تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على فيجي وسهلة الاستخدام إلى جانب تعليمات مباشرة تشرح كيفية تحليل سلوك الكنتوموسين بشكل موثوق في الخلايا الفردية والأنسجة الظهارية المنحنية. لا توجد مهارات البرمجة المطلوبة لمتابعة البرنامج التعليمي. يتم تنفيذ جميع الخطوات بطريقة شبه تفاعلية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من فيجي والإضافات المرتبطة بها.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Viktorinová, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58587, doi:10.3791/58587 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويسمى البيض Drosophila غير ناضجة غرف البيض، وهيكلها يشبه الأجهزة البدائية التي تخضع للتغيرات المورفولوجية من جولة إلى شكل القطع الناقص أثناء التنمية. وتسمى هذه العملية التنموية oogenesis وحاسمة لتوليد البيض ناضجة وظيفية لتأمين الجيل القادم ذبابة. لهذه الأسباب، كانت غرف البيض بمثابة نموذج مثالي وذي صلة لفهم تطور الأعضاء الحيوانية.

وقد وضعت عدة بروتوكولات الزراعة في المختبر، ولكن هناك العديد من العيوب لهذه البروتوكولات. واحدة يتضمّن التطبيق من تغطيات مختلفة أنّ يمارس ضغطة اصطناعيّة على ال يصور بيضة غرف [إين وردر تو] عاقمتهم وأن يزيد ال يصور اكتساب مستوى من السطح محيطيّة من ال يحلّ بيضة غرف. مثل هذا النهج قد تؤثر سلبا على سلوك آلات actomyosin رقيقة التي تولد القدرة على تدوير غرف البيض حول محورها أطول.

وهكذا، للتغلب على هذا القيد، ونحن ثقافة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام من أجل تحليل موثوق آلات actomyosin على طول محيط غرف البيض. في الجزء الأول من البروتوكول، نقدم دليل بالتفصيل كيفية تحليل آلات actomyosin في طائرة اقتناء محدودة على نطاق الخلوية المحلية (ما يصل إلى 15 خلية). في الجزء الثاني من البروتوكول، ونحن نقدم للمستخدمين مع البرنامج المساعد الجديد مقرها فيجي التي تسمح استخراج بسيطة من طبقة رقيقة محددة من سطح غرف البيض المحيطية. ثم يصف البروتوكول التالي كيفية تحليل إشارات الأتوموسين على مقياس الأنسجة (>50 خلية). وأخيرا، نحدد أوجه القصور في هذه النهج على كل من النطاقات الخلوية والأنسجة المحلية ونناقش تطورها المحتمل في المستقبل وتطبيقاتها الممكنة.

Introduction

وقد أدى التطوير المستمر لتكنولوجيات التصوير والبرمجيات الجديدة ذات التطبيقات في علوم الحياة إلى تأثير هائل على فهم المبادئ الأساسية للحياة. أحد التحديات الرئيسية هو التصور الموثوق به للعمليات التنموية بالاقتران مع تصويرها الحي في أنسجة مختلفة. الأنسجة هي أجزاء من الأعضاء والهيئات، وعلى هذا النحو، فإن الغالبية لا يمكن الوصول إليها بسهولة للتصوير. ولذلك، تم وضع بروتوكولات تسمح بتشريحها والزراعة في المختبر من أجل تصور الأحداث البيولوجية التي تعكس بما فيه الكفاية حالة في الجسم الحي داخل الجسم الحي.

على مدى العقود الماضية، وقد ساهم زراعة والتصوير الحي لغرف البيض Drosophila، هياكل تشبه acinar تشبه الأجهزة البدائية، بشكل كبير في فهم المبادئ الأساسية لتطوير الأعضاء البدائية1 , 2 , 3.حاليا، هناك العديد من بروتوكولات الزراعة المتاحة، واستخدامها يعتمد على وقت اكتساب، ونوع الخلية ليتم تصويرها، وسهولة الوصول إليها (على سبيل المثال، الجرثومية الداخلية مقابل الخط الجسدي الخارجي)4.

ومن السمات الشائعة في جميع بروتوكولات الزراعة هذه الحاجة إلى تجميد غرف البيض التي تم تحليلها التي تعرض نشاط ًا منضدية عالية في الوسائط السائلة. ويتسبب النشاط العقدي من غرف البيض أساسا من ورقة العضلاتالتي تغطي سلسلة طويلة من غرف البيض المتصلة 5،7. لذلك، لتحقيق الجمود السليم من غرف البيض الشباب، وقد وضعت نهج مختلفة،والتي تنطوي على تغطية غرف البيض مع الأغطية 6،9 أو البطانيات المرنة 10 أو تضمينها في منخفضة ذوباننقطة agarose 3،11. هذه النهج تحظى بشعبية لأنها تسمح أيضا بتصوير طائرة بصرية أكبر بسبب تسطيح خفية من سطح محيطي من غرف البيض.

ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن غرف البيض الشباب (المرحلة 1-8) تدور حول محورها الأمامي الخلفي وأن هذه الحركة الأنسجة مدعوم من شبكة actomyosin غرامة قريبة من السطح المحيطي من هذه الغرف البيض الشباب 12.ولذلك، فإن التغيير الاصطناعي للسطح الخلوي الناجم عن تسطيح خفية من هذا النسيج قد يكون لها تأثير سلبي على سلوك آلات actomyosin توليد القوة. والنقطة المضادة هي أنه إذا لم يتم تسطيح أنسجة غرفة البيض، فإن التصوير المجهري للبروتينات على السطح المحيطي لغرف البيض يصبح أكثر محدودية بسبب انخفاض حجم مستوى الاستحواذ.

لذلك، قمنا بالجمع بين بروتوكولات من Prasad وآخرون9 ومختبر سيليست بيرغ 4،10 وتعديلها مرة أخرى بحيث لا يتم استخدام غطاء / بطانية مرنة / أجاروز في الطريقة المتقدمة. يتم زراعة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام والبروتوكول المعروض هنا ينطبق فقط المجهرية المقلوبة. هناك جزأين للبروتوكول. ويركز الجزء الأول على تحليل إشارات الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (ما يصل إلى 15 خلية) داخل غرف البيض. في الجزء الثاني، نركز على التغلب على القيود المرتبطة بطائرة اقتناء صغيرة بسبب زراعة غرف البيض مجاناً. وفي هذا الصدد، قمنا بتطوير طريقة حسابية جديدة مقرها فيجي مع واجهة مستخدم رسومية شبه تفاعلية تستخرج وتتكشف بشكل انتقائي طبقات محددة من سطح الأنسجة المحيطية. ويلي ذلك بروتوكول يصف كيفية تحليل الكنتوموسين على مقياس الأنسجة (أي، >50 خلية). وبما أن الاستخراج الانتقائي لطبقة رقيقة محددة من الأنسجة الظهارية المنحنية لم يكن من الممكن بسهولة باستخدام إسقاط z-stack الكلاسيكي (الشكل1)، فإن هذه الطريقة السهلة الاستخدام بمثابة شرط مسبق هام لفهم الأنسجة الظهارية بشكل شامل سلوك شبكة أكميوسين رقيقة (<1 μm) على مقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا.

بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل البروتوكول، نقدم مثال أفلام الفاصل الزمني (TLMs) وملفات عينة من سلوك Myosin II التقليدي غير العضلي ذو العلامات الفلورية (انظر الملف التكميلي3). Myosin II هو بروتين محرك ويمثل الجزء التقلصي النشط من آلات actomyosin. من أجل صورة Myosin الثاني، ونحن نستخدم خطوط Drosophila المعدلة المعدلة التي تحتوي على سلسلة ضوء التنظيمية المعدلة من Myosin الثاني دعا MRLC::GFP (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)12،13. من أجل تصور أغشية الخلايا، ويستند البروتوكول على الأصباغ التجارية (انظر جدولالمواد). هذا البروتوكول هو مناسبة ليس فقط لتحليل الصغيرة دون الخلوية MRLC::GFP إشارات12 ولكن أيضا لأي جزيئات شبه خلوية مماثلة الحجم حول ± 300 درجة مئوية، مثل تلك التي لوحظت مع Life-Act::GFP12,14.

على الرغم من أن كلا البروتوكولين يتم تقديمها باستخدام غرف البيض Drosophila المستزرعة في المختبر، يمكن أيضا أن يتم الحصول على إشارات الactomyosin باستخدام أنسجة أخرى على الاستفادة المثلى من وسائل الإعلام زراعة واعتمادا على توافر من البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الأصباغ التجارية المقابلة أو، على سبيل المثال، الحقن المجهرية mRNA للحصول على ملامح التعبير الجيني العابر. وبالمثل، يمكن تطبيق البروتوكول القائم على فيجي لاستخراج طبقة رقيقة من سطح محيطي بشكل أعم على الأنسجة المثلة بالقطع الناقص والأعضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يوفر البروتوكول التالي إرشادات حول كيفية تحليل الأتوموسين في الخلايا المحلية ومقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا. يسمح النهج المحلي للمستخدمين بتحليل سلوك الكنتوموسين المفصل في ما يصل إلى 15 خلية لكل غرفة بيض ويتطلب الحصول على TLMs لفترة قصيرة من الزمن (5-10 دقيقة) باستخدام التصوير عالي السرعة ومجهر مقلوب. وعلى النقيض من ذلك، يوفر مقياس الأنسجة للمستخدمين معلومات الكنتوموسين في 50-100 خلية ويتطلب الحصول على TLMs لفترة طويلة من الزمن (≥ 30 دقيقة) باستخدام التصوير منخفض السرعة ومجهر قرص الغزل المقلوب (انظر الشكل 2 و المعلمات الموصى بها في كل مقياس في الجدول1). يعتمد القرار الذي يتم في أي مقياس لتحليل إشارات الأتوموسين بشكل كامل على السؤال العلمي للمستخدم. يجب أن تساعد TLMs الاختبار المصاحبة في اتخاذ هذا القرار.

1. مقياس الخلوية المحلية (LCS)

ملاحظة: لتشريح وصورة في المختبر مثقف غرف البيض Drosophila، اتبع البروتوكول الموصوف في الملف التكميلي 1. لتحليل TLMs المكتسبة، تابع مع البروتوكول التالي. يتم توفير ارتباطات إلى ملفات الاختبار المصاحبة لـ TLMs في الملف التكميلي 3.

