Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol biedt een op Fiji gebaseerde, gebruiksvriendelijke methodologie, samen met eenvoudige instructies waarin wordt uitgelegd hoe u het gedrag van actomyosine in afzonderlijke cellen en gebogen epitheel weefsels betrouwbaar analyseren. Er zijn geen programmeervaardigheden vereist om de tutorial te volgen; alle stappen worden uitgevoerd op een semi-interactieve manier met behulp van de grafische gebruikersinterface van Fiji en bijbehorende plugins.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Viktorinová, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58587, doi:10.3791/58587 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Drosophila onrijpe eieren heten Eier kamers, en hun structuur lijkt op primitieve organen die morfologische veranderingen ondergaan van een ronde tot een ellipsoïde vorm tijdens de ontwikkeling. Dit ontwikkelingsproces wordt oögenese genoemd en is cruciaal voor het genereren van functionele volwassen eieren om de volgende vlieggeneratie te beveiligen. Om deze redenen hebben Eier kamers gediend als een ideaal en relevant model om de ontwikkeling van dierlijke organen te begrijpen.

Verschillende in vitro kweek protocollen zijn ontwikkeld, maar er zijn verschillende nadelen aan deze protocollen. De ene omvat de toepassing van verschillende covers die een kunstmatige druk uitoefenen op de afbeelding gemaakt Eier kamers om ze te immobiliseren en om het beeldoppervlak van de omtrek van de geanalyseerde Eier kamers te vergroten. Een dergelijke benadering kan een negatieve invloed hebben op het gedrag van de dunne actomyosine-machine die de kracht genereert om Eier kamers rond hun langere as te draaien.

Dus om deze beperking te overwinnen, cultuur we Drosophila Eier kamers vrij in de media om betrouwbaar actomyosine machines te analyseren langs de omtrek van de Eier kamers. In het eerste deel van het Protocol, bieden we een handmatige Details over het analyseren van de actomyosine machines in een beperkte acquisitie vliegtuig op de lokale cellulaire schaal (maximaal 15 cellen). In het tweede deel van het Protocol bieden we gebruikers een nieuwe plug-in op basis van Fiji waarmee de eenvoudige extractie van een gedefinieerde dunne laag van het omtrek oppervlak van de Eier kamers mogelijk is. Het volgende protocol beschrijft vervolgens hoe te analyseren actomyosine signalen op de weefsel schaal (> 50 cellen). Tot slot, we lokaliseren de beperkingen van deze benaderingen op zowel de lokale cellulaire en weefsel schalen en bespreken van de mogelijke toekomstige ontwikkeling en mogelijke toepassingen.

Introduction

De voortdurende ontwikkeling van nieuwe beeldvormings-en software technologieën met toepassingen in de biowetenschappen heeft een enorme impact op het begrijpen van de basisprincipes van het leven gegeven. Een van de grootste uitdagingen is de betrouwbare visualisatie van ontwikkelingsprocessen in combinatie met hun Live beeldvorming in verschillende weefsels. Weefsels zijn delen van organen en lichamen en als zodanig zijn de meeste niet gemakkelijk toegankelijk voorbeeld vorming. Daarom zijn protocollen die hun dissectie en in-vitro kweek mogelijk maken, ontwikkeld om biologische gebeurtenissen te visualiseren die de in vivo situatie in een levend lichaam voldoende weerspiegelen.

In de afgelopen decennia heeft de kweek en live beeldvorming van Drosophila Eier kamers, acinar achtige structuren die lijken op primitieve organen, enorm bijgedragen aan het begrijpen van de basisprincipes van primitieve orgaan ontwikkeling1 , 2 , 3. op dit moment zijn er verschillende kweek protocollen beschikbaar, en het gebruik ervan is afhankelijk van de acquisitie tijd, het celtype dat moet worden afgebeeld en hun toegankelijkheid (bijv. binnenste kiembaan versus buitenste somatische lijn)4.

Een gemeenschappelijk kenmerk in al deze kweek protocollen is de noodzaak voor de immobilisatie van geanalyseerde Eier kamers die een hoge contractiele activiteit in vloeibare media weergeven. De contractiele activiteit van de Eier kamers wordt voornamelijk veroorzaakt door het spier blad dat een lange reeks verbonden Eier kamers5,6,7bedekt. Om een goede immobilisatie van jonge Eier kamers te bewerkstelligen, zijn er daarom verschillende benaderingen ontwikkeld, waarbij de Eier kamers met dekstroken6,8,9 of flexibele dekens4worden bedekt, 10 of inbedden in een laag smeltpunt, agarose3,11. Deze benaderingen zijn populair omdat ze ook de beeldvorming van een groter visueel vlak mogelijk maken door de subtiele afvlakking van het omtrek oppervlak van de Eier kamers.

Onlangs is echter aangetoond dat jonge Eier kamers (fase 1-8) rond hun anterieure-posterieure as6 draaien en dat deze weefsel beweging wordt aangedreven door een fijn actomyosine-netwerk dicht bij het omtrek oppervlak van deze jonge Eier kamers 12. Daarom kan kunstmatige verandering van het cellulaire oppervlak veroorzaakt door een subtiele afvlakking van dit weefsel een negatieve invloed hebben op het gedrag van de kracht-genererende actomyosine machines. Het contrapunt is dat als het weefsel van de Eier kamer niet afgevlakt is, microscopische beeldvorming van eiwitten op het omtrek oppervlak van de Eier kamers nog beperkter wordt door de verminderde omvang van het acquisitie vlak.

Daarom hebben we protocollen van Prasad et al.9 en het lab van Celeste berg4,10 gecombineerd en verder aangepast zodat er geen afdekraam/flexibele deken/agarose wordt gebruikt in de ontwikkelde methode. Drosophila Eier kamers zijn vrij gekweekt in media en het protocol hier gepresenteerd geldt alleen omgekeerde microscopie. Het protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel is gericht op de analyse van actomyosine signalen op de lokale cellulaire schaal (tot 15 cellen) binnen de Eier kamers. In het tweede deel richten we ons op het overwinnen van de beperkingen in verband met een klein acquisitie vliegtuig veroorzaakt door het gratis kweken van eier kamers. In dit verband hebben we een nieuwe, op Fiji gebaseerde computationele methode ontwikkeld met een semi-interactieve grafische gebruikersinterface die selectief gedefinieerde lagen van een omtrek weefseloppervlak extraheert en ontvouwt. Dit wordt gevolgd door een protocol dat beschrijft hoe te analyseren actomyosine op de weefsel schaal (dat wil zeggen, > 50 cellen). Aangezien de selectieve extractie van een gedefinieerde dunne laag gebogen epitheelweefsel niet gemakkelijk mogelijk was met behulp van een klassieke z-stack projectie (Figuur 1), dient deze gebruiksvriendelijke methode als een belangrijke voorwaarde om de gedrag van een dun (< 1 μm) actomyosine-netwerk op de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers.

Om het protocol te faciliteren, bieden we ook voorbeeld time-lapse movies (Tlm's) en voorbeeldbestanden van fluorescently gelabeld nonmuscle conventioneel myosin II-gedrag (Zie aanvullend bestand 3). Myosin II is een motor proteïne en vertegenwoordigt het actieve contractisch deel van de actomyosine machines. Om myosin II te kunnen afbeelden, gebruiken we Drosophila transgene lijnen die een gemodificeerde regelgevende licht keten van myosin II bevatten, genaamd mrlc:: GFP (Zie tabel met materialen voor details)12,13. Om celmembranen te visualiseren, is het protocol gebaseerd op commerciële kleurstoffen (Zie tabel met materialen). Dit protocol is niet alleen geschikt voor de analyse van kleine subcellulaire mrlc:: GFP signalen12 maar ook voor elke vergelijkbare grootte subcellulaire deeltjes rond ± 300 μM, zoals die waargenomen met Life-Act:: GFP12,14.

Hoewel beide protocollen worden gepresenteerd met behulp van in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, de overname van actomyosine signalen kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere weefsels op de optimalisatie van de kweekmedia en afhankelijk van de beschikbaarheid van ofwel fluorescently gelabelde eiwitten met overeenkomstige commerciële kleurstoffen of, bijvoorbeeld, mRNA-micro injecties om voorbijgaande genexpressie profielen te verkrijgen. Evenzo kan het op Fiji gebaseerde protocol voor de extractie van een dunne laag van een omtrek oppervlak meer in het algemeen worden toegepast op ellipsoïde en orgel achtige weefsels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol bevat instructies voor het analyseren van actomyosine op de lokale cellulaire en de weefsel schaal in Drosophila Eier kamers. De lokale aanpak stelt gebruikers in staat om gedetailleerd actomyosine gedrag te analyseren in maximaal 15 cellen per Eier kamer en vereist de overname van TLMs voor een korte periode (5 – 10 min) met behulp van high-speed imaging en een omgekeerde confocale Microscoop. Daarentegen, de weefsel schaal biedt gebruikers actomyosine informatie in 50 – 100 cellen en vereist de overname van TLMs voor een lange periode van tijd (≥ 30 min) met behulp van lage-snelheid beeldvorming en een omgekeerde draaiende schijf Microscoop (Zie Figuur 2 en Aanbevolen parameters op elke schaal in tabel 1). De beslissing op welke schaal om actomyosine signalen te analyseren is volledig afhankelijk van de wetenschappelijke vraag van de gebruiker. Begeleid test Tlm's moeten helpen om deze beslissing te maken.

1. lokale cellulaire schaal (LCS)

Opmerking: Om te ontleden en beeld in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, volg het protocol beschreven in aanvullende bestand 1. Als u wilt analyseren verworven Tlm's, gaat u verder met het volgende protocol. In het aanvullende bestand 3vindt u koppelingen naar de bijbehorende testbestanden van tlm's.

