स्थानीय सेलुलर और ऊतक तराजू पर Actomyosin गतिशीलता का विश्लेषण संस्कृतिD Drosophila अंडे कक्षों के समय चूक सिनेमा का उपयोग

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Developmental Biology

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Summary

इस प्रोटोकॉल एक फिजी आधारित प्रदान करता है, उपयोगकर्ता के अनुकूल पद्धति सरल निर्देश समझा कैसे मज़बूती से व्यक्तिगत कोशिकाओं और घुमावदार उपकला ऊतकों में actomyosin व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए के साथ. कोई प्रोग्रामिंग कौशल ट्यूटोरियल का पालन करने के लिए आवश्यक हैं; सभी कदम फिजी और संबद्ध plugins के चित्रमय यूजर इंटरफेस का उपयोग कर एक अर्द्ध इंटरैक्टिव तरीके से प्रदर्शन कर रहे हैं.

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Viktorinová, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58587, doi:10.3791/58587 (2019).

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Abstract

Drosophila अपरिपक्व अंडे अंडे कक्षों कहा जाता है, और उनकी संरचना आदिम अंगों है कि विकास के दौरान एक दीर्घवृत्त आकार के लिए एक दौर से आकृतिविज्ञान परिवर्तन से गुजरना जैसा दिखता है। इस विकासात्मक प्रक्रिया को ऊजेनेसिस कहा जाता है और अगली मक्खी पीढ़ी को सुरक्षित करने के लिए कार्यात्मक परिपक्व अंडे पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन कारणों के लिए, अंडे कक्षों पशु अंग विकास को समझने के लिए एक आदर्श और प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा की है.

कई इन विट्रो culturing प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, लेकिन इन प्रोटोकॉल के लिए कई नुकसान कर रहे हैं. एक विभिन्न कवर है कि उन्हें स्थिर करने के लिए और विश्लेषण अंडे कक्षों के परिधीय सतह की छवि प्राप्त विमान को बढ़ाने के लिए छवि अंडे कक्षों पर एक कृत्रिम दबाव डालती है के आवेदन शामिल है। इस तरह के एक दृष्टिकोण नकारात्मक पतली actomyosin मशीनरी है कि उनके लंबे अक्ष के आसपास अंडे कक्षों बारी बारी से करने की शक्ति उत्पन्न के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं.

इस प्रकार, इस सीमा को दूर करने के लिए, हम मीडिया में स्वतंत्र रूप से Drosophila अंडे कक्षों संस्कृति के क्रम में मज़बूती से अंडा कक्षों की परिधि के साथ actomyosin मशीनरी का विश्लेषण करने के लिए. प्रोटोकॉल के पहले भाग में, हम एक मैनुअल विवरण कैसे स्थानीय सेलुलर पैमाने पर एक सीमित अधिग्रहण विमान में actomyosin मशीनरी का विश्लेषण करने के लिए प्रदान करते हैं (अप करने के लिए 15 कोशिकाओं). प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में, हम एक नया फिजी आधारित प्लगइन है कि अंडे कक्षों परिधीय सतह की एक परिभाषित पतली परत के सरल निष्कर्षण की अनुमति देता है के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करते हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल तो ऊतक पैमाने पर actomyosin संकेतों का विश्लेषण करने के लिए कैसे का वर्णन करता है (gt; 50 कोशिकाओं). अंत में, हम दोनों स्थानीय सेलुलर और ऊतक तराजू पर इन दृष्टिकोणों की सीमाओं को इंगित और इसके संभावित भविष्य के विकास और संभव अनुप्रयोगों पर चर्चा.

Introduction

जीवन विज्ञान में अनुप्रयोगों के साथ उपन्यास इमेजिंग और सॉफ्टवेयर प्रौद्योगिकियों के निरंतर विकास जीवन के बुनियादी सिद्धांतों को समझने पर एक भारी प्रभाव प्रदान की है. मुख्य चुनौतियों में से एक विभिन्न ऊतकों में उनके लाइव इमेजिंग के साथ संयोजन में विकासात्मक प्रक्रियाओं के विश्वसनीय दृश्य है। ऊतक अंगों और शरीर के हिस्से हैं और, इस तरह के रूप में, बहुमत इमेजिंग के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं। इसलिए, प्रोटोकॉल है कि उनके विच्छेदन और इन विट्रो culturing की अनुमति के क्रम में जैविक घटनाओं है कि पर्याप्त रूप से एक जीवित शरीर के भीतर vivo स्थिति को प्रतिबिंबित कल्पना करने के लिए विकसित किया गया है.

पिछले दशकों में, Drosophila अंडे कक्षों की culturing और जीने इमेजिंग, आदिम अंगों की तरह acinar की तरह संरचनाओं, आदिम अंग विकास1 के बुनियादी सिद्धांतों की समझ के लिए बेहद योगदान दिया है , , 3. वर्तमान में, वहाँ कई culturing प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, और उनके उपयोग अधिग्रहण समय पर निर्भर करता है, सेल प्रकार छवि हो, और उनकी पहुंच (उदा., आंतरिक gerline बनाम बाहरी दैहिक लाइन)4.

इन सभी culturing प्रोटोकॉल में एक आम विशेषता विश्लेषण अंडे कक्षों कि तरल मीडिया में एक उच्च संकुचन गतिविधि प्रदर्शित की अचलीकरण के लिए की जरूरत है. अंडे के कक्षों की संकुचनीय गतिविधि मुख्य रूप से मांसपेशी शीट के कारण होती है जो जुड़े अंडे कक्षों5,6,7की एक लंबी स्ट्रिंग को कवर करती है . इसलिए, युवा अंडे कक्षों की उचित अचलीकरण को प्राप्त करने के लिए, विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जिसमें कवरलिप्स6,8,9 या लचीली कंबल4, के साथ अंडे के कक्षों को कवर शामिल किया गया है, 10 या उन्हें कम पिघल बिंदु agarose3,11में embedding. इन दृष्टिकोण लोकप्रिय हैं के रूप में वे भी अंडे कक्षों के परिधीय सतह के सूक्ष्म समतल के कारण एक बड़ा दृश्य विमान की इमेजिंग की अनुमति.

हालांकि, हाल ही में, यह दिखाया गया है कि युवा अंडे कक्षों (चरण 1-8) उनके पूर्वकाल-पोस्टर अक्ष6 के आसपास बारी बारी से और यह कि इस ऊतक गति इन युवा अंडे कक्षों के परिधीय सतह के करीब एक ठीक actomyosin नेटवर्क द्वारा संचालित है 12इसलिए, इस ऊतक के सूक्ष्म सपाट होने के कारण कोशिकीय सतह का कृत्रिम परिवर्तन बल उत्पन्न करने वाली एक्टोमायोसिन मशीनरी के व्यवहार पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकता है। प्रतिबिंदु यह है कि अगर अंडा चैम्बर ऊतक चपटा नहीं है, अंडे कक्षों के परिधीय सतह पर प्रोटीन की सूक्ष्म इमेजिंग अधिग्रहण विमान के कम आकार से भी अधिक सीमित हो जाता है.

इसलिए, हमने प्रसाद एट अल9 और सेलेस्टे बर्ग4,10 की प्रयोगशाला से प्रोटोकॉल को संयुक्त किया है और उन्हें और अधिक संशोधित किया है ताकि विकसित विधि में कोई कवरस्लिप/फ्लैंकेट कंबल/अरोस का उपयोग न किया जा सके। Drosophila अंडे कक्षों स्वतंत्र रूप से मीडिया में सुसंस्कृत कर रहे हैं और यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल केवल उल्टे माइक्रोस्कोपी लागू होता है. प्रोटोकॉल के दो भाग हैं. पहले भाग अंडे कक्षों के भीतर स्थानीय सेलुलर पैमाने पर actomyosin संकेतों के विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है (अप करने के लिए 15 कोशिकाओं)। दूसरे भाग में, हम अंडे कक्षों के मुक्त culturing की वजह से एक छोटे से अधिग्रहण विमान के साथ जुड़े सीमाओं पर काबू पाने पर ध्यान केंद्रित. इस संबंध में, हमने एक अर्द्ध-सहभागी आलेखीय यूजर इंटरफेस के साथ एक उपन्यास फिजी-आधारित अभिकलन विधि विकसित की है जो चुनिंदा रूप से परिधीय ऊतक की सतह की परिभाषित परतों को निकालता है और प्रकट करता है। यह ऊतक पैमाने पर actomyosin का विश्लेषण करने के लिए कैसे का वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल द्वारा पीछा किया जाता है (यानी, gt; 50 कोशिकाओं). के रूप में घुमावदार उपकला ऊतकों की एक परिभाषित पतली परत के चयनात्मक निष्कर्षण आसानी से एक शास्त्रीय z-स्टैक प्रक्षेपण का उपयोग कर संभव नहीं किया गया है (चित्र1), यह आसान करने के लिए उपयोग विधि व्यापक रूप से समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त के रूप में कार्य करता है Drosophila अंडे कक्षों में ऊतक पैमाने पर एक पतली (और 1 डिग्री मीटर) actomyosin नेटवर्क का व्यवहार।

इसके अलावा, प्रोटोकॉल की सुविधा के लिए, हम उदाहरण समय चूक फिल्में (TLMs) और फ्लोरोसेंट टैग nonmuscle पारंपरिक Myosin द्वितीय व्यवहार के नमूना फ़ाइलें प्रदान करते हैं (देखें अनुपूरक फ़ाइल 3). मायोसिन द्वितीय एक मोटर प्रोटीन है और actomyosin मशीनरी के सक्रिय संकुचनशील भाग का प्रतिनिधित्व करता है। Myosin द्वितीय छवि के लिए, हम Drosophila ट्रांसजेनिक लाइनों है कि Myosin द्वितीय MRLC कहा जाता है की एक संशोधित नियामक प्रकाश श्रृंखला होते हैं का उपयोग करें::GFP (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)12,13. कोशिका झिल्ली की कल्पना करने के लिए, प्रोटोकॉल वाणिज्यिक रंगों पर आधारित है (सामग्री की तालिकादेखें)। यह प्रोटोकॉल न केवल छोटे उपकोशिकीय एमआरएलसी के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है::GFP संकेत12 लेकिन यह भी $ 300 $M के आसपास किसी भी समान आकार के subcellular कणों के लिए, इस तरह के जीवन अधिनियम के साथ मनाया उन के रूप में::GFP12,14.

हालांकि इन दोनों प्रोटोकॉल इन विट्रो सुसंस्कृत Drosophila अंडे कक्षों में उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे हैं, actomyosin संकेतों के अधिग्रहण भी culturing मीडिया के अनुकूलन पर अन्य ऊतकों का उपयोग कर और उपलब्धता के आधार पर किया जा सकता है या तो फ्लोरोसेंट की इसी वाणिज्यिक रंगों के साथ प्रोटीन टैग या, उदाहरण के लिए, MRNA microinsinctions क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए. इसी प्रकार, परिधीय सतह से एक पतली परत की निकासी के लिए फिजी आधारित प्रोटोकॉल को अधिक सामान्य रूप से दीर्घवृत्ताभ और अंग जैसे ऊतकों पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल कैसे स्थानीय सेलुलर और Drosophila अंडे कक्षों में ऊतक पैमाने पर actomyosin का विश्लेषण करने पर निर्देश प्रदान करता है. स्थानीय पैमाने पर दृष्टिकोण उपयोगकर्ताओं को अंडे कक्ष प्रति 15 कोशिकाओं में विस्तृत actomyosin व्यवहार का विश्लेषण करने की अनुमति देता है और उच्च गति इमेजिंग और एक उल्टे confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके समय (5-10 मिनट) की एक छोटी अवधि के लिए TLMs के अधिग्रहण की आवश्यकता है. इसके विपरीत, ऊतक पैमाने 50-100 कोशिकाओं में actomyosin जानकारी के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करता है और समय की एक लंबी अवधि के लिए TLMs के अधिग्रहण की आवश्यकता है ($30 मिनट) कम गति इमेजिंग और एक उल्टे कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग करके (चित्रा 2 और देखें सारणी 1में प्रत्येक पैमाने पर अनुशंसित पैरामीटर । actomyosin संकेतों का विश्लेषण करने के लिए पैमाने पर जो निर्णय पूरी तरह से उपयोगकर्ता के वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है. संगत परीक्षण TLMs यह निर्णय लेने में मदद करनी चाहिए।

1. स्थानीय सेलुलर स्केल (एलसीएस)

नोट: इनविट्रो सुसंस्कृत ड्रोसोफिला अंडे कक्षों में विच्छेदन और छवि के लिए, अनुपूरक फाइल 1में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें। प्राप्त TLMs का विश्लेषण करने के लिए, निम्न प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें। TLMs की साथ परीक्षण फ़ाइलों के लिए लिंक पूरक फ़ाइल 3में प्रदान की जाती हैं.