  1. معالجة بيانات TLMs على مقياس الهواتف الخلوية المحلية (LCS)
    1. تصحيح التبييض من TLMs للتعويض عن اضمحلال كثافة التسميات الفلورية
      1. تأكد من تثبيت تطبيق فيجي محدث على الكمبيوتر المستخدم باتباع هذه الإرشادات: Fiji > فتح TLM (على سبيل المثال، TestMovie1.tif من الملف التكميلي 3).
      2. تقسيم قنوات الألوان بالنقر فوق صورة > اللون > تقسيم القنوات.
      3. إجراء تصحيح التبييض على كلتا القناتين باستخدام صورة > ضبط > تصحيح التبييض > نسبة بسيطة > كثافة الخلفية 0.0.
        ملاحظة: إذا تم الحصول على نتائج غير مرضية، واستكشاف أي طرق التصحيح في هذا البرنامج المساعد يناسب أفضل (على سبيل المثال، استخدام مطابقة الرسم البياني بدلا من نسبة بسيطة).
    2. تجزئة الخلية لإنشاء قناع خلية لـ TLMs
      1. إذا لم تكن فيجي مفتوحة بالفعل، فأعد فتحها (وتأكد من تحديثها) بعد التعليمات > تحديث > تطبيق التغييرات > موافق.
      2. إذا لم يتم ذلك بالفعل، قم بتنزيل الماكرو TissueCellSegmentMovie.ijm (من http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). اسحب هذا البرنامج النصي وأسقطه في فيجي.
      3. افتح الملف .tiff الذي تم تصحيحه بالتبييض (راجع القسم 1.1.1). تقسيم قنوات الملف تصحيح التبييض باستخدام صورة > اللون > تقسيم القنوات.
      4. تشغيل البرنامج النصي الذي تم تحميله على قناة غشاء الخلية النشطة من TLM المحدد عن طريق الضغط على الرمز تشغيل في البرنامج النصي المفتوح. تعيين طمس غاوسي إلى 2.500 وحساسية الكشف عن الخلية إلى -1 وانقر فوق موافق. من أجل الحصول على قناع خلية لطيفة، لا تغيير هذه المعلمات أعلاه. قم بتعيين التسامح المتوقع للضوضاء بين 10-20 لـ TLMs التي تم الحصول عليها مع هدف 63x وانقر فوق موافق.
        ملاحظة: وبالنسبة لأهداف أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى بارامترات مختلفة. الأنظف الخلفية في TLM، مطلوب التسامح الضوضاء المقدرة أقل.
      5. يظهر قناع الخلية التي تم إنشاؤها في TLM تحليلها وأيضا في نافذة جديدة تسمى ParticleStack (G)،وبالإضافة إلى ذلك، يظهر نافذة صغيرة تسمى العمل المطلوب. من قناع الخلية على TLM، والتركيز فقط على الخلايا في وسط TLM واختيار تلك التي يمكن أن توفر الخطوط العريضة كاملة ومحددة جيدا في جميع أنحاء TLM.
      6. إذا كانت الخلايا المحددة تحتوي على مخططات خلايا اصطناعية/إضافية، استخدم إطار أداة الدمج المسمى الإجراء المطلوب في TLM. بالنسبة لهذا الأخير، اتبع الإرشادات الموجودة في النافذة.
        ملاحظة: تأكد من أن الخطوط العريضة للخلايا محددة بشكل جيد وتتوافق مع أغشية الخلايا الحقيقية في TLM لأن أي عدم دقة قد يؤثر على التحليلات اللاحقة. يمكن إجراء تعديلات وتغييرات إضافية، مثل إزالة الخلايا غير المرغوب فيها، لاحقًا باستخدام أداة مدير Surface (الموضحة في القسم 1.1.3).
      7. عندما تتوافق الخلايا المحددة في المركز بشكل جيد مع أغشية الخلايا الحقيقية، احفظ ParticleStack كملف .tiff بعد ملف > حفظ باسم > Tiff.
    3. تحميل قناع الخلية الذي تم إنشاؤه في إدارة Surface
      1. تثبيت سطح مدير المساعد15 في إعداد فيجي المستخدمة. اتبع تعليمات فيكتوريانوفا وآخرون16.
      2. افتح Surface Manager باستخدام الإضافات > التجزئة > مدير Surface (3D).
        ملاحظة: يعرض إطار إدارة Surface عدة أزرار إجراء على اليمين وإطار فارغ على اليسار. لمشاهدة كافة أزرار الإجراء، قد يكون مطلوباً لتمدد الإطار في ارتفاعه/عرضه. لاحظ أن الإطارات الزمنية ستظهر كشرائح z.
      3. افتح الملف .tiff ParticleStack المطابق في Surface Manager بالنقر فوق ملف > فتح وحدد الصورة لفتحها (على سبيل المثال، ParticlesStack1.tif).
      4. في Surface Manager، انقر فوق الزر قراءة صورة المخطط التفصيلي وتعيين فهرس الجاكار إلى 60%.
        ملاحظة: تحميل الملف ParticlesStack1.tif يمكن أن يستغرق عدة دقائق، اعتماداً على طاقة معالجة الكمبيوتر.
      5. بمجرد تحميلها، سيتم تعيين كل خلية برقم S وتظهر في الجزء الأيسر من إطار إدارة Surface.
        ملاحظة: لإظهار المخططات التفصيلية وأسماء الخلايا لكافة الخلايا، حدد خانات الاختيار إظهار الكل وإظهار التسميات في أسفل إطار مدير Surface. من المستحسن استخدام هذه الوظيفة بمجرد التحقق من أرقام الخلايا للتأكد من صحتها.
      6. انقر على رقم S الأول; يظهر مخطط الخلية المستوردة من ParticlesStack1.tif على TLM. تحقق من كل رقم S المستوردة لجودة مخطط الخلية في جميع أنحاء TLM وإزالة الخلايا غير المرغوب فيها التي تعرض مخططات الخلايا غير صحيحة. للقيام بذلك، قم بتمييز مخطط الخلية وانقر على الزر حذف.
        ملاحظة: ومن الممكن أيضا لتصحيح الخطوط العريضة للخلية غير دقيقة وإضافة الخطوط العريضة للخلية الجديدة. ويرد وصف ذلك في قسم المناقشة.
      7. حفظ كافة الخلايا التي تم تصحيحها كملف RoiSet.zip عن طريق الضغط على الزر حفظ إلى القرص.
        ملاحظة: إذا كانت جلسة العمل تحتاج إلى مقاطعة، فمن الممكن تحميل الملف RoiSet في إدارة Surface لاحقاً: فتح TLM في فيجي (ملف > فتح)وحدد TLM. فتح مدير السطح عن طريق الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). قم بتحميل الملف RoiSet.zip المطابق بالنقر فوق الزر تحميل من القرص واختيار الملف RoiSet.zip المناسب. تحقق مرتين من أن أقنعة الخلايا المحملة تتوافق مع TLM المحملة.
    4. تصحيح لانحراف الأنسجة في TLMs
      ملاحظة: خلال وقت الاستحواذ على TLMs، يمكن ملاحظة آثار الانجراف بسبب دوران الظهارية أو حركة غير مرغوب فيها. في كلتا الحالتين، نوصي بتصحيح أي انحراف من أجل تبسيط تحليل actomyosin اليدوي في وقت لاحق. مطلوب تصحيح الانجراف فقط لتحليل actomyosin اليدوي. هذا البرنامج التعليمي يتطلب ما يصل إلى تاريخ برنامج فيجي مع البرنامج المساعد MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) مثبتة.
      1. فتح TLM تصحيح التبييض في فيجي عن طريق ملف > فتح وحدد ملف تصحيح التبييض التي تم إنشاؤها باستخدام البرنامج التعليمي المذكورأعلاه.
      2. تقسيم القنوات وتحديد واحد الذي يحدد أغشية الخلايا عن طريق صورة > اللون > تقسيم القنوات.
      3. استخدم البروتوكول التالي عندما لا تكون الخطوط العريضة للخلية ناعمة بشكل واضح: معالجة > المرشحات > ضبابية غاوسية. قم بتعيينه إلى ~ 1-2 لهدف 63x وانقر فوق موافق ثم نعم. انقر فوق عملية > ثنائي > تحويل إلى قناع باستخدام الإعدادات الافتراضية; ثم انقر فوق موافق.
      4. تحميل البرنامج المساعد MultiStackReg التالية الإضافات > التسجيل > MultiStackReg.
      5. تأكد من تعيين المكدس 1 إلى قناة غشاء الخلية، يتم تعيين الإجراء 1 إلى محاذاة، ويتم تعيين التحويل إلى الترجمة. حدد خانة الاختيار حفظ ملف التحويل ثم انقر فوق موافق.
      6. إعادة فتح TLM المحدد، والبرنامج المساعد MultiStackReg، وملف التحويل المحفوظة باستخدام ملف > فتح وحدد TLM. تقسيم قنوات الألوان باستخدام Image > اللون > قنوات سبليت.
      7. تحميل البرنامج المساعد MultiStackReg عن طريق النقر على الإضافات > التسجيل > MultiStackReg. حدد ملف تحويل التحميل كإجراء 1.
      8. ترك التحول كجسم جامد وانقر فوق موافق. حدد ملف التحويل الذي تم حفظه مسبقاً ثم انقر فوق موافق مرة أخرى.
      9. دمج قنوات الصورة وحفظ TLM المسجلة كملف .tiff بعد الصورة > اللون > دمج القنوات. حفظ الملف بالنقر فوق ملف > حفظ باسم > Tiff.
        ملاحظة: هناك طرق بديلة لتصحيح الانجراف الأنسجة في فيجي، وهي عن طريق الإضافات > التسجيل > StackReg / تصحيح الانجراف 3D.
  2. تحليل نبضات الكنتوموسين في مدير Surface في LCS
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة البروتوكولية للعلماء بتحديد ما إذا كانت نبضات الكنتيوموسين موجودة في الأنسجة التي تم تحليلها وفهم السلوك التفصيلي وكذلك اتجاه إشارات الأتيوميوسين.
    1. فتح فيجي والتأكد من أن TLM وقناع الخلية المقابلة لها مفتوحة في مدير Surface.
      ملاحظة: تأكد من تثبيت فيجي ومحدثة ويتم تثبيت البرنامج المساعد مدير Surface (الخطوة 1.1.3.1).
    2. افتح TLM مع ملف > افتح وحدد TLM لفتح (على سبيل المثال، TestMovie1_bleach.tif). تحميل البرنامج المساعد مدير السطح عن طريق الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). تحميل قناع الخلية المحفوظة التي تم إنشاؤها في البرنامج التعليمي هنا (على سبيل المثال، ParticlesStack1.tif) عبر ملف > فتح وحدد قناع الخلية (على سبيل المثال، ParticlesStack1.tif). قم بتحميل المنطقة ذات الأهمية المقابلة (عائد الاستثمار، على سبيل المثال، TestMovie1_RoiSet.zip). انظر الشكل 3 ألف.
    3. قم بالتبديل إلى قناة الاهتمام بـ TLM المحدد.
      ملاحظة: لتمييز القنوات، اتبع رمز اللون المشار إليه حول TLM.
    4. في Surface Manager، انقر فوق الزر إحصائيات للحصول على إطار يسمى متوسط القيمة الرمادية شريحة حسب الشريحة (الشكل3B). لاحظ أنه سيتم عرض قيم الكثافة المتوسطة/الوسيطة لإشارات الكنتيوموسين في قناة معينة تم تحليلها داخل مخططات الخلايا المحددة مع مرور الوقت، بالإضافة إلى المعلمات الأخرى المتعلقة بمنطقة الخلية وشكل الخلية.
      ملاحظة: قيم الكثافة هي في وحدات التحكيم (A.U.); منطقة الخلية بالبكسل وتحتاج إلى تحويلها إلى ميكرومترات مربعة.
    5. حفظ القيم التي تم الحصول عليها كملف جدول بيانات. انقر على نافذة الإحصائيات، ملف > حفظ باسم.
      ملاحظة: من الممكن التحقق من القيم الإحصائية التي تم الحصول عليها في وقت لاحق على النحو التالي: فتح TLM تصحيح التبييض في فيجي وفتح مدير السطح. قم بتحميل RoiSet.zip المطابق إلى TLM عن طريق الضغط على الزر تحميل من القرص وفتح الملف. سيتم تحميل القناع المحفوظ مع الخطوط العريضة للخلية وستظهر أسماء الخلايا في إطار مدير Surface الأيسر. انقر فوق الزر إحصائيات للقيم الإحصائية.
  3. التحليل اليدوي لإشارات الأتوموسين دون الخلوية الفردية في LCS
    ملاحظة: ويتطلب هذا البروتوكول أكبر قدر من التركيز ويستغرق وقتا طويلا. بشكل عام، يمكن تحليل واحد TLM المكتسبة بشكل مريح في غضون يوم واحد. وهذا لا يشمل الوقت لإعداد ذبابة قبل تشريحها، وتشريح نفسها، والحصول على صورة.
    1. فتح TLM مختارة ومصوبة بالتبييض ومسجلة (مصححة بالانجراف) في طلب محدّث لفيجي. استخدم TLM مصوبًا ومصححًا بالانحراف (على سبيل المثال، TestMovie1_bleach_reg.tif) كمثال اختباري.
    2. اضبط السطوع والتباين لرؤية إشارات الكنتوموسين الفردية باستخدام الصورة > ضبط > السطوع/التباين.
    3. محاذاة TLMs في نفس الاتجاه بالنسبة إلى محور الأنسجة / الجسم. في حالة غرف البيض، محاذاة الجانب الأمامي من غرف البيض دائما إلى يسار الصورة / الفيلم الفرعي / TLM قبل التحليل.
    4. تقسيم الفيلم المحدد إلى أفلام فرعية قصيرة 30 s والوقت المشروع كل واحد منهم. حفظ الأفلام الفرعية غير المتوقعة والمتوقعة بالوقت مع الأسماء المقابلة. احتفظ بالمصدر الأصلي.
      ملاحظة: يمكن إنشاء الأفلام الفرعية من TLMs الأصلي عن طريق حذف الإطارات غير المرغوب فيها أولاً عبر Image > مكدسات > مزيل الشرائح. تعريف الشرائح التي سيتم إزالتها وتعيين الزيادة. قم بالتحويل إلى RGB قبل استخدام مزيل الشرائح عند الزيادة = 1. لمشروع الوقت فيلم فرعي 30 s، انقر فوق صورة > مكدسات > Z-project > الحد الأقصى للكثافة للإطارات المعرفة (الشرائح) ثم انقر فوق موافق. تخطي كل ثانية 30 ثانية s الفيلم الفرعي من أجل تجنب عد إشارات actomyosin 2X في اثنين من الأفلام الفرعية 30 ثانية اللاحقة.
    5. وضع صورة مسقطة الوقت بجانب الفيلم الفرعي 30 ق المقابلة (الشكل4A، B). حدد خط الإشارة في الفيلم الفرعي المتوقع في الوقت المحدد. حدد اتجاه حركة إشارة الكنتوموسين (0°-360 درجة) على طول هذا الخط في الفيلم الفرعي الأصلي عن طريق تشغيل الفيلم الفرعي يدويًا. استخدم أداة الزاوية (في شريط فيجي) لقياس اتجاه حركة الإشارة يدويًا بالنسبة إلى محور الأنسجة المحدد أو أداة متوفرة مشابهة.
      ملاحظة: لا تعمل فيجي إلا على مقياس 0°-180° (الشكل4C)،ويلزم إعادة حساب القيم التي تم الحصول عليها على مقياس 0°-360 درجة. يتوافق خط الإشارة مع مسار حركة إشارة أكميوسين واحدة مع مرور الوقت.
    6. لتجنب الازدواجية في تحليل إشارات الكنتوموسين، ضع علامة على خطوط الإشارة التي تم تحليلها داخل الخلايا في الفيلم الفرعي المتوقع زمنياً (الشكل4B,D).
    7. تحليل جميع الخلايا المحددة في الفيلم الفرعي 30 s وحفظ الزوايا التي تم الحصول عليها.
      ملاحظة: تحليل إشارات السيتوميوسين السيتوبلازمي تحت الخلية فقط في الخلايا مع الخطوط العريضة للخلايا محددة جيدا في جميع أنحاء TLM. استبعاد الخلايا الفردية التي تحتوي على أقل من 15-20 إشارة مكتشفة في TLM بأكمله. تجاهل إشارات الكنتوموسين التي تتحرك عبر الخلايا بسبب أصلها غير معروف. يظهر مثال على عدد الإشارات لخلية واحدة تم تحليلها في الفيلم الفرعي 30 s في الشكل 4D.
    8. استمر حتى يتم تحليل جميع الأفلام الفرعية 30 s-long من TLM واحد، وحفظ جميع الزوايا المقاسة من إشارات actomyosin من TLM واحد في ملف جدول بيانات.
    9. تلخيص جميع الزوايا المقاسة على العدد ذي الصلة من TLMs (تعتمد على التجربة). رسم النسبة المئوية لاتجاه إشارات actomyosin التي تم تحليلها، على سبيل المثال، كرسم تخطيطي وردي مع نطاق يتراوح بين 0 درجة إلى 360 درجة مع برنامج مفضل.
      ملاحظة: للحصول على نتائج هامة إحصائيا، ينصح خمس إلى عشر غرف البيض مستقلة من أي مرحلة غرفة البيض لتحليلها.