  1. Gegevensverwerking van Tlm's op de lokale cellulaire schaal (LCS)
    1. Bleken correctie van Tlm's om te compenseren voor intensiteit verval van fluorescerende etiketten
      1. Zorg ervoor dat een up-to-date Fiji-toepassing is geïnstalleerd op de computer die wordt gebruikt door de volgende instructies: Fiji > een TLM openen (bijv. TestMovie1. TIF uit het aanvullende bestand 3).
      2. Splits de kleurkanalen door te klikken op afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      3. Voer een Bleach-correctie uit op beide kanalen met behulp van beeld > pas > bleekmiddel correctie > eenvoudige verhouding > achtergrond intensiteit 0,0.
        Opmerking: Als er onbevredigende resultaten worden verkregen, ontdek dan welke correctiemethoden in deze plugin het beste passen (gebruik bijvoorbeeld histogram matching in plaats van een eenvoudige verhouding).
    2. Celsegmentatie voor het genereren van een celmasker voor Tlm's
      1. Als Fiji nog niet is geopend, opent u het opnieuw (en controleert u of het up-to-date is) na Help > Update > wijzigingen toepassen > OK.
      2. Als dit nog niet is gebeurd, downloadt u de macro Tissuecellsegmentmovie. IJM (van http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.IJM). Sleep en zet dit script neer in Fiji.
      3. Open het door Bleach gecorrigeerde bestand TLM. TIFF (zie punt 1.1.1). Splits de kanalen van het Bleach-gecorrigeerde bestand met behulp van afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      4. Voer het geüploade script uit op het actieve celmembraan kanaal van de geselecteerde TLM door op het pictogram uitvoeren in het geopende script te drukken. Stel de Gaussiaanse vervaging in op 2,500 en de gevoeligheid van de celdetectie op -1 en klik op OK. Om een mooi celmasker te krijgen, verander deze parameters hierboven niet. Stel de geschatte ruis tolerantie in tussen 10 – 20 voor Tlm's die zijn aangeschaft met de 63x-doelstelling en klik op OK.
        Opmerking: Voor andere doelstellingen kunnen verschillende parameters nodig zijn. De reiniger de achtergrond in een TLM, de lagere geschatte geluids tolerantie is vereist.
      5. Een gegenereerde celmasker verschijnt in de geanalyseerde TLM en ook in een nieuw venster genaamd Particlestack (G), en bovendien, een klein venster genaamd actie vereist verschijnt. Van het celmasker op de TLM, focus alleen op cellen in het midden van de TLM en selecteer die die volledige en goed gedefinieerde contouren kunnen bieden in de TLM.
      6. Als geselecteerde cellen kunstmatige/extra celconto uren bevatten, gebruikt u het venster samenvoegen met de naam actie vereist in de TLM. Voor de laatste, volg de instructies in het venster.
        Opmerking: Zorg ervoor dat celcontouren goed gedefinieerd zijn en overeenkomen met echte celmembranen in een TLM, aangezien elke onnauwkeurigheid van invloed kan zijn op latere analyses. Extra tweaks en wijzigingen, zoals het verwijderen van ongewenste cellen, kunnen later worden gedaan met behulp van de tool Surface Manager (beschreven in sectie 1.1.3).
      7. Wanneer de geselecteerde cellen in het centrum mooi overeenkomen met de echte celmembranen, bewaar ParticleStack als een. TIFF-bestand na het bestand Opslaan als > TIFF.
    3. Het gegenereerde celmasker wordt geladen in Surface Manager
      1. Installeer Surface Manager plugin15 in de gebruikte Fiji Setup. Volg de instructies van Viktorinova et al.16.
      2. Open Surface Manager met Plug-ins > segmentatie Surface Manager (3D).
        Opmerking: Het venster Surface Manager bevat verschillende Actieknoppen aan de rechterkant en een leeg venster aan de linkerkant. Om alle actieknoppen te zien, kan het nodig zijn om het venster in de hoogte/breedte te strekken. Houd er rekening mee dat tijdframes worden weergegeven als z-segmenten.
      3. Open het bijbehorende bestand ParticleStack. TIFF in Surface Manager door te klikken op bestand > openen en selecteer de afbeelding die u wilt openen (bijvoorbeeld ParticlesStack1. TIF).
      4. Klik in Surface Manager op de knop overzichts afbeelding lezen en stel de Jacquard-index in op 60%.
        Opmerking: Het laden van het bestand ParticlesStack1. TIF kan enkele minuten duren, afhankelijk van de verwerkingskracht van de computer.
      5. Eenmaal geladen, zal elke cel worden toegewezen met een S-nummer en worden weergegeven in het linker gedeelte van het venster Surface Manager.
        Opmerking: Als u contouren en celnamen voor alle cellen wilt weergeven, vinkt u de selectievakjes alle weer geven en labels weer geven aan onder aan het venster Surface Manager. Het wordt aanbevolen om deze functie te gebruiken zodra de celnummers zijn gecontroleerd op hun juistheid.
      6. Klik op het eerste S-nummer; de geïmporteerde celomtrek van ParticlesStack1. TIF verschijnt op de TLM. Controleer elk geïmporteerd S-nummer voor de kwaliteit van de celcontour gedurende de TLM en verwijder ongewenste cellen die onjuiste celconto uren weergeven. Om dit te doen, Markeer de celomtrek en klik op de knop verwijderen.
        Opmerking: Het is ook mogelijk om te corrigeren voor onnauwkeurige celcontouren en nieuwe celcontouren toe te voegen. Dit wordt beschreven in de sectie discussie.
      7. Sla alle gecorrigeerde cellen op als een RoiSet. zip-bestand door op de knop opslaan op schijf te drukken.
        Opmerking: Als de sessie moet worden onderbroken, is het mogelijk om het RoiSet-bestand later in Surface Manager te laden: Open een TLM in Fiji (bestand > geopend) en selecteer een TLM. Open Surface Manager via Plug-ins > segmentatieSurface Manager (3D). Laad het bijbehorende RoiSet. zip-bestand door op de knop laden van schijf te klikken en het juiste roiset. zip-bestand te kiezen. Controleer of de geladen celmaskers overeenkomen met de geladen TLM.
    4. Correctie voor weefsel drift in Tlm's
      Opmerking: Tijdens de acquisitie tijd van TLMs kunnen drift effecten worden waargenomen als gevolg van epitheliale rotatie of een ongewenste beweging. In beide gevallen raden we aan om te corrigeren voor elke drift om de handmatige actomyosine-analyse later te vereenvoudigen. Drift correctie is alleen nodig voor de handmatige actomyosine-analyse. Deze zelfstudie vereist up-to-date Fiji-software met de MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) geïnstalleerd.
      1. Open de bleekmiddel-gecorrigeerde TLM in Fiji via bestand > Open en selecteer de Bleach-gecorrigeerde bestand gemaakt met behulp van de bovengenoemde tutorial.
      2. Splits de kanalen en selecteer degene die de celmembranen identificeert via afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      3. Gebruik het volgende protocol wanneer de celcontouren niet zichtbaar vloeiend zijn: proces > filters Gaussiaanse vervaging. Stel het in op ~ 1 – 2 voor een 63x doelstelling en klik op OK en vervolgens op Ja. Klik op proces > binaire > converteren naar masker met behulp van de standaardinstellingen; Klik vervolgens op OK.
      4. Laad de MultiStackReg plugin volgende Plugins > registratie > multistackreg.
      5. Zorg ervoor dat stack 1 is ingesteld op het celmembraan kanaal, actie 1 is ingesteld op uitlijnen en transformatie is ingesteld op vertaling. Vink het selectievakje transformatiebestand opslaan aan en klik op OK.