  1. स्थानीय सेलुलर पैमाने पर TLMs के डेटा प्रसंस्करण (एलसीएस)
    1. फ्लोरोसेंट लेबल की तीव्रता क्षय के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए TLMs के ब्लीच सुधार
      1. सुनिश्चित करें कि इन निर्देशों का पालन करके उपयोग किए जा रहे कंप्यूटर पर एक अप-टू-डेट फ़िजी अनुप्रयोग स्थापित किया गया है: फिजी और TLM खोलें (उदा., TestMovie1.tif पूरक फ़ाइल 3से).
      2. छवि पर क्लिक करके रंग चैनलों को विभाजित करें gt; रंग gt; विभाजित चैनल|
      3. दोनों चैनलों पर एक ब्लीच सुधार प्रदर्शन छवि का उपयोग कर ते व समायोजित करें ] र्ं ब्लीच सुधार ]gt; सरल अनुपात gt; पृष्ठभूमि तीव्रता 0.0.
        नोट: असंतोषजनक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं, तो इस प्लगइन में जो सुधार के तरीकों का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा फिट बैठता है (जैसे, एक साधारण अनुपातके बजाय हिस्टोग्राम मिलान का उपयोग करें).
    2. TLMs के लिए कोई सेल मास्क जनरेट करने के लिए कक्ष विभाजन
      1. यदि फिजी पहले से खुला नहीं है, तो उसे फिर से खोलें (और सुनिश्चित करें कि यह अद्यतित है) निम्न सहायता के बाद ] अद्यतन करें; परिवर्तन लागू करें ]gt; ठीकहै.
      2. यदि यह पहले से ही नहीं किया गया है, तो मैक्रो TissueCellSegmentMovie.iJm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm से) डाउनलोड करें। खींचें और फिजी में इस स्क्रिप्ट ड्रॉप.
      3. ब्लीच-सही TLM .tiff फ़ाइल खोलें (अनुभाग 1.1.1 देखें)। छवि का उपयोग कर ब्लीच सही फ़ाइल के चैनलों को विभाजित करें ] रंग gt; स्प्लिट चैनल|
      4. खुली स्क्रिप्ट में चिह्न चलाएँ दबाकर चयनित TLM के सक्रिय कक्ष मेम्ब्रेन चैनल पर अपलोड की गई स्क्रिप्ट चलाएँ. 2.500 और सेल का पता लगाने संवेदनशीलता -1 करने के लिए गाऊसी कलंक सेट और ठीकक्लिक करें. आदेश में एक अच्छा सेल मुखौटा पाने के लिए, ऊपर इन मापदंडों को बदल नहीं है. 63x उद्देश्य के साथ प्राप्त TLMs के लिए 10-20 के बीच अनुमानित शोर सहिष्णुता सेट करें और ठीकक्लिक करें.
        नोट: अन्य उद्देश्यों के लिए, विभिन्न पैरामीटर की आवश्यकता हो सकती है। एक TLM में पृष्ठभूमि क्लीनर, कम अनुमानित शोर सहिष्णुता की आवश्यकता है.
      5. एक उत्पन्न सेल मुखौटा विश्लेषण TLM में और भी एक नई विंडो में ParticleStack (जी)कहा जाता है में प्रकट होता है, और इसके अलावा, एक छोटी सी विंडो बुलाया कार्रवाई आवश्यक प्रकट होता है. TLM पर कक्ष मास्क से, केवल TLM के केंद्र में कक्षों पर ध्यान केंद्रित करें और उन का चयन करें जो पूरे TLM में पूर्ण और अच्छी तरह से परिभाषित बाह्यरेखाएँ प्रदान कर सकते हैं.
      6. यदि चयनित कक्षों में कृत्रिम/अतिरिक्त कक्ष बाह्यरेखाएँ हैं, तो TLM में क्रिया आवश्यक नामक मर्ज उपकरण विंडो का उपयोग करें. बाद के लिए, विंडो में दिए गए निर्देशों का पालन करें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि सेल बाह्यरेखाएँ अच्छी तरह से परिभाषित हैं और TLM में वास्तविक कोशिका झिल्ली के अनुरूप हैं क्योंकि कोई भी अपरिपक्वता बाद के विश्लेषणों को प्रभावित कर सकती है। अतिरिक्त tweaks और परिवर्तन, जैसे अवांछित कक्षों को निकालने, बाद में सतह प्रबंधक उपकरण (अनुभाग 1.1.3 में वर्णित) का उपयोग कर किया जा सकता है।
      7. जब केंद्र में चयनित कोशिकाओं को अच्छी तरह से असली कोशिका झिल्ली के अनुरूप हैं, एक .tiff फ़ाइल के रूप में ParticleStack बचाने के लिए फ़ाइल के बाद और सहेजें के रूप में gt; Tiff.
    3. भूतल प्रबंधक में जनरेट किया गया सेल मास्क का लोड हो रहा है
      1. उपयोग किए गए फ़िजी सेटअप में सतह प्रबंधक प्लग 15 स्थापित करें. Viktorinova एट अल16द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करें.
      2. Plugins का उपयोग कर खुला भूतल प्रबंधक और विभाजन ]gt; भूतल प्रबंधक (3 D).
        नोट: सतह प्रबंधक विंडो दाईं ओर कई क्रिया बटन और बाईं ओर एक रिक्त विंडो प्रदर्शित करता है। सभी क्रिया बटन देखने के लिए, यह विंडो अपनी ऊंचाई/चौड़ाई में फैलाने के लिए आवश्यक हो सकता है। ध्यान दें कि समय फ़्रेम z-slices के रूप में दिखाई देगा।
      3. फ़ाइल पर क्लिक करके सतह प्रबंधक में इसी ParticleStack .tiff फ़ाइल खोलें और खोलने के लिए छवि का चयन करें (जैसे, ParticlesStack1.tif).
      4. सतह प्रबंधक में, बाह्यरेखा छवि पढ़ें बटन क्लिक करें और जैकार्ड अनुक्रमणिका को 60% पर सेट करें.
        नोट: ParticlesStack1.tif फ़ाइल लोड हो रहा है, कंप्यूटर की संसाधन शक्ति के आधार पर कई मिनट तक ले सकते हैं।
      5. एक बार लोड होने पर, प्रत्येक कक्ष को S संख्या के साथ असाइन किया जाएगा और सतह प्रबंधक विंडो के बाएँ भाग में दिखाई देगा.
        नोट: सभी कक्षों के लिए बाह्यरेखाएँ और कक्ष नाम दिखाने के लिए, सभी दिखाएँ और सतह प्रबंधक विंडो के निचले भाग पर लेबल दिखाएँ चेकबॉक्स दिखाएँ. यह एक बार सेल नंबर उनकी शुद्धता के लिए जाँच की गई है इस समारोह का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
      6. पहले एस नंबर पर क्लिक करें; कणStack1.tif से आयातित सेल बाह्यरेखा TLM पर प्रकट होता है। TLM में कक्ष बाह्यरेखा गुणवत्ता के लिए प्रत्येक आयातित S संख्या की जाँच करें और अवांछित कक्ष जो गलत कक्ष बाह्यरेखा प्रदर्शित निकालें। ऐसा करने के लिए, कक्ष बाह्यरेखा को हाइलाइट करें और हटाएँबटन पर क्लिक करें.
        नोट: यह भी imprecise सेल रूपरेखा के लिए सही है और नई कक्ष रूपरेखा जोड़ने के लिए संभव है. यह चर्चा अनुभाग में वर्णित है.
      7. डिस्क पर सहेजें बटन दबाकर सभी सही कक्षों को RoiSet.zip फ़ाइल के रूप में सहेजें.
        नोट: सत्र बाधित करने की आवश्यकता है, तो बाद में सतह प्रबंधक में RoiSet फ़ाइल लोड करने के लिए संभव है: फिजी में TLM खोलें (फ़ाइल और खोलें) और एक TLM का चयन करें। Plugins के माध्यम से खुला भूतल प्रबंधक और खंडीकरण ]gt; भूतल प्रबंधक (3 डी)| डिस्क बटन से लोड क्लिक करके और उपयुक्त RoiSet.zip फ़ाइल का चयन करके इसी RoiSet.zip फ़ाइल लोड करें। डबल-चेक करें कि लोड किए गए कक्ष मास्क लोड किए गए TLM के संगत हैं.
    4. TLMs में ऊतक बहाव के लिए सुधार
      नोट: TLMs के अधिग्रहण समय के दौरान, बहाव प्रभाव उपकला रोटेशन या एक अवांछित आंदोलन के कारण देखा जा सकता है. दोनों ही मामलों में, हम बाद में मैनुअल actomyosin विश्लेषण को सरल बनाने के क्रम में किसी भी बहाव के लिए सही करने की सलाह देते हैं. बहाव सुधार केवल मैनुअल actomyosin विश्लेषण के लिए आवश्यक है. इस ट्यूटोरियल MultiStackReg प्लगइन (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) स्थापित के साथ अप करने की तारीख फिजी सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है।
      1. फ़ाइल के माध्यम से फिजी में ब्लीच-सही TLM खोलें और ऊपर उल्लेख किया ट्यूटोरियल का उपयोग कर बनाया ब्लीच सही फ़ाइल का चयन करें।
      2. चैनलों को विभाजित करें और एक का चयन करें जो छवि के माध्यम से कोशिका झिल्ली की पहचान करता है ।
      3. जब कक्ष की रूपरेखा स्पष्ट रूप से चिकनी नहीं होती है, तो निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करें: प्रक्रिया और फ़िल्टर ] गाऊसी धुंधला। 63x उद्देश्य के लिए इसे $1-2 पर सेट करें और ठीक क्लिक करें और फिर हाँ. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके प्रक्रिया पर क्लिक करें और बाइनरी और मास्क में कनवर्ट करें; उसके बाद, ठीकक्लिक करें.
      4. MultiStackReg प्लगइन निम्नलिखित Plugins लोड करें और पंजीकरण gt; MultiStackReg|
      5. सुनिश्चित करें कि स्टैक 1 कक्ष मेम्ब्रेन चैनल पर सेट है, क्रिया 1 संरेखित करने के लिए सेट किया गया है, और परिवर्तन अनुवाद करने के लिए सेट किया गया है। ट्रांसफ़ॉर्मेशन फ़ाइल सहेजें चेक बॉक्स चेक बॉक्स चेक बॉक्स की जाँच करें और फिर ठीकक्लिक करें.
      6. चयनित TLM, MultiStackReg प्लगइन, और फ़ाइल का उपयोग कर सहेजी गई रूपांतरण फ़ाइल को पुन: खोलें और TLM का चयन करें. छवि का उपयोग कर रंग चैनलों को विभाजित करें gt; रंग gt; विभाजित चैनल|
      7. Plugins पर क्लिक करके MultiStackReg प्लगइन लोड करें gt; पंजीकरण gt; MultiStackReg| क्रिया 1 के रूप में ट्रांस्फ़ॉर्मेशन फ़ाइल लोड करें का चयन करें.
      8. कठोर शरीर के रूप में परिवर्तन छोड़ दो और ठीकक्लिक करें . पहले सहेजी गई ट्रांस्फ़ॉर्मेशन फ़ाइल का चयन करें और ठीक फिर से क्लिक करें.
      9. छवि चैनल ों को मर्ज करें और पंजीकृत TLM को .tiff फ़ाइल के रूप में सहेजें छवि के बाद ] रंग और मर्जचैनल. फ़ाइल पर क्लिक करके फ़ाइल सहेजें gt; के रूप में सहेजें ]gt; Tiff|
        नोट: फिजी में ऊतक बहाव के लिए सही करने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं, अर्थात् Plugins के माध्यम से gt; पंजीकरण ] StackReg/Correct 3D बहाव.
  2. एलसीएस में सतह प्रबंधक में actomyosin दालों का विश्लेषण
    नोट: इस प्रोटोकॉल कदम वैज्ञानिकों की पहचान करने के लिए कि क्या actomyosin दालों का विश्लेषण ऊतक में मौजूद हैं और विस्तृत व्यवहार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से actomyosin संकेतों की दिशात्मकता को समझने के लिए अनुमति देता है.
    1. फिजी खोलें और सुनिश्चित करें कि कोई TLM और उसके संबंधित कक्ष मास्क सतह प्रबंधक में खुला है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि फिजी स्थापित किया गया है और अप-टू-डेट और सतह प्रबंधक प्लगइन स्थापित किया गया है (चरण 1.1.3.1)।
    2. फ़ाइल के साथ एक TLM खोलें और खोलने के लिए एक TLM का चयन करें (उदा., TestMovie1]bleach.tif). Plugins के माध्यम से सतह प्रबंधक प्लगइन लोड करें और खंडीकरण (3 डी)| यहाँ ट्यूटोरियल में बनाया बचाया सेल मुखौटा लोड (जैसे, ParticlesStack1.tif) फ़ाइल के माध्यम से और खोलें और एक सेल मुखौटा (जैसे, कणStack1.tif) का चयन करें। ब्याज के इसी क्षेत्र लोड (ROI, उदा., TestMovie1]RoiSet.zip). चित्र 3Aदेखें.
    3. चयनित TLM में रुचि के चैनल पर स्विच करें.
      नोट: चैनल भेद करने के लिए, TLM के आस-पास इंगित रंग कोड का पालन करें.
    4. सतह प्रबंधक में, स्लाइस द्वारा औसत धूसर मान स्लाइस नामक विंडो को प्राप्त करने के लिए सांख्यिकी बटन क्लिक करें (चित्र 3B). ध्यान दें कि समय के साथ परिभाषित कक्ष रूपरेखा के भीतर दिए गए विश्लेषण चैनल में actomyosin संकेतों का माध्य/मध्य तीव्रता मान प्रदर्शित किया जाएगा, साथ ही कक्ष क्षेत्र और कक्ष आकृति से संबंधित अन्य पैरामीटर भी प्रदर्शित किए जाएँगे।
      नोट: तीव्रता मूल्यों मध्यस्थ इकाइयों में हैं (A.U.); सेल क्षेत्र पिक्सेल में है और वर्ग micrometers में परिवर्तित करने की जरूरत है.
    5. प्राप्त मानों को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें. सांख्यिकी विंडो पर क्लिक करें, फ़ाइल और के रूप में सहेजें.
      नोट: बाद में प्राप्त सांख्यिकीय मानों को निम्नानुसार सत्यापित करना संभव है: फिजी में ब्लीच-सही TLM खोलें और सतह प्रबंधक खोलें। संबंधित RoiSet.zip को TLM में लोड डिस्क बटन से दबाकर लोड करें और फ़ाइल खोलें. कक्ष बाह्यरेखाओं के साथ सहेजा गया मास्क अपलोड किया जाएगा और कक्षों के नाम बाएँ Surface प्रबंधक विंडो में दिखाई देंगे. सांख्यिकीय मानों के लिए सांख्यिकी बटन पर क्लिक करें.
  3. एलसीएस पर व्यक्तिगत उपकोशिक actomyosin संकेतों का मैनुअल विश्लेषण
    नोट: इस प्रोटोकॉल सबसे एकाग्रता की आवश्यकता है और समय लेने वाली है. सामान्य में, एक अधिग्रहीत TLM आराम से 1 दिन के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है. यह उनके विच्छेदन से पहले उड़ान भरने की तैयारी के लिए समय शामिल नहीं है, विच्छेदन ही, और छवि अधिग्रहण.
    1. एक अप-टू-डेट फिजी आवेदन में एक चयनित, ब्लीच-सही और पंजीकृत (ड्रिफ्ट-सही) TLM खोलें। एक परीक्षण उदाहरण के रूप में एक ब्लीच सही और बहाव सही TLM (उदाहरण के लिए, TestMovie1]bleach-reg.tif) का प्रयोग करें।
    2. छवि का उपयोग कर अलग-अलग actomyosin संकेतों को देखने के लिए चमक और इसके विपरीत समायोजित करें ; समायोजित करें और चमक /
    3. टीएलएम को ऊतक/शरीर अक्ष के सापेक्ष एक ही दिशा में संरेखित करें। अंडा कक्षों के मामले में, विश्लेषण से पहले अंडे के कक्षों के पूर्ववर्ती पक्ष को हमेशा छवि/सबमूवी/टीएलएम के बाईं ओर संरेखित करें।
    4. चयनित फिल्म को शॉर्ट 30 एस सबफिल्म्स और टाइम-प्रोजेक्ट में विभाजित करें। संगत नामों के साथ गैर-समय-प्रक्षेपित और समय-प्रक्षेपित उप-फिल्मों को सहेजें. मूल स्रोत रखें.
      नोट: Submovies पहले छवि के माध्यम से अवांछित फ्रेम को हटाने के द्वारा मूल TLMs से बनाया जा सकता है gt; ढेर gt; स्लाइस रिमूवर. निकाला जा करने के लिए स्लाइस निर्धारित करें और Increment सेट करें। जब Increment $ 1 टुकड़ा पदच्युत का उपयोग करने से पहले RGB करने के लिए रूपांतरण करें। समय-परियोजना के लिए एक 30 s submovie, क्लिक करें छवि gt; स्टैक ; $ परियोजना और परिभाषित फ़्रेम (slices) के लिए अधिकतम तीव्रता और उसके बाद ठीकक्लिक करें. दो बाद 30 s submovies में actomyosin संकेतों 2x गिनती से बचने के क्रम में हर दूसरे 30 s submovie छोड़ें.
    5. संगत 30 उपचलचित्र के आगे एक समय-प्रक्षेपित प्रतिबिंब रखें (चित्र 4क,बी)। समय-प्रक्षेपित उप-फिल्म पर सिग्नल लाइन की पहचान करें। मैन्युअल रूप से submovie खेलने के द्वारा मूल उपफिल्म में इस लाइन के साथ actomyosin संकेत आंदोलन (0 डिग्री-360 डिग्री) की दिशा की पहचान. परिभाषित ऊतक अक्ष या समान उपलब्ध उपकरण के सापेक्ष सिग्नल आंदोलन की दिशा को मैन्युअल रूप से मापने के लिए कोण उपकरण (फिजी पट्टी में) का उपयोग करें.
      नोट: फिजी केवल 0-180 डिग्री पैमाने पर कार्य करता है (चित्र 4ब्) और प्राप्त मानों की पुनर्परिकलन की आवश्यकता है 0 $-360$ पैमाने पर। एक संकेत लाइन समय के साथ एक actomyosin संकेत आंदोलन की गति से मेल खाती है.
    6. actomyosin संकेतों के विश्लेषण में दोहराव से बचने के लिए, समय-प्रक्षेपित उपफिल्म में कक्षों के भीतर विश्लेषण संकेत लाइनों को चिह्नित करें (चित्र 4B,D)।
    7. 30 s submovie में सभी चयनित कोशिकाओं का विश्लेषण करें और प्राप्त कोण को बचाने के.
      नोट: TLM भर में अच्छी तरह से परिभाषित सेल रूपरेखा के साथ कोशिकाओं में केवल subcellular कोशिकाद्रव्यी actomyosin संकेतों का विश्लेषण करें. पूरे TLM में कम से कम 15-20 का पता लगाया संकेतों के साथ अलग-अलग कोशिकाओं को शामिल नहीं। actomyosin संकेत है कि उनके अज्ञात मूल के कारण कोशिकाओं के पार ले जाने पर ध्यान न दें. 30 उपफिल्म में एक विश्लेषण ित कक्ष के लिए संकेत गणना का एक उदाहरण चित्र 4Dमें दर्शाया गया है।
    8. एक TLM के सभी 30 s लंबी submovies का विश्लेषण कर रहे हैं जब तक जारी रखें, और एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में एक TLM के actomyosin संकेतों के सभी मापा कोण को बचाने के.
    9. TLMs की प्रासंगिक संख्या (प्रयोग पर निर्भर) पर सभी मापा कोण योग करें. विश्लेषण actomyosin संकेतों की दिशा का प्रतिशत प्लॉट, उदाहरण के लिए, एक पसंदीदा सॉफ्टवेयर के साथ 0 डिग्री से 360 डिग्री के लिए एक सीमा के साथ एक गुलाब आरेख के रूप में.
      नोट: सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए, किसी भी अंडा चैम्बर चरण के पांच से दस स्वतंत्र अंडे कक्षों का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।