2. مقياس الأنسجة

ملاحظة: لتشريح وصورة في المختبر مثقف غرف البيض Drosophila، اتبع البروتوكول في ملف تكميلي 2. لتحليل TLMs المكتسبة، تابع مع البروتوكول التالي أدناه. يتم وضع ملفات الاختبار المصاحبة لـ TLMs في الملف التكميلي 3.

  1. استخراج سطح انتقائي من الأنسجة الظهارية المنحنية
    ملاحظه:يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين باستخراج طبقة رقيقة من الكنتوموسين بشكل انتقائي في نسيج ظهاري منحني مع مرور الوقت. هذه الخطوة بروتوكول سهلة الاستخدام وتستند إلى واجهة رسومية بديهية. فمن الممكن لتحليل مريح (استخراج السطح) عدة TLMs. استخدام TestMovie2.czi (منالملف التكميلي 3) كمثال اختبار TLM.
    1. افتح تطبيق فيجي محدث (فيجي > تعليمات > تحديث > تطبيق التغييرات > موافق).
    2. تأكد من تثبيت البرنامج المساعد الإسقاط السطحي القطعي15. اتبع فيكتوريانوفا وآخرون. 16.
    3. فتح TLM وتصديره كملف XML / HDF5 عن طريق النقر على الإضافات > BigDataViewer > تصدير الصورة الحالية كملف XML / HDF5.
      ملاحظة: مطلوب لتعريف مسار تصدير. الحفظ نفسه يمكن أن يستغرق عدة دقائق ويعتمد على طول TLM.
    4. افتح الملف الذي تم تصديره في شاشة سطح القطع الناقص بالنقر فوق الإضافات > BigDataViewer > إسقاط سطح القطع الناقص > تحديد ملف XML.
      ملاحظة: ستظهر نافذة جديدة مع طرق عرض مترهلة لغرفة البيض ومربع حوار لتوجيه المستخدم خلال المعالجة. يمكن العثور على تفاصيل حول كيفية التنقل في طريقة عرض الشريحة في https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. يحتوي إطار الحوار المسمى "إسقاط المبيضين" على عدة علامات تبويب. في علامة التبويب الحوار الأولى تسمى مربع الحدود المحيطة، حدد حدود x و y لغرفة البيض في TLM مع عرض z للمربع المحيط (أي عمق غرفة z-stack/egg) ومجموعة الضغط (الشكل5A).
    6. لتعريف الحدود، اسحب الأزرار المجاورة لـ x وy و z أو قم بتعريف إحداثيات الرقم في مربعات x و y و z. تأكد من أن الحدود سخية بما فيه الكفاية للحصول على جزء من غرفة البيض من الفائدة في استخراج السطح. يتم تمييز الأجزاء المختارة من غرفة البيض باللون الوردي.
    7. التبديل إلى علامة التبويب تسمى البحث عن النقط في نافذة المبايض الإسقاط. تعريف سيغما وقيمة الذروة الحد الأدنى؛ ثم، اضغط على حساب لتحديد إشارات actomyosin (الشكل5B)،والتي سوف تظهر كما النقط الخضراء. إعادة محاولة هذه الخطوة مع معلمات مختلفة حتى يتم العثور على بقع كافية (حوالي 100).
      ملاحظة: سيغما 1\u20123 مع الحد الأدنى من قيمة الذروة 20\u2012100 يعمل أفضل لتحديد إشارات actomyosin من المرحلة 6 إلى -8 غرف البيض. تحديد إشارات الactomyosin هو خطوة حاسمة ويعتمد على نوعية الإشارة وحجمها. من المهم تأكيد الحجم الصحيح للنقط الموجودة. لا توجد بقع خضراء مرئية/ النقط في الصورة يعني أن الخطوة التالية لن تعمل. تصفح من خلال طائرات z المحددة لرؤية النقط.
    8. لتصميم القطع الناقص، تابع علامة التبويب التي تسمى تناسب القطع الناقص. تعيين عينات عشوائية إلى 10,000، خارج / داخل مسافة قطع إلى 1\u201210، ومن ثم، انقر فوق حساب (الشكل5C).
      ملاحظة: كلما انخفضت مسافة القطع، كلما كانت القطع الناقص ة المطلوبة أكثر دقة. بعد ذلك، سيتم فتح علامة التبويب تسمى الإسقاط تلقائيًا وتسمح بتعريف استخراج السطح. يجب تحسين الإعدادات.
    9. مواصلة أكثر مع علامة التبويب تسمى الإسقاط (الشكل5D). إعداد مسافة إسقاط الحد الأدنى والحد الأقصى (أي عرض القطع الناقص المطلوب). مطلوب لتعيين مسافة الإسقاط الحد الأدنى والحد الأقصى بحيث تشمل منطقة القطع الناقص الوردي المحدد الطبقة الخارجية بأكملها من غرفة البيض. حدد مسافة الشريحة (1 مستحسن).
      ملاحظة: يتم عرض أمثلة على تناسب القطع الناقص غير صحيحة والأمثل مما يؤدي إلى معلمات الإسقاط غير صحيحة والأمثل في الشكل 6A،C. ويمكن تعريف الطبقة المحيطة رقيقة من الفائدة في وقت لاحق. تأكد من أن المنطقة الوردية من القطع الناقص مع عرض محدد على غرفة البيض مرئية قبل الضغط على حساب. من المهم أن القطع الناقص المطلوب (خط واحد وردي) يناسب بشكل جيد سطح القطع الناقص من غرفة البيض من أجل الحصول على أفضل النتائج. إذا كان تناسب القطع الناقص ليست جيدة، وترتيب إعدادات مختلفة حتى يتم الحصول على استخراج السطح المطلوب.
      1. تعيين عرض الإخراج (≥ 800) وارتفاع (≥ 400) من القطع الناقص. تعيين النقطة الزمنية التي ينبغي إنشاء استخراج السطح (أي تحديد طول استخراج TLM). اختيار إما كروية أو إسقاط أسطواني. الوجه Z ومحاذاة Y إذا لزم الأمر.
      2. اضغط على حساب للحصول على استخراج سطح لكلا القناتين في نوافذ جديدة تسمى صورة. اضبط سطوع وتباين نوافذ الصور التي تم الحصول عليها حتى تتمكن من رؤية إشارات الكنتيوسين المتوقعة، وذلك بالنقر فوق Image > ضبط > السطوع/التباين.
        ملاحظة: يظهر في الشكل 6B,Dمقارنة مثال للإسقاط الناتج عن تناسب القطع الناقص غير الصحيح والأمثل .
    10. إذا كان استخراج السطح يبدو جيداً، حفظ الصور (كلتا القناتين بشكل منفصل) كـ .tiff. بالإضافة إلى ذلك، حفظ ملف إطار السجل للرجوع إليها في المستقبل فيما يتعلق بكيفية استخراج سطح غرفة البيض هذه معينة.
      ملاحظة: هذه معلومات هامة بشكل خاص إذا كان يجب إرجاع الطبقة الرقيقة المستخرجة إلى شكلها الأصلي (للمطورين فقط).
    11. دمج القنوات مع رمز اللون المفضل في فيجي.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، المشروع المحدد z-كومة الطبقات مع إشارات actomyosin. مطلوب إسقاط طبقات z-stack المحددة عندما يتغير تركيز الاكتساب قليلاً مع مرور الوقت في TLM. للحصول على أفضل النتائج، قم بالمشروع على الأكثر من طبقة إلى طبقتين z-stack.
    12. حفظ النتائج كملفات .tiff.
      ملاحظة: يمكن العثور على أمثلة تمثيلية للطبقات الرقيقة (سطح القاعدية وapical الانتقائية) التي تمثل إشارة Myosin II (MRLC::GFP) من ظهارة الجريب للتحكم وغرف البيض المتحولة fat2 في الشكل 8.
  2. معالجة البيانات لسطح الأنسجة المستخرجة بشكل انتقائي
    1. التبييض تصحيح TLMs للتعويض عن اضمحلال كثافة من تسميات الفلورسنت.
      1. فتح فيجي. فتح TLM (على سبيل المثال، TestMovie2_extraction.tif من الملف التكميلي3) باستخدام ملف > فتح. حدد الصورة لفتحها.
      2. تقسيم قنوات الألوان وتحويلها إلى صور 16 بت، إذا لزم الأمر، عن طريق النقر فوق صورة > اللون > تقسيم القنوات. تحويل القنوات إلى صور 16 بت (من صور 32 بت) باستخدام صورة > نوع > 16 بت.
      3. إجراء تصحيح التبييض على كلتا القناتين باستخدام صورة > ضبط > تصحيح التبييض > نسبة بسيطة > كثافة الخلفية 0.0.
        ملاحظة: إذا تم الحصول على نتائج غير مرضية، فمن المطلوب لاستكشاف أي طرق التصحيح في هذا البرنامج المساعد تناسب أفضل (على سبيل المثال، استخدام مطابقة الرسم البياني بدلا من نسبة بسيطة).
      4. دمج القنوات من الصورتين المصححتين بالتبييض بالنقر فوق صورة > اللون > دمج القنوات. حفظ الصورة المدمجة كملف .tiff بالنقر فوق ملف > حفظ باسم > Tiff.
        ملاحظة: اضبط التباين والسطوع للقنوات إذا لزم الأمر.
    2. تجزئة الخلية لإنشاء قناع خلية لـ TLMs
      1. إذا لم تكن فيجي مفتوحة بالفعل، فأعد فتحها (وتأكد من تحديثها بالنقر فوق تعليمات > تحديث > تطبيق التغييرات > موافق).
      2. إذا لم يتم ذلك بالفعل، قم بتنزيل الماكرو TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. اسحب هذا البرنامج النصي وأسقطه في فيجي. افتح الملف المُصحح بالتبييض (على سبيل المثال، TestMovie2_bleach.tif من الملف التكميلي3، راجع أيضًا 2.2.1).
