मेटास्टेटिक कोलोरेक्टल कैंसर के साथ रोगियों में एक परिसंचारी microrna कस्टम पैनल का पता लगाने

Cancer Research

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Summary

हम कैंसर रोगियों से प्लाज्मा नमूनों में माइक्रोना (mirnas) परिसंचारी के अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । विशेष रूप से, हम mirna निष्कर्षण और रिवर्स transcription परिचालित के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का इस्तेमाल किया । अंत में, हम वास्तविक समय पूर्व देखा जांच कस्टम प्लेटों का उपयोग कर 24 चयनित mirnas के एक पैनल का विश्लेषण किया ।

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Canale, M., Marisi, G., Passardi, A., Scarpi, E., Ulivi, P. Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (145), e58615, doi:10.3791/58615 (2019).

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Abstract

नैदानिक अभ्यास के लिए विश्वसनीय और उपयोगी बायोमार्कर की आवश्यकता पैदा करने, कैंसर निदान, रोग का निदान और चिकित्सीय निगरानी के लिए तरल बायोप्सी में रुचि बढ़ रही है । यहाँ, हम निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, रिवर्स ट्रांसक्राइब और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के साथ रोगियों के प्लाज्मा नमूनों से mirnas परिसंचारी के अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन. micrornas (mirnas) गैर की एक कक्षा हैं-कोडिंग rnas की लंबाई में 18-25 न्यूक्लियोटाइड की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए लक्ष्य जीन शोधों स्तर पर और एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, सहित कि समर्थक और विरोधी एंजियोजेनिक समारोह के फिजियोथोलॉजी में विभिन्न अंगों । mirnas इस तरह के सीरम और प्लाज्मा के रूप में जैविक तरल पदार्थ में स्थिर हैं, जो उन्हें कैंसर निदान, रोग का निदान और उपचार निर्णय लेने और निगरानी के लिए आदर्श परिचालित बायोमार्कर renders. मिरना निष्कर्षण परिचालित एक तेजी से और प्रभावी तरीका है कि दोनों कार्बनिक और कॉलम-आधारित तरीके शामिल है का उपयोग किया गया । mirna retrotranscription के लिए, हम एक बहु कदम प्रक्रिया है कि 3 पर polyadenylation समझता है ' और परिपक्व mirna के 5 ' पर एक एडाप्टर के बंधाव, यादृच्छिक mirna पूर्व प्रवर्धन द्वारा पीछा किया । हम एक 24 mirna कस्टम पैनल का चयन करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qrt-पीसीआर) द्वारा परीक्षण किया और सरणी कस्टम प्लेटों पर mirna जांच देखा । हमने qrt-पीसीआर प्लेट का प्रदर्शन रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम पर चलता है । मानक के लिए हाउसकीपिंग mirnas का उपयोग कर genorm सॉफ्टवेयर (v. ३.२) का चयन किया गया । डेटा अभिव्यक्ति सुइट सॉफ्टवेयर (v १.१) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया । विधि विश्वसनीय और तकनीकी रूप से मजबूत साबित हुई और प्लाज्मा और/या सीरम जैसे तरल नमूनों में बायोमार्कर के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

CRC तीसरी सबसे अक्सर निदान द्रोह और कैंसर से संबंधित मौत का चौथा कारण दुनिया भर में प्रतिनिधित्व करता है । तिथि करने के लिए, bevacizumab (बी), एक मोनोक्लोनल संवहनी-endothelial वृद्धि कारक (vegf) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी, और सीटुक्जीमैब (सी) या panitumumab (पी), मोनोक्लोनल एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (egfr) के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी, के लिए अनुमोदित कीमोथेरेपी (सीटी) regimens के साथ संयोजन में पहली पंक्ति उपचार ।

K-ras और N-ras जीन में परिवर्तन केवल नैदानिक रूप से उपयोगी बायोमार्कर हैं, जो उन रोगियों की पहचान करने में सक्षम हैं, जिन्हें एंटी-ईजीएफआर-आधारित सीटी से कम लाभ होने की संभावना है । हालांकि कई अध्ययनों के लिए बायोमार्कर कि बी के जवाब की भविष्यवाणी कर रहे है के लिए खोज आयोजित किया गया है सीटी आधारित है, वहां अभी भी नैदानिक अभ्यास1में उपयोग के लिए विश्वसनीय और प्रभावी दवाओं की एक पर्याप्त कमी है ।

mirnas छोटे rnas (लंबाई में 18-25 ंयूक्लियोटाइड) कर रहे है कि लक्ष्य जीन के अनुवाद को विनियमित और कई फिजियोथोलॉजिकल प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, भ्रूणविज्ञान और कैंसरजनन सहित । ये अणु प्लाज्मा/सीरम, मूत्र और थूक जैसे जैविक तरल पदार्थों में अत्यधिक स्थिर होते हैं, जो गैर-इनवेसिव नमूनाकरण2के लिए उपयोग करने के लिए मजबूत बायोमार्कर को रेंडर करते हैं । एंजियोजेनिक मार्ग में शामिल mirnas के एक पैनल का उपयोग करना, हम एक बी आधारित सीटी आहार के साथ इलाज मेटास्टेटिक सीआरसी (mcrc) के साथ रोगियों में नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी करने में सक्षम नए घूम बायोमार्कर की पहचान करने के उद्देश्य से.