2. ऊतक स्केल

नोट: इनविट्रो सुसंस्कृत ड्रोसोफिला अंडे कक्षों में विच्छेदन और छवि के लिए, अनुपूरक फाइल 2में प्रोटोकॉल का पालन करें। प्राप्त TLMs का विश्लेषण करने के लिए, नीचे दिए गए निम्न प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें. TLMs की संगत परीक्षण फाइलें अनुपूरक फाइल 3में रखी जाती हैं।

  1. वक्र उपकला ऊतकों का चयनात्मक पृष् ठ निष्कर्षण
    नोट:इस प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को चुनिंदा समय के साथ एक घुमावदार उपकला ऊतक में actomyosin की एक पतली परत निकालने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल कदम उपयोगकर्ता के अनुकूल है और एक सहज ज्ञान युक्त चित्रमय अंतरफलक पर आधारित है. यह आराम से विश्लेषण करने के लिए संभव है (सतह निकालने) कई TLMs. का उपयोग करें TestMovie2.czi (सेअनुपूरक फ़ाइल 3) एक परीक्षण TLM उदाहरण के रूप में.
    1. एक अप-टू-डेट फिजी आवेदन खोलें (फिजी और मदद gt; अद्यतन gt; लागू करें परिवर्तन और ठीकहै)।
    2. सुनिश्चित करें कि दीर्घवृत्ताभ सतह प्रोजेक्शन प्लगइन15 स्थापित किया गया है। का पालन करें Viktorinova एट अल. 16.
    3. एक TLM खोलें और Plugins पर क्लिक करके एक XML/HDF5 फ़ाइल के रूप में निर्यात करें , BigDataViewer और वर्तमान छवि को XML/HDF5 फ़ाइलके रूप में निर्यात करें।
      नोट: यह एक निर्यात पथ को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है। बचत ही कई मिनट लग सकते हैं और TLM लंबाई पर निर्भर करता है.
    4. Plugins पर क्लिक करके दीर्घवृत्त पृष्ठ ीय प्रोजेक्शन में निर्यात की गई फ़ाइल खोलें ] BigDataViewer ]
      नोट: अंडे कक्ष के sagittal विचारों और प्रसंस्करण के माध्यम से उपयोगकर्ता मार्गदर्शन करने के लिए एक संवाद के साथ एक नई खिड़की दिखाई देगा. स्लाइस दृश्य में नेविगेट करने के तरीके पर विवरण https://imagej.net/BigDataViewer पर पाया जा सकता है.
    5. ओवेरी प्रोजेक्शन नामक संवाद विंडो में कई टैब हैं. पहले संवाद टैब में बाउंडिंग बॉक्स कहा जाता है, TLM में एक अंडा कक्ष के x और y सीमाओं को बाध्य बॉक्स के z चौड़ाई के साथ (अर्थात, एक z-stack/egg कक्ष की गहराई) और प्रेस सेट (चित्र 5A) को परिभाषित करें.
    6. बॉर्डर्स निर्धारित करने के लिए, x, y, और z के आगे बटन खींचें या x, y, और z बक्सों में संख्या निर्देशांक निर्धारित करें. सुनिश्चित करें कि सीमाओं सतह निष्कर्षण में ब्याज के अंडे कक्ष का हिस्सा पाने के लिए पर्याप्त उदार हैं। अंडा कक्ष के चयनित भागों गुलाबी में प्रकाश डाला जाता है.
    7. विंडो डिम्बग्रंथि प्रक्षेपण में blobs ढूँढें कहा जाता है टैब पर स्विच करें। सिग्मा और न्यूनतम शिखर मूल्य को परिभाषित करें; फिर, actomyosin संकेतों की पहचान करने के लिए गणना दबाएँ (चित्र 5B),जो हरे रंग के blobs के रूप में दिखाई देगा. पर्याप्त स्पॉट (लगभग 100) पाए जाते हैं जब तक कि विभिन्न पैरामीटर के साथ इस चरण का पुन: प्रयास करें।
      नोट: सिग्मा 1-u20123 कम से कम पीक मूल्य के साथ 20-u2012100 चरण-6 से -8 अंडे कक्षों के actomyosin संकेतों की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा काम करता है। actomyosin संकेतों की पहचान एक महत्वपूर्ण कदम है और संकेत की गुणवत्ता और उसके आकार पर निर्भर करता है. मौजूदा blobs के सही आकार की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। छवि में कोई दिखाई हरे धब्बे / blobs देखने के लिए चयनित z विमानों के माध्यम से ब्राउज़ करें.
    8. दीर्घवृत्तों को डिज़ाइन करने के लिए, फ़िट दीर्घवृत्तॉइडनामक टैब जारी रखें। रैंडम नमूने सेट करने के लिए 10,000, बाहर / अंदर कट-ऑफ दूरी करने के लिए 1$u201210, और उसके बाद, क्लिक करें Compute (चित्र 5C) .
      नोट: कम कट-ऑफ दूरी, और अधिक सटीक वांछित दीर्घवृत्तीय होगा। इस के बाद, प्रोजेक्शन नामक टैब स्वचालित रूप से खुल जाएगा और सतह निष्कर्षण की परिभाषा की अनुमति देता है। सेटिंग्स अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
    9. प्रोजेक्शन नामक टैब के साथ आगे जारी की जा रही है (चित्र 5D)। एक न्यूनतम और अधिकतम प्रक्षेपण दूरी (यानी, वांछित दीर्घवृत्तकी चौड़ाई) निर्धारित करें। यह एक न्यूनतम और अधिक से अधिक प्रक्षेपण दूरी निर्धारित करने के लिए इतना है कि गुलाबी परिभाषित दीर्घवृत्त क्षेत्र अंडे कक्ष के पूरे बाहर परत भी शामिल है की आवश्यकता है. टुकड़ा दूरी निर्धारित करें (1 अनुशंसित है).
      नोट: गलत और एक इष्टतम दीर्घवृत्ताभ फिट के उदाहरण जिसके परिणामस्वरूप गलत और इष्टतम प्रक्षेपण पैरामीटर चित्र 6A,Cमें दिखाए गए हैं। ब्याज की पतली परिधीय परत बाद में परिभाषित किया जा सकता है. सुनिश्चित करें कि अंडा कक्ष पर परिभाषित चौड़ाई के साथ दीर्घवृत्तका का गुलाबी क्षेत्र गणना दबाने से पहले दिखाई देता है। यह महत्वपूर्ण है कि वांछित दीर्घवृत्त (गुलाबी एकल पंक्ति) अच्छी तरह से सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए एक अंडा कक्ष के दीर्घवृत्त सतह फिट बैठता है। यदि दीर्घवृत्ताभ फिट अच्छा नहीं है, तो वांछित सतह निष्कर्षण प्राप्त होने तक विभिन्न सेटिंग्स की व्यवस्था करें।
      1. एक उत्पादन चौड़ाई सेट ($800) और ऊंचाई ($400) दीर्घवृत्तका. यह सेट करें कि किस समय बिंदु से सतह निष्कर्षण बनाया जाना चाहिए (यानी, TLM निष्कर्षण की लंबाई को परिभाषित करें)। या तो एक गोलाकार या बेलनाकार प्रक्षेपण चुनें. यदि आवश्यक हो तो Y को फ़्लिप करें और संरेखित करें.
      2. छविनामक नई विंडो में दोनों चैनलों के लिए सतह निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए पे्रस परिकलन करें। छवि पर क्लिक करके, अनुमानित actomyosin संकेतों को देखने में सक्षम होने के लिए प्राप्त छवि विंडो की चमक और इसके विपरीत समायोजित करें, छवि को समायोजित करें और ]gt; चमक/कन्ट्रास्ट को समायोजित करें।
        नोट: गलत और इष्टतम दीर्घवृत् तज फिट के परिणामस्वरूप किसी प्रक्षेपण की एक उदाहरण तुलना चित्र 6ठ,Dमें दर्शाया गया है।
    10. यदि सतह निष्कर्षण अच्छा लग रहा है, छवियों को बचाने के (दोनों चैनलों अलग से) के रूप में .tiff. साथ ही, कैसे इस विशेष अंडे कक्ष की सतह निकाला गया था के रूप में भविष्य के संदर्भ के लिए लॉग विंडो फ़ाइल सहेजें।
      नोट: यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण जानकारी है अगर निकाले पतली परत अपने मूल प्रकट आकार (केवल डेवलपर्स के लिए) को वापस किया जाना चाहिए.
    11. फिजी में एक पसंदीदा रंग कोड के साथ चैनलों मर्ज करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो, परियोजना actomyosin संकेतों के साथ z-स्टैक परतों का चयन किया. चयनित z-स्टैक परतों के प्रक्षेपण की आवश्यकता है जब अधिग्रहण ध्यान केंद्रित एक TLM में समय के साथ थोड़ा परिवर्तन. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सबसे एक से दो z-स्टैक परतों पर परियोजना.
    12. परिणामों को .tiff फ़ाइलों के रूप में सहेजें.
      नोट: पतली परतों के प्रतिनिधि उदाहरण (चयनात्मक बेसल और शीर्ष सतह) कि मायोसिन द्वितीय का प्रतिनिधित्व (MRLC::GFP) नियंत्रण और fat2 उत्परिवर्ती अंडे कक्षों के कूप उपकला से संकेत चित्रा 8में पाया जा सकता है.
  2. चुनिंदा निकाले गए ऊतक सतह का डाटा प्रोसेसिंग
    1. ब्लीच सही TLMs फ्लोरोसेंट लेबल की तीव्रता क्षय के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए.
      1. फिजी खोलें. एक TLM खोलें (जैसे, TestMovie2]extraction.tif पूरक फ़ाइल 3से ) फ़ाइल का उपयोग कर छवि को खोलने के लिए उसका चयन करें.
      2. रंग चैनलों को विभाजित करें और उन्हें 16-बिट छवियों में परिवर्तित करें, यदि आवश्यक हो, तो छवि पर क्लिक करके 16-बिट छवियों के लिए चैनल कन्वर्ट (32-बिट छवियों से) छवि का उपयोग कर [gt; प्रकार gt; 16-बिट.
      3. दोनों चैनलों पर एक ब्लीच सुधार प्रदर्शन छवि का उपयोग कर ते व समायोजित करें ] र्ं ब्लीच सुधार ]gt; सरल अनुपात gt; पृष्ठभूमि तीव्रता 0.0.
        नोट: असंतोषजनक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं, तो यह पता लगाने के लिए जो इस प्लगइन में सुधार के तरीकों सबसे अच्छा फिट (जैसे, एक सरल अनुपात के बजाय हिस्टोग्राम मिलान का उपयोग करें) की आवश्यकता है.
      4. छवि पर क्लिक करके दो ब्लीच सही छवियों से चैनलों मर्ज gt; रंग gt; मर्ज चैनल. फ़ाइल पर क्लिक करके मर्ज की गई छवि को .tiff फ़ाइल के रूप में सहेजें ; इस रूप में सहेजें ] Tiff.
        नोट: यदि आवश्यक हो तो चैनलों के लिए इसके विपरीत और चमक समायोजित करें।
    2. TLMs के लिए कोई सेल मास्क जनरेट करने के लिए कक्ष विभाजन
      1. यदि फिजी पहले से खुला नहीं है, तो उसे फिर से खोलें (और सुनिश्चित करें कि यह मदद पर क्लिक करके अप-टू-डेट है]
      2. यदि यह पहले से ही ऐसा नहीं किया जाता है, तो मैक्रो टिश्यू-सेलसेगमेंटमूवी.http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm डाउनलोड करें।
      3. खींचें और फिजी में इस स्क्रिप्ट ड्रॉप. ब्लीच-सही फ़ाइल खोलें (उदा., Supplementary File 3से TestMovie2-bleach.tif , 2.2.1) भी देखें।
      4. छवि पर क्लिक करके ब्लीच-सही फ़ाइल के चैनलों को विभाजित करें । छवि पर क्लिक करके स्पष्ट कक्ष बाह्यरेखाओं को सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली चैनल समायोजित करें ; समायोजित करें ] चमक/
      5. खुली स्क्रिप्ट में चिह्न चलाएँ दबाकर चयनित TLM के सक्रिय कक्ष मेम्ब्रेन चैनल पर अपलोड की गई स्क्रिप्ट चलाएँ. 1.500करने के लिए गाऊसी कलंक सेट | -1 के लिए कक्ष डिटेक्शन संवेदनशीलता सेट करें और ठीकक्लिक करें. 40x उद्देश्य के साथ प्राप्त TLMs के लिए $8 के लिए अनुमानित शोर सहिष्णुता सेट करें और ठीकक्लिक करें.
        नोट: आदेश में एक अच्छा सेल मुखौटा पाने के लिए, ऊपर इन मापदंडों को बदल नहीं है. अन्य उद्देश्यों के लिए, विभिन्न पैरामीटर की आवश्यकता हो सकती है। एक TLM में पृष्ठभूमि क्लीनर, कम अनुमानित शोर सहिष्णुता की आवश्यकता है.
      6. एक उत्पन्न सेल मुखौटा विश्लेषण TLM में और भी एक नई विंडो में ParticleStack (जी)कहा जाता है प्रकट होता है. साथ ही, क्रिया आवश्यक नामक एक छोटी विंडो प्रकट होता है। TLM पर कक्ष मास्क से, केवल TLM के केंद्र में कक्षों पर ध्यान केंद्रित करें और उन का चयन करें जो पूरे TLM में पूर्ण और अच्छी तरह से परिभाषित बाह्यरेखाएँ प्रदान कर सकते हैं.
      7. यदि चयनित कक्षों में कृत्रिम/अतिरिक्त कक्ष बाह्यरेखाएँ हैं, तो TLM में आवश्यक क्रिया नामक मर्ज उपकरण विंडो का उपयोग करें. बाद के लिए, विंडो में दिए गए निर्देशों का पालन करें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि सेल बाह्यरेखाएँ अच्छी तरह से परिभाषित हैं और TLM में वास्तविक कोशिका झिल्ली के अनुरूप हैं क्योंकि कोई भी अपरिपक्वता बाद के विश्लेषणों को प्रभावित कर सकती है। अतिरिक्त tweaks और परिवर्तन, जैसे अवांछित कोशिकाओं को हटाने, बाद में सतह प्रबंधक उपकरण का उपयोग कर किया जा सकता है (नीचे ट्यूटोरियल में उल्लिखित).
      8. जब केंद्र में चयनित कोशिकाओं को अच्छी तरह से असली कोशिका झिल्ली के अनुरूप हैं, एक .tiff फ़ाइल के रूप में ParticleStack सहेजें फ़ाइल निम्नलिखित और सहेजें के रूप में gt; Tiff. पहले अनुभाग 1.1.3 और 1.2 (भी खंड 2.2.3 और 2.3 में विस्तार से वर्णित) में प्रदर्शन के रूप में भूतल प्रबंधक में उत्पन्न सेल मास्क और actomyosin विश्लेषण की लोडिंग करने के लिए आगे बढ़ें।
    3. भूतल प्रबंधक में जनरेट किया गया सेल मास्क का लोड हो रहा है
      1. सतह प्रबंधक प्लगइन पहले से ही फिजी सेटअप में स्थापित है, तो चरण 2 के लिए आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो Viktorinova एट अल16का पालन करें . डेवलपर्स के लिए, सिर्फ स्रोत कोड भी उपलब्ध है15.
      2. Plugins पर क्लिक करके खोलें सतह प्रबंधक gt; खंडीकरण ]gt; भूतल प्रबंधक (3D)|
        नोट: सतह प्रबंधक विंडो दाईं ओर कई क्रिया बटन और बाईं ओर एक रिक्त विंडो प्रदर्शित करता है। सभी क्रिया बटन देखने के लिए, यह विंडो अपनी ऊंचाई/चौड़ाई में फैलाने के लिए आवश्यक हो सकता है। ध्यान दें कि समय फ़्रेम z-slices के रूप में दिखाई देगा।
      3. फ़ाइल के माध्यम से सतह प्रबंधक में इसी ParticleStack.tif फ़ाइल खोलें और खोलने के लिए छवि का चयन करें (जैसे, ParticleStack2.tif अनुपूरक फ़ाइल 3से).
      4. सतह प्रबंधक में, बाह्यरेखा छवि पढ़ें बटन क्लिक करें और जैकार्ड अनुक्रमणिका को 60% पर सेट करें.
        नोट: एक ParticleStack.tif फ़ाइल लोड हो रहा है, कंप्यूटर पावर के आधार पर कई मिनट तक ले सकते हैं।
      5. एक बार लोड होने पर, प्रत्येक कक्ष को S संख्या के साथ असाइन किया जाएगा और वह Surface Manager विंडो के बाएँ भाग में दिखाई देगा (चित्र 7A).
        नोट: सभी कक्षों के लिए बाह्यरेखाएँ और कक्ष नाम दिखाने के लिए, सभी दिखाएँ और सतह प्रबंधक विंडो के निचले भाग पर लेबल दिखाएँ चेकबॉक्स दिखाएँ. यह एक बार सेल नंबर उनकी शुद्धता के लिए जाँच की गई है इस समारोह का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
      6. पहले एस नंबर पर क्लिक करें; कणStack.tif से आयातित सेल बाह्यरेखा TLM पर प्रकट होता है। TLM में कक्ष बाह्यरेखा गुणवत्ता के लिए प्रत्येक आयातित S संख्या की जाँच करें और अवांछित कक्ष जो गलत कक्ष बाह्यरेखा प्रदर्शित निकालें। ऐसा करने के लिए, कक्ष बाह्यरेखा को हाइलाइट करें और हटाएँबटन पर क्लिक करें.
        नोट: यह भी imprecise सेल रूपरेखा के लिए सही है और नई कक्ष रूपरेखा जोड़ने के लिए संभव है. यह चर्चा अनुभाग में वर्णित है.
      7. डिस्क पर सहेजें बटन दबाकर सभी सही कक्षों को RoiSet.zip फ़ाइल के रूप में सहेजें.
        नोट: सत्र बाधित करने की आवश्यकता है, तो बाद में सतह प्रबंधक में RoiSet.zip फ़ाइल लोड करने के लिए संभव है: फ़ाइल के माध्यम से फिजी में TLM खोलें और एक TLMका चयन करें। खुला सतह प्रबंधक निम्नानुसार: Plugins और सेगमेंटेशन ]gt; भूतल प्रबंधक(3 D)| संबंधित RoiSet.zip डिस्क बटन से लोड पर क्लिक करके और उपयुक्त RoiSet.zip फ़ाइल (जैसे, TestMovie2-RoiSet.zip) का चयन करके लोड करें। डबल-चेक करें कि लोड किए गए कक्ष मास्क लोड किए गए TLM के संगत हैं.
  3. भूतल प्रबंधक में actomyosin दालों का विश्लेषण
    नोट: फिजी खोलें और सुनिश्चित करें कि कोई TLM और उसके संबंधित कक्ष मास्क सतह प्रबंधक में खुला है। सुनिश्चित करें कि फिजी स्थापित किया गया है और अद्यतित है और सतह प्रबंधक प्लगइन (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) स्थापित किया गया है।
    1. फ़ाइल के साथ एक TLM खोलें और खोलने के लिए एक TLM का चयन करें (उदा., TestMovie2-bleach.tif). Plugins के माध्यम से सतह प्रबंधक प्लगइन लोड करें gt; खंडीकरण ]gt; भूतल प्रबंधक (3 डी)| यहाँ ट्यूटोरियल में बनाया बचाया सेल मुखौटा लोड (जैसे, ParticlesStack2.tif) फ़ाइल के माध्यम से और खोलें और एक सेल मुखौटा (जैसे, कणStack2.tif) का चयन करें। संबंधित ROI लोड करें (उदा., TestMovie2]RoiSet.zip).
    2. चयनित TLM में रुचि के चैनल पर स्विच करें.
      नोट: चैनलों के बीच अंतर करने के लिए, TLM के आस-पास इंगित रंग कोड का पालन करें.
    3. सतह प्रबंधक में, स्लाइस द्वारा औसत धूसर मान स्लाइस नामक विंडो को प्राप्त करने के लिए सांख्यिकी बटन क्लिक करें (चित्र 7B). ध्यान दें कि समय के साथ परिभाषित कक्ष रूपरेखा के भीतर दिए गए विश्लेषण चैनल में actomyosin संकेतों का माध्य/मध्य तीव्रता मान प्रदर्शित किया जाएगा, साथ ही कक्ष क्षेत्र और कक्ष आकृति से संबंधित अन्य पैरामीटर भी प्रदर्शित किए जाएँगे।
      नोट: तीव्रता मान A.U. में हैं; सेल क्षेत्र पिक्सेल में है और वर्ग micrometers में परिवर्तित करने की जरूरत है.
    4. प्राप्त मानों को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें: सांख्यिकी विंडो, फ़ाइल पर क्लिक करें और इस रूप मेंसहेजें.
      नोट: प्राप्त सांख्यिकीय मानों को बाद में सत्यापित करना निम्नानुसार संभव है. फिजी में ब्लीच-सुधारित TLM खोलें। सतह प्रबंधक खोलें। संबंधित RoiSet.zip को TLM में लोड डिस्क बटन से दबाकर लोड करें और फ़ाइल खोलें. कक्ष बाह्यरेखाओं के साथ सहेजा गया मास्क अपलोड किया जाएगा और कक्षों के नाम बाएँ Surface प्रबंधक विंडो में दिखाई देंगे. सांख्यिकीय मानों के लिए सांख्यिकी बटन पर क्लिक करें.
      नोट: व्यक्तिगत subcellular actomyosin संकेतों केएक मैनुअल विश्लेषण के बारे में, यह ऊतक पैमाने पर subcellular actomyosin संकेतों का एक मैनुअल विश्लेषण करने के लिए संभव नहीं है. अनुकूलन अर्द्ध ऊतक पैमाने पर व्यक्तिगत actomyosin संकेतों के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, के रूप में चर्चा अनुभाग में प्रकाश डाला.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों उपकला ऊतकों में actomyosin नेटवर्क के व्यवहार की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है. यह केवल तभी संभव है जब स्थानीय सेलुलर पैमाने पर actomyosin व्यवहार का एक विस्तृत विश्लेषण (कुछ कोशिकाओं) ऊतक पैमाने पर एक समान विश्लेषण के साथ संयुक्त है (कई कोशिकाओं). तथापि, उपकला ऊतक अक्सर वक्रित होते हैं और इन ऊतकों की पतली परत की निष्कर्षण पहले आसानी से संभव नहीं था, जैसा कि ड्रोसोफिला अंडे कक्षों में दिखाया गया है (चित्र 1)। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन दोनों तराजू पर actomyosin व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए कैसे का वर्णन सरल निर्देश के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करता है (चित्र2).

इस प्रोटोकॉल का पहला भाग भूतल प्रबंधक प्लगइन (चित्र 3) का उपयोग करके actomyosin दालों के विश्लेषण के संबंध में निर्देशों पर केंद्रित है। यह भी वर्णन करता है कि कैसे मैन्युअल रूप से स्थानीय सेलुलर पैमाने पर व्यक्तिगत actomyosin व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए (चित्र 4). इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में बताया गया है कि दीर्घवृत्तीय भूतल प्रोजेक्शन प्लगइन का उपयोग करके उपकला ऊतक की एक पतली परत कैसे निकाली जाए (चित्र 5 तथा चित्र 6)। केवल तभी सतह प्रबंधक प्लगइन का उपयोग करते हुए ऊतक पैमाने पर actomyosin दालों का विश्लेषण करना संभव है (चित्र 7)। प्रतिनिधि परिणाम और स्थानीय सेलुलर और ऊतक पैमाने पर स्थिर fat2 उत्परिवर्ती Drosophila अंडे कक्षों घूर्णन में actomyosin व्यवहार की तुलना चित्रा 8 में दिखाया गया है और इसी मूवी 1में , मूवी 2, मूवी 3, मूवी 4, मूवी 5, और मूवी 6 (विवरण के लिए, चित्रा 8देखें )।

Figure 1
चित्र 1: घुमावदार ऊतक की सतह की पतली परत का चयनात्मक निष्कर्षण। (ए) परिधीय घुमावदार एपिथेलिया में actomyosin नेटवर्क के बारे में पर्याप्त जानकारी प्राप्त करने के लिए, यह एक दृश्य ऊतक के बहुमत पर एक गहरी z-स्टैक (गुलाबी) प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के रूप में घुमावदार कूप उपकला उपकला (ग्रे) के लिए दिखाया गया है Drosophila अंडे कक्षों की. (ए') हालांकि, इस तरह के एक z-स्टैक का एक सरल प्रक्षेपण कूप कोशिकाओं में पूरे actomyosin नेटवर्क के मिश्रण की ओर जाता है. Myosin द्वितीय MRLC के साथ कल्पना::GFP (हरा) दृढ़ता से व्यक्त आंतरिक (शीर्ष) इस तरह के एक z-प्रक्षेप में कूप कोशिकाओं के क्षेत्र से पता चलता है और बेसल (बाहरी) पक्ष से लगभग कोई जानकारी नहीं है, जहां Myosin द्वितीय एक मजबूत समतल सेल polarity phenotype प्रदर्शित करता है, लेकिन इसके संकेत की तीव्रता कम12है। पैनल में दिखाए गए इस तरह के मिश्रण से बचने के लिए, हमने एक उपयोगकर्ता के अनुकूल,फिजी-आधारित प्लगइन विकसित किया है जिसे BigDataViewer18 में दीर्घवृत्तSurface प्रोजेक्शन कहा जाता है जो एक परिभाषित, पतली परत के चयनात्मक निष्कर्षण की अनुमति देता है (गुलाबी) ) एक घुमावदार उपकला से actomyosin की ) के रूप में Myosin द्वितीय के लिए दिखाया गया है (हरा) कूप उपकला के आधार (बाहरी) पक्ष का एक चयनित निष्कर्षण में. Myosin द्वितीय के संकेत में अंतर की तुलना करें (MRLC::GFP) पैनलों में 'A' और B'| पैनल बी में मायोसिन द्वितीय के समतल ध्रुवित पैटर्न को नोट करें। कक्ष बाह्यरेखाएँ लाल रंग में हैं. अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: स्थानीय सेलुलर और ऊतक तराजू पर प्लैनार polarized actomyosin नेटवर्क. विभिन्न पैमानों पर actomyosin के इमेजिंग उपकला कोशिकाओं की विभिन्न संख्या के विश्लेषण की अनुमति देता है, अर्थात् () अप करने के लिए 15 स्थानीय सेलुलर पैमाने पर कोशिकाओं और (बी) 50-100 कोशिकाओं को सुसंस्कृत के कूप उपकला उपकला में ऊतक पैमाने पर Drosophila अंडे कक्षों. Nonmuscle Myosin II MRLC के साथ कल्पना की है::GFP (हरा) और प्रयुक्त ट्रांसजेनिक लाइन के जीनोटाइप सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट किया गया है। कक्ष रूपरेखा मैजंटा में हैं। अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार्स ] 5 $m (A); 50 डिग्री मी (बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: स्थानीय सेलुलर पैमाने पर सतह प्रबंधक में Myosin द्वितीय दालों के विश्लेषण का एक उदाहरण. (ए) एक कण ढेर सतह प्रबंधक में भरी हुई है. ध्यान दें कि TLM में सभी पहचाने गए कक्ष सतह प्रबंधक विंडो में प्रकट होते हैं। यह एक TLM भर में सभी अवांछित या अपूर्ण कक्षों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है. (B) चयनित कक्षों के लिए मायोसिन II (MRLC::GFP) पर प्राप्त आंकड़े सतह प्रबंधक में स्लाइस द्वारा औसत धूसर मान स्लाइस नामक विंडो में दिखाए जाते हैं. MRLC::GFP हरे रंग में दिखाया गया है whilst सेलुलर झिल्ली लाल रंग में हैं. अग्र पक्ष बाईं ओर है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: स्थानीय सेलुलर पैमाने पर व्यक्तिगत मायोसिन द्वितीय संकेतों के मैनुअल विश्लेषण का एक उदाहरण। () एक चयनित 30 एस लंबीउपफिल्म अपने समय प्रक्षेपण के बगल में रखा गया है . ध्यान दें कि समय प्रक्षेपण पर, Myosin द्वितीय (MRLC::GFP) एक व्यक्तिगत समय सीमा की तुलना में व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर अब प्रक्षेप पथ रेखाओं से पता चलता है (पैनल बीदेखें). कोशिकाओं में अलग-अलग लाइनों अंडे कक्षों के पूर्वकाल-पश्च अक्ष के सापेक्ष उनके कोणीय दिशा के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए। (ग) ध्यान दें कि फ़िजी 0डिग्री-360 डिग्री का माप नहीं करता है, लेकिन केवल 0-180 डिग्री ऊपर की ओर इशारा करने वाले संकेतों के लिए और 0 डिग्री-179 डिग्री नीचे की ओर इशारा करने वाले संकेतों के लिए। ध्यान रखें कि 0 डिग्री एक विश्लेषण छवि के अधिकार पर आम तौर पर रखा जाता है. (घ) इस सूचना के आधार पर, किसी विशेष अंडा कक्ष में उपकला घूर्णन की दिशा (गुलाबी में) या उसके विरुद्ध (पीले रंग में) के विरुद्ध चलने वाली रेखाओं को यह पहचानने के लिए बाध्य किया जाना चाहिए कि क्या विश्लेषणित संकेतों का सममिति तोड़ने के भीतर एक सेल और फिर विश्लेषण ऊतक में कई कोशिकाओं के लिए. MRLC::GFP हरे रंग में दिखाया गया है whilst सेलुलर झिल्ली लाल रंग में हैं. अग्र पक्ष बाईं ओर है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ऊतक पैमाने पर दीर्घवृत्ताभ फिट उत्पन्न करने का एक उदाहरण। BigDataViewer में दीर्घवृत्तीय सतह प्रोजेक्शन प्लगइन का उपयोग करके एक अंडा कक्ष पर एक दीर्घवृत्तभ को फिट करने के लिए, यह परिभाषित करने के लिए आवश्यक है (ए ) एक बाउंडिंग बॉक्स जिसमें स्कैन किए गए ऊतक के बहुमत शामिल हैं। इसके बाद, संकेत बिंदुओं की पहचान करना (बी) महत्वपूर्ण है, जो इष्टतम दीर्घवृत्ताभ फिट पीढ़ी के लिए एक पूर्वावश्यकता है। () जब दीर्घवृत् तज फिट इष्टतम नहीं होता है और अंडे के चैम्बर को अच्छी तरह से चारों ओर नहीं रखता है, तो इसका परिणाम यह होता है (डी) खराब ऊतक परत निष्कर्षण। चित्र 6में निष्कर्षण और बाद के प्रक्षेपण के परिणाम देखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एक गलत और इष्टतम दीर्घवृत्ताभ फिट और इसी सतह अनुमानों की तुलना. () जब दीर्घवृत्ताभ ठीक से फिट नहीं होता है, (बी) अंतिम सतह प्रक्षेपण विश्लेषणित ऊतक की पतली परत में पूर्ण संकेत डेटा प्रदान नहीं करेगा। (ग) हालांकि, जब इष्टतम रूप से फिट किया जाता है, तो यह ऊतक में एक पतली परत का समान संकेत पता लगाने की गारंटी देता है। (घ) ध्यान दें कि इष्टतम सतह प्रक्षेपण में समय के साथ सतह पर प्रक्षेपित z-स्टैक के रूप में कई पतली परतें होती हैं, जिन्हें बाद में चित्र 8में दर्शाए अनुसार अलग किया जा सकता है. Myosin द्वितीय संकेत (MRLC::GFP, सफेद) और झिल्ली संकेतों (सफेद) शुरू में प्रक्षेपण से पहले विलय कर रहे हैं (पैनल और सी),लेकिन सतह प्रक्षेपण पर ही, इन चैनलों को अलग कर रहे हैं (पैनल बी में Myosin द्वितीय के अनुमानों देखें और डी) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: ऊतक पैमाने पर सतह प्रबंधक में Myosin द्वितीय दालों के विश्लेषण का एक उदाहरण. (ए) एक कण ढेर सतह प्रबंधक में भरी हुई है. ध्यान दें कि TLM में सभी पहचाने गए कक्ष सतह प्रबंधक विंडो में प्रकट होते हैं। यह एक TLM भर में सभी अवांछित या अपूर्ण कक्षों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है. (B) मायोसिन II (MRLC::GFP) पल्सेस (mean या माध्यिका) पर प्राप्त सांख्यिकी समय के साथ चयनित कक्षों के लिए पृष्ठ प्रबंधक में स्लाइस द्वारा औसत ग्रे मान स्लाइस नामक विंडो में दिखाए जाते हैं। ध्यान दें कि मजबूत Myosin द्वितीय डॉट्स आंतरिक Myosin द्वितीय तीव्रता के अंतिम उपाय को प्रभावित कर सकते हैं. इन मायोसिन II डॉट्स जहाँ जनरेट किया गया कक्ष मास्क में कोई ग़लत कक्ष बाह्यरेखा परिभाषा है कक्ष बाह्यरेखा से बाहर माइग्रेट करने के लिए प्रकट हो सकता है जो समस्या से यह परिणाम है। MRLC::GFP हरे रंग में दिखाया गया है whilst सेलुलर झिल्ली लाल रंग में हैं. पूर्वकाल पक्ष शीर्ष पर है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: Drosophila कूप उपकला उपकला उपकला में एक Myosin द्वितीय नेटवर्क के प्रतिनिधि परिणाम. गतिशील Myosin द्वितीय के प्रतिनिधि उदाहरण (MRLC::GFP) व्यवहार ( और बी) स्थानीय सेलुलर पैमाने पर और (सी-एफ) नियंत्रण और fat2 उत्परिवर्ती Drosophila अंडे कक्षों के लिए ऊतक पैमाने पर. प्रयुक्त जीनोटाइप के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें। ध्यान दें कि MRLC:GFP संकेतों (हरा) नियंत्रण अंडे कक्षों के पूर्वकाल-पश्च (एपी) अक्ष के लंबवत ले जाएँ। इस ध्रुवता fat2 उत्परिवर्ती अंडे कक्षों में खो दिया है औरएनिसोट्रोपिक मायोसिन द्वितीय दालों की ओर जाता है / छोटे MRLC के मैनुअल विश्लेषण पर::GFP संकेतों ($300 $m) और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में उनके कोणीय दिशात्मक आंदोलन के परिमाणीकरण, MRLC की समरूपता तोड़ने::GFP संकेतों उपकला की दिशा के खिलाफ एक वरीयता के साथ मनाया जा सकता है एक विश्लेषित अंडा कक्ष12 में रोटेशन (चित्र 4)। संगत फिल्में हैं: पैनल ] मूवी 1, पैनल बी ] मूवी 2, पैनल सी ] मूवी 3, पैनल डी ] मूवी 4, पैनल ] मूवी 5, और पैनल एफ ] मूवी 6| कक्ष रूपरेखा मैजंटा में दिखाई जाती हैं। अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार्स - 5 डिग्री ( और बी) और 50 डिग्री (सी-एफ) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्थानीय सेलुलर पैमाने पर कम समय उच्च गति इमेजिंग के लिए अनुशंसित पैरामीटर:
मैं. ब्याज के ऊतक मुक्त रूप से culturing माध्यम में रखा (यानी कोई कवर फिसल जाता है, लचीला कंबल, आदि)
द्वितीय. 63x जल उद्देश्य संख्यात्मक छिद्र के साथ gt; $ 1.3
Iii. उल्टे कॉन्फोकल सूक्ष्मदर्शी
Iv. एकल विमान
वी. 6-12 s समय अंतराल
Vi. 5-10 मिनट टीएलएम
सातवीं. 100MB तक TLM प्रति डेटा संग्रहण आवश्यकता
ऊतक पैमाने पर लंबे समय तक कम गति इमेजिंग के लिए अनुशंसित पैरामीटर:
मैं. ब्याज के ऊतक मुक्त रूप से culturing माध्यम में रखा (यानी कोई कवर फिसल जाता है, लचीला कंबल, आदि)
द्वितीय. 40x जल उद्देश्यों और संख्यात्मक छिद्र gt; $ 1.3
Iii. उल्टे कताई डिस्क माइक्रोस्कोप
Iv. z-स्टैक्स को अंडे के कक्ष का आधा प्राप्त करने के लिए
वी. 60 s समय अंतराल
Vi. कम से कम 30 मिनट TLMs
सातवीं. डेटा भंडारण आवश्यकता ca. 1GB

तालिका 1: अनुशंसित इमेजिंग पैरामीटर.

Movie 1
मूवी 1: Myosin द्वितीय के प्रतिनिधि गतिशील व्यवहार (MRLC::GFP) एक नियंत्रण Drosophila अंडे कक्ष में सेलुलर पैमाने पर. ध्यान दें कि MRLC:GFP (हरा) अंडे कक्षों के एपी अक्ष के लंबवत स्थानांतरित करने के लिए पसंद करते हैं. सेल रूपरेखा मैजंटा में हैं. बासल दृश्य. अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 5 m. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।

Movie 2
मूवी 2: Myosin द्वितीय के प्रतिनिधि गतिशील व्यवहार (MRLC::GFP) एक fat2 उत्परिवर्ती Drosophila अंडे कक्ष में सेलुलर पैमाने पर. ध्यान दें कि MRLC:GFP दालों (हरा) और अब planar स्थिर अंडा कक्षों के एपी अक्ष के लंबवत गठबंधन है. सेल रूपरेखा मैजंटा में हैं. बासल दृश्य. अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 5 m. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।

Movie 3
मूवी 3: बेसल Myosin द्वितीय के प्रतिनिधि गतिशील व्यवहार (MRLC::GFP) एक नियंत्रण Drosophila अंडे कक्ष में ऊतक पैमाने पर. ध्यान दें कि केवल एक पतली बेसल (बाहरी) MRLC::GFP परत एक अंडा कक्ष के कूप उपकला उपकला के लगभग आधे से निकाला जाता है. MRLC::GFP हरे रंग में है और सेल रूपरेखा मैजंटा में हैं. प्राप्त MRLC के विस्तार के स्तर में अंतर पर ध्यान दें::GFP संकेत व्यवहार यहाँ (ऊतक पैमाने का प्रतिनिधित्व) के रूप में मूवी 1 की तुलना में (सेल्युलर पैमाने का प्रतिनिधित्व). अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।

Movie 4
फिल्म 4: एक fat2 उत्परिवर्ती Drosophila अंडे कक्ष में ऊतक पैमाने पर बेसल Myosin द्वितीय (MRLC::GFP) के प्रतिनिधि गतिशील व्यवहार. ध्यान दें कि MRLC: GFP (हरा) दालों दृढ़ता से एक fat2 उत्परिवर्ती अंडे कक्ष के कूप उपकला उपकला के लगभग आधे के आधार पक्ष पर और उपकला रोटेशन को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक सिंक्रनाइज़ बल उत्पन्न करने में विफल रहता है. सेल रूपरेखा मैजंटा में हैं. अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।

Movie 5
फिल्म 5: एक नियंत्रण Drosophila अंडे कक्ष में ऊतक पैमाने पर शीर्ष Myosin द्वितीय (MRLC::GFP) के प्रतिनिधि गतिशील व्यवहार. केवल एक पतली MRLC::GFP परत एक अंडा कक्ष के कूप उपकला उपकला के लगभग आधे के शीर्ष (इनर) पक्ष से निकाला जाता है. ध्यान दें कि MRLC:GFP (हरे रंग में) शीर्ष पक्ष पर यहाँ विभिन्न गतिशील व्यवहार से पता चलता है के रूप में कूप उपकला के बेसल पक्ष की तुलना में (जैसा कि मूवी 3में दिखाया गया है ). सेल रूपरेखा मैजंटा में हैं. अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।

Movie 6
मूवी 6: शीर्ष Myosin द्वितीय के प्रतिनिधि गतिशील व्यवहार (MRLC::GFP) एक fat2 उत्परिवर्ती Drosophila अंडे कक्ष में ऊतक पैमाने पर. MRLC के बदल गतिशील व्यवहार::GFP (हरा) एक स्थिर fat2 उत्परिवर्ती अंडे कक्ष के कूप उपकला उपकला के लगभग आधे की एक पतली शीर्ष क्षेत्र से निकाले. सेल रूपरेखा मैजंटा में हैं. अग्र पक्ष बाईं ओर है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।

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Discussion

महत्वपूर्ण कदम और विच्छेदन और अंडे कक्षों की culturing के लिए समस्या निवारण

यदि बहुत अधिक मक्खियां एक छोटी शीशी में रखी जाती हैं, तो मक्खी भोजन 2-3 दिनों के बाद मैला हो सकता है क्योंकि लार्वा और वयस्क मक्खियां मक्खी भोजन में फंस जाती हैं। ऐसे मामले में, ताजा भोजन के साथ एक नई शीशी में इन मक्खियों के बाकी फ्लिप और उनकी संख्या downsize. विशेष रूप से, महिलाओं है कि भोजन में फंस गए थे बाहर.

Schneider मिश्रण (एसएम) अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए और $ 14 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ध्यान रखें कि एक पुराने मिश्रण क्रिस्टल है कि अंडे कक्षों की सतह को नुकसान पहुंचा सकता है हो सकता है. हमेशा ताजा जोड़ा इंसुलिन के साथ एसएम मिश्रण और यह कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति. यह ठंड सदमे के खिलाफ अंडे कक्षों की रक्षा करता है, जो microtubules के विकास और साइटोस्केलेटन के समतल संरेखण पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है (जैसा कि विकासशील ड्रोसोफिला विंग19में देखा जाता है)।

अंडा कक्षों और चयनित ovarioles बहुत नाजुक हैं और, उनके छोटे आकार के कारण, SMI में तैर सकता है (इंसुलिन के साथ एसएम). यह उन्हें स्वतः SMI में सिंक जाने के लिए सिफारिश की है. वे भी अक्सर विच्छेदन forceps / कैक्टस उपकरण के लिए छड़ी. ऐसे मामले में, उन्हें धीरे से उन्हें SMI में ले जाकर विच्छेदन उपकरणों से खुद को रिहा करते हैं. निचोड़ और हर समय उन्हें सीधे छू से बचें। यदि आवश्यक हो, तो आगे के प्रोटोकॉल से इन अंडे कक्षों/

चूंकि विच्छेदन स्टीरियोस्कोप क्षतिग्रस्त अंडा कक्षों/ओवोरियोल्स की पहचान के लिए विश्वसनीय नहीं है, अंडा कक्षों/ओवोरियोल को एक confocal/स्पिनिंग डिस्क माइक्रोस्कोप के तहत एक CellMask या FM 4-64 डाई का उपयोग करके जांच की जानी चाहिए। क्षतिग्रस्त अंडा कक्षों चरम रंग दिखाने के रूप में एक क्षतिग्रस्त अंडा चैम्बर ऊतक पृष्ठभूमि की तुलना में. कभी मजबूत डाई पैच के साथ एक TLM प्राप्त.

महत्वपूर्ण कदम और अंडा कक्षों के इन विट्रो लाइव इमेजिंग के लिए समस्या निवारण

यदि SMI में स्वतंत्र रूप से रखा अंडे कक्षों अभी भी कदम, confocal माइक्रोस्कोप के तहत फिर से जाँच करने के लिए देखने के लिए कि क्या वहाँ अभी भी मांसपेशी शीट और SMI में चल मलबे के किसी भी अनदेखी अवशेष हैं. उन्हें निकालें और पुन: प्रयास करें. अंडे के कक्षों में से, 90% बाद इमेजिंग के दौरान स्थिर और स्थिर होना चाहिए।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक चयनित अंडा कक्ष/ओवैरियोल स्थिर है, 1 मिनट के लिए उच्च गति इमेजिंग (6 s अंतराल) का उपयोग करें। अस्थिर अंडा कक्ष इस बिंदु से आगे बढ़ेगा। हालांकि, यह धीरे छवि अंडे कक्ष के एक संभावित अप्रत्याशित आंदोलन को सही करने में सक्षम होने के लिए पूरे समय चूक रिकॉर्डिंग देखने के लिए सिफारिश की है। यह सूक्ष्म मंच / टेबल, जो सुसंस्कृत अंडे कक्षों के साथ पेट्री पकवान रखती है /

छवि अंडे कक्ष के अचानक और अप्रत्याशित आंदोलन प्रकट होता है, तो इमेजिंग बंद करो। माइक्रोस्कोप तालिका के cushioning की जाँच करें, और अधिग्रहण के समय के दौरान माइक्रोस्कोप के पास चारों ओर चलने से बचने के रूप में इस कारण कंपन के कारण छवि अधिग्रहण के विघटन में परिणाम हो सकता है.

यदि कोशिका झिल्ली डाई 30 मिनट के बाद दिखाई नहीं देता है और इस्तेमाल किया लेजर लाइन सही है, डाई के अधिक जोड़ने और अगले अधिग्रहण के लिए अपनी एकाग्रता में वृद्धि.

यदि actomyosin संकेत धुंधला होने के लिए दिखाई देते हैं, उद्देश्य के एनए की जाँच करें. एक एनए 1.3 से कम इमेजिंग गुणवत्ता में कमी होगी. इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि इस्तेमाल किया विसर्जन तेल पानी 63x उद्देश्य के लिए सही ढंग से लागू किया गया है. यदि आवश्यक हो तो जोड़ें या बदलें.

यदि अंडा कक्ष सिकुड़ते हैं और प्रेक्षित कोशिका झिल्ली विकृत हो जाती है, तो जाँच करें कि ढक्कन ठीक से बंद है या नहीं। यदि ढक्कन याद आ रही है या ठीक से बंद नहीं है, अंडे कक्षों अधिग्रहण समय पर SMI वाष्पीकरण के कारण बाहर सूख सकता है.

यदि अंडा कक्षों का रोटेशन धीमा हो जाता है या बंद हो जाता है, तो लेजर शक्ति को कम करें। यदि अंडा कक्ष में एक छेद दिखाई देता है, यह लेजर द्वारा जला दिया गया है. लेज़र पावर घटाएँ.

यदि actomyosin संकेत TLM अधिग्रहण के दौरान 2 मिनट के बाद ब्लीच, लेजर शक्ति में कमी और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में संकेत प्रवर्धन में वृद्धि.

एक बार एक अंडा कक्ष के कूप उपकला उपकला के एक TLM का अधिग्रहण किया गया है, यह इस अंडे कक्ष के एक ही ऊतक क्षेत्र में फिर से इमेजिंग से बचने के लिए सिफारिश की है. हालांकि, के रूप में अंडे कक्षों उनके एपी अक्ष के आसपास बारी बारी से, यह एक TLM के अधिग्रहण को दोहराने के लिए संभव है इस क्षतिग्रस्त अंडे कक्ष का उपयोग कर के बाद circa 30 मिनट. जबकि एक अंडा कक्ष में कूप उपकला इमेजिंग, अन्य अंडे कक्षों विरंजन नहीं किया जाएगा /

यदि इन सभी आवश्यकताओं को पूरा कर रहे हैं, सफलतापूर्वक छवि अंडे कक्षों का प्रतिशत circa होना चाहिए 90%-100% चरणों के लिए 6-8, circa 50%-60% चरणों के लिए 3-5, और circa 20%-30% चरणों के लिए 1--2. विफलता मुख्य रूप से अंडे कक्षों की आवाजाही या उनके विच्छेदन/मैनिपुलेशन के दौरान उन्हें नुकसान के कारण है।

डेटा संसाधन के लिए महत्वपूर्ण चरण और समस्या निवारण

फिजी में प्रदान की स्क्रिप्ट का उपयोग मुखौटा पीढ़ी के दौरान, यह हो सकता है कि वहाँ उत्पन्न सेल रूपरेखा है कि एक TLM में वास्तविक कोशिका झिल्ली को प्रतिबिंबित नहीं कर रहे हैं की एक बहुत कुछ कर रहे हैं. यह अक्सर उच्च पृष्ठभूमि शोर के कारण होता है, खासकर जब दाग कोशिका झिल्ली के लिए रंगों का उपयोग किया जाता है. ऐसे मामले में, उत्पन्न मुखौटा में अवांछित सेल रूपरेखा के थकाऊ सुधार से बचने के लिए, विभाजन फिर से चलाने के लिए और सबसे अच्छा फिट करने के लिए मानकों सेट. यह अनुमानित शोर सहिष्णुता पैरामीटर का समायोजन करके किया जा सकता है.

सतह प्रबंधक में रूपरेखा युक्त ParticleStack.tif फ़ाइलों में से एक लोड हो रहा है, जब लोड हो रहा है समय रैखिक सेल रूपरेखा की संख्या के साथ तराजू और कई मिनट लग सकते हैं। यदि लोडिंग बाधित या गलत है, तो उसे दोहराएँ. सुनिश्चित करें कि अपलोडिंग विंडो फ़ोकस में है और कोई अन्य प्रोग्राम उपयोग नहीं किया जा रहा है.

कभी कभी एक सेल रूपरेखा कुछ फ्रेम में सही करने की जरूरत है; ऐसे मामले में, ब्रश बटन का उपयोग करें। कोशिका झिल्ली के चारों ओर माउस को खींचकर एक विशेष फ़्रेम में सही कक्ष बाह्यरेखा बनाएँ. TLM के किसी भिन्न फ़्रेम पर जाएँ, और उसके बाद, सुधार के साथ समय फ़्रेम पर वापस जाएँ: गलत कक्ष बाह्यरेखा अब प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। फिर, उस एक को सही करने के लिए अगले फ़्रेम पर फिर से जाएँ। ब्रश उपकरण अब मोड मिटाने के लिए स्विच करेगा। यदि आवश्यक हो, तो मौजूदा कक्ष बाह्यरेखा को आगे बढ़ाकर अगली बार फ़्रेम में बाह्यरेखाओं को ठीक करें और फिर एक नया कक्ष बाह्यरेखा बनाने के लिए +Add बटन दबाकर. सतह प्रबंधक विंडो से पुराने S नंबर हटाएँ और यदि आवश्यक हो तो नाम बदलें बटन दबाकर नए कक्ष बाह्यरेखा का नाम बदलें।

यदि कोई संपूर्ण महत्वपूर्ण कक्ष TLM में अनुपलब्ध है, तो अचयनित करें और बहुभुजदबाकर एक नया मास्क बाह्यरेखा बनाएँ. कक्ष झिल्ली के साथ क्लिक करके TLM के पहले फ़्रेम में एक नई कक्ष बाह्यरेखा बनाएँ. उसके बाद, TLM के अंतिम फ़्रेम पर जाएँ और चयनित कक्ष के लिए समान करें। समय पर चल रहे फिल्म को चलाने से, कक्ष बाह्यरेखाएँ अंतर्विष्ट ित की जाएँगी. यदि आवश्यक हो तो ब्रश उपकरण के साथ सही है। एक बार समाप्त हो जाने पर, +Add बटन दबाएँ और नाम बदलें बटन दबाकर कक्ष बाह्यरेखा का नाम बदलें. एक नया कक्ष बाह्यरेखा बनाने के लिए अधिक अंक/क्लिक, बेहतर प्रक्षेप कार्य करता है।

उपकला रोटेशन के अलावा, टीएलएम कभी-कभी अवांछित आंदोलन से प्रभावित होते हैं। इसलिए, इन टीएलएम में इस तरह के ऊतक बहाव के लिए सही करने की सिफारिश की जाती है। ऐसा करने से, TLMs भी अंडे कक्षों के उपकला रोटेशन के लिए सही कर रहे हैं, और कोशिका झिल्ली कठोर हो जाते हैं. यह actomyosin संकेतों के मैनुअल विश्लेषण आसान बनाता है. हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण वैज्ञानिकों को भेद करने की अनुमति नहीं है कि मनाया actomyosin संकेतों चाल या कोशिका झिल्ली के सापेक्ष स्थिर हैं. यदि actomyosin संकेतों की स्थिर और सक्रिय आंदोलनों के बीच एक अंतर इस तरह के एक विश्लेषण का लक्ष्य है, कोई ऊतक बहाव सुधार लागू किया जाना चाहिए. हमने पाया कि actomyosin संकेतों के बहुमत सक्रिय रूप से कोशिका झिल्ली के सापेक्ष ले जाएँ और उनमें से केवल एक छोटा सा हिस्सा स्थिर दिखाई देते हैं.

महत्वपूर्ण कदम और subcellular actomyosin संकेतों के विश्लेषण के लिए समस्या निवारण

यदि उत्पन्न आँकड़े outliers होते हैं, सुनिश्चित करें कि पूरे डेटा सेट के संबंध में किसी भी अत्यंत कम या उच्च मूल्यों वास्तव में सेल में व्यवहार को दर्शाती हैं और कलाकृतियों नहीं हैं. यह बाहरी लोगों वाले सेल की पहचान करके और कम/उच्च मूल्य को मापे जाने के समय सेल आउटलाइन गुणवत्ता की जांच करके किया जा सकता है। अक्सर, इस तरह के चरम मूल्यों दोषपूर्ण सेल से परिणाम रूपरेखा है कि गलत तरीके से एक और सेल के हिस्से को मापने. यह विशेष रूप से स्पष्ट हो सकता है जब बड़े blobs एक पड़ोसी सेल के सेल रूपरेखा के साथ हस्तक्षेप. ऐसे मामले में, सेल की रूपरेखा को सही करना और माप दोहराना महत्वपूर्ण है।

परिमाणीकरण को आसान बनाने के लिए, एक विशेष सेल सतह में संकेतों का विश्लेषण करें और एक-एक करके तब तक जारी रखें जब तक कि उप-फिल्म में सभी कोशिकाओं का विश्लेषण न किया जाए। उपकोशिकीय ऐक्टोमीयोसिन संकेतों के मैनुअल विश्लेषण के परिणाम एक सेल और एक विशेष अंडा कक्ष में समरूपता को तोड़ते नहीं दिखा सकते हैं। हमने अनुभव किया है कि actomyosin स्पष्ट रूप से में ऊतक आंदोलन के सापेक्ष समरूपता को तोड़ नहीं है और में lt;10% घूर्णन अंडा कक्षों के (चरणों 6-8). यह प्रतिशत चरण 412के आस - पास बढ़ा है . हमने यह भी पाया कि अंडे के कक्ष12में एसीटोमीसिन सिग्नल मूवमेंट की पसंदीदा दिशा की पहचान में 5 मिनट या 10 मिनट का विश्लेषण किया जाता है या नहीं , इसमें कोई अंतर नहीं है .

घुमावदार ऊतकों से actomyosin संकेतों के चयनात्मक निष्कर्षण के लिए महत्वपूर्ण कदम और समस्या निवारण

blobs के गलत आकार (पहचान संकेतों) कोई blobs में परिणाम होगा और कार्यक्रम अगले चरण में फ्रीज होगा. इस मामले में, बल-क्विट फिजी और नए प्लगइन दीर्घवृत्तशीर्ष प्रक्षेपणपुनः आरंभ करें। ऐसा तब करें जब प्रोग्राम कम्प्यूटदबाने के बाद प्रतिक्रिया नहीं करता है . यह अक्सर एक संकेत है कि अनुपयुक्त पैरामीटर चुना गया है.

यदि वहाँ भी कई blobs हैं और / यदि वे विश्लेषण अंडे कक्ष के एक तरफ केंद्रित कर रहे हैं, यह डिजाइन दीर्घवृत्ताभ को प्रभावित कर सकते हैं और अंडे कक्ष के लिए सही फिट प्रदान नहीं करते हैं. बूँद पहचान करने के लिए वापस जाओ और एक्स के साथ संयोजन में उनके आकार की व्यवस्था करने की कोशिश, वाई, और अंडे कक्ष के z-अक्ष चयन. एक अच्छा दीर्घवृत्ताभ फिट उत्पन्न करने के लिए एक विफलता भी अक्सर तब होती है जब अनुपयुक्त कट-ऑफ दूरी सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है।

प्राप्त अनुमानों कभी कभी miscentriced लग सकता है, या शायद प्राप्त z विमान वास्तव में अंडे कक्ष की सतह के पास सेल परतों के बीच ले जाता है. यह आमतौर पर एक खराब फिटिंग दीर्घवृत्तका संकेत है जहां दीर्घवृत्तका एक क्षेत्र अंडे के कक्ष से बहुत दूर सेट किया जाता है। दीर्घवृत्तों को फिट करने का प्रयास करें ताकि यह अंडा कक्ष परिधि से समान दूरी बनाए रख सके।

विधि और उपन्यास दृष्टिकोण की सीमाएं

अंडे के कक्षों की यह मुक्त culturing एक अंडा कक्ष की सतह के सूक्ष्म समतल छोड़ देता है. यह अंत करने के लिए, इस विधि के अपने फायदे और नुकसान है. confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते समय, यह उच्च संकल्प और उच्च गति इमेजिंग है कि मज़बूती से समय की एक छोटी अवधि के लिए अंडे कक्षों की परिधि में कोशिकाओं में actomyosin व्यवहार उजागर के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करता है (5-10 मिनट). हालांकि, ऐसा करके, यह एक ही विमान है कि समय के साथ confocal माइक्रोस्कोपी के साथ छवि की जा सकती है के आकार को सीमित करता है. सामान्य तौर पर, यह चरणों में अंडे कक्ष प्रति $ 15 कोशिकाओं को छवि संभव है 6-8 लेकिन चरणों में अंडे कक्षों में केवल दो कोशिकाओं के बारे में 1-5. इसलिए, हमने इस विधि को यहां केवल स्थानीय कोशिकीय पैमाने के लिए उपयुक्त होने के रूप में परिभाषित किया है।

इन आकार सीमा है कि एक confocal विमान के सीमित आकार के कारण होते हैं पर काबू पाने के लिए, हम एक वैकल्पिक फिजी आधारित दृष्टिकोण दीर्घलिप्सोइड भूतल प्रोजेक्शन कहा जाता है, ऊतक पैमाने पर उपयोग के लिए विकसित किया है. यह ऊतक पैमाने पर अंडे कक्षों के एक अर्द्ध-सहभागी सतह निष्कर्षण के साथ कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है। इस तरह, actomyosin संकेत एक विश्लेषण अंडे कक्ष से 50 से अधिक--100 कोशिकाओं के लिए एक ही समय में प्राप्त किया जा सकता है. यह ध्यान दें कि इस दृष्टिकोण प्राप्त डेटा के बहुत बड़े डेटासेट उत्पन्न करता है महत्वपूर्ण है (जेडगी बाइट्स), एक कम संकल्प है (यह एक 40x बनाम एक 63x उद्देश्य का उपयोग करता है), और यह भी एक धीमी इमेजिंग गति प्रदान करता है (यह लेता है $60 एक अंडे चाम के ऊतक के आधे के माध्यम से स्कैन करने के लिए एस बर [चरणों 6-8] और, इस तरह के रूप में, यह सीमित confocal विमान विधि की तुलना में 10x धीमी है.

parametrized सतहों से स्तरित अनुमानों निकालने के लिए अन्य मौजूदा सॉफ्टवेयर की तुलना में, इस प्रोटोकॉल के लिए विकसित प्लगइन प्रक्रिया के हर कदम पर आसानी से उपयोग और इंटरैक्टिव दृश्य प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है. अन्य उपकरण, जैसे MATLAB आधारित ImSaNE20, चेन एट अल द्वारा इस्तेमाल किया21,parametrized और nonparametrized सतह मॉडल और विभिन्न प्रक्षेपण तरीकों की एक विस्तृत विविधता से निपटने पर ध्यान केंद्रित. उदाहरण के लिए, ImSaNE डेटा preprocessed और एक विशेष तरीके से गठबंधन किया जा करने के लिए आवश्यक है और आंशिक रूप से मध्यवर्ती चरणों में बाहरी उपकरणों की आवश्यकता है। इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तुत प्लगइन किसी भी 3D/4D/5D छवि (क्रम) है कि बाह्य पूर्व प्रसंस्करण के बिना फिजी में खोला जा सकता है संभालती है. जबकि ImSaNE MATLAB स्क्रिप्ट संपादित करके उच्च विन्यास (प्रोग्रामेबल) है, हम एक कार्यप्रवाह में विकल्पों का एक न्यूनतम सेट प्रदान करते हैं जो यहाँ चर्चा की गई विशिष्ट समस्या के अनुरूप है. इंटरैक्टिव कार्यप्रवाह के प्रत्येक चरण परिणाम है कि तुरंत नेत्रहीन निरीक्षण किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो समायोजित प्रदान करता है.

इन इमेजिंग दृष्टिकोण, स्थानीय सेलुलर या ऊतक पैमाने के रूप में जो निर्णय, एक विशेष प्रयोग के लिए सबसे अच्छा है, विशुद्ध रूप से वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है जवाब दिया जा करने के लिए (यानी, उच्च बनाम कम संकल्प; कम बनाम लंबे अधिग्रहण समय). इन दो तराजू के बीच एक अच्छा समझौता दोनों दृष्टिकोण गठबंधन करने के लिए हो सकता है, इस प्रकार अर्द्ध ऊतक पैमाने पर actomyosin संकेतों की इमेजिंग प्राप्त (यानी, 20-30 कोशिकाओं). यह एक कताई डिस्क माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है, एनए $1.3 के साथ एक पानी 63x लेंस, और एक अंडा कक्ष के 20-30 कोशिकाओं के लिए z-स्टैक सेटिंग्स की स्थापना की. यह बहुत उथले z-स्टैक (एक अंडा चैम्बर के एक आधे के अधिग्रहण के लिए आवश्यक z-स्टैक के विपरीत) के तहत तेजी से स्कैनिंग की अनुमति देता है 60 s. यहाँ प्राप्त समय या तो दोहराया z-स्टैक अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता इमेजिंग की गति के लिए या एक नमूना वसूली के लिए (समय interleaves) अलग-अलग z-स्टैक के बीच. बाद के साथ, अंडे कक्षों घूर्णन के TLMs की एक लंबे समय तक अधिग्रहण समय (gt; 30 मिनट) प्राप्त किया जा सकता है. इस अर्द्ध ऊतक दृष्टिकोण actomyosin संकेतों और लंबे समय तक समय अवधि में एक ही समय में अधिक कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए एक पर्याप्त संकल्प की गारंटी देता है.

भविष्य अनुप्रयोगों और दृष्टि

दोनों वर्णित तरीकों (स्थानीय सेलुलर और ऊतक पैमाने पर) actomyosin नेटवर्क पर सीमित दुष्प्रभाव के साथ एक सरल और कम लागत दृष्टिकोण (माइक्रोस्कोप उपकरणों को छोड़कर) प्रदान करते हैं और लागू किया जा सकता है और आसानी से अन्य विच्छेदन पशु ऊतकों के लिए अपनाया. यहाँ केवल शर्त ब्याज की एक घुमावदार ऊतक, उपलब्ध transgenes, और मार्करों या लेबलिंग तरीकों के लिए एक पेट्री डिश में एक मौजूदा culturing प्रोटोकॉल है.

प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी22के साथ संयोजन में, टोटो में actomyosin मशीनरी छवि के लिए भी संभव है (यानी, छवि Drosophila अंडे कक्षों की पूरी बाहरी परिधीय सतह एक साथ और फिर बाद में प्लगइन दीर्घवृत्तभ सतह निष्कर्षणका उपयोग कर प्रकट करें| हालांकि, वहाँ कुछ सीमाएं हैं जो actomyosin संकेतों की उच्च गति इमेजिंग के लिए उपयुक्तता के मामले में हल करने की आवश्यकता है, अर्थात् 1) एक कम बिंदु पिघलने agarose में अंडे कक्षों के embedding या इमेजिंग के दौरान एक केशिका से चिपके हुए; ii) प्रयुक्त जल लेंस ों की एक कम संख्यात्मक अपर्चर जो पर्याप्त actomyosin संकेत रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करते हैं; iii) अतिरिक्त समय अंडे कक्षों के कई कोणों, जो उच्च गति इमेजिंग रोकता है प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

यह अंत करने के लिए, यह निकट है कि, इस तरह के उपकला ऊतक के माध्यम से स्कैन करने के लिए गति और इस्तेमाल किया सूक्ष्म लेंस के सुधार के रूप में माइक्रोस्कोप मापदंडों के शोधन के साथ, actomyosin मशीनरी का विस्तृत विश्लेषण, भविष्य में, सक्षम होगा वादा उच्च संकल्प परिणाम ऊतक पर और टो पैमाने में लंबे समय अवधि में प्राप्त किया जा करने के लिए.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक ों को सेलेस्टे बर्ग प्रयोगशाला4से अपनाए गए दृष्टिकोण का उपयोग करके अंडे के कक्षों के इन विट्रो लाइफ इमेजिंग पर अपनी सलाह साझा करने के लिए मिरियम ओस्टरफील्ड के बहुत आभारी हैं . हम भी सेबस्टियन Tosi फिजी स्क्रिप्ट है कि सेल विभाजन सक्षम बनाता है के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider Medium Gibco 21720-024 [+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122  [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum Sigma  F135 Heat inactivated
Insulin Solution Human Sigma  I9278
50 mL Falcon tubes Eppendorf sterile
Millex-GV filter Millipore SLGV033NS 33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps A. Dumont & Fils  #55
CellMask Deep Red (cell membrane dye) Invitrogen C10046
FM4-64 (cell membrane dye) ThermoFisher/Invitrogen T13320
Depression dissection slide Fisher Scientific 12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope e.g. Zeiss Stemi SV 6
Inverted confocal microscope e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder Hammacher 9160020
Cactus spine Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.

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