      4. تقسيم قنوات الملف الذي تم تصحيحه بالتبييض بالنقر فوق صورة > اللون > قنوات سبليت. ضبط قناة الغشاء لضمان الخطوط العريضة واضحة للخلية عن طريق النقر فوق صورة > ضبط > السطوع / التباين.
      5. تشغيل البرنامج النصي الذي تم تحميله على قناة غشاء الخلية النشطة من TLM المحدد عن طريق الضغط على الرمز تشغيل في البرنامج النصي المفتوح. تعيين طمس غاوسي إلى 1.500. تعيين حساسية الكشف عن الخلية إلى -1 وانقر فوق موافق. تعيين التسامح الضوضاء المقدرة إلى ~ 8 لTLMs المكتسبة مع الهدف 40x وانقر فوق موافق.
        ملاحظة: من أجل الحصول على قناع خلية لطيفة، لا تغيير هذه المعلمات أعلاه. وبالنسبة لأهداف أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى بارامترات مختلفة. الأنظف الخلفية في TLM، مطلوب التسامح الضوضاء المقدرة أقل.
      6. يظهر قناع الخلية التي تم إنشاؤها في TLM التي تم تحليلها وأيضا في نافذة جديدة تسمى ParticleStack (G). بالإضافة إلى ذلك، يظهر إطار صغير يسمى الإجراء المطلوب. من قناع الخلية على TLM، والتركيز فقط على الخلايا في وسط TLM واختيار تلك التي يمكن أن توفر الخطوط العريضة كاملة ومحددة جيدا في جميع أنحاء TLM.
      7. إذا كانت الخلايا المحددة تحتوي على مخططات خلايا اصطناعية/إضافية، استخدم نافذة أداة الدمج التي تسمى الإجراء المطلوب في TLM. بالنسبة لهذا الأخير، اتبع الإرشادات الموجودة في النافذة.
        ملاحظة: تأكد من أن الخطوط العريضة للخلايا محددة بشكل جيد وتتوافق مع أغشية الخلايا الحقيقية في TLM لأن أي عدم دقة قد يؤثر على التحليلات اللاحقة. يمكن إجراء تعديلات وتغييرات إضافية، مثل إزالة الخلايا غير المرغوب فيها، لاحقًا باستخدام أداة مدير Surface (الموضحة في البرنامج التعليمي أدناه).
      8. عندما تتوافق الخلايا المحددة في المركز بشكل جيد مع أغشية الخلايا الحقيقية، احفظ ParticleStack كملف .tiff بعد ملف > حفظ باسم > Tiff. انتقل إلى إجراء تحميل قناع الخلية التي تم إنشاؤها وتحليل actomyosin في Surface Manager كما تم إجراؤها مسبقًا في القسمين 1-1-3 و1.2 (الموضح أيضًا بالتفصيل في القسمين 2-2-3 و2.3).
    3. تحميل قناع الخلية الذي تم إنشاؤه في إدارة Surface
      1. إذا تم تثبيت البرنامج المساعد "إدارة السطح" بالفعل في إعداد فيجي المستخدمة، انتقل إلى الخطوة 2. إذا لم يكن الأمر كذلك، اتبع Viktorinova وآخرون16. للمطورين، فقط التعليمات البرمجية المصدر هو متاح أيضا15.
      2. افتح Surface Manager بالنقر فوق الإضافات > الشرائح > مدير Surface(3D).
        ملاحظة: يعرض إطار إدارة Surface عدة أزرار إجراء على اليمين وإطار فارغ على اليسار. لمشاهدة كافة أزرار الإجراء، قد يكون مطلوباً لتمدد الإطار في ارتفاعه/عرضه. لاحظ أن الإطارات الزمنية ستظهر كشرائح z.
      3. افتح الملف ParticleStack.tif المطابق في Surface Manager عبر ملف > فتح وحدد الصورة لفتحها (على سبيل المثال، ParticleStack2.tif من الملف التكميلي 3).
      4. في Surface Manager، انقر فوق الزر قراءة صورة المخطط التفصيلي وتعيين فهرس الجاكار إلى 60%.
        ملاحظة: تحميل ملف ParticleStack.tif يمكن أن يستغرق عدة دقائق، اعتماداً على قوة الكمبيوتر.
      5. بمجرد تحميلها، سيتم تعيين كل خلية مع رقم S وسوف تظهر في الجزء الأيسر من إطار مدير Surface (الشكل7A).
        ملاحظة: لإظهار المخططات التفصيلية وأسماء الخلايا لكافة الخلايا، حدد خانات الاختيار إظهار الكل وإظهار التسميات في أسفل إطار مدير Surface. من المستحسن استخدام هذه الوظيفة بمجرد التحقق من أرقام الخلايا للتأكد من صحتها.
      6. انقر على رقم S الأول; يظهر مخطط الخلية المستوردة من ParticleStack.tif على TLM. تحقق من كل رقم S المستوردة لجودة مخطط الخلية في جميع أنحاء TLM وإزالة الخلايا غير المرغوب فيها التي تعرض مخططات الخلايا غير صحيحة. للقيام بذلك، قم بتمييز مخطط الخلية وانقر على الزر حذف.
        ملاحظة: ومن الممكن أيضا لتصحيح الخطوط العريضة للخلية غير دقيقة وإضافة الخطوط العريضة للخلية الجديدة. ويرد وصف ذلك في قسم المناقشة.
      7. حفظ كافة الخلايا التي تم تصحيحها كملف RoiSet.zip عن طريق الضغط على الزر حفظ إلى القرص.
        ملاحظة: إذا كانت جلسة العمل تحتاج إلى مقاطعة، فمن الممكن تحميل الملف RoiSet.zip في مدير Surface لاحقاً: فتح TLM في فيجي عبر ملف > فتح وحدد TLM. فتح مدير السطح على النحو التالي: الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). قم بتحميل RoiSet.zip المطابق بالنقر فوق الزر تحميل من القرص واختيار الملف RoiSet.zip المناسب (على سبيل المثال، TestMovie2_RoiSet.zip). تحقق مرتين من أن أقنعة الخلايا المحملة تتوافق مع TLM المحملة.
  3. تحليل نبضات الكنتوموسين في مدير Surface
    ملاحظة: فتح فيجي والتأكد من أن TLM وقناع الخلية المقابلة لها مفتوحة في مدير Surface. تأكد من تثبيت فيجي ومحدثة ويتم تثبيت البرنامج المساعد Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager).
    1. افتح TLM مع ملف > افتح وحدد TLM لفتح (على سبيل المثال، TestMovie2_bleach.tif). تحميل البرنامج المساعد مدير السطح عن طريق الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). تحميل قناع الخلية المحفوظة التي تم إنشاؤها في البرنامج التعليمي هنا (على سبيل المثال، ParticlesStack2.tif) عبر ملف > فتح وحدد قناع الخلية (على سبيل المثال، ParticlesStack2.tif). قم بتحميل عائد الاستثمار المقابل (على سبيل المثال، TestMovie2_RoiSet.zip).
    2. قم بالتبديل إلى قناة الاهتمام بـ TLM المحدد.
      ملاحظة: للتمييز بين القنوات، اتبع رمز اللون المشار إليه حول TLM.
    3. في Surface Manager، انقر فوق الزر إحصائيات للحصول على إطار يسمى متوسط القيمة الرمادية شريحة حسب الشريحة (الشكل7B). لاحظ أنه سيتم عرض قيم الكثافة المتوسطة/الوسيطة لإشارات الكنتيوموسين في قناة معينة تم تحليلها داخل مخططات الخلايا المحددة مع مرور الوقت، بالإضافة إلى المعلمات الأخرى المتعلقة بمنطقة الخلية وشكل الخلية.
      ملاحظة: قيم الكثافة في A.U.; منطقة الخلية بالبكسل وتحتاج إلى تحويلها إلى ميكرومترات مربعة.
    4. حفظ القيم التي تم الحصول عليها كملف جدول بيانات: انقر على نافذة الإحصائيات، ملف > حفظ باسم.
      ملاحظة: ويمكن التحقق من القيم الإحصائية التي تم الحصول عليها في وقت لاحق، على النحو التالي. فتح TLM تصحيح التبييض في فيجي. افتح مدير Surface. قم بتحميل RoiSet.zip المطابق إلى TLM عن طريق الضغط على الزر تحميل من القرص وفتح الملف. سيتم تحميل القناع المحفوظ مع الخطوط العريضة للخلية وستظهر أسماء الخلايا في إطار مدير Surface الأيسر. انقر فوق الزر إحصائيات للقيم الإحصائية.
      ملاحظة: وفيما يتعلق بتحليل يدوي لإشارات الأتوميوسين دونالخلوية الفردية ، لا يمكن إجراء تحليل يدوي لإشارات الأتوميوسين تحت الخلية على مقياس الأنسجة. التحسين مطلوب لتحليل إشارات الأتيوميوسين الفردية على مقياس شبه الأنسجة، كما هو موضح في قسم المناقشة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكّن هذا البروتوكول العلماء من التحقيق في سلوك شبكات الكتميوسين في الأنسجة الظهارية. هذا ممكن فقط عندما يتم الجمع بين تحليل مفصل لسلوك الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (عدد قليل من الخلايا) مع تحليل مماثل على مقياس الأنسجة (العديد من الخلايا). ومع ذلك، غالبا ما تكون الأنسجة الظهارية منحنية واستخراج طبقة رقيقة من هذه الأنسجة لميكن من الممكن في السابق بسهولة، كما هو مبين في غرف البيض Drosophila (الشكل 1). البروتوكول المعروض هنا يوفر للمستخدمين تعليمات بسيطة تصف كيفية تحليل سلوك الكنتوموسين على كل من هذه المقاييس (الشكل 2).

يركز الجزء الأول من هذا البروتوكول على التعليمات المتعلقة بتحليل نبضات الكنتيوموسين باستخدام البرنامج المساعد مدير Surface (الشكل3). كما يصف كيفية تحليل سلوك الأتوموسين الفردي يدويًا على النطاق الخلوي المحلي (الشكل4). الجزء الثاني من هذا البروتوكول يشرح كيفية استخراج طبقة رقيقة من الأنسجة الظهارية باستخدام البرنامج الفرعي إسقاط سطح القطع الناقص (الشكل5 والشكل 6). عندها فقط من الممكن تحليل نبضات الكنتوموسين على مقياس الأنسجة باستخدام البرنامج المساعد مدير Surface (الشكل7). تظهر النتائج التمثيلية ومقارنة سلوك الأتومموسين في التحكم الدوري والدهون الثابتة2 متحولة دروسوفيلا غرف البيض على مقياس الخلوية والأنسجة المحلية في الشكل 8 وفي الفيلم المقابل 1، فيلم 2, فيلم 3, فيلم 4, فيلم 5, و فيلم 6 (لمزيد من التفاصيل, انظر الشكل 8).

Figure 1
الشكل 1: استخراج انتقائي لطبقة رقيقة من سطح الأنسجة المنحنية. (أ) من أجل الحصول على معلومات كافية بشأن شبكات الكنتيوميوسين في الظهارة المنحنية المحيطة، من الضروري الحصول على كومة z عميقة (وردي) على غالبية الأنسجة المرئية كما هو موضح للظهارة بصيلات منحنية (رمادي) من غرف البيض دروسوفيلا. (أ) ومع ذلك، إسقاط بسيط من هذا القبيل z-المكدس يؤدي إلى خلط شبكات actomyosin كله في خلايا الجريب. Myosin II تصور مع MRLC::GFP (الأخضر) يظهر المنطقة الداخلية (apical) تعبر بقوة من الخلايا بصيلات في مثل هذا الإسقاط z وتقريبا أي معلومات من الجانب القاعدي (الخارجي)، حيث يعرض Myosin الثاني فينتيبي القطبية الخلية اللوح قوية، ولكن لها كثافة إشارة منخفضة12. لتجنب مثل هذا الخلط كما هو مبين في لوحة A '، قمنا بتطوير البرنامج المساعد سهلة الاستخدام، ومقرها فيجي ودعا الإسقاط سطح القطع الناقص في BigDataViewer18 الذي يسمح (B) استخراج انتقائي ة من طبقة محددة رقيقة (الوردي ) من الكتميوسين من ظهارة منحنية(B') كما هو مبين لميوسين الثاني (الأخضر) في استخراج مختارة من الجانب القاعدي (الخارجي) من ظهارة الجريب. قارن الفرق في إشارة Myosin الثاني (MRLC::GFP) في اللوحتين A' و B'. لاحظ نمط مستقطب من Myosin الثاني في لوحة B'. الخطوط العريضة للخلية باللون الأحمر. الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 50 درجة.

Figure 2
الشكل 2: شبكة الأتيوميوسين المستقطبة المعبّلة على الموازين الخلوية والأنسجة المحلية. تصوير الأتوموسين على نطاقات مختلفة يسمح بتحليل أعداد مختلفة من الخلايا الظهارية، وهي (أ) ما يصل إلى 15 خلية على النطاق الخلوي المحلي و (ب) 50-100 خلية على مقياس الأنسجة في ظهارة الجريب المستزرعة غرف البيض دروسوفيلا. يتم تصور Myosin غير العضلات الثاني مع MRLC::GFP (الأخضر) ويتم تحديد النمط الجيني للخط المعدل وراثيا المستخدمة في جدول المواد. الخطوط العريضة للخلية في أرجواني. الجانب الأمامي على اليسار. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر (A)؛ 50 ميكرومتر (ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على تحليل نبضات Myosin II في Surface Manager على النطاق الخلوي المحلي. (أ) يتم تحميل مكدس الجسيمات في مدير Surface. لاحظ أن كافة الخلايا المعرّفة في TLM تظهر في إطار إدارة Surface. من المهم حذف جميع الخلايا غير المرغوب فيها أو غير المكتملة في جميع أنحاء TLM. (B) تظهر الإحصائيات التي تم الحصول عليها على Myosin II (MRLC::GFP) للخلايا المحددة في النافذة التي تسمى متوسط القيمة الرمادية Slice by Slice في Surface Manager. MRLC::GFP يظهر باللون الأخضر في حين أن الأغشية الخلوية باللون الأحمر. الجانب الأمامي على اليسار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مثال على التحليل اليدوي لإشارات ميوسين الثاني الفردية على النطاق الخلوي المحلي. (أ) يتم وضع فيلم فرعي محدد بطول 30 s بجوار (B) الإسقاط الزمني. لاحظ أنه عند تحديد الوقت، يعرض Myosin II (MRLC::GFP) خطوط مسار أطول (انظر اللوحة B) داخل الخلايا الفردية مما هو عليه في إطار زمني فردي (انظر اللوحة A). وينبغي تحليل الخطوط الفردية في الخلايا لاتجاهها الزاوي بالنسبة إلى المحور الأمامي الخلفي من غرف البيض. (C) لاحظ أن فيجي لا تقيس 0°-360° ولكن فقط 0°-180° للإشارات التي تشير إلى أعلى و 0°-179° للإشارات التي تشير إلى الأسفل. كن على علم بأن 0 درجة يتم وضعها بشكل غير عادي على يمين الصورة التي تم تحليلها. (د) استنادا ً إلى هذه المعلومات، يجب وضع الخطوط التي تتحرك مع (حتى باللون الوردي) أو ضد (أسفل باللون الأصفر) اتجاه الدوران الظهاري في غرفة بيض معينة لتحديد ما إذا كان كسر التماثل للإشارات التي تم تحليلها موجودًا داخل الخلية ومن ثم لخلايا متعددة في الأنسجة التي تم تحليلها. MRLC::GFP يظهر باللون الأخضر في حين أن الأغشية الخلوية باللون الأحمر. الجانب الأمامي على اليسار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مثال على توليد القطع الناقص تناسب على مقياس الأنسجة. من أجل احتواء القطع الناقص على غرفة البيض باستخدام البرنامج المساعد الإسقاط سطح القطع الناقص في BigDataViewer، فإنه مطلوب لتحديد (أ) مربع المحيطة التي تشمل غالبية الأنسجة الممسوحة ضوئيا. بعد ذلك، منالمهم (B) تحديد نقاط الإشارة، والتي هي شرط مسبق لتوليد تناسب القطع الناقص الأمثل. (C) عندما تناسب القطع الناقص ليست الأمثل ولا تحيط لطيف غرفة البيض، وهذا يؤدي إلى (D) استخراج طبقة الأنسجة الفقيرة. انظر استخراج ونتائج الإسقاط في وقت لاحق في الشكل 6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مقارنة بين تناسب القطع الناقص غير الصحيح والأمثل والإسقاطات السطحية المقابلة. (أ) عندما لا يتم تركيب القطع الناقص بشكل صحيح، (B) الإسقاط السطحي النهائي لن يوفر بيانات إشارة كاملة في الطبقة الرقيقة من الأنسجة التي تم تحليلها. (C) ومع ذلك، عند تركيبها على النحو الأمثل، فإنه يضمن الكشف عن إشارة متساوية من طبقة رقيقة في الأنسجة. (D) لاحظ أن الإسقاط السطحي الأمثل يحتوي على عدة طبقات رقيقة ككومة zالمتوقعة على السطح مع مرور الوقت، والتي يمكن فصلها فيما بعد كما هو موضح في الشكل8. يتم دمج إشارات Myosin II (MRLC::GFP، أبيض) وإشارات الغشاء (أبيض) في البداية قبل الإسقاط (اللوحتان A و C)،ولكن عند الإسقاط السطحي نفسه، يتم فصل هذه القنوات (انظر إسقاطات Myosin II في الألواح B وD). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: مثال على تحليل نبضات Myosin II في Surface Manager على مقياس الأنسجة. (أ) يتم تحميل مكدس الجسيمات في مدير Surface. لاحظ أن كافة الخلايا المعرّفة في TLM تظهر في إطار إدارة Surface. من المهم حذف جميع الخلايا غير المرغوب فيها أو غير المكتملة في جميع أنحاء TLM. (B) تظهر الإحصائيات التي تم الحصول عليها على نبضات Myosin II (MRLC::GFP) (متوسط أو متوسط) للخلايا المحددة مع مرور الوقت في النافذة التي تسمى متوسط القيمة الرمادية Slice by Slice في Surface Manager. لاحظ أن أقوى نقاط Myosin الثاني قد تؤثر على المقياس النهائي لكثافة Myosin الثاني الجوهرية. ينتج هذا عن المشكلة التي قد تظهر هذه النقاط Myosin II ترحيل خارج المخطط التفصيلي للخلية حيث يوجد تعريف مخطط تفصيلي خلية غير صحيحة في قناع الخلية التي تم إنشاؤها. MRLC::GFP يظهر باللون الأخضر في حين أن الأغشية الخلوية باللون الأحمر. الجانب الأمامي هو في الأعلى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: النتائج التمثيلية لشبكة ميوسين الثاني في ظهارة بصيلات دروسوفيلا. أمثلة تمثيلية من دينامية Myosin الثاني (MRLC::GFP) السلوك(A و B)على نطاق الخلوية المحلية و (C-F) على مقياس الأنسجة للسيطرة وfat2 متحولة غرف البيض Drosophila. انظر جدول المواد للحصول على معلومات مفصلة عن الأنماط الجينية المستخدمة. لاحظ أن إشارات MRLC::GFP (خضراء) تتحرك عموديًا على محور الأمامي الخلفي (AP) لغرف البيض للتحكم. يتم فقدان هذا القطبية في fat2 غرف البيض متحولة ويؤدي إلى النبضات Myosin II غير متجانسة / التذبذبات12. عند التحليل اليدوي لإشارات MRLC::GFP الصغيرة (~300 درجة مئوية) والتحديد الكمي لحركة الاتجاه الزاوي على النحو الموضح في البروتوكول، يمكن ملاحظة كسر التماثل لإشارات MRLC::GFP مع تفضيل ضد اتجاه الظهارية التناوب في غرفة البيض تحليلها12 (الشكل 4). الأفلام المقابلة هي: لوحة A = فيلم 1، لوحة B = فيلم 2، لوحة C = فيلم 3، لوحة D = فيلم 4، لوحة E = فيلم 5، ولوحة F = فيلم 6. يتم عرض الخطوط العريضة للخلية باللون الأرجواني. الجانب الأمامي على اليسار. قضبان مقياس = 5 ميكرومتر (A و B)و 50 ميكرومتر (C -F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المعلمات الموصى بها للتصوير عالي السرعة لوقت قصير على النطاق الخلوي المحلي:
(ط) نسيج من الفائدة وضعت بحرية في وسط الزراعة (أي لا زلات غطاء، والبطانيات المرنة، وما إلى ذلك)
الثاني. 63x هدف المياه مع فتحة رقمية >= 1.3
الثالث. مجهر مقلوب
رابعا. طائرة واحدة
الخامس. 6-12 فترات زمنية
السادس. 5-10 دقائق TLMs
'7' متطلبات تخزين البيانات لكل TLM تصل إلى 100MB
المعلمات الموصى بها للتصوير عالي السرعة منذ فترة طويلة على مقياس الأنسجة:
(ط) نسيج من الفائدة وضعت بحرية في وسط الزراعة (أي لا زلات غطاء، والبطانيات المرنة، وما إلى ذلك)
الثاني. 40x أهداف المياه والفتحة العددية >= 1.3
الثالث. مجهر قرص الغزل المقلوب
رابعا. z-مداخن للحصول على كاليفورنيا نصف غرفة البيض
الخامس. 60 s فترات زمنية
السادس. 30 دقيقة على الأقل من الـ TLMs
'7' متطلبات تخزين البيانات حوالي 1 جيجابايت

الجدول 1: معلمات التصوير الموصى بها.

Movie 1
فيلم 1: السلوك الديناميكي التمثيلي من Myosin الثاني (MRLC::GFP) على نطاق الخلوية في غرفة البيض دروسوفيلا السيطرة. لاحظ أن MRLC::GFP (الأخضر) يفضل التحرك عمودياً على محور AP لغرف البيض. الخطوط العريضة للخلايا في أرجواني. منظر القاعدية. الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 5 ميكرومتر. انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.

Movie 2
فيلم 2: السلوك الديناميكي التمثيلي لميوسين الثاني (MRLC::GFP) على نطاق الخلوية في fat2 متحولة غرفة البيض Drosophila. لاحظ أن نبضات MRLC::GFP (خضراء) ولم تعد مائلة متعامدة مع محور AP لغرف البيض الثابتة. الخطوط العريضة للخلايا في أرجواني. منظر القاعدية. الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 5 ميكرومتر. انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.

Movie 3
فيلم 3: السلوك الديناميكي التمثيلي للقاعدة ميوسين الثاني (MRLC::GFP) في مقياس الأنسجة في غرفة البيض Drosophila السيطرة. لاحظ أنه يتم استخراج طبقة فقط من الباسيل رقيقة (الخارجي) MRLC::GFP من ما يقرب من نصف ظهارة بصيلات غرفة البيض. MRLC::GFP باللون الأخضر والخطوط العريضة للخلايا باللون الأرجواني. لاحظ الفرق في مستوى التفاصيل من سلوك إشارة MRLC::GFP التي تم الحصول عليها هنا (تمثل مقياس الأنسجة) بالمقارنة مع الفيلم 1 (الذي يمثل المقياس الخلوي). الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 50 درجة. انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.

Movie 4
الفيلم الرابع: السلوك الديناميكي التمثيلي للقاعدة Myosin الثاني (MRLC::GFP) على مقياس الأنسجة في غرفة البيض Drosophila متحولة fat2. لاحظ أن MRLC::GFP (الأخضر) البقول بقوة في الجانب القاعدي من ما يقرب من نصف ظهارة الجريب من غرفة البيض متحولة fat2 ويفشل في توليد القوة المتزامنة اللازمة لتعزيز دوران الظهارية. الخطوط العريضة للخلايا في أرجواني. الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 50 درجة. انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.

Movie 5
الفيلم الخامس: السلوك الديناميكي التمثيلي من Myosin apical الثاني (MRLC::GFP) على مقياس الأنسجة في غرفة البيض دروسوفيلا السيطرة. يتم استخراج فقط طبقة MRLC::GFP رقيقة من الجانب apical (الداخلية) من ما يقرب من نصف ظهارة بصيلات من غرفة البيض. لاحظ أن MRLC::GFP (باللون الأخضر) يظهر سلوك ديناميكي مختلف هنا في الجانب apical بالمقارنة مع الجانب القاعدي من ظهارة الجريب (كما هو موضح في الفيلم 3). الخطوط العريضة للخلايا في أرجواني. الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 50 درجة. انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.

Movie 6
فيلم 6: السلوك الديناميكي التمثيلي من Myosin apical الثاني (MRLC::GFP) على مقياس الأنسجة في غرفة البيض Drosophila متحولة fat2. تغيير السلوك الديناميكي من MRLC::GFP (الأخضر) المستخرجة من منطقة رقيقة apical من ما يقرب من نصف ظهارة بصيلات من غرفة البيض متحولة fat2 الدهون ثابتة. الخطوط العريضة للخلايا في أرجواني. الجانب الأمامي على اليسار. شريط مقياس = 50 درجة. انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتشريح وزراعة غرف البيض

إذا تم وضع الكثير من الذباب في قارورة صغيرة، يمكن أن يتحول الطعام يطير الموحلة بعد 2-3 أيام بسبب كميات كبيرة من اليرقات تغذية والذباب الكبار الحصول على المحاصرين في الغذاء يطير. في مثل هذه الحالة، الوجه بقية هذه الذباب في قارورة جديدة مع المواد الغذائية الطازجة وتقليص عددها. على وجه الخصوص، استبعاد الإناث التي كانت عالقة في الغذاء.

يجب إعداد مزيج شنايدر (SM) مسبقًا ويمكن تخزينه عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 14 يومًا تقريبًا. يجب أن تدرك أن مزيج أقدم قد تحتوي على بلورات التي يمكن أن تضر سطح غرف البيض. دائما خلط SM مع الأنسولين المضافة حديثا والسماح لها الوقت الكافي للوصول إلى درجة حرارة الغرفة. وهذا يحمي غرف البيض ضد الصدمة الباردة، والتي يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على نمو microtubules والمحاذاة اللوح للهيكل الخلوي (كما رأينا في الجناح Drosophila النامية19).

غرف البيض والبويضات المختارة هشة جدا، ونظرا لصغر حجمها، قد تطفو في SMI (SM مع الأنسولين). فمن المستحسن السماح لهم تغرق تلقائيا في SMI. كما أنها غالباً ما تلتزم بملقط التشريح/ أداة الصبار. في مثل هذه الحالة، السماح لهم بتحرير أنفسهم من أجهزة تشريح عن طريق نقل بلطف لهم في SMI. تجنب الضغط ولمسها مباشرة في جميع الأوقات. إذا لزم الأمر، استبعاد هذه الغرف البيض / ovarioles من البروتوكول آخر.

وبما أن منظار الاستريو لا يمكن الاعتماد عليه في تحديد غرف البيض التالفة/البويضة، ينبغي فحص غرف البيض/البويضة باستخدام قناع الخلية أو صبغة FM 4-64 تحت مجهر قرص مجهر قرص مجهر للقرص ذي البؤرة/الغزل. غرف البيض التالفة تظهر التلوين المدقع بالمقارنة مع خلفية الأنسجة غرفة البيض غير التالفة. أبدا الحصول على TLM مع بقع صبغ قوية.

الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتصوير الحي في المختبر من غرف البيض

إذا وضعت بحرية غرف البيض في SMI لا تزال تتحرك، تحقق مرة أخرى تحت المجهر البؤري لمعرفة ما إذا كان لا يزال هناك أي بقايا التغاضي عن ورقة العضلات والحطام العائمة في SMI. إزالتها وحاول مرة أخرى. من غرف البيض، يجب أن تكون 90٪ مستقرة وغير متحركة أثناء التصوير اللاحق.

للتأكد من أن غرفة البيض المختارة / البويضة مستقرة، استخدم التصوير عالي السرعة (6 فترات) لمدة دقيقة واحدة. ومع ذلك، فمن المستحسن لمشاهدة تسجيل الفاصل الزمني كله لتكون قادرة على تصحيح بلطف حركة غير متوقعة محتملة من غرفة البيض المصورة. هذا يستطيع كنت أتمّت ب يتحرّك المرحلة مجهريّة/طاولة, أيّ يمسك ال [بتري] طبق مع المثقفة بيضة غرف/[أفريولس], إلى الموقعة أصليّة [س ثت] البيضة غرفة من الفائدة ثانية في ال يصور, يركّز نافذة.

توقف عن التصوير في حالة ظهور حركة مفاجئة وغير متوقعة لغرفة البيض المصورة. تحقق من توسيد الجدول المجهر، وتجنب المشي بالقرب من المجهر خلال وقت اكتساب لأن هذا قد يؤدي إلى تعطيل الحصول على الصورة بسبب الاهتزازات الناجمة.

إذا كانت صبغة غشاء الخلية غير مرئية بعد 30 دقيقة وخط الليزر المستخدم هو الصحيح، إضافة المزيد من الصبغة وزيادة تركيزها للاكتساب المقبل.

إذا كانت إشارات الكنتوموسين تبدو غير واضحة، تحقق من NA من الهدف المستخدم. وNA أقل من 1.3 سوف يقلل من جودة التصوير. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن استخدام زيت الغمر قد تم تطبيقه بشكل صحيح على هدف الماء 63x. إضافة أو استبدال إذا لزم الأمر.

إذا تقلصت غرف البيض وتشوه أغشية الخلايا الملاحظة، تحقق مما إذا كان الغطاء مغلقًا بشكل صحيح. إذا كان الغطاء مفقودًا أو غير مغلق بشكل صحيح، يمكن أن تجف غرف البيض بسبب تبخر SMI خلال وقت الاكتساب.

إذا كان دوران غرف البيض يبطئ أو يتوقف، وانخفاض قوة الليزر. إذا ظهرت حفرة في غرفة البيض، فقد تم حرقها بواسطة الليزر. تقليل قوة الليزر.

إذا كان actomyosin إشارات التبييض بعد 2 دقيقة خلال الحصول على TLM، وانخفاض قوة الليزر وزيادة تضخيم إشارة في برنامج المجهر.

مرة واحدة وقد تم الحصول على TLM من ظهارة بصيلات من غرفة بيضة واحدة، فمن المستحسن لتجنب التصوير مرة أخرى في نفس منطقة الأنسجة من هذه الغرفة البيض. ومع ذلك، كما غرف البيض تدور حول محور AP، فمن الممكن لتكرار الحصول على TLM باستخدام هذه الغرفة البيض غير التالفة بعد حوالي 30 دقيقة. أثناء تصوير ظهارة الجريب في غرفة بيض واحدة، لن يتم تبييض/تلف غرف البيض الأخرى حتى لو كانت موجودة في نفس البويضة أو في أوفاريول آخر في SMI.

إذا تم استيفاء جميع هذه المتطلبات، يجب أن تكون النسبة المئوية لغرف البيض المصورة بنجاح حوالي 90%-100% للمراحل 6-8، وحوالي 50%-60% للمراحل 3-5، وحوالي 20%-30% للمراحل 1-2. الفشل يرجع أساسا إلى حركة غرف البيض أو الأضرار التي لحقت بهم أثناء تشريح / التلاعب.

الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لمعالجة البيانات

أثناء توليد قناع باستخدام البرنامج النصي المقدمة في فيجي، يمكن أن يحدث أن هناك الكثير من الخطوط العريضة للخلايا التي تم إنشاؤها التي لا تعكس أغشية الخلايا الفعلية في TLM. يحدث هذا في كثير من الأحيان بسبب الضوضاء الخلفية العالية، وخاصة عندما يتم استخدام الأصباغ لوصمة عار أغشية الخلايا. في مثل هذه الحالة، لتجنب التصحيح الممل للمخططات التفصيلية للخلية غير المرغوب فيها في القناع الذي تم إنشاؤه، قم بتشغيل التجزئة مرة أخرى وتعيين المعلمات إلى الأنسب. يمكن القيام بذلك عن طريق ضبط المعلمة التسامح الضوضاء المقدرة.

عند تحميل أحد ملفات ParticleStack.tif التي تحتوي على مخططات خلية في إدارة Surface، يتم قياس وقت التحميل خطياً مع عدد مخططات الخلايا ويمكن أن يستغرق عدة دقائق. إذا تعطل التحميل أو غير صحيح، كرر ذلك. تأكد من أن إطار التحميل في التركيز ولا يتم استخدام أي برنامج آخر.

في بعض الأحيان يجب تصحيح مخطط تفصيلي للخلية في بعض الإطارات; في مثل هذه الحالة، استخدم الزر فرشاة. ارسم مخطط الخلية الصحيح في إطار معين عن طريق سحب الماوس حول غشاء الخلية. الانتقال إلى إطار مختلف من TLM ثم العودة إلى الإطار الزمني مع التصحيح: يجب الآن استبدال المخطط التفصيلي للخلية غير صحيحة. ثم، انتقل مرة أخرى إلى الإطار التالي لتصحيح هذا واحد. ستقوم أداة الفرشاة الآن بالتبديل إلى وضع المسح. إذا لزم الأمر، قم بتصحيح الخطوط التفصيلية في الأطر الزمنية التالية عن طريق الضغط على مخطط الخلية الموجود ثم الضغط على الزر +إضافة لإنشاء مخطط تفصيلي جديد للخلية. احذف رقم S القديم من إطار إدارة Surface ثم أعد تسمية المخطط التفصيلي للخلية الجديدة عن طريق الضغط على الزر إعادة تسمية إذا لزم الأمر.

إذا كانت خلية هامة بأكملها مفقودة خلال TLM، قم بإنشاء مخطط تفصيلي قناع جديد عن طريق الضغط على إلغاء تحديد > مضلع. إنشاء مخطط خلية جديدة في الإطار الأول من TLM عن طريق النقر على طول غشاء الخلية. ثم انتقل إلى الإطار الأخير من TLM وتفعل الشيء نفسه للخلية المحددة. من خلال تشغيل الفيلم في الوقت المناسب، سيتم استيفاء الخطوط العريضة للخلية. تصحيح باستخدام أداة الفرشاة إذا لزم الأمر. بمجرد الانتهاء، اضغط على الزر +إضافة وإعادة تسمية مخطط الخلية عن طريق الضغط على الزر إعادة تسمية. كلما زاد عدد النقاط/النقرات لإنشاء مخطط تفصيلي جديد للخلية، كلما كان الاستيفاء أفضل.

وإلى جانب التناوب الظهاري، تتأثر TLMs في بعض الأحيان بالحركة غير المرغوب فيها. ولذلك، فمن المستحسن لتصحيح مثل هذه الانجراف الأنسجة في هذه TLMs. من خلال القيام بذلك، يتم تصحيح TLMs أيضا للدوران الظهاري ة من غرف البيض، وأغشية الخلايا تصبح جامدة. وهذا يجعل التحليل اليدوي لإشارات الكنتوموسين أسهل. ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج لا يسمح للعلماء بالتمييز بين ما إذا كانت إشارات الكنتيوموسين الملاحظة تتحرك أو تكون ثابتة بالنسبة لغشاء الخلية. إذا كان التمييز بين الحركات الثابتة والنشطة لإشارات الأكتيوميوسين هو الهدف من مثل هذا التحليل، لا ينبغي تطبيق أي تصحيح الانجراف الأنسجة. وجدنا أن غالبية إشارات actomyosin تتحرك بنشاط بالنسبة لغشاء الخلية وجزء صغير منهم فقط تظهر ثابتة.

الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحليل إشارات الكتميوسين تحت الخلوية

إذا كانت الإحصائيات التي تم إنشاؤها تحتوي على القيم الخارجية، تأكد من أن أي قيم منخفضة للغاية أو عالية فيما يتعلق بمجموعة البيانات بأكملها تعكس حقاً السلوك في الخلية وليست نتائج ملموسة. ويمكن القيام بذلك عن طريق تحديد الخلية التي تحتوي على القيم الخارجية والتحقق من جودة مخطط الخلية في الوقت الذي تم فيه قياس القيمة المنخفضة/العالية. في كثير من الأحيان، تنتج هذه القيم المتطرفة من الخطوط العريضة الخلية المعيبة التي تقيس بشكل غير صحيح جزء من خلية أخرى. قد يكون هذا واضحًا بشكل خاص عندما تتداخل النقط الكبيرة مع مخطط الخلية لخلية مجاورة. في مثل هذه الحالة، من الأهمية بمكان تصحيح الخطوط العريضة للخلية وتكرار القياس.

لتسهيل التحديد الكمي، قم بتحليل الإشارات في سطح خلية معين واحدًا تلو الآخر حتى يتم تحليل جميع الخلايا في فيلم فرعي. قد لا تظهر نتائج التحليل اليدوي لإشارات الكتميوسين تحت الخلية التماثل في خلية واحدة وغرفة بيض معينة واحدة. لقد اختبرنا أن الكنتوموسين لا يكسر بوضوح التماثل بالنسبة لحركة الأنسجة في <10% من غرف البيض الدوارة (المراحل 6-8). وتزداد هذه النسبة المئوية حول المرحلة 412. وجدنا أيضا أنه لا يوجد فرق سواء تم تحليل 5 دقيقة أو 10 دقيقة في تحديد الاتجاه المفضل لحركة إشارة actomyosin في غرفة البيض12.

الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لاستخراج انتقائي من إشارات الكنتيوسين من الأنسجة المنحنية

حجم خاطئ من النقط (إشارات محددة) سوف يؤدي إلى أي النقط وسوف تجميد البرنامج في الخطوة التالية. في هذه الحالة، إنهاء القوة فيجي وإعادة تشغيل حديثا البرنامج المساعد الإسقاط سطح القطع الناقص. تفعل الشيء نفسه عندما لا يتفاعل البرنامج بعد الضغط على Compute. وكثيرا ما يكون ذلك مؤشرا على أنه قد تم اختيار بارامترات غير مناسبة.

إذا كان هناك الكثير من النقط و / إذا كانت تتركز نحو جانب واحد من غرفة البيض تحليلها، وهذا قد يؤثر على القطع الناقص مصممة ولا توفر المناسبة الصحيحة لغرفة البيض. العودة إلى تحديد النقطة ومحاولة لترتيب حجمها في تركيبة مع اختيار x-, y و z-محور من غرفة البيض. كما يحدث الفشل في إنشاء تناسب القطع الناقص جيدة أيضا عند استخدام إعدادات المسافة قطع غير مناسبة.

قد تبدو الإسقاطات التي تم الحصول عليها في بعض الأحيان خاطئة التركيز، أو ربما الطائرة z التي تم الحصول عليها تتحرك في الواقع بين طبقات الخلايا بالقرب من سطح غرفة البيض. هذا هو عادة علامة على القطع الناقص المناسب سيئة حيث يتم تعيين منطقة واحدة من القطع الناقص بعيدا جدا عن غرفة البيض. في محاولة لتناسب القطع الناقص بحيث يحافظ على نفس المسافة من محيط غرفة البيض.

حدود الأسلوب والنهج الجديدة

هذا التركيب الحر لغرف البيض يغفل التسطيح الدقيق لسطح غرفة البيض. ولهذه الغاية، فإن لهذه الطريقة مزاياها وعيوبها. عند استخدام الفحص المجهري البؤري، فإنه يوفر للمستخدمين مع التصوير عالية الدقة وعالية السرعة التي تكشف بشكل موثوق سلوك الكتميوسين في الخلايا في محيط غرف البيض لفترة قصيرة من الزمن (5-10 دقيقة). ومع ذلك، من خلال القيام بذلك، فإنه يحد من حجم مستوى واحد التي يمكن تصويرها مع المجهرية البؤرية مع مرور الوقت. بشكل عام، فمن الممكن صورة ما يصل إلى ~ 15 خلية لكل غرفة البيض في المراحل 6-8 ولكن فقط حول اثنين من الخلايا في غرف البيض في المراحل 1-5. لذلك، قمنا بتعريف هذه الطريقة هنا بأنها مناسبة فقط للمقياس الخلوي المحلي.

وللتغلب على حدود الحجم هذه التي يسببها الحجم المحدود لمستوى واحد من البؤر، قمنا بتطوير نهج بديل قائم على فيجي يسمى إسقاط سطح القطع الناقص، لاستخدامه على مقياس الأنسجة. هذا يجمع بين قرص الغزل المجهري مع استخراج سطح شبه تفاعلي من غرف البيض على مقياس الأنسجة. وبهذه الطريقة، يمكن الحصول على إشارات الأتوموسين في نفس الوقت لأكثر من 50-100 خلية من غرفة بيض واحدة تم تحليلها. من المهم أن نلاحظ أن هذا النهج يولد مجموعات بيانات كبيرة جدا من البيانات المكتسبة (~ غيغا بايت)، لديه دقة أقل (يستخدم 40X مقابل هدف 63x)، ويوفر أيضا سرعة تصوير أبطأ (يستغرق ~ 60 ق لمسح من خلال نصف أنسجة البيض شام [المراحل 6-8] وعلى هذا النحو، هو أبطأ 10x من طريقة المستوى البؤري ة المحدودة).

بالمقارنة مع البرامج الموجودة الأخرى لاستخراج الإسقاطات الطبقات من الأسطح parametrized، ويركز البرنامج المساعد وضعت لهذا البروتوكول على سهولة الاستخدام والتغذية المرتدة البصرية التفاعلية في كل خطوة من هذه العملية. وتركز أدوات أخرى، مثل نظام ImSaNE20الذي يستند إلى MATLAB، الذي يستخدمه Chen وآخرون21،على التعامل مع مجموعة واسعة من النماذج السطحية شبه المُرْضِبة وغير الباراميتريزة وأساليب الإسقاط المختلفة. على سبيل المثال، يتطلب ImSaNE معالجة البيانات مسبقًا ومواءمتها بطريقة معينة ويتطلب جزئيًا أدوات خارجية في خطوات وسيطة. وعلى النقيض من ذلك، فإن البرنامج المساعد المعروض هنا يعالج أي صورة ثلاثية الأبعاد/4D/5D (تسلسل) يمكن فتحها في فيجي دون معالجة خارجية مسبقة. في حين ImSaNE هو شكلي للغاية (للبرمجة) عن طريق تحرير البرامج النصية MATLAB، ونحن نقدم مجموعة ضئيلة من الخيارات في سير عمل واحد التي تم تصميمها خصيصا لمشكلة محددة نوقشت هنا. توفر كل خطوة من خطوات سير العمل التفاعلي نتائج يمكن فحصها وتعديلها بشكل مرئي على الفور إذا لزم الأمر.

والقرار المتعلق بالنهج التصويري المحلي، أي مقياس الهواتف الخلوية أو الأنسجة المحلية، هو الأفضل لتجربة معينة، وهو يعتمد فقط على السؤال العلمي الذي يتعين الإجابة عليه (أي أعلى مقابل دقة أقل؛ ووقت الاقتناء القصير مقابل الوقت الطويل). ويمكن أن يكون الحل الوسط الجيد بين هذين المقياسين هو الجمع بين النهجين، وبالتالي الحصول على تصوير إشارات الأتوموسين على مقياس الأنسجة شبه (أي الخلايا 20-30). وهذا يتطلب مجهر قرص الغزل، وعدسة المياه 63X مع NA ≥ 1.3، وإعدادات Z-المكدس المنشأة لخلايا 20-30 من غرفة البيض. هذا أكثر ضحلة z-المكدس (على النقيض من z-المكدس المطلوبة للحصول على نصف غرفة البيض) يسمح المسح الضوئي أسرع من أقل من 60 ق. يمكن استخدام الوقت المكتسب هنا إما للحصول على z-stack المتكرر لتسريع التصوير أو لاسترداد عينة (الفواصل الزمنية) بين مكدسات z الفردية. مع هذا الأخير، يمكن تحقيق وقت أطول للاستحواذ (>30 دقيقة) من TLMs من غرف البيض الدوارة. هذا النهج شبه الأنسجة يضمن دقة كافية لإشارات الأتومموسين وتصوير المزيد من الخلايا في نفس الوقت على مدى فترات زمنية أطول.

التطبيقات المستقبلية والرؤية

كلا الأسلوبين الموصوفين (على نطاق الخلوية والأنسجة المحلية) توفر نهجا بسيطا ومنخفض التكلفة (باستثناء أجهزة المجهر) مع آثار جانبية محدودة على شبكة actomyosin ويمكن تنفيذها واعتمادها بسهولة للأنسجة الحيوانية تشريح أخرى. الشرط الأساسي الوحيد هنا هو بروتوكول زراعة موجود في طبق بيتري لنسيج منحني من الفائدة، والجينات المتحولة المتاحة، وعلامات أو أساليب وضع العلامات.

في تركيبة مع ضوء ورقة الفلورية المجهرية22، فمن الممكن أيضا أن صورة آلات actomyosin في toto (أي، صورة سطح محيطي الخارجي الكامل من غرف البيض Drosophila في وقت واحد ثم في وقت لاحق تتكشف باستخدام البرنامج المساعد القطع الناقص استخراجالسطح). ومع ذلك، هناك عدد قليل من القيود التي تحتاج إلى حل من حيث ملاءمة للتصوير عالية السرعة من إشارات الactomyosin، وهي 1) تضمين غرف البيض في أغاروز ذوبان نقطة منخفضة أو التمسك بالشعرية أثناء التصوير؛ '2' فتحة عددية منخفضة من عدسات المياه المستعملة التي لا توفر دقة كافية لإشارة الكتميوسين؛ 3) الوقت الإضافي اللازم للحصول على عدة زوايا من غرف البيض، مما يمنع التصوير عالي السرعة.

ولهذه الغاية، من المتوقع، مع صقل معلمات المجهر مثل سرعة المسح الضوئي من خلال الأنسجة الظهارية وتحسين العدسات المجهرية المستخدمة، فإن التحليل التفصيلي لآلات actomyosin، في المستقبل، سوف تمكن، في المستقبل، واعدة نتائج عالية الدقة التي سيتم الحصول عليها في الأنسجة وtoto مقياس على مدى فترات زمنية طويلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

أصحاب البلاغ ممتنون جدا لميريام أوسترفيلد لتقاسم مشورتها على التصوير الحياة في المختبر من غرف البيض باستخدام نهج اعتمد من مختبر سيليست بيرغ4. كما نشكر سيباستيان تسي على الخط الفيجي الذي يمكّن من تجزئة الخلايا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider Medium Gibco 21720-024 [+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122  [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum Sigma  F135 Heat inactivated
Insulin Solution Human Sigma  I9278
50 mL Falcon tubes Eppendorf sterile
Millex-GV filter Millipore SLGV033NS 33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps A. Dumont & Fils  #55
CellMask Deep Red (cell membrane dye) Invitrogen C10046
FM4-64 (cell membrane dye) ThermoFisher/Invitrogen T13320
Depression dissection slide Fisher Scientific 12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope e.g. Zeiss Stemi SV 6
Inverted confocal microscope e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder Hammacher 9160020
Cactus spine Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics