemente de otros enfoques basado en la fluorescencia como el traste10 y fluorescencia complementación11, no hay ningún requisito para las etiquetas fluorescentes a localizarse en el lado extracelular (potencialmente interferir con interacciones de la proteína-proteína). Sin embargo, debe señalarse que c-terminal FPs todavía podría alterar la Unión a componentes intracelulares, por ejemplo, proteínas que median la interacción con el citoesqueleto. En particular, el ensayo es aplicable a homo - y las interacciones heterotípicos.

Algunos requisitos para una aplicación exitosa del ensayo presentado valen el mencionar. Los métodos de la fluctuación de fluorescencia realizados se basan en mediciones temporales que requieren brillante y Fotoestables monomérica FPs, que es un gran obstáculo para muchos rojo FPs23. A pesar de que el esquema de análisis presentado está particularmente bien adaptado para la investigación de la dinámica lenta de las proteínas transmembranales, que normalmente están implicadas en las interacciones célula-célula, photobleaching residual puede producirse. Por lo tanto, presentamos una descripción detallada de los planes de corrección, es decir, una corrección de blanqueaba para filtro sFCCS y furgón para ccN & B, que reducen al mínimo tales perturbaciones. Además, discutimos algoritmos de alineación numérica que efectivamente corrigen otras perturbaciones sistemáticas, tales como el movimiento lateral de las células y proporcionar directrices para eliminar inestabilidades transitorias. Una fuente importante de tales inestabilidades es transporte vesicular, es decir, vesículas intracelulares con la proteína de interés que ingresan transitoriamente el volumen focal. Aunque varían de caso a caso, este fenómeno en general puede perturbar seriamente análisis y adquisición de datos. Sin embargo, la aplicación de algoritmos de corrección mejora la estabilidad de la adquisición, permitiendo la medida extendida tiempos que son necesarios para sondear la dinámica difusión especialmente lento. En este sentido, tiene que destacar que la presencia de difusión dinámica es condición esencial para que el método de trabajo. El ejemplo del ión zinc mediada APLP1 clustering muestra un ejemplo drástico de complejos de proteína grande, muy lenta (D ≈ 0.001 μm2/s) que la técnica a sus límites y asegurarlo una cuantificación precisa de las dinámicas subyacentes, debido al gran ruido inducida por el tiempo de adquisición limitada30,17.

En este contexto, los avances recientes en peinar súper resolución enfoques, por ejemplo, análisis emisión estimulada agotamiento FCS (STED-FCS), pueden ser beneficiosos, proporcionando un menor volumen focal y así menor difusión eficaz y sFCS veces39 ,40. Esto también podría ayudar a resolver los racimos de proteínas en el caso de una localización no homogénea de la proteína de interés en los contactos célula-célula, como observado en APLP1 en presencia de zinc. Por desgracia, una implementación de la correlación cruzada de exploración STED-FCS, es decir, STED-FCCS, que podría ser aplicada directamente aquí, no ha sido satisfactoriamente demostrada aún debido a la dificultad de encontrar tintes compatibles para dos colores STED-FCS. En el caso de dinámica lo suficientemente rápida (D ≥ ~0.05 μm2/s), sFCCS análisis permite para cuantificar la difusión de proteínas en los contactos célula-célula o en otras regiones de la PM12.

Además, puede realizarse un análisis de brillo para todos los datos (sFCCS y ccN y B), proporcionando una estimación de la estequiometría de trans complejos de la proteína. Debe señalarse que la exactitud de la cuantificación de estequiometría aumenta con la cantidad de proteínas que se unen en trans (es decir, si hay sólo algunos cis complejos que también podrían afectar a la determinación de brillo). Análisis de brillo no permite resolver mezclas de diferentes Estados oligoméricos, e.g.,cis monómeros y tetrámeros de trans . Más en general, cabe señalar que N & B no pueden resolver mezclas de diferentes especies oligoméricas homogéneamente distribuidas en una muestra. Si hay varias especies dentro de un pixel, un único valor de brillo será medido (es decir, un promedio ponderado de la luminosidad de cada especies oligoméricas). La distribución estadística de los valores de brillo observado (por ejemplo, en píxeles diferentes) no está conectada directamente a las cantidades relativas de las especies oligoméricas. Para resolver dichas mezclas, se deben utilizar otros métodos (por ejemplo, intensidad espacial distribución análisis (SpIDA)41, fotón contando histograma (PCH)42). Del mismo modo, la cuantificación de la correlación cruzada espectral en sFCCS proporciona una cuantificación precisa de la fracción de proteínas enlazadas y sólo para stoichiometries simple, conocidas, por ejemplo, 1:1. Para una estequiometría más compleja, más supuestos tienen a43. En general, análisis de brillo sigue siendo una herramienta experimental, si el sistema detector y la fracción de FPs no fluorescente son calibradas23 descrito en los protocolos.

Aunque la aplicación que presentamos se centra en las interacciones de la proteína-proteína en células adherentes, el análisis puede aplicarse a una amplia gama de muestras, por ejemplo, las células de suspensión. Para estos sistemas, corrección de movimiento lateral de la célula puede ser particularmente crucial. Además, puede ser fácilmente aplicado a los sistemas de membranas modelo como 2.fino o GPMVs, que permite la cuantificación de interacciones moleculares bajo condiciones bien controladas, por ejemplo, lípidos diferentes composiciones o carecer de manera organizada las membranas citoesqueleto. Cuando realice el sFCCS de dichas vesículas, movimiento vertical puede causar fluctuaciones de señal adicional, pero puede ser minimizado cuando se centra en grandes vesículas. En este contexto, múltiples combinaciones son prometedores, por ejemplo, GUV - GPMV-cell mezcla12. Como se muestra en una publicación reciente, la formación de sinapsis inmunes se puede modelar con éxito por tales sistemas44. Así, el análisis presentado será útil para la investigación de una gran variedad de interacciones célula-célula.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue parcialmente financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) conceder 254850309. Los autores agradecen Madlen Luckner para lectura crítica del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

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