हम की एक श्रृंखला का विश्लेषण ५२ mcrc रोगियों के भीतर बी आधारित सीटी के साथ इलाज किया भावी multicenter यादृच्छिक चरण III परीक्षण "इतालवी परीक्षण उन्नत कोलोरेक्टल कैंसर में" (itaca). वर्तमान प्रोटोकॉल स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (comitato ईटीको क्षेत्र vasta ई इस्टिट्युटो scientifico romagnolo प्रति लो स्टूडियो ई ला cura देई तुमोरी (irst) irst, नहीं ६७४) 19वें सितंबर को २००७ । सभी मरीजों को ब्लड सैंपल कलेक्शन से पहले सूचित सहमति दे दी । प्रत्येक रोगी के लिए, शिरापरक रक्त के नमूने उपचार से पहले एकत्र किए गए थे और पहली नैदानिक मूल्यांकन (8 सप्ताह के बाद) में रोगी परिणाम के संबंध में उपचार के दौरान आधारभूत mirna अभिव्यक्ति और इसके मॉडुलन का मूल्यांकन करने के लिए ।

साहित्य की एक खोज के माध्यम से, हम 21 mirnas एंजियजेनिक प्रक्रिया है कि मानव प्लाज्मा में detectable होने के लिए जाना जाता है के साथ सहसंबद्ध का चयन किया: है-मीर-१०७, है-मीर-126-3p, है-मीर-145-5p, है-मीर-194-5p, है-मीर-199a-5p, है-मीर-200b-3p, है-मीर-20b-5p , है-मीर-21-5p, है-मीर-210-3p, है-मीर-221-3p, है-मीर-24-3p, है-मीर-27a-3p, है-मीर-29b-3p, है-मीर-335-5p, है-मीर-424-5p, है-मीर-497-5p, है-mir-520d-3p, है-मीर-92a-3p, है-mir-17-5p और है-मीर-155-5p । हम भी चुना है-मीर-223-3p और है-मीर-४८४ अंतर्जात सामान्यीकरण के लिए3,4,5,6, और cel-मीर-३९ exogenous सामान्यीकरण के लिए एक स्पाइक के रूप में सी एलिगेंस से शुद्ध. सभी डेटा normalizations का उपयोग किया गया 2 ̂ ̄ (...) विधि ।

प्रसारित mirnas का पता लगाने के कुछ तकनीकी कठिनाइयों प्रस्तुत करता है क्योंकि अणुओं प्लाज्मा में बहुत कम स्तर पर मौजूद हैं और उनके प्रवर्धन रासायनिक उनके छोटे अनुक्रम दिया चुनौतीपूर्ण है. इन कारणों के लिए, हम एक प्रक्रिया है कि phenol और एक गिलास फाइबर कॉलम आधारित कार्यप्रणाली के साथ दोनों कार्बनिक निष्कर्षण समझता है का चयन किया । प्रसारित mirna निष्कर्षण तरल बायोप्सी के क्षेत्र में एक गर्म विषय है, और हम एक वाणिज्यिक किट है कि राशि और बरामद पैदावार7,8की गुणवत्ता के मामले में सबसे विश्वसनीय में से एक होना दिखाया गया है का चयन किया । हम 5 पर एक एडाप्टर के अलावा द्वारा प्रतिलेखन mirnas रिवर्स करने के लिए एक प्रोटोकॉल का चयन ' और एक पाली (एक) पूंछ के लिए 3 ' परिपक्व mirnas की चयनात्मकता और प्रतिक्रिया की विशिष्टता बढ़ाने के लिए.

विधि की मजबूती को देखते हुए, हमने आरटी-पीसीआर के लिए पूर्व-देखा जांच के साथ कस्टम प्लेट को डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने का आकलन करने के लिए डिजाइन किया है और प्रत्येक थाली के भीतर 2 रोगियों का विश्लेषण, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है ।

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Protocol

नोट: अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास (जीएलपी) के अनुसार एक निष्फल धूआं हुड के तहत निम्न चरणों के सभी प्रदर्शन.

1. प्लाज्मा संग्रह और भंडारण

  1. एक K3E edta ट्यूब में परिधीय रक्त नमूना के 3 मिलीलीटर ले लीजिए ।
  2. 15 मिनट के लिए १,८८० एक्स जी पर कमरे के तापमान पर ट्यूब centrifuge ।
  3. ४५० μl के aliquots में सतह पर तैरनेवाला प्लाज्मा पुनर्प्राप्त करें ।
  4. पर नमूनों की दुकान-८० ° c उपयोग तक ।
    नोट: संग्रह के 2 ज के भीतर परिधीय रक्त ट्यूब की प्रक्रिया । जब ट्यूब से प्लाज्मा उबरने, लिम्फोसाइट परत परेशान मत करो ।

2. प्लाज्मा नमूनों से परिसंचारी mirnas के निष्कर्षण (सामग्री की तालिका)

  1. सभी आवश्यक समाधानों को तैयार करें और निष्कर्षण चरणों के लिए नमूनों को गल लें ।
    1. 2-mercaptoethanol के 2x denaturating समाधान करने के लिए ३७५ μl जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. जोड़ने के 21 एमएल ACS ग्रेड १००% इथेनॉल mirna धोने समाधान के लिए मैं और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    3. जोड़ने के ४० एमएल के ACS ग्रेड १००% इथेनॉल को धोने के समाधान 2/3 और अच्छी तरह से मिश्रण.
    4. एक प्लाज्मा aliquot कमरे के तापमान पर गल करने की अनुमति दें और फिर निष्कर्षण कदम शुरू करते हैं ।
  2. कार्बनिक निष्कर्षण
    1. एक rnase मुक्त 2 मिलीलीटर ट्यूब में प्लाज्मा नमूने के ४०० μl स्थानांतरण ।
    2. जोड़ें ४०० μl के 2x denaturating समाधान, मिश्रण द्वारा vortexing और संक्षेप में अपकेंद्री.
    3. 1 एनएम स्पाइक में 4 μl जोड़ें, वोर्टेक्सिंग और संक्षेप में अपकेंद्री द्वारा मिश्रण ।
    4. एसिड फीनॉल के ८०० μl जोड़ें-क्लोरोफॉर्म ।
    5. ६० एस के लिए भंवर और 15 मिनट के लिए अधिकतम गति (≥ १०,००० एक्स जी) पर सेंट्रेसेज ।
    6. एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण । इंटरफेज को डिस्टर्ब न करें । नोट वॉल्यूम पुनर्प्राप्त और गैर-acqueous चरण वाले ट्यूब छोड़ें ।
      नोट: 2x डिनेटरिंग समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाता है और इस तापमान पर जमना हो सकता है । उपयोग करने से पहले, ३७ डिग्री सेल्सियस के समाधान को गर्म करें, 10-15 मिनट के लिए कभी-कभार उत्तेजित होते हैं । एसिड फीनॉल-क्लोरोफॉर्म से युक्त नीचे चरण को वापस लेने के लिए सावधान रहें, न कि जलीय बफर जो मिश्रण के शीर्ष पर स्थित है । ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए रेफरेंस समाधान या न्यूनास्पेस-मुक्त पानी को पहले से गरम करें । समाधान की एक पर्याप्त मात्रा में गर्मी के लिए सावधान रहें (१०० μl प्रति नमूना + 10% अधिक).
  3. लघु आरएनए संवर्धन
    1. 1/3 चरण 2.2.6 से जलीय चरण के लिए १००% इथेनॉल की मात्रा जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा संग्रह ट्यूब में एक फिल्टर कारतूस प्लेस ।
    3. के लिए स्थानांतरण ७०० μl lysate से कदम 2.3.1 और इथेनॉल में फिल्टर कारतूस और अपकेंद्री में १०,००० एक्स जी के लिए 30 एस ।
    4. अगर वहां > है मिश्रण के 700 μl छोड़ दिया, एक ताजा ट्यूब में छानना जगह और दोहराएं कदम 2.3.3; दोहराएं जब तक सभी मिश्रण फिल्टर कारतूस के माध्यम से पारित कर दिया है ।
    5. प्रवाह के माध्यम से की कुल मात्रा को मापने ।
    6. 2/3 इथेनॉल की मात्रा १००% छानना करने के लिए जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    7. एक ताजा संग्रह ट्यूब में एक दूसरे फिल्टर कारतूस प्लेस ।
    8. कारतूस में नमूना मात्रा के ७०० μl तक स्थानांतरण और १०,००० एक्स जी में 30 एस के लिए अपकेंद्री प्रवाह के माध्यम से त्याग ।
    9. दोहराएं कदम 2.3.8 जब तक सभी मिश्रण फिल्टर कारतूस के माध्यम से पारित कर दिया है ।
    10. लागू ७०० μl के mirna धो समाधान 1 फिल्टर कारतूस और अपकेंद्री के लिए १०,००० पर संग्रह ट्यूब के साथ फिल्टर कारतूस एक्स जी 15 एस के लिए. प्रवाह के माध्यम से त्याग । एक ही कलेक्शन ट्यूब में फिल्टर कारतूस रखें ।
    11. फ़िल्टर कारतूस के लिए धो समाधान 2/3 के ५०० μl लागू करें और 15 एस के लिए १०,००० एक्स जी पर संग्रह ट्यूब के साथ फिल्टर कारतूस अपकेंद्री प्रवाह के माध्यम से त्याग । एक ताजा संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस प्लेस ।
    12. एक ताजा संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस प्लेस और धो समाधान 2/3 के ५०० μl साथ चरण 2.3.11 दोहराएं । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक ताजा संग्रह ट्यूब के लिए फिल्टर कारतूस हस्तांतरण ।
    13. 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर फिल्टर कारतूस के साथ ट्यूबों centrifuge ।
    14. एक ताजा १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर कारतूस हस्तांतरण और preheated के १०० μl जोड़ें (९५ डिग्री सेल्सियस) रेफरेंस समाधान या न्यूकासे मुक्त पानी ।
    15. 30 एस के लिए १०,००० एक्स जी में अपकेंद्री mirnas की वसूली और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      नोट: एक सफेद हाला धो समाधान 2/3 में फार्म कर सकते हैं । यह अतिरिक्त edta समाधान से जारी किया है । पाइटिंग चरणों के दौरान इन क्रिस्टल को ड्राइंग से बचें ।

3. रिवर्स transcription और mirna पूर्व प्रवर्धन (सामग्री की तालिका) प्रदर्शन

  1. प्रदर्शन polyadenylation प्रतिक्रिया
    1. बर्फ पर सभी अभिकर्मकों thaw, तो संक्षेप में भंवर और सेंटैविज नीचे सामग्री स्पिन करने के लिए । इसके अलावा, गल ५०% खूंटी ८०००, यह कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देता है ।
    2. एक ०.५ मिलीलीटर अपकेंद्री ट्यूब में रिएक्शन मिश्रण तैयार करें, प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया कॉकटेल के 3 μl की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करना । निम्न वॉल्यूम का उपयोग करें, साथ ही प्रत्येक अभिकर्मक के लिए 10% अतिरिक्त वॉल्यूम ।
    3. १.७ μl के rnase-मुक्त पानी, 10x पाली के ०.५ μl (A) बफर, 10 मिमी एटीपी के ०.५ μl, और अंत में ०.३ μl 5 U/μl polya एंजाइम जोड़ें ।
    4. संक्षेप में भंवर और अपकेंद्री सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए कॉकटेल मिश्रण ।
    5. प्रतिक्रिया प्लेट या रिएक्शन ट्यूब के प्रत्येक अच्छी तरह से नमूना के 2 μl हस्तांतरण और प्रतिक्रिया कॉकटेल के 3 μl जोड़ें । संक्षेप में भंवर और अपकेंद्री सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए ।
    6. थाली को एक थर्मल चक्रीय में रखें और निंन चरणों का पालन करें ।
    7. ४५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते (polyadenylation कदम) ।
    8. 10 मिनट (स्टॉप रिएक्शन) के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निम्नलिखित पकड़ के साथ ।
  2. बंधाव प्रतिक्रिया प्रदर्शन ।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए निम्नलिखित मात्रा के साथ एक अपकेंद्री ट्यूब में रिएक्शन मिक्स तैयार करें और अधिक मात्रा में 10%
    2. ०.४ μl के rnase-मुक्त पानी, 5x डीएनए ligase बफर के 3 μl, 25x ligase अनुकूलक के ०.६ μl, ५०% खूंटी ८००० के ४.५ μl, और अंत में १.५ μl के आरएनए ligase जोड़ें ।
    3. संक्षेप में भंवर और अपकेंद्री सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए कॉकटेल मिश्रण ।
    4. पाली (क) उत्पाद पीछा युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से/प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए मिश्रण के 10 μl जोड़ें । 1 मिनट या संक्षेप में vortexing और नीचे सामग्री स्पिन के लिए १,९०० आरपीएम पर एक थाली शेखर द्वारा मिक्स ।
    5. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मल cycler में प्लेट/प्रतिक्रिया ट्यूबों रखें: ६० डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन ६० मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर निम्नलिखित पकड़ के साथ ।
      नोट: ५०% खूंटी ८००० अत्यधिक चिपचिपा है । कमरे के तापमान पर प्रयोग करें, और धीरे से aspirating तिरस्कारी । प्रत्येक आकांक्षा और वितरण कदम के बाद, 10 एस के लिए plugger पकड़ के लिए अभिकर्मक प्रवाह को और नीचे की अनुमति है ।
  3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया प्रदर्शन ।
    1. एक अपकेंद्री ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें, प्रत्येक नमूने के लिए निम्न मात्रा के साथ और अधिक मात्रा में 10%.
    2. rnase मुक्त पानी की ३.३ μl जोड़ें, 5x आरटी बफर के 6 μl, dntp मिश्रण के १.२ μl (25 मिमी प्रत्येक), 20x यूनिवर्सल आरटी primers के १.५ μl, और अंत में 3 μl के 10x आरटी एंजाइम मिक्स.
    3. संक्षेप में भंवर और अपकेंद्री सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए कॉकटेल मिश्रण ।
    4. मिश्रण के 15 μl जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से/ 1 मिनट या संक्षेप में vortexing और नीचे सामग्री स्पिन के लिए १,९०० आरपीएम पर एक थाली शेखर द्वारा मिक्स ।
    5. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मल cycler में थाली/
    6. 15 मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर सेते (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन) ।
    7. 5 मिनट (स्टॉप रिएक्शन) के लिए ८५ डिग्री सेल्सियस पर सेते, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निम्नलिखित पकड़ के साथ ।
      नोट: आरटी उत्पाद अब-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और 2 महीने तक के लिए स्थिर रहेगा ।
  4. मीर-Amp प्रतिक्रिया (सामग्री की तालिका) प्रदर्शन.
    1. प्रत्येक नमूने के लिए निम्नलिखित मात्रा के साथ एक अपकेंद्री ट्यूब में रिएक्शन मिक्स तैयार करें और अधिक मात्रा में 10%
    2. rnase मुक्त पानी, 2x मीर-amp मास्टर मिश्रण के 25 μl, और 20x मीर-amp प्राइमर मिश्रण के २.५ μl के १७.५ μl जोड़ें ।
    3. संक्षेप में भंवर और अपकेंद्री सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए कॉकटेल मिश्रण ।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए, एक नई प्रतिक्रिया प्लेट या एक प्रतिक्रिया ट्यूब के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण के ४५ μl स्थानांतरण. प्रत्येक अच्छी तरह से या प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए आरटी उत्पाद के 5 μl जोड़ें । 1 मिनट या संक्षेप में vortexing और नीचे सामग्री स्पिन के लिए १,९०० आरपीएम पर एक थाली शेखर द्वारा मिक्स ।
    5. एक थर्मल cycler में प्लेट/प्रतिक्रिया ट्यूबों प्लेस और चलाने के रूप में तालिका 1में दिखाया गया है ।

4. रीयल-टाइम पीसीआर का प्रदर्शन करें

  1. प्रत्येक cdna नमूना 1:10 में 0.1 x TE बफ़र को पतला ।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए कुओं की संख्या की गणना/ प्रत्येक नमूने के लिए निम्न खंडों के साथ एक अपकेंद्री ट्यूब में रिएक्शन मिक्स तैयार करें, मात्रा का 10% अतिरिक्त में जोड़कर ।
  3. rnase मुक्त पानी के 4 μl जोड़ें, 2x तेजी से उन्नत मास्टर मिश्रण के 10 μl (सामग्री की तालिका), और अंत में पतला cdna के 5 μl.
  4. सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए vortexing और संक्षेप में अपकेंद्री द्वारा मिक्स ।
  5. एक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण के 19 μl हस्तांतरण, थाली मुहर और संक्षेप में अपकेंद्री ।
  6. एक आरटी-पीसीआर सिस्टम पर थर्मल प्रोटोकॉल (तालिका 2) निष्पादित करें ।

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Representative Results

हम एक ५२ mcrc रोगियों में प्रगति से मुक्त अस्तित्व (pfs), समग्र अस्तित्व (ओएस) और उद्देश्य प्रतिक्रिया दर (orr) के संबंध में एंजियोजेनेसिस से संबंधित परिसंचारी mirnas के एक पैनल का विश्लेषण बी आधारित सीटी के साथ इलाज किया । प्लाज्मा नमूनों में ऐसे बायोमार्कर का मूल्यांकन तकनीकी दिक्कतों की वजह से चुनौतीपूर्ण है. हम रोगी प्लाज्मा नमूनों, रिवर्स प्रतिलेखन और पूर्व प्रवर्धन से mirna निष्कर्षण के लिए स्थापित तरीकों का इस्तेमाल किया । निर्माता के निर्देशों के बाद और केवल कुछ आवश्यक संशोधनों के साथ, विशेष रूप से निष्कर्षण चरणों में, हम सफलतापूर्वक रोगी जनसंख्या में हमारे सभी लक्ष्यों का मूल्यांकन (चित्रा 2).

विशेष रूप से, हम 2 प्लाज्मा नमूनों का विश्लेषण/रोगी, आधारभूत और चिकित्सा के रोगी परिणाम के साथ संशोधित mirna अभिव्यक्ति सहसंबद्ध ।

हम cel-miR-३९ के सीरियल dilutions पर ०.०५ एनएम, ०.५ एनएम, 5nm और 5 बजे प्लाज्मा नमूना के ८०० μl में प्रदर्शन (४०० μl प्लाज्मा प्लस 2x denaturating समाधान के ४०० μl) का उपयोग करने के लिए स्पाइक-एकाग्रता निर्धारित करने के लिए । जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, exogenous नियंत्रण दहलीज चक्र (सीटी) मूल्यों है कि धारावाहिक dilutions के साथ अनुकूल थे दिखाया, पूरे प्रोटोकॉल की मजबूती का संकेत (यानी, निष्कर्षण, रिवर्स प्रतिलेखन और qrt-पीसीआर मूल्यांकन) । इसके अलावा, इन धारावाहिक dilutions हमें स्पाइक एकाग्रता में है कि सभी लक्ष्य mirnas के रिवर्स प्रतिलेखन के साथ हस्तक्षेप नहीं होगा चयन करने के लिए सक्षम होना चाहिए ।

इस विधि हमें नैदानिक रोग सुविधाओं के साथ आधारभूत mirnas सहसंबंधित करने की अनुमति दी. विशेष रूप से, हमने पाया है कि-मीर-199a-5p, है-मीर-335-5p और है-मीर-520d-3p काफी बाएं पक्षीय घावों (पी = ०.०३, पी = ०.००६ और पी = ०.००८, क्रमशः) के लिए संमान के साथ में upregulated थे । इसके विपरीत, है-मीर-21-5p काफी रास-mutated रोगियों में downregulated (K-रास, पी = ०.०१ और N-रास, पी = ०.००८), जबकि है-मीर-221-3p था upregulated (पी = ०.०५, पी = ०.०१, कश्मीर और N-रास, क्रमशः) ।

आधारभूत और पहले नैदानिक मूल्यांकन के बीच mirna की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना, हमने देखा है कि है में वृद्धि-मीर-155-5p अभिव्यक्ति स्तर छोटे pfs (पी = ०.०४) और ओएस (पी = ०.०२) के साथ जुड़ा हुआ था । विशेष रूप से, एक ≥ में 30% की वृद्धि के साथ रोगियों में है-मीर-155-5p, pfs था ९.५ महीने (९५% ci, 6.8-18.7) और OS १५.९ महीने था (९५% ci, ८.४-नहीं पहुंचा) की तुलना में २२.३ महीने (९५% ci, 10.2-25.5) और ४२.९ महीने (९५% ci, २४.८-नहीं पहुंच) < 30% के साथ उन लोगों के लिए बढ़ाएं (चित्र 3) । मामला श्रृंखला में भिन्नता का औसत मूल्य (30%) कटऑफ प्वाइंट के रूप में सेट किया गया था । mirnas के बेसल स्तर परिसंचारी "उच्च" या "कम" माध्य9मूल्यों के अनुसार में dichotomized थे ।

Figure 1
चित्रा 1: कस्टम प्लेट लेआउट का डिजाइन । जांच पूर्व में एक अच्छी तरह से देखा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: qrt-पीसीआर प्रवर्धन भूखंडों के उदाहरण । () एक ही qrt-पीसीआर कस्टम प्लेट के प्रवर्धन भूखंड । सभी मार्कर दोनों एकल प्लेट नमूनों में मूल्यांकन कर रहे थे । () कुल मिलाकर मामला श्रृंखला में है-मीर-17-5p की qrt-पीसीआर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रयोगात्मक और नैदानिक परिणाम है-मीर-155-5p के सापेक्ष । () है के लिए सीटी मूल्यों-मीर-155-5p । समग्र मामले श्रृंखला में है-मीर-155-5p की प्रवर्धन साजिश । () pfs और एक ≥ 30% के साथ रोगियों के ओएस या परिसंचारी में 30% की वृद्धि < है-मीर-155-5p । पीएफएस randomization की तारीख से समय के रूप में गणना की थी ट्यूमर प्रगति के पहले दस्तावेज साक्ष्य की तारीख को, पिछले ट्यूमर मूल्यांकन या रोग प्रगति के अभाव में मौत । ओएस randomization की तारीख से किसी भी कारण या पिछले अनुवर्ती से मौत की तारीख को समय के रूप में गणना की थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रायोगिक परिणाम forcel-मीर-३९ धारावाहिक कमजोर पड़ने । () cel-miR-३९ के धारावाहिक dilutions के लिए qrt-पीसीआर के साथ () रिश्तेदार cts. dilutions 5 एनएम, ०.५ एनएम, ०.०५ एनएम और एक ही मरीज से प्लाज्मा नमूनों में 5 बजे प्रदर्शन किया गया । इस तरह परख रैखिकता हमें सबसे अच्छा समग्र मामले श्रृंखला में उपयोग एकाग्रता का चयन करने के लिए सक्षम होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

चरण तापमान अवधि चक्र
एंजाइम सक्रियण ९५ डिग्री सेल्सियस 5 min 1
डेनत्रे ९५ डिग्री सेल्सियस 3 एस 14
एनआल विस्तार/ ६० डिग्री सेल्सियस 30 एस
रोक अभिक्रिया ९९ डिग्री सेल्सियस 10 min 1
पकड़ 4 ° c पकड़

तालिका 1: मीर-AMP प्रतिक्रिया के थर्मल प्रोटोकॉल ।

चरण तापमान अवधि चक्र
एंजाइम सक्रियण ९५ डिग्री सेल्सियस 20 एस 1
डेनत्रे ९५ डिग्री सेल्सियस 3 एस ४०
एनआल विस्तार/ ६० डिग्री सेल्सियस 30 एस
पकड़ 4 ° c पकड़

तालिका 2: qrt-पीसीआर के थर्मल प्रोटोकॉल ।

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Discussion

mirnas छोटे गैर कोडिंग कर रहे हैं rnas (लंबाई में 18-25 न्यूक्लियोटाइड) 3 ' अपने लक्ष्य दूत आरएनए के utr क्षेत्र बाध्यकारी और बाधा और/ वे इस प्रकार शोधों स्तर पर जीन अभिव्यक्ति नियामकों माना जा सकता है । पिछले दशक में, कई mirnas कैंसर दीक्षा और विकास के साथ सहसंबद्ध किया गया है, निदान, रोग का निदान और चिकित्सा के लिए उन्हें उपयोगी नैदानिक बायोमार्कर बनाने. rnases द्वारा संरक्षित, mirnas रक्त, प्लाज्मा, सीरम, मूत्र और लार के रूप में जैविक तरल पदार्थ में एक स्थिर रूप में मौजूद हैं, जो नैदानिक अभ्यास10में अपने संभावित उपयोगिता में बढ़ती रुचि के लिए नेतृत्व किया गया है.

इस के बावजूद, संचारी mirnas का मूल्यांकन एक चुनौतीपूर्ण कार्य और कठिनाइयों नमूना संग्रह, लक्ष्य निष्कर्षण, मंच विकल्प और वैश्विक सामान्यीकरण के बारे में वैज्ञानिक समुदाय के भीतर गर्मागर्म बहस विषयों रहे हैं ।

नमूना संग्रह और भंडारण के लिए, पूर्व विश्लेषणात्मक चर बारीकी से प्लाज्मा हैंडलिंग और प्रसंस्करण के लिए जुड़े हुए हैं । हम प्लाज्मा पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय सीरम नमूने दिया है कि उच्च mirna सांद्रता के बाद में पर्याप्त सबूत है, संभवतः जमावट प्रक्रिया के दौरान इन अणुओं की रिहाई के कारण10,11,12 . सेलुलर न्यूलिक एसिड रक्त कोशिका lysis से प्राप्त की रिहाई के मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम रक्त संग्रह के 2 एच के भीतर नमूनों centrifuged. हम भी K3E edta ट्यूबों इस्तेमाल किया क्योंकि अन्य विरोधी coagulants प्रवर्धन कदम के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है (यानी, हेपरिन) और हेमोलाइसिस ट्रिगर कर सकते हैं (यानी, साइट्रेट). के रूप में यह पूर्व विश्लेषणात्मक चरण में प्लेटलेट और लिम्फोसाइट संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, हम ट्यूब से प्लाज्मा को बहुत धीरे से हटा दिया और ट्यूब से नमूने के अंतिम ~ ५० μl महाप्राण नहीं था.

विभिंन अध्ययनों से पता चला है कॉलम आधारित निष्कर्षण तरीकों की श्रेष्ठता पर guanidine/phenol/क्लोरोफॉर्म-आधारित प्रोटोकॉल11,13, लेकिन khoury एट अल । प्रभावी रूप से अलग अच्छी गुणवत्ता सीरम से छोटे rnas ऐसे संदूषण के बिना अभिकर्मकों14. हम क्रमिक रूप से इस्तेमाल किया वाणिज्यिक किट दोनों निष्कर्षण तरीकों, स्पाइक सांद्रता के मामले में उपयुक्त mirna पैदावार की अनुमति करता है । हम केवल निर्माता के निर्देशों के संबंध में एक संशोधन किया, अर्थात्, ताजा संग्रह ट्यूबों हमेशा प्रत्येक फ़िल्टर कारतूस धोने कदम के बाद इस्तेमाल किया गया को खत्म करने/अभिकर्मक संदूषण के जोखिम को कम । हमारे नमूनों में एकाग्रता में सबसे अच्छा स्पाइक की पहचान करने के लिए और इस प्रकार बाद में प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए, हम पहली बार की औसत अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए निष्कर्षण कदम के दौरान cel-miR-३९ जोड़ने के बिना पूरे प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया हमारे लक्ष्य । हम तो एक ही रोगी के प्लाज्मा नमूनों से डी नोवो mirna निष्कर्षण प्रदर्शन cel-मीर-३९ के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा एकाग्रता की पहचान करने के लिए हमारे मामले श्रृंखला के प्लाज्मा नमूनों को जोड़ने के लिए (चित्रा 4). यह, तथापि, रेखांकित किया जाना चाहिए कि इष्टतम cel-मीर-३९ एकाग्रता, केवल एक नमूना के लिए पहचान की है, जरूरी नहीं कि आयु, लिंग या जीवन की आदतों के रूप में आंतरिक चर की एक श्रृंखला की वजह से समग्र मामले श्रृंखला के लिए सबसे अच्छा एकाग्रता हो सकता है, जो रक्त के भीतर निरपेक्ष mirna अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है ।

mirna रिवर्स प्रतिलेखन और प्रवर्धन 2 महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं । mirna का पता लगाने के लिए दो मुख्य तकनीकों मेंसे (यानी, qrt-पीसीआर और microarray), हम qrt-पीसीआर अपने उच्च संवेदनशीलता और हमारे mirna के केवल एक चयनित पैनल का मूल्यांकन करने की जरूरत दी चुना (इस पद्धति का एक प्रमुख सीमा है इसकी कम throughput)15। हम रिवर्स प्रतिलेखन रसायन विज्ञान के आधार पर 3 ' polya और 5 ' बंधाव अनुकूलक अनुक्रम परिपक्व mirna विस्तार और यूनिवर्सल आरटी primers की अनीलन परमिट के लिए इस्तेमाल किया । एकल आधार-जोड़ी मांयता के आधार पर, 5 ' बंधाव एडेप्टर से जुड़े उन के रूप में आम biases से बचने में मदद कर सकता है 5 बेमेल । इस किट में एक पूर्व प्रवर्धन कदम भी शामिल है जो कम उपज के नमूनों के लिए आवश्यक है, जैसे प्लाज्मा । हालांकि आवश्यक है, इस कदम का पता लगाने के कदम से पहले कुछ प्रवर्धन biases परिचय सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एंजियोजेनेसिस के साथ सहसंबद्ध 24 चयनित mirnas के एक पैनल का विश्लेषण किया । विशेष रूप से, हमने प्री-देखा जांच कस्टम प्लेट्स को चुना और इसके बाद क्यूआरटी-पीसीआर रन के निर्माता के निर्देशों का पालन किया । मिरना qrt-पीसीआर से संबंधित मुख्य मुद्दों संदर्भ जीन और उनके बाद के डेटा विश्लेषण सामांयीकरण के विकल्प हैं ।

हालांकि कई अध्ययनों को सामान्यीकरण के लिए उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा mirna की पहचान करने के लिए आयोजित किया गया है, कोई वर्दी आम सहमति तक पहुँच गया है. इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हम एक साहित्य खोज किया बाहर परिसंचारी mirnas कि हमारे मामले श्रृंखला में संदर्भ जीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान ।

हम भी mcrc रोगियों से प्लाज्मा नमूनों में स्थिर अभिव्यक्ति के मजबूत सबूत के साथ 4 mirnas का चयन किया और उन्हें हमारे मामले श्रृंखला के एक छोटे हिस्से में परीक्षण किया. 2 सबसे स्थिर mirnas संदर्भ हाउसकीपिंग जीन के रूप में genorm विश्लेषण द्वारा की पहचान की गई ।

अंत में, परिधीय रक्त के नमूनों में mirnas परिसंचारी का मूल्यांकन ज्ञात कठिनाइयों के एक नंबर है. हालांकि, हम मानते हैं कि हमारे द्वारा उपयोग किए गए तरीके विश्वसनीय और मजबूत हैं, जो इन बायोमार्कर के गहन और सटीक अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं, जो कोलोरेक्टल कैंसर के उपचार परिदृश्य को बदलने की क्षमता रखते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन को आंशिक रूप से roche स्पा और इतालवी दवाओं एजेंसी (aifa) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes Eppendorf 0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips Starlab S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips Starlab S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips Starlab S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit Thermo Fisher AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher A28007
100% ethanol anidrous ACS grade Carlo Erba Reagents 414605
2-mercapto-ethanol Sigma-Aldrich M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher 4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays Thermo Fisher A25576
7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes

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References

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