      6. Open de geselecteerde TLM, de plug-in MultiStackReg en het opgeslagen transformatiebestand met behulp van het bestand > openen en selecteer een TLM. Splits de kleurkanalen met behulp van afbeelding > kleur > gesplitste kanalen.
      7. De invoegtoepassing MultiStackReg laden door te klikken op invoegtoepassingen > registratie > multistackreg. Selecteer transformatiebestand laden als actie 1.
      8. Laat transformatie als stijve lichaam en klik op OK. Selecteer het eerder opgeslagen transformatiebestand en klik nogmaals op OK .
      9. Voeg de beeld kanalen samen en sla de geregistreerde TLM op als een. TIFF-bestand na afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen. Sla het bestand op door te klikken op bestand Opslaan als > TIFF.
        Opmerking: Er zijn alternatieve manieren om te corrigeren voor een weefsel drift in Fiji, namelijk via Plugins > registratie STACKREG/juiste 3D Drift.
  2. Analyse van actomyosine pulsen in oppervlak Manager bij LCS
    Opmerking: Deze protocol stap stelt wetenschappers in staat om te bepalen of actomyosine pulsen aanwezig zijn in het geanalyseerde weefsel en om te begrijpen van het gedetailleerde gedrag, alsmede de directionaliteit van actomyosine signalen.
    1. Open Fiji en zorg ervoor dat een TLM en het bijbehorende celmasker is geopend in Surface Manager.
      Opmerking: Zorg ervoor dat Fiji is geïnstalleerd en up-to-date en de Surface Manager-plugin is geïnstalleerd (stap 1.1.3.1).
    2. Open een TLM met bestand > geopend en selecteer een TLM te openen (bijvoorbeeld TestMovie1_bleach. TIF). Laad de Surface Manager-plug-in via Plug-ins > segmentatieSurface Manager (3D). Laad het opgeslagen celmasker dat in de tutorial is gemaakt (bijv. ParticlesStack1. TIF) via het bestand > Open en selecteer een Celmasker (bijvoorbeeld ParticlesStack1. TIF). Laad de corresponderende regio van belang (ROI, bijvoorbeeld TestMovie1_RoiSet. zip). Zie Figuur 3a.
    3. Overschakelen naar het kanaal van belang in de geselecteerde TLM.
      Opmerking: Volg de kleurcode die is aangegeven rond de TLM om de kanalen te onderscheiden.
    4. Klik in Surface Manager op de knop Statistieken om het venster te verkrijgen met de naam gemiddelde grijze waarde segment per segment (Figuur 3b). Merk op dat de gemiddelde/mediane intensiteitswaarden van actomyosine-signalen in een bepaald geanalyseerd kanaal binnen de gedefinieerde celcontouren na verloop van tijd worden weergegeven, evenals andere parameters die verband houden met het celgebied en de celvorm.
      Opmerking: De intensiteitswaarden zijn in arbitraty-eenheden (A.U.); het celgebied is in pixels en moet worden omgezet in vierkante micrometers.
    5. Sla de verkregen waarden op als een spreadsheetbestand. Klik op het statistiekvenster, bestand Opslaan als.
      Opmerking: Het is mogelijk om verkregen statistische waarden later als volgt te controleren: Open het bleekmiddel-gecorrigeerde TLM in Fiji en open Surface Manager. Laad de corresponderende RoiSet. zip in de TLM door op de knop laden van schijf te drukken en het bestand te openen. Het opgeslagen masker met celcontouren wordt geüpload en de namen van de cellen worden weergegeven in het linker Surface Manager-venster. Klik op de knop Statistieken voor statistische waarden.
  3. Handmatige analyse van afzonderlijke subcellulaire actomyosine-signalen bij LCS
    Opmerking: Dit protocol vereist de meeste concentratie en is tijdrovend. In het algemeen, een verworven TLM kan comfortabel worden geanalyseerd binnen 1 dag. Dit omvat geen tijd voor vlieg voorbereiding voor hun dissectie, de dissectie zelf, en Image Acquisition.
    1. Open een geselecteerde, bleekmiddel-gecorrigeerde en geregistreerde (drift-gecorrigeerde) TLM in een up-to-date Fiji-applicatie. Gebruik een bleekmiddel gecorrigeerd en drift-gecorrigeerde TLM (bijvoorbeeld TestMovie1_bleach_reg. TIF) als een testvoorbeeld.
    2. Pas de helderheid en het contrast aan om de individuele actomyosine-signalen te zien met behulp van beeld > pas > helderheid/contrast aan .
    3. De Tlm's in dezelfde richting uitlijnen ten opzichte van de weefsel-/lichaamsas. In het geval van eier kamers, lijn de voorste zijde van de Eier kamers altijd links van de afbeelding/subfilm/TLM vóór de analyse.
    4. Verdeel de geselecteerde film in korte subfilms van 30 s en elk tijdproject. Sla niet-tijd geprojecteerde en tijdgeprojecteerde subfilms op met bijbehorende namen. Bewaar de oorspronkelijke bron.
      Opmerking: Subfilms kunnen worden gemaakt van originele Tlm's door eerst ongewenste frames te verwijderen via Image > stacks > slice Remover. Definieer de segmenten die moeten worden verwijderd en stel een increment in. Transformeer naar RGB voordat u de slice Remover gebruikt wanneer increment = 1. Tot tijd-project een subfilm van 30 s, klikt u op afbeelding > stapels > Z-project > maximale intensiteit voor de gedefinieerde frames (segmenten) en klik vervolgens op OK. Sla elke seconde 30 s submovie over om te voorkomen dat actomyosine-signalen 2x in twee daaropvolgende 30 s-subfilms worden geteld.
    5. Plaats een tijdgeprojecteerde afbeelding naast de bijbehorende subfilm van 30 s (Afbeelding 4a, B). Identificeer de signaal lijn op de tijd geprojecteerde submovie. Identificeer de richting van de actomyosine-signaal beweging (0 °-360 °) langs deze lijn in de originele subfilm door de subfilm handmatig af te spelen. Gebruik het gereedschap hoek (in de Fiji-balk) om handmatig de richting van de signaal verplaatsing te meten ten opzichte van de gedefinieerde weefsel-as of een soortgelijk beschikbaar gereedschap.
      Opmerking: Fiji werkt alleen op een schaal van 0 °-180 ° (figuur 4c) en een herberekening van de verkregen waarden op een schaal van 0 ° – 360 ° is vereist. Een signaal lijn komt overeen met het traject van één actomyosine-signaal beweging na verloop van tijd.
    6. Om duplicatie in de analyse van actomyosine-signalen te voorkomen, markeert u de geanalyseerde signaallijnen binnen cellen in de tijd geprojecteerde subfilm (figuur 4b, D).
    7. Analyseer alle geselecteerde cellen in de subfilm van 30 s en sla de verkregen hoeken op.
      Opmerking: Analyseer alleen subcellulaire cytoplasmische actomyosine signalen in cellen met goed gedefinieerde celconto uren in een TLM. Uitsluiten van individuele cellen met minder dan 15 – 20 gedetecteerde signalen in de hele TLM. Negeer actomyosine signalen die over cellen verplaatsen vanwege hun onbekende oorsprong. Een voorbeeld van signaal tellingen voor één geanalyseerde cel in de 30 s subfilm wordt getoond in figuur 4D.
    8. Ga door totdat alle 30 s-lange subfilms van één TLM worden geanalyseerd en bewaar alle gemeten hoeken van actomyosine-signalen van één TLM in een spreadsheetbestand.
    9. Som van alle gemeten hoeken over het relevante aantal Tlm's (afhankelijk van het experiment). Plot het percentage van de richting van geanalyseerde actomyosine signalen, bijvoorbeeld, als een roos diagram met een bereik van 0 ° tot 360 ° met een voorkeurs software.
      Opmerking: Om statistisch significante resultaten te behalen, worden vijf tot tien onafhankelijke Eier kamers van elk stadium van de Eier kamer aanbevolen om te worden geanalyseerd.

2. weefsel schaal

Opmerking: Om te ontleden en beeld in vitro gekweekte Drosophila Eier kamers, volg het protocol in aanvullend bestand 2. Als u wilt analyseren verworven Tlm's, gaat u verder met het volgende protocol hieronder. Begeleid test dossiers van Tlm's worden geplaatst in het aanvullende bestand 3.

  1. Selectieve oppervlakte extractie van gebogen epitheel weefsels
    Opmerking:Dit protocol stelt gebruikers in staat om selectief een dunne laag van actomyosine in een gebogen epitheelweefsel te extraheren na verloop van tijd. Deze protocol stap is gebruiksvriendelijk en gebaseerd op een intuïtieve grafische interface. Het is mogelijk om comfortabel te analyseren (oppervlak te extraheren) verschillende Tlm's. gebruik TestMovie2. czi (van deAanvullend bestand 3) als voorbeeld van een test-TLM.
    1. Open een up-to-date Fiji-toepassing (fiji > Help bijwerken > wijzigingen toepassen > OK).
    2. Zorg ervoor dat de Ellipsoid Surface projection plugin15 is geïnstalleerd. Volg Viktorinova et al. 16.
    3. Open een TLM en exporteer het als een XML/HDF5-bestand door te klikken op Plugins bigdataviewer > huidige afbeelding exporteren als XML/hdf5-bestand.
      Opmerking: Het is vereist voor het definiëren van een exportpad. De besparing zelf kan enkele minuten duren en is afhankelijk van de lengte van de TLM.
    4. Open het geëxporteerde bestand in het ellipsoïde oppervlak projectie door te klikken op Plugins bigdataviewer ellipsoid oppervlak projectie > Selecteer XML-bestand.
      Opmerking: Een nieuw venster met Sagittaal uitzicht op de Eier kamer en een dialoog om de gebruiker door de verwerking te begeleiden zal verschijnen. Meer informatie over navigeren in de segment weergave vindt u op https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. Het dialoogvenster met de naam eierstokken projectie heeft verschillende tabs. Definieer in het eerste dialoogvenster met de naam omsluitend kader de x-en y-randen van een Eier kamer in de TLM samen met de z-breedte van het begrenzingsvak (d.w.z. de diepte van een z-stack/Eier kamer) en druk op set (figuur 5a).
    6. Als u randen wilt definiëren, sleept u knoppen naast x, y en z of definieert u de getalcoördinaten in de vakken x, y en z. Zorg ervoor dat de grenzen royaal genoeg zijn om het deel van de Eier kamer van belang in de oppervlakte extractie te krijgen. De geselecteerde delen van de Eier kamer zijn roze gemarkeerd.
    7. Schakel over naar het tabblad met de naam Find-blobs in de projectie van het venster eierstokken. Definieer de Sigma en de minimale piekwaarde; Druk vervolgens op Compute om te identificeren van de actomyosine-signalen (afbeelding 5b), die wordt weergegeven als groene blobs. Probeer deze stap opnieuw met verschillende parameters totdat er voldoende punten (rond 100) zijn gevonden.
      Opmerking: Sigma 1 \ u20123 met minimale piekwaarde 20 \ u2012100 werkt het beste om actomyosine signalen van stage-6 tot-8 Eier kamers te identificeren. Het identificeren van actomyosine-signalen is een cruciale stap en is afhankelijk van de signaalkwaliteit en de grootte ervan. Het is belangrijk om te bevestigen van de juiste grootte van de bestaande blobs. Geen zichtbare groene vlekken/blobs in de afbeelding betekent dat de volgende stap niet zal werken. Blader door de geselecteerde z-vlakken om blobs te zien.
    8. Als u de ellipsoïde wilt ontwerpen, gaat u verder met het tabblad ' fit ellipsoïde'. Stel willekeurige samples in op 10.000, buiten/binnen cut-off afstand tot 1 \ u201210, en klik vervolgens op Compute (Figure 5c).
      Opmerking: Hoe lager de cut-off afstand, hoe preciezer de gewenste ellipsoïde zal zijn. Hierna wordt het tabblad projectie automatisch geopend en wordt de definitie van de oppervlakte extractie toegestaan. De instellingen moeten worden geoptimaliseerd.
    9. Ga verder met het tabblad projectie (afbeelding 5d). Stel een minimale en maximale projectie afstand in (d.w.z. de breedte van het gewenste ellipsoïde). Het is vereist om een minimale en maximale projectie afstand in te stellen, zodat de roze gedefinieerde ellipsoïde regio de gehele buitenlaag van de Eier kamer omvat. Definieer de segment afstand (1 wordt aanbevolen).
      Opmerking: Voorbeelden van een onjuiste en optimale ellipsoïde pasvorm die resulteert in onjuiste en optimale projectie parameters worden weergegeven in Figuur 6a, C. De dunne omtrek van de rente kan later worden gedefinieerd. Zorg ervoor dat de roze regio van de ellipsoïde met de gedefinieerde breedte op de Eier kamer zichtbaar is voordat u op Compute drukt. Het is belangrijk dat de gewenste ellipsoïde (roze enkele lijn) mooi past bij het ellipsoïde oppervlak van een Eier kamer om de beste resultaten te behalen. Als de ellipsoïde fit niet goed is, rangschikt u verschillende instellingen tot de gewenste oppervlakte extractie is verkregen.
      1. Stel een uitvoer breedte (≥ 800) en de hoogte (≥ 400) van de ellipsoïde in. Instellen vanaf welk tijdstip op welk tijdstip de oppervlakte extractie moet worden gemaakt (d.w.z. de lengte van de TLM-extractie definiëren). Kies een sferische of een cilindrische projectie. Flip Z en uitlijnen Y indien nodig.
      2. Druk op Compute om een oppervlakte extractie te verkrijgen voor beide kanalen in nieuwe Vensters met de naam Image. Pas de helderheid en het contrast van de verkregen beeld Vensters aan om de geprojecteerde actomyosine-signalen te kunnen zien, door te klikken op afbeelding ≫ > helderheid/contrast aan te passen .
        Opmerking: Een voorbeeld vergelijking van een projectie als gevolg van een onjuiste en optimale ellipsoïde pasvorm wordt weergegeven in Figuur 6b, D.
    10. Als de oppervlakte extractie er goed uitziet, slaat u de afbeeldingen (beide kanalen afzonderlijk) op als. TIFF. Sla het logboekbestand ook op voor toekomstig gebruik van de manier waarop het oppervlak van deze specifieke Eier kamer is geëxtraheerd.
      Opmerking: Dit is met name belangrijk informatie als de geëxtraheerde dunne laag moet worden teruggegeven aan de oorspronkelijke uitgevouwen vorm (alleen voor ontwikkel ontwikkelaars).
    11. Voeg de kanalen samen met een voorkeurskleur code in Fiji.
      Opmerking: Indien nodig, project geselecteerde z-stack lagen met actomyosine signalen. De projectie van geselecteerde z-stack lagen is vereist wanneer de verwervings focus enigszins in de tijd verandert in een TLM. Voor de beste resultaten, project maximaal één tot twee z-stack lagen.
    12. Sla de resultaten op als. TIFF-bestanden.
      Opmerking: Representatieve voorbeelden van dunne lagen (selectieve basale en apicale oppervlakte) die het myosin II (MRLC:: GFP) signaal van de follikel epitheel van de controle en fat2 Mutante Eier kamers kunnen worden gevonden in Figuur 8.
  2. Gegevensverwerking van een selectief geëxtraheerd weefseloppervlak
    1. Bleken-Corrigeer de Tlm's om het intensiteit verval van de fluorescerende etiketten te compenseren.
      1. Open Fiji. Open een TLM (bijvoorbeeld TestMovie2_extraction. TIF uit het aanvullende bestand 3) met behulp van bestand > geopend. Selecteer de afbeelding om deze te openen.
      2. Splits de kleurkanalen en converteer ze zo nodig naar 16-bits afbeeldingen door te klikken op afbeelding > kleur > gesplitste kanalen. Converteer de kanalen naar 16-bits afbeeldingen (van 32-bits afbeeldingen) met afbeelding > type > 16-bits.
      3. Voer een Bleach-correctie uit op beide kanalen met behulp van beeld > pas > bleekmiddel correctie > eenvoudige verhouding > achtergrond intensiteit 0,0.
        Opmerking: Als er onbevredigende resultaten worden verkregen, is het nodig om te onderzoeken welke correctiemethoden in deze plugin het beste passen (bijvoorbeeld, gebruik histogram matching in plaats van een eenvoudige verhouding).
      4. Voeg de kanalen van de twee door Bleach gecorrigeerde afbeeldingen samen door te klikken op afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen. Sla de samengevoegde afbeelding op als een. TIFF-bestand door te klikken op bestand Opslaan als > TIFF.
        Opmerking: Pas zo nodig het contrast en de helderheid van de kanalen aan.
    2. Celsegmentatie voor het genereren van een celmasker voor Tlm's
      1. Als Fiji nog niet is geopend, opent u het opnieuw (en controleert u of het up-to-date is door te klikken op Help > Update > wijzigingen toepassen > OK).
      2. Als dit nog niet is gebeurd, downloadt u de macro TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Sleep en zet dit script neer in Fiji. Open het door Bleach gecorrigeerde bestand (bijv. TestMovie2_bleach. TIF uit het aanvullende bestand 3, zie ook 2.2.1).
      4. Splits de kanalen van het door Bleach gecorrigeerde bestand door op afbeelding > kleur > gesplitste kanalente klikken. Pas het membraan kanaal aan om te zorgen voor duidelijke celconto uren door te klikken op afbeelding ≫ > helderheid/contrast aan te passen .
      5. Voer het geüploade script uit op het actieve celmembraan kanaal van de geselecteerde TLM door op het pictogram uitvoeren in het geopende script te drukken. Stel Gaussiaanse vervaging in op 1,500. Stel de gevoeligheid voor celdetectie in op-1 en klik op OK. Stel geschatte geluids tolerantie in op ~ 8 voor tlm's die zijn aangeschaft met de 40x-doelstelling en klik op OK.
        Opmerking: Om een mooi celmasker te krijgen, verander deze parameters hierboven niet. Voor andere doelstellingen kunnen verschillende parameters nodig zijn. De reiniger de achtergrond in een TLM, de lagere geschatte geluids tolerantie is vereist.
      6. Een gegenereerde celmasker verschijnt in de geanalyseerde TLM en ook in een nieuw venster genaamd Particlestack (G). Bovendien verschijnt een klein venster met de naam actie vereist . Van het celmasker op de TLM, focus alleen op cellen in het midden van de TLM en selecteer die die volledige en goed gedefinieerde contouren kunnen bieden in de TLM.
      7. Als geselecteerde cellen kunstmatige/extra celconto uren bevatten, gebruikt u het venster samenvoegen met de naam actie vereist in de TLM. Voor de laatste, volg de instructies in het venster.
        Opmerking: Zorg ervoor dat celcontouren goed gedefinieerd zijn en overeenkomen met echte celmembranen in een TLM, aangezien elke onnauwkeurigheid van invloed kan zijn op latere analyses. Extra tweaks en wijzigingen, zoals het verwijderen van ongewenste cellen, kunnen later worden gedaan met behulp van de Surface Manager tool (beschreven in de tutorial hieronder).
      8. Wanneer geselecteerde cellen in het midden mooi overeenkomen met de echte celmembranen, slaat u de ParticleStack op als een. TIFF-bestand na bestand Opslaan als > TIFF. Ga verder met het laden van het gegenereerde celmasker en de actomyosine-analyse in oppervlakte beheer zoals eerder uitgevoerd in de paragrafen 1.1.3 en 1,2 (ook gedetailleerd beschreven in de paragrafen 2.2.3 en 2,3).
    3. Het gegenereerde celmasker wordt geladen in Surface Manager
      1. Als de Surface Manager-invoegtoepassing al is geïnstalleerd in de Fiji-instellingen die worden gebruikt, gaat u verder met stap 2. Zo niet, volg Viktorinova et al.16. Voor ontwikkel ontwikkelaars, alleen de broncode is ook beschikbaar15.
      2. Open Surface Manager door te klikken op Plug-ins > segmentatie Surface Manager (3D).
        Opmerking: Het venster Surface Manager bevat verschillende Actieknoppen aan de rechterkant en een leeg venster aan de linkerkant. Om alle actieknoppen te zien, kan het nodig zijn om het venster in de hoogte/breedte te strekken. Houd er rekening mee dat tijdframes worden weergegeven als z-segmenten.
      3. Open het corresponderende bestand ParticleStack. TIF in Surface Manager via bestand > openen en selecteer de afbeelding die u wilt openen (bijvoorbeeld ParticleStack2. TIF uit het aanvullende bestand 3).
      4. Klik in Surface Manager op de knop overzichts afbeelding lezen en stel de Jacquard-index in op 60%.
        Opmerking: Het laden van een ParticleStack. TIF-bestand kan enkele minuten duren, afhankelijk van de kracht van de computer.
      5. Eenmaal geladen, zal elke cel worden toegewezen met een S-nummer en zal verschijnen in het linker deel van de Surface Manager venster (afbeelding 7A).
        Opmerking: Als u contouren en celnamen voor alle cellen wilt weergeven, vinkt u de selectievakjes alle weer geven en labels weer geven aan onder aan het venster Surface Manager. Het wordt aanbevolen om deze functie te gebruiken zodra de celnummers zijn gecontroleerd op hun juistheid.
      6. Klik op het eerste S-nummer; de geïmporteerde celomtrek van ParticleStack. TIF wordt weergegeven op de TLM. Controleer elk geïmporteerd S-nummer voor de kwaliteit van de celcontour gedurende de TLM en verwijder ongewenste cellen die onjuiste celconto uren weergeven. Om dit te doen, Markeer de celomtrek en klik op de knop verwijderen.
        Opmerking: Het is ook mogelijk om te corrigeren voor onnauwkeurige celcontouren en nieuwe celcontouren toe te voegen. Dit wordt beschreven in de sectie discussie.
      7. Sla alle gecorrigeerde cellen op als een RoiSet. zip-bestand door op de knop opslaan op schijf te drukken.
        Opmerking: Als de sessie moet worden onderbroken, is het mogelijk om het bestand RoiSet. zip later in Surface Manager te laden: Open een TLM in Fiji via bestand > openen en selecteer een TLM. Open Surface Manager als volgt: Plug-ins > segmentatie Surface Manager (3D). Laad de corresponderende RoiSet. zip door op de knop laden van schijf te klikken en het juiste roiset. zip-bestand te kiezen (bijv. TestMovie2_RoiSet. zip). Controleer of de geladen celmaskers overeenkomen met de geladen TLM.
  3. Analyse van actomyosine pulsen in oppervlakte Manager
    Opmerking: Open Fiji en zorg ervoor dat een TLM en het bijbehorende celmasker is geopend in Surface Manager. Zorg ervoor dat Fiji is geïnstalleerd en up-to-date en de Surface Manager-invoegtoepassing (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) is geïnstalleerd.
    1. Open een TLM met bestand > geopend en selecteer een TLM te openen (bijvoorbeeld TestMovie2_bleach. TIF). Laad de Surface Manager-plug-in via Plug-ins > segmentatie Surface Manager (3D). Laad het opgeslagen celmasker dat in de tutorial is gemaakt (bijv. ParticlesStack2. TIF) via het bestand > Open en selecteer een Celmasker (bijvoorbeeld ParticlesStack2. TIF). Laad de corresponderende ROI (bijv. TestMovie2_RoiSet. zip).
    2. Overschakelen naar het kanaal van belang in de geselecteerde TLM.
      Opmerking: Volg de kleurcode die is aangegeven rond de TLM om onderscheid te maken tussen de kanalen.
    3. Klik in Surface Manager op de knop Statistieken om het venster te verkrijgen met de naam gemiddelde grijze waarde segment per segment (afbeelding 7b). Merk op dat de gemiddelde/mediane intensiteitswaarden van actomyosine-signalen in een bepaald geanalyseerd kanaal binnen de gedefinieerde celcontouren na verloop van tijd worden weergegeven, evenals andere parameters die verband houden met het celgebied en de celvorm.
      Opmerking: De intensiteitswaarden zijn in A.U.; het celgebied is in pixels en moet worden omgezet in vierkante micrometers.
    4. De verkregen waarden opslaan als een spreadsheetbestand: Klik op het statistiekvenster, bestand Opslaan als.
      Opmerking: Het is mogelijk om de verkregen statistische waarden later te controleren, als volgt. Open het bleekmiddel-gecorrigeerde TLM in Fiji. Open Surface Manager. Laad de corresponderende RoiSet. zip in de TLM door op de knop laden van schijf te drukken en het bestand te openen. Het opgeslagen masker met celcontouren wordt geüpload en de namen van de cellen worden weergegeven in het linker Surface Manager-venster. Klik op de knop Statistieken voor statistische waarden.
      Opmerking: Met betrekking tot een Handmatige analyse van individuele subcellulaire actomyosine signalen, het is niet mogelijk om het uitvoeren van een handmatige analyse van subcellulaire actomyosine signalen op de weefsel schaal. Optimalisatie is vereist voor de analyse van individuele actomyosine-signalen op de semi-weefsel schaal, zoals aangegeven in de sectie discussie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om het gedrag van actomyosine netwerken in epitheliale weefsels te onderzoeken. Dit is alleen mogelijk wanneer een gedetailleerde analyse van actomyosine gedrag op de lokale cellulaire schaal (een paar cellen) wordt gecombineerd met een soortgelijke analyse op de weefsel schaal (veel cellen). Epitheliale weefsels zijn echter vaak gebogen en de extractie van een dun laagje van deze weefsels was voorheen niet gemakkelijk mogelijk, zoals weergegeven in Drosophila Eier kamers (Figuur 1). Het protocol hier gepresenteerd biedt gebruikers eenvoudige instructies beschrijven hoe te analyseren actomyosine gedrag op beide schalen (Figuur 2).

Het eerste deel van dit protocol richt zich op instructies met betrekking tot de analyse van actomyosine pulsen met behulp van de Surface Manager plugin (Figuur 3). Ook wordt beschreven hoe u individueel actomyosine gedrag op de lokale cellulaire schaal handmatig analyseren (Figuur 4). Het tweede deel van dit protocol legt uit hoe een dun laagje epitheelweefsel moet worden uitgepakt met behulp van de ellipsoïde oppervlak projectie plug- in (Figuur 5 en Figuur 6). Alleen dan is het mogelijk om actomyosine pulsen op de weefsel schaal te analyseren met behulp van de Surface Manager plugin (Figuur 7). Representatieve resultaten en een vergelijking van het actomyosine-gedrag in roterende besturing en statische fat2 Mutante Drosophila Eier kamers op de lokale cellulaire en weefsel schaal wordt weergegeven in Figuur 8 en in overeenkomstige film 1, Film 2, film 3, film 4, film 5en film 6 (Zie afbeelding 8voor meer informatie).

Figure 1
Figuur 1: selectieve extractie van een dunne laag van een gebogen weefseloppervlak. A) om voldoende informatie te verkrijgen met betrekking tot actomyosine-netwerken in de omtrek gebogen epitheel, is het noodzakelijk om een diepe z-stack (roze) over de meerderheid van een zichtbaar weefsel te verwerven, zoals weergegeven voor het gebogen follikel epitheel (grijs) van Drosophila Egg Chambers. (A ') Echter, een eenvoudige projectie van een dergelijke z-stack leidt tot het mengen van hele actomyosine netwerken in follikel cellen. Myosin II gevisualiseerd met MRLC:: GFP (groen) toont de sterk uitdrukken innerlijke (apicale) regio van follikel cellen in een dergelijke z-projectie en bijna geen informatie van de basale (buitenste) kant, waar myosin II toont een sterke planaire celpolariteit fenotype, maar haar de signaalintensiteit is laag12. Om dergelijke vermenging te voorkomen zoals weergegeven in panel A ', hebben we een gebruiksvriendelijke, op Fiji gebaseerde plugin ontwikkeld genaamd ellipsoïde oppervlakte projectie in Bigdataviewer18 waarmee (B) de selectieve extractie van een gedefinieerde, dunne laag (roze ) van actomyosine uit een gebogen epitheel (B ') zoals weergegeven voor MYOSINE II (groen) in een geselecteerde extractie van de basale (buitenste) kant van de follikel epitheel. Vergelijk het verschil in signaal van myosin II (MRLC:: GFP) in de panelen A ' en B '. Noteer het planaire gepolariseerde patroon van myosin II in panel B '. De celcontouren zijn rood. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Planar gepolariseerd actomyosine netwerk op de lokale cellulaire en weefsel schalen. De beeldvorming van actomyosine op verschillende schalen maakt de analyse van verschillende aantallen epitheelcellen mogelijk, namelijk (a) tot 15 cellen op de lokale cellulaire schaal en (B) 50-100 cellen op de weefsel schaal in het follikel epitheel van gekweekte Drosophila Eier kamers. Nonmuscle myosin II wordt gevisualiseerd met MRLC:: GFP (groen) en het genotype van de gebruikte transgene lijn wordt gespecificeerd in de tabel met materialen. De celcontouren zijn in magenta. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaal staven = 5 μm (A); 50 μm (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: een voorbeeld van de analyse van myosin II pulsen in oppervlakte Manager op de lokale cellulaire schaal. A) een deeltjes stapel wordt in de oppervlakte beheerder geladen. Houd er rekening mee dat alle geïdentificeerde cellen in de TLM worden weergegeven in het venster Surface Manager. Het is belangrijk om alle ongewenste of onvolledige cellen in een TLM te verwijderen. (B) statistieken verkregen op MYOSIN II (mrlc:: GFP) voor geselecteerde cellen worden weergegeven in het venster met de naam gemiddelde grijze waarde segment per segment in Surface Manager. MRLC:: GFP wordt weergegeven in het groen terwijl cellulaire membranen in rood zijn. De voorste kant is aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: een voorbeeld van de manuele analyse van individuele myosin II-signalen op de lokale cellulaire schaal. A) een geselecteerde 30 s-lange subfilm wordt geplaatst naast (B) de tijd projectie. Houd er rekening mee dat bij de tijd projectie myosin II (MRLC:: GFP) langere traject lijnen toont (zie deel B) binnen afzonderlijke cellen dan in een individueel tijdsbestek (Zie deelvenster A). Afzonderlijke lijnen in cellen moeten worden geanalyseerd op hun hoek richting ten opzichte van de voorste-posterieure as van de Eier kamers. C) merk op dat Fiji niet meet 0 ° – 360 ° maar slechts 0 ° – 180 ° voor signalen die naar boven wijzen en 0 ° – 179 ° voor signalen die naar beneden wijzen. Houd er rekening mee dat 0 ° atypisch aan de rechterkant van een geanalyseerde afbeelding wordt geplaatst. D) op basis van deze informatie moeten lijnen die met (omhoog in roze) of tegen (in geel) worden verplaatst, de richting van de epitheliale rotatie in een bepaalde Eier kamer worden binned om te bepalen of symmetrie breken van geanalyseerde signalen aanwezig is in een cel en vervolgens voor meerdere cellen in het geanalyseerde weefsel. MRLC:: GFP wordt weergegeven in het groen terwijl cellulaire membranen in rood zijn. De voorste kant is aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Afbeelding 5: een voorbeeld van het genereren van een ellipsoïde passen op de weefsel schaal. Om een ellipsoïde op een Eier kamer aan te passen met behulp van de ellipsoïde oppervlak projectie plugin in bigdataviewer, is het nodig om (A) een selectiekader te definiëren dat de meerderheid van het gescande weefsel omvat. Vervolgens is het belangrijk (B) om signaal stippen te identificeren, die een vereiste zijn voor een optimale generatie van de ellipsoïde pasvorm. (C) wanneer de ellipsoïde pasvorm niet optimaal is en niet mooi rond een Eier kamer, resulteert dit in (D) slechte weefsellaag extractie. Zie de extractie en latere projectie resultaten in Figuur 6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: vergelijking van een onjuist en optimaal ellipsoïde pasvorm en bijbehorende oppervlakte projecties. A) wanneer het ellipsoïde niet goed is aangebracht, (B) zal de uiteindelijke oppervlakte projectie geen volledige signaal gegevens leveren in de dunne laag van het geanalyseerde weefsel. C) wanneer het echter optimaal wordt gemonteerd, garandeert het een gelijkblijvende signaaldetectie van een dunne laag in het weefsel. D) er rekening mee dat de optimale oppervlakte projectie verschillende dunne lagen bevat als een oppervlakte-geprojecteerde z-stack in de loop van de tijd, die vervolgens kan worden gescheiden zoals weergegeven in Figuur 8. Myosin II-signalen (MRLC:: GFP, wit) en membraan signalen (wit) worden aanvankelijk samengevoegd vóór de projectie (panelen A en C), maar op de oppervlakte projectie zelf worden deze kanalen gescheiden (Zie projecties van myosine II in panelen B en D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: een voorbeeld van de analyse van myosine II pulseert in oppervlakte beheer op de weefsel schaal. A) een deeltjes stapel wordt in de oppervlakte beheerder geladen. Houd er rekening mee dat alle geïdentificeerde cellen in de TLM worden weergegeven in het venster Surface Manager. Het is belangrijk om alle ongewenste of onvolledige cellen in een TLM te verwijderen. (B) statistieken verkregen op MYOSIN II (mrlc:: GFP) pulsen (gemiddelde of mediaan) voor geselecteerde cellen in de loop van de tijd worden weergegeven in het venster met de naam gemiddelde grijze waarde slice per slice in Surface Manager. Merk op dat sterkere myosine II-stippen de uiteindelijke maat van intrinsieke myosine II-intensiteit kunnen beïnvloeden. Dit resulteert in het probleem dat deze myosin II stippen lijken te migreren buiten de celomtrek waar er een onjuiste celcontour definitie in het gegenereerde celmasker is. MRLC:: GFP wordt weergegeven in het groen terwijl cellulaire membranen in rood zijn. De voorste kant is aan de bovenkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Representatieve resultaten van een myosin II-netwerk in het epitheel van Drosophila follikel. Representatieve voorbeelden van dynamische myosin II (mrlc:: GFP) gedrag (A en B) op de lokale cellulaire schaal en(C-F) op de weefsel schaal voor controle en fat2 Mutant Drosophila Eier kamers. Zie tabel met materialen voor gedetailleerde informatie over gebruikte genotypes. Merk op dat MRLC:: GFP-signalen (groen) loodrecht op de anterieure-posterieure (AP) as van de controle Eier kamers worden verplaatst. Deze polariteit gaat verloren in fat2 Mutante Eier kamers en leidt tot anisotrope MYOSINE II pulsen/oscillaties12. Bij handmatige analyse van kleine MRLC:: GFP-signalen (~ 300 μm) en de kwantificering van hun hoekige richtings beweging zoals beschreven in het Protocol, symmetrie breken van MRLC:: GFP-signalen kunnen worden waargenomen met een voorkeur tegen de richting van het epitheel de rotatie in een geanalyseerde Eier kamer12 (Figuur 4). Bijbehorende films zijn: panel A = film 1, panel B = film 2, panel C = film 3, panel D = film 4, panel E = Movie 5, en panel F = Film 6. Celcontouren worden in magenta weergegeven. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaal staven = 5 μm (a en B) en 50 μm (C-F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanbevolen parameters voor kortdurende High-Speed beeldvorming op de lokale cellulaire schaal:
I. Weefsel van belang vrij geplaatst in het kweekmedium (d.w.z. geen dekstroken, flexibele dekens, enz.)
Ii. 63x water doelstelling met numeriek diafragma > = 1,3
Iii. Omgekeerde confocale Microscoop
Iv. Enkel vlak
V. 6-12 s tijdsintervallen
Vi. 5-10 minuten TLMs
Vii. Vereiste gegevensopslag per TLM tot 100MB
Aanbevolen parameters voor lange tijd beeldvorming met lage snelheid op de weefsel schaal:
I. Weefsel van belang vrij geplaatst in het kweekmedium (d.w.z. geen dekstroken, flexibele dekens, enz.)
Ii. 40x water doelstellingen en numerieke diafragma > = 1,3
Iii. Omgekeerde draaiende schijf Microscoop
Iv. z-stacks om ca. helft van een Eier kamer te verwerven
V. 60 s tijdsintervallen
Vi. Ten minste 30 minuten TLMs
Vii. Vereiste gegevensopslag ca. 1GB

Tabel 1: aanbevolen beeldvormings parameters.

Movie 1
Film 1: representatief dynamisch gedrag van myosin II (MRLC:: GFP) op cellulair niveau in een controle Drosophila Eier kamer. Merk op dat MRLC:: GFP (groen) het liefst loodrecht op de AP-as van de Eier kamers beweegt. Celcontouren zijn in magenta. Basale weergave. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Movie 2
Film 2: representatief dynamisch gedrag van myosin II (MRLC:: GFP) op de cellulaire schaal in een Fat2 Mutant Drosophila Egg Chamber. Merk op dat MRLC:: GFP pulsen (groen) en is niet langer Planar loodrecht uitgelijnd op de AP-as van statische Eier kamers. Celcontouren zijn in magenta. Basale weergave. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Movie 3
Film 3: representatief dynamisch gedrag van basale myosin II (MRLC:: GFP) op de weefsel schaal in een controle Drosophila Eier kamer. Merk op dat alleen een dunne basale (buitenste) MRLC:: GFP-laag wordt geëxtraheerd uit bijna de helft van het follikel epitheel van een Eier kamer. MRLC:: GFP is in groen en celcontouren zijn in magenta. Let op het verschil in het detailniveau van het verkregen MRLC:: GFP-signaal gedrag hier (dat de weefsel schaal vertegenwoordigt) in vergelijking met film 1 (die de cellulaire schaal vertegenwoordigt). De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Movie 4
Film 4: Representatief dynamisch gedrag van basale myosine II (MRLC:: GFP) op de weefsel schaal in een Fat2 Mutant Drosophila Egg Chamber. Merk op dat MRLC:: GFP (groen) pulseert sterk aan de basale kant van bijna de helft van het follikel epitheel van een fat2 Mutante Eier kamer en slaagt er niet in om de gesynchroniseerde kracht te genereren die nodig is om epitheliale rotatie te bevorderen. Celcontouren zijn in magenta. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Movie 5
Film 5: Representatief dynamisch gedrag van apicale myosine II (MRLC:: GFP) op de weefsel schaal in een controle Drosophila Eier kamer. Alleen een dunne MRLC:: GFP-laag wordt geëxtraheerd uit de apicale (binnenste) kant van bijna de helft van het follikel epitheel van een Eier kamer. Merk op dat MRLC:: GFP (in het groen) toont verschillende dynamische gedrag hier aan de apicale kant in vergelijking met de basale kant van de follikel epitheel (zoals weergegeven in film 3). Celcontouren zijn in magenta. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Movie 6
Film 6: representatief dynamisch gedrag van apicale myosin II (MRLC:: GFP) op de weefsel schaal in een Fat2 Mutant Drosophila Egg Chamber. Gewijzigd dynamisch gedrag van MRLC:: GFP (groen) geëxtraheerd uit een dun apicale gebied van bijna de helft van het follikel epitheel van een statische fat2 Mutante Eier kamer. Celcontouren zijn in magenta. De voorste kant is aan de linkerkant. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te bekijken. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen en probleemoplossing voor de dissectie en het kweken van eier kamers

Als er te veel vliegen in een kleine injectieflacon worden geplaatst, kan het vlieg voedsel modderig worden na 2 – 3 dagen als gevolg van grote hoeveelheden voeden larven en volwassen vliegen gevangen in het vlieg voedsel. In een dergelijk geval, Flip de rest van deze vliegt in een nieuwe flacon met vers voedsel en krimpen hun aantal. In het bijzonder, uitsluiten vrouwtjes die vastzaten in het voedsel.

De Schneider mix (SM) dient van tevoren te worden klaargemaakt en kan gedurende ~ 14 dagen bij 4 °C worden bewaard. Houd er rekening mee dat een oudere mix kristallen kan bevatten die het oppervlak van de Eier kamers kunnen beschadigen. Meng de SM altijd met vers toegevoegde insuline en laat voldoende tijd om kamertemperatuur te bereiken. Dit beschermt de Eier kamers tegen koude schokken, wat een negatieve invloed kan hebben op de groei van microtubuli en de vlakke uitlijning van het cytoskelet (zoals te zien in de ontwikkeling van Drosophila Wing19).

Eier kamers en geselecteerde ovariolen zijn zeer kwetsbaar en kunnen vanwege hun geringe omvang in de SMI drijven (SM met insuline). Het wordt aanbevolen om ze spontaan in de SMI te laten zinken. Ze houden ook vaak aan de dissectie Tang/cactus tool. Laat ze zich in een dergelijk geval vrij laten van dissectie-apparaten door ze zachtjes in de SMI te verplaatsen. Vermijd knijpen en raak ze te allen tijde direct aan. Indien nodig, uitsluiten van deze Eier kamers/ovariolen van het verdere protocol.

Aangezien een dissectie-stereoscoop niet betrouwbaar is voor de identificatie van beschadigde Eier kamers/ovariolen, moeten Eier kamers/ovariolen worden gecontroleerd met behulp van een CellMask of FM 4-64-kleurstof onder een confocale/draaiende schijf Microscoop. Beschadigde Eier kamers vertonen extreme kleuring in vergelijking met een onbeschadigde weefsel achtergrond in de Eier kamer. Verkrijg nooit een TLM met sterke kleurstof patches.

Kritieke stappen en probleemoplossing voor de in vitro Live beeldvorming van eier kamers

Als vrij geplaatste Eier kamers in de SMI nog steeds bewegen, controleer dan opnieuw onder de confocale Microscoop om te zien of er nog steeds over het hoofd gezien resten van spier blad en puin zweven in de SMI. Verwijder ze en probeer het opnieuw. Van de Eier kamers moet 90% stabiel en immobiel zijn tijdens latere beeldvorming.

Om ervoor te zorgen dat een geselecteerde Eier kamer/ovariole stabiel is, gebruikt u een hoge-snelheid beeldvorming (6 s intervallen) gedurende 1 min. instabiele Eier kamers zouden op dit punt bewegen. Het wordt echter aanbevolen om de hele time-lapse-opname te bekijken om een mogelijke onverwachte beweging van de afbeelding gemaakt Egg Chamber zachtjes te kunnen corrigeren. Dit kan worden gedaan door het verplaatsen van de microscopische fase/tabel, die de Petri schaal met de gekweekte Eier kamers/ovariolen houdt, naar de oorspronkelijke positie, zodat de Eier kamer van de rente weer in het imaged, gerichte venster.

Stop Imaging als een plotselinge en onverwachte beweging van de afbeelding gemaakt Egg Chamber verschijnt. Controleer de demping van de Microscoop tafel en Vermijd tijdens de aanschaf tijd rondlopen bij de Microscoop omdat dit kan resulteren in de verstoring van de beeld verwerving als gevolg van de veroorzaakte trillingen.

Als de celmembraan kleurstof na 30 minuten niet zichtbaar is en de gebruikte laser lijn juist is, voegt u meer van de kleurstof toe en verhoogt u de concentratie voor de volgende overname.

Als de actomyosine-signalen wazig lijken te zijn, controleer dan de nb van het gebruikte doel. Een NA lager dan 1,3 zal de beeldkwaliteit verlagen. Zorg er bovendien voor dat gebruikte Dompel olie correct is toegepast op de water 63x-doelstelling. Toevoegen of vervangen indien nodig.

Als de Eier kamers krimpen en de waargenomen celmembranen vervormen, controleer dan of het deksel goed gesloten is. Als het deksel ontbreekt of niet goed gesloten is, kunnen de Eier kamers uitdrogen als gevolg van SMI-verdamping gedurende de aanschaf tijd.

Als de rotatie van de Eier kamers vertraagt of stopt, verlaagt u het Laser vermogen. Als er een gat in de Eier kamer verschijnt, is het verbrand door de laser. Verlaag het Laser vermogen.

Als de actomyosine bleekwater na 2 min tijdens TLM overname, verminderen van de laser vermogen en verhoging van de signaalversterking in de Microscoop software.

Zodra een TLM van het follikel epitheel van één Eier kamer is verworven, wordt het aanbevolen om opnieuw imaging in hetzelfde weefselgebied van deze Eier kamer te vermijden. Echter, als Eier kamers rond hun AP-as roteren, is het mogelijk om de overname van een TLM te herhalen met behulp van deze onbeschadigde Eier kamer na circa 30 minuten. Terwijl het follikel epitheel in één Eier kamer wordt geimaging, zullen andere Eier kamers niet gebleekt/beschadigd zijn, zelfs als ze zich in dezelfde ovarium of in een andere ovarium in de SMI bevinden.

Als aan al deze voorwaarden wordt voldaan, moet het percentage van met succes afbeelding gemaakt Egg Chambers circa 90% – 100% zijn voorstadia 6 – 8, circa 50% – 60% voorstadia 3 – 5, en circa 20% – 30% voorstadia 1 –-2. Falen is voornamelijk te wijten aan de verplaatsing van eier kamers of schade aan hen tijdens hun dissectie/manipulatie.

Kritieke stappen en probleemoplossing voor gegevensverwerking

Tijdens het genereren van het masker met behulp van het meegeleverde script in Fiji, kan het gebeuren dat er veel gegenereerde celconto uren zijn die niet de werkelijke celmembranen in een TLM weerspiegelen. Dit wordt vaak veroorzaakt door hoge achtergrondruis, vooral wanneer kleurstoffen op vlekkencelmembranen worden gebruikt. In een dergelijk geval, om de vervelende correctie van ongewenste celconto uren in het gegenereerde masker te voorkomen, voert u de segmentatie opnieuw uit en stelt u de parameters in op de beste pasvorm. Dit kan worden gedaan door de geschatte ruis tolerantie parameter aan te passen.

Bij het laden van een van de ParticleStack. TIF-bestanden met celconto uren in oppervlak Manager, schaalt de laadtijd lineair met het aantal celomtrekken en kan enkele minuten duren. Als het laden is verstoord of onjuist, herhaalt u het. Zorg ervoor dat het Upload venster scherp is en dat er geen ander programma wordt gebruikt.

Soms moet een celomtrek in sommige frames worden gecorrigeerd; gebruik in dat geval de penseel knop. Teken de juiste celomtrek in een bepaald frame door de muis rond de celmembraan te slepen. Ga naar een ander frame van de TLM en keer terug naar het tijdsbestek met de correctie: de onjuiste celomtrek moet nu worden vervangen. Ga vervolgens opnieuw naar het volgende frame om die te corrigeren. Het penseel wordt nu overgeschakeld naar de wis-modus. Corrigeer indien nodig de contouren in de volgende tijdsperioden door de bestaande celomtrek te duwen en vervolgens op de knop + toevoegen te drukken om een nieuwe celomtrek te maken. Verwijder het oude S-nummer uit het Surface Manager-venster en wijzig de naam van de nieuwe celomtrek door indien nodig op de knop naam wijzigen te drukken.

Als een hele belangrijke cel ontbreekt in een TLM, maakt u een nieuwe masker omtrek door te drukken op deselecteren > veelhoek. Maak een nieuwe celomtrek in het eerste frame van de TLM door te klikken langs de celmembraan. Ga vervolgens naar het laatste frame van de TLM en doe hetzelfde voor de geselecteerde cel. Door de film op tijd uit te voeren, worden de celcontouren geïntermuleerd. Corrigeer met het penseel indien nodig. Als u klaar bent, drukt u op de knop + toevoegen en wijzigt u de naam van de celomtrek door op de knop hernoemen te drukken. Hoe meer punten/klikken om een nieuwe celomtrek te maken, hoe beter interpolatie werkt.

Naast epitheliale rotatie, worden Tlm's soms beïnvloed door ongewenste bewegingen. Daarom wordt aanbevolen om te corrigeren voor dergelijke weefsel drift in deze Tlm's. Door dit te doen, worden Tlm's ook gecorrigeerd voor de epitheliale rotatie van eier kamers, en celmembranen worden stijf. Dit maakt de handmatige analyse van actomyosine signalen gemakkelijker. Een dergelijke benadering laat wetenschappers echter niet toe om te onderscheiden of de waargenomen actomyosine-signalen zich verplaatsen of statisch zijn ten opzichte van het celmembraan. Als een onderscheid tussen statische en actieve bewegingen van actomyosine signalen het doel van een dergelijke analyse is, moet er geen correctie van de weefsel drift worden toegepast. We ontdekten dat de meerderheid van actomyosine signalen actief bewegen ten opzichte van de celmembraan en slechts een klein deel van hen lijken statisch.

Kritieke stappen en probleemoplossing voor de analyse van subcellulaire actomyosine signalen

Als de gegenereerde statistieken uitschieters bevatten, moet u ervoor zorgen dat alle extreem lage of hoge waarden met betrekking tot de hele gegevensset echt het gedrag in de cel weerspiegelen en geen artefacten zijn. Dit kan worden gedaan door de cel met de uitschieters te identificeren en te controleren op de kwaliteit van de celcontour op het moment dat de lage/hoge waarde werd gemeten. Vaak resulteren dergelijke extreme waarden uit defecte celoverzichten die een deel van een andere cel onjuist meten. Dit kan met name duidelijk zijn wanneer grote blobs interfereren met de celomtrek van een naburige cel. In een dergelijk geval is het van cruciaal belang om de celcontouren te corrigeren en de meting te herhalen.

Om de kwantificering gemakkelijker te maken, analyseert u de signalen in een bepaald celoppervlak en gaat u één voor één verder totdat alle cellen in een subfilm worden geanalyseerd. De resultaten van handmatige analyse van subcellulaire actomyosine signalen vertonen mogelijk geen symmetrie breuk in één cel en één bepaalde Eier kamer. We hebben ervaren dat de actomyosine de symmetrie ten opzichte van de weefsel beweging niet duidelijk breekt in < 10% van de roterende Eier kamers (stadia 6 – 8). Dit percentage wordt verhoogd rond fase 412. We constateerden ook dat er geen verschil is of 5 min of 10 min worden geanalyseerd in de identificatie van de voorkeurs richting van de actomyosine-signaal beweging in een Eier kamer12.

Kritieke stappen en probleemoplossing voor de selectieve extractie van actomyosine-signalen van gebogen weefsels

De verkeerde grootte van blobs (geïdentificeerde signalen) zal resulteren in geen blobs en het programma wordt bevroren in de volgende stap. In dit geval Force-Quit Fiji en pas opnieuw de plugin Ellipsoid oppervlak projectie. Doe hetzelfde wanneer het programma niet reageert na het indrukken van Compute. Dit is vaak een indicatie dat er ongeschikte parameters zijn gekozen.

Als er te veel blobs en/als ze zijn geconcentreerd aan de ene kant van de geanalyseerde Eier kamer, dit kan invloed hebben op de ontworpen ellipsoïde en niet de juiste pasvorm voor de Eier kamer bieden. Ga terug naar de BLOB-identificatie en probeer hun grootte te rangschikken in de combinatie met de x-, y-en z-as selectie van de Eier kamer. Het niet genereren van een goede ellipsoïde pasvorm treedt ook vaak op wanneer ongeschikte cut-off afstand instellingen worden gebruikt.

De verkregen projecties kunnen er soms verkeerd uitzien, of misschien is het verkregen z-vlak daadwerkelijk verplaatst tussen cellagen in de buurt van het oppervlak van de Eier kamer. Dit is meestal een teken van een slecht passend ellipsoïde waarbij één regio van de ellipsoïde te ver van de Eier kamer is ingesteld. Probeer de ellipsoïde te passen zodat deze dezelfde afstand van de omtrek van de Eier kamer behoudt.

Beperkingen van de methode en de nieuwe benaderingen

Deze vrije kweek van eier kamers omvormt de subtiele afvlakking van het oppervlak van een Eier kamer. Daarom heeft deze methode zijn voor-en nadelen. Bij het gebruik van confocale microscopie biedt het gebruikers met een hoge resolutie en hoge snelheid beeldvorming die op betrouwbare wijze het gedrag van actomyosine in cellen in de omtrek van de Eier kamers voor een korte periode van tijd (5 – 10 min) onthult. Echter, door dit te doen, beperkt het de grootte van een enkel vlak dat kan worden afgebeeld met confocale microscopie na verloop van tijd. In het algemeen is het mogelijk om beeld tot ~ 15 cellen per Eier kamer in stadia 6-8 maar slechts ongeveer twee cellen in eier kamers in stadia 1 – 5. Daarom hebben we deze methode hier gedefinieerd als zijnde alleen geschikt voor de lokale cellulaire schaal.

Om deze groottelimieten die worden veroorzaakt door de beperkte grootte van een enkel confocale vlak te overwinnen, hebben we een alternatieve Fiji-gebaseerde benadering genaamd Ellipsoid oppervlak projectie ontwikkeld, voor gebruik op de weefsel schaal. Dit combineert draaiende schijf microscopie met een semi-interactieve oppervlakte extractie van eier kamers op de weefsel schaal. Op deze manier, actomyosine signalen kunnen worden verkregen op hetzelfde moment voor meer dan 50 –-100 cellen uit één geanalyseerde Eier kamer. Het is belangrijk op te merken dat deze aanpak genereert zeer grote gegevenssets van de verworven gegevens (~ Giga bytes), heeft een lagere resolutie (het maakt gebruik van een 40x vs. een 63x doel), en biedt ook een langzamere Imaging snelheid (het duurt ~ 60 s om te scannen door de helft van het weefsel van een Egg Cham [stadia 6 – 8] en, als zodanig, het is 10x langzamer dan de beperkte confocale Plane methode).

In vergelijking met andere bestaande software voor het extraheren van gelaagde projecties van parametriseerde oppervlakken, is de plugin ontwikkeld voor dit protocol gericht op gebruiksgemak en interactieve visuele feedback bij elke stap van het proces. Andere hulpmiddelen, zoals de op MATLAB gebaseerde ImSaNE20, gebruikt door Chen et al.21, richten zich op het hanteren van een breed scala aan parametriseerde en niet-parametriseerde oppervlakte modellen en verschillende projectie methoden. ImSaNE vereist bijvoorbeeld dat gegevens vooraf worden verwerkt en op een bepaalde manier worden uitgelijnd en deels externe tools nodig hebben in tussenliggende stappen. De plugin die hier wordt gepresenteerd, behandelt daarentegen elke 3D/4D/5D-afbeelding (sequentie) die in Fiji kan worden geopend zonder externe voor verwerking. Hoewel ImSaNE zeer configureerbaar is (programmeerbaar) door MATLAB-scripts te bewerken, bieden we een minimale set opties in één workflow die is afgestemd op het specifieke probleem dat hier wordt besproken. Elke stap van de interactieve workflow levert resultaten die onmiddellijk visueel geïnspecteerd en indien nodig aangepast kunnen worden.

Het besluit over welke van deze beeldvormings benaderingen, de lokale cellulaire of weefsel schaal, het beste is voor een bepaald experiment, hangt uitsluitend af van de wetenschappelijke vraag die moet worden beantwoord (d.w.z. hoger versus lagere resolutie; korte versus lange acquisitie tijd). Een goed compromis tussen deze twee schalen zou kunnen zijn om beide benaderingen te combineren, waardoor het verkrijgen van de beeldvorming van actomyosine signalen op de semi-weefsel schaal (dat wil zeggen, 20 – 30 cellen). Dit vereist een draaiende schijf Microscoop, een water 63x lens met NA ≥ 1,3, en gevestigde z-stack instellingen voor 20 – 30 cellen van een Eier kamer. Deze veel onlagere z-stack (in tegenstelling tot de z-stack die nodig is voor de aanschaf van de ene helft van een Eier kamer) maakt sneller scannen van onder 60 s mogelijk. De hier opgedane tijd kan worden gebruikt voor herhaalde z-stack overname om de beeldvorming te versnellen of voor een monster herstel (tijd interleaves) tussen individuele z-stacks. Met deze laatste kan een langere acquisitie tijd (> 30 min) Tlm's van roterende Eier kamers worden bereikt. Deze semi-weefsel aanpak garandeert een voldoende resolutie voor actomyosine signalen en de beeldvorming van meer cellen op hetzelfde moment over langere perioden.

Toekomstige toepassingen en visie

Beide beschreven methoden (op de lokale cellulaire en weefsel schaal) bieden een eenvoudige en goedkope aanpak (met uitzondering van Microscoop-apparaten) met beperkte bijwerkingen op het actomyosine-netwerk en kunnen worden geïmplementeerd en gemakkelijk worden aangenomen voor andere gedissected dierlijke weefsels. De enige vereiste hier is een bestaand kweek protocol in een Petri schaaltje voor een gebogen weefsel van belang, beschikbare transgenen, en markers of etiketterings methoden.

In combinatie met lichte fluorescentiemicroscopie22, is het ook mogelijk om actomyosine-machines in Toto te laten afbeelden (d.w.z. het volledige buitenste omtrek oppervlak van Drosophila Eier kamers gelijktijdig en daarna ontvouwen met behulp van de plugin Ellipsoid oppervlakte extractie). Echter, er zijn een paar beperkingen die moeten worden opgelost in termen van geschiktheid voor High-Speed beeldvorming van actomyosine signalen, namelijk 1) het insluiten van eier kamers in een low-Point smelten agarose of hun vasthouden aan een capillair tijdens beeldvorming; II) een laag numeriek diafragma van gebruikte water lenzen die niet voldoende actomyosine-signaal resolutie bieden; III) de extra tijd die nodig is om verschillende hoeken van eier kamers te verwerven, waardoor beeldvorming met hoge snelheid wordt voorkomen.

Daartoe is het voorzienbaar dat, met de verfijning van de Microscoop parameters zoals de snelheid die door het epitheelweefsel wordt gescand en de verbetering van gebruikte microscopische lenzen, de gedetailleerde analyse van actomyosine-machines in de toekomst zal toelaten veelbelovende hoge-resolutie resultaten te verkrijgen op het weefsel en in Toto Scale over lange perioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zijn Miriam Osterfield zeer erkentelijk voor het delen van haar advies over de in vitro Life beeldvorming van eier kamers met behulp van een aanpak die is overgenomen uit het Celeste berg Laboratory4. We danken ook Sebastian Tosi voor het Fiji-script dat celsegmentatie mogelijk maakt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider Medium Gibco 21720-024 [+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122  [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum Sigma  F135 Heat inactivated
Insulin Solution Human Sigma  I9278
50 mL Falcon tubes Eppendorf sterile
Millex-GV filter Millipore SLGV033NS 33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps A. Dumont & Fils  #55
CellMask Deep Red (cell membrane dye) Invitrogen C10046
FM4-64 (cell membrane dye) ThermoFisher/Invitrogen T13320
Depression dissection slide Fisher Scientific 12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope e.g. Zeiss Stemi SV 6
Inverted confocal microscope e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder Hammacher 9160020
Cactus spine Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics