Antimikrobiyal sinerji mürekkep püskürtmeli yazıcı yoluyla tarafından test otomatik Dama Tahtası dizi ve el ile zaman-kill yöntem

Immunology and Infection
 

Summary

Antimikrobiyal sinerji test birlikte kullanılan iki veya daha fazla antibiyotik etkisini değerlendirmek için kullanılır ve genellikle iki yöntemden birini kullanarak gerçekleştirilir: Dama Tahtası dizi ya da zaman-kill tahlil. Burada, otomatik bir, mürekkep püskürtmeli yazıcı destekli Dama Tahtası dizi sinerji teknik ve bir klasik saat-kill sinerji çalışma mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yeni antimicrobials, gelişimi geride bıraktı oranları kökenlerinin dayanıklı (MDR) patojenlerin, yükselmeye devam ettikçe MDR bakteri tedavisinde yeni yaklaşımlar giderek bir zorunluluk haline. Böyle bir yaklaşım kombinasyon tedavisi, hangi iki veya daha fazla antibiyotik birlikte bir enfeksiyona karşı tedavi etmek için kullanılır hangi birini veya her ikisini ilaçlar tek başına etkisiz olabilir. Ne zaman birlikte, iki ilaç kullanmak daha büyük bir katkı etkisi onlar sinerjik kabul edilir. Sinerjik aktivitesinin in vitro soruşturma uyuşturucu kombinasyonları mümkün etkinliğinin değerlendirilmesinde önemli bir ilk adımdır. İki ana tüp bebek sinerji test yöntemleri geliştirilmiştir: Dama Tahtası dizi ve zaman-kill çalışma. Bu yazıda, biz bu bir otomatik Dama Tahtası dizi yöntemi mevcut verimlilik ve bu teknik, hem de bir çift el ile zaman-kill sinerji yöntemi doğruluğunu artırmak için mürekkep püskürtmeli baskı teknolojisi kullanır. El ile zaman-kill çalışma sinerjik etkinlik ve öldürme ek, tamamlayıcı veri sağlarken otomatik Dama Tahtası dizi yüksek üretilen iş tarama tahlil olarak hizmet verebilir.

Dama Tahtası dizi hangi bakteriler antibiyotikler, farklı konsantrasyon kombinasyonları ile inkübe ve büyüme inhibisyon gecede kuluçka sonra için değerlendirilen test, Standart minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) bir değişiklik olduğunu. El ile performans Dama Tahtası dizi hesaplamalar ve dilutions zahmetli ve hata eğilimli bir dizi gerektirir. Otomatik yönteminde, hesaplama ve birimleri mürekkep püskürtmeli yazıcı teknolojisi kullanımı yoluyla otomatik olarak gerekli antibiyotik hisse senedi çözümün dağıtımı sundu. Zaman-kill sinerji assay olarak, faiz, antibiyotiklerle birlikte ve ayrı ayrı inkübe bakteri ve kantitatif kültürü için 24 saat boyunca aralıklarla örnek. Sonuçları bir kombinasyonu sinerjik olup olmadığını ve bakteri yok edici olup olmadığını belirlemek ve veri inhibisyonu ve bakterilerin öldürülmesi zaman içinde sağlar.

Introduction

Kökenlerinin dayanıklı (MDR) bakteriyel patojenler, özellikle MDR Ayagin Gram-negatif bakteriler gibi carbapenem dirençli Enterobacteriaceae (CRE), yayılmasını klinisyenler için başarılı anti infective terapi giderek sınırlı seçenekleri ile terk etti 1, roman antibakteriyel ilaç bulma2,3durgun hızı tarafından şiddetlenir bir sorun. Antimikrobiyal sinerji, iki ilaç birlikte kullanılan bir katkı daha büyük etkisi uygulamak bile bu bakterilerin biri veya her ikisi için dayanıklıdır MDR bakteri, tedavisinde kullanılacak varolan antibiyotik salvaging imkanı sunar antibiyotik tek tek. Bu raporda açıklanan teknikleri, birlikte kullanıldıklarında test tüp bebek sinerji iki tamamlayıcı yöntemler sunar müfettişler verimli ekran antibiyotik kombinasyonları sinerjik unsuruna (otomatik için ilgi için izin Dama Tahtası array yöntemi) ve daha sonra daha fazla inhibisyonu ve umut verici kombinasyonları (elle yapılan zaman-kill yöntem) tarama aşamasında tespit gösterdiği öldürme Kinetik değerlendirmek için.

Dama Tahtası dizi tahlil tüp bebek sinerji test en sık kullanılan yöntemlerden biri, içinde iki farklı antibiyotik bir bakteriyel karşı inhibitör etkinliği izole minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) test bir değişiklik test konsantrasyon kombinasyonları4,5aralığında. İki ilaç birlikte kullanıldığında katkı etkinlik daha büyük uygulamayın, kombinasyonu sinerjik6kabul edilir. Ancak, bir Dama Tahtası dizi el ile ayarlama hesaplamalar ve zahmetli ve insan hatası karşı savunmasız sulandrarak ve pipetting adımları bir dizi içerir. Bu kısıtlamaları öncelikle antibiyotik kombinasyonları ve bakteriyel yalıtır az sayıda geriye dönük olarak değerlendirilmesi için test sinerji kullanımının sınırlanmasının etkisi vardı ve sonuçları her zaman çalışmaları7arasındatutarlı olmamıştır, 8,9,10,11. Ayrıca, sinerji sınama karmaşıklığını onun olarak kullanım dışı kalması Klinik Mikrobiyoloji laboratuvarında ve tüp bebek sinerji sınama verileri sanal yokluğu kombinasyon terapisi12, klinik çalışmalar için katkıda bulunmuştur 13.

Verimlilik ve Dama Tahtası dizi yöntem-in artırmak için biz daha önce mürekkep püskürtmeli baskı teknolojisi için tam olarak kullanır bizim laboratuvarda geliştirilmiş bir otomatik mikrofon test tekniği kullanmak ve sürekli küçük birimleri dağıtmak yaptı wells için yapılan bir microtiter içine antibiyotik hisse senedi çözümün14plaka. Platform karmaşık hesaplamalar ve birden çok pipetting adımı ihtiyacını namussuz. İlişkili yazılım hesaplar ve antibiyotik kullanıcı sade bir şekilde istenen konsantrasyon aralığı girişleri, bir iki boyutlu Dama Tahtası dizi oluşturmak için uygun birimler ve antibiyotikler hisse senedi çözüm konsantrasyonu dağıtır. Biz başlangıçta bu yöntem bir koleksiyon CRE yalıtır15 karşı test edilmiş ve daha sonra kolistin içeren kombinasyonlar faaliyetin, kolistin dayanıklı yalıtır16karşı test üzerinde odaklanmıştır. Kolistin MDR Ayagin Gram-negatif patojenlere17,18ve kolistin direnci tedavisinde genellikle için ayrılan son çare bir ilaç zaten onları ideal hale MDR bakteri neredeyse pan dayanıklı19, işler olduğunu adaylar için tek tek büyük küçük harf duyarlı oldukları uyuşturucu kullanan roman tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için. Kolistin ve protein sentezi inhibitörü antibiyotik Minosiklin ile birlikte sinerji, hatta kolistin bir subinhibitory giderek artan bağlı olduğundan tek tek, muhtemelen her bu ilaçların dayanıklı suşlar karşı çok yüksek oranda olduğu bulundu Hatta kolistin dirençli bakteriler üzerinde etkisi permeabilizing. Bir örnek bu kağıt olarak kullanmak için bu kombinasyon seçtik. Not, sinerji test aynı zamanda hem ayrı ayrı olan iki ilaç gelişmiş etkinlik için değerlendirmek için kullanılabilir.

Otomatik Dama Tahtası array yöntemi hızlı, yüksek üretilen iş sinerji test kolaylaştırır. Ancak, Dama Tahtası array yöntemi kısıtlamalar bulunmaktadır. Değiştirilmiş bir mikrofon tahlil olarak sadece Bakteriyel büyüme inhibisyonu ve öldürme değil üzerinde veri sağlar ve bu veriler üzerinde antibiyotik etkileri zaman içinde sağlamaz. Aksine, zaman-kill sinerji deneyleri el ile performansını daha fazla emek yoğun olmakla birlikte inhibisyonu ve öldürme üzerinde bir 24 h saat ders20,21bilgi sağlar. Biz zaman-kill analiz yalıtır daha küçük bir sayı üzerinde bizim Dama Tahtası dizi sonuçları onaylamak için ve biz tespit sinerjik kombinasyonları da bakteri yok edici olup olmadığını belirlemek için kullanılır.

Her iki Dama Tahtası dizi ve zaman-kill sinerji yöntem uyuşturucu kombinasyonları faaliyete değerli bilgiler sağlamak ve son derece dirençli bakteriyel patojenler için potansiyel yeni tedavi seçenekleri değerlendirilmesinde özellikle yararlıdır. Yöntemleri de içerdiği sınırlamaları var. Standart microbroth seyreltme mikrofon yöntemi iki ilaç birlikte bir Dama Tahtası dizide test edilirken yükselten 1 iki kat seyreltme22, bilinen beklenen hata yelpazesine sahiptir. Sinerjik bir arada sadece uyuşturucu birlikte dörtte biri onların anılan sıraya göre MICs6', etkin değilse dikkate bu alır dikkate alır sinerji standart tanımlı değişkenliği, (ki neden düşünülen böyle değişkenlik ama beklenen biyolojik ve teknik dalgalanmaları23bir arada gelen) kaçınılmaz kararsızca sinerji sonuçları güvenilirlik hakkında oluşturur. Sinerji testleri için kurulan kalite kontrol standartları eksikliği de geçerli bir kısıtlamadır. Belki de sinerji test yöntemlerinin en önemli sınırlama tüp bebek sonuçları ve klinik sonuçlar arasında kurulan ilişkiler eksikliği olduğunda kombinasyonları hastalar24tedavi etmek için kullanılır. Daha basit ve daha hızlı sinerji testi yöntemleri, burada açıklanan otomatik Dama Tahtası dizi yöntemi gibi tüp bebek sinerji klinik veya hasta sonuçları diğer değerlendirme içinde daha iyi test entegrasyonu kolaylaştırmak Tüp Bebek ve içinde vivo etkileri gelecekte arasındaki ilişkiyi tanımlamak.

Burada mevcut otomatik Dama Tahtası array yöntemi kombinasyonları çeşitli yüksek üretilen iş tarama için bir seçenek sunar ve sıradışı, "yüksek risk-ödül yüksek" kombinasyon zaman büyük bir yatırım yapmadan hızlı değerlendirme sağlar ve kaynaklar. Biz daha sonra göstermek, zaman-kill yöntem kombinasyonu sinerjik faaliyete ek destekleyici bilgiler sağlar ve onun bakterisidal etkinlik ve antibakteriyel Kinetik karakterize etmek için yardımcı olabilir.

Protocol

Uyarı: Uygun güvenlik prosedürleri bakteri ile çalışırken kullanın. Her zaman eldiven ve önlük giymek. İş bir biyogüvenlik aerosoller oluşturursa dolap ya da yüksek riskli patojenler ile çalışma gerçekleştirin.

Not: Yirmi-24 h çizgi (Stoktan tryptic soya suyu % 50 gliserol hisse senedi ile-80 ° C arasında dondurulup bir koloni saf, en az pasajlı) bir kan agar tabağa test edilecek bakteriyel isolate(s) dışarı deneyler, başlamadan önce. 35 ° c ortam havası içinde plaka kuluçkaya.

1. mürekkep püskürtmeli yazıcı destekli otomatik Dama Tahtası dizi sinerji

  1. Antimikrobiyal hisse senedi Çözümleri (kolistin ve Minosiklin) olun.
    1. Antibiyotik hisse senedi çözüm konsantrasyonları antibiyotik çözünürlük üzerinde dayalı ve Dama Tahtası dizideki son konsantrasyonları istenen belirler. 10 mg/mL stokları kolistin ve Minosiklin Bu örnek için yapmak. CLSI M100 belge her antibiyotik25için uygun maddeleri belirlemek için kullanın. Kolistin ve Minosiklin suda çözünebilir. D300 mürekkep püskürtmeli yazıcı düzgün sulu akışkan için yüzey aktif ilavesi gerektirdiğinden, antibiyotik ultrasaf deiyonize su ile % 0.3 polysorbate 20 geçiyoruz.
    2. Bir analitik denge kullanarak antibiyotik tozu tartmak ve hedef hisse senedi toplama almak için gerekli solvent hacmi hesaplamak.
      1. Antibiyotik bir tuz (kolistin sülfat, Minosiklin hidroklorid) olarak mı yoksa sulu formu (örneğin meropenem trihidrat) belirttiğinizde veya üretici tarafından raporlanırsa daha az için %100 saflıkta, bir güç hesaplama-26 gerçekleştirmek solvent gerekli sayısını belirle.
      2. Bu örnek, Minosiklin hidroklorür 900 mg/mg belirtilen bir saflığı ile izleyin:
        Tahlil saflık: 900 mg/mg
        Su içeriği: hiçbiri
        Etkin kesir: (Minosiklin (457.48 Da) molekül ağırlığı Minosiklin hidroklorür (493.94 Da) tarafından Moleküler ağırlığına bölünerek) 0.926.
        KUDRET (tahlil saflık) = * (1-su içeriği) * (etkin kesir)
        (900 mg/mg) = * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg veya %83.34
        Sonra aşağıdaki gibi gerekli solvent birimi belirleyin:
        Hacmi (mL) = [ağırlığı (mg) * kudret (mg/mg)] ÷ [konsantrasyon (mg/mL)]
        Minosiklin hidroklorür tozu 34,7 mg ağırlığını koydu, böylece, örneğin, aşağıdaki hesaplama 10 mg/mL solüsyon yapmak için gereken solvent hacmi belirlemek için kullanın:
        Hacmi = (34,7 mg) * (833.4 mg/mg) 2.89 mL =
        10,000 mg/mL
    3. Antibiyotik tozu 15 mL konik tüp içine dökün ve su artı % 0,3 polysorbate 20 uygun hacmi ekleyin. Girdap eriyene kadar.
    4. Aliquot antibiyotik hisse senedi çözümde 0.5 mL microcentrifuge tüpler ve mağaza-80 ° c kadar kullanım için hazır.
  2. Kalite kontrol (QC) antibiyotik stoklarının kullanılmak üzere Dama Tahtası dizi deneyler QC sonuçları sinerji test etmek için hisse senedi kullanmadan önce değerlendirilebilir böylece sinerji test önce en az bir gün gerçekleştirmek.
    NOT:
    Burada açıklanan QC tekniği minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) bireysel ilaçların test etmek için kullanılacaktır ve bu nedenle herhangi bir suş araştırmacı ilgi ile kullanılan tekniği aynıdır.
    1. Bakteriyel süspansiyon hazırlamak.
      1. Bakteriyel süspansiyon hazırlarken çözdürme başlatmak için-80 ° C dondurucu çöpten bir aliquot her antibiyotik stokunun alın. Antibiyotik çözüm olduğundan emin olmak için bir kez çözdürülen girdap.
      2. Uygun bir QC zorlanma seçin ve test edilen uyuşturucu için kabul edilen mikrofon aralığı tablo 5A-1 üzerinde CLSI M10025bağlı olarak belirler. Burada ilaç, E. coli ATCC 25922 kullanın; Bu zorlanma için mikrofon aralıkları olan 0,25-1 mg/mL Minosiklin ve 0,25-2 mg/mL kolistin için.
      3. Antibiyotik konsantrasyonları test etmek için tüm QC aralığı içeren aralığı seçin. 0.0156 mg/mL 8 mg/ml aralığını Minosiklin ve kolistin ATCC 25922 için kullanın.
      4. 1 mL % 0,9 Sodyum Klorür bir 12 x 75 mm yuvarlak alt cam kültür tüp ekleyin. Bir ya da iki kolonileri gecede saçtan ATCC 25922 ve girdap yavaşça askıya seçin.
      5. McFarland reader'ı kullanarak bakteri konsantrasyonu kontrol edin. Okuma bir 0.5 McFarland bulanıklık elde etmek için daha fazla % 0,9 Sodyum Klorür ya da daha fazla bakteri ekleyerek gereken şekilde ayarlayın.
      6. 1:300 seyreltme 0.5 McFarland süspansiyon 100 mL süspansiyon ba *-düzeltilir Mueller Hinton suyu (CAMHB) 5 x 105 CFU/mL, son hücre yoğunluğu ulaşmak için 50 mL konik tüp içinde 30 ml CLSI27tarafından tavsiye edilen şekilde ekleyerek getirin.
      7. Steril bir inoculating döngü, yalıtım çizgi başlangıç inoculum inoculum saflık onaylayın ve 35 ° c ortam havası içinde kuluçkaya kan agar plaka üzerine bir damla kullanarak.
    2. Antimicrobials D300 kullanarak bir düz dipli, kare-Peki, açık, tedavi edilmemiş 384-şey plaka için ekleyin. Süspansiyon plakaları hazırlık2615 dk içinde eklenebilir böylece hemen bakteriyel süspansiyon hazırladıktan sonra bu adımı gerçekleştirin.
      1. D300 mürekkep püskürtmeli yazıcı ve ilişkili bilgisayar açın. Yazılım programını açın.
      2. Yeni bir dosya başlatın. Görüntü plaka kılavuzunun üzerinde plaka 1 üzerinde sağ tıklatın ve plaka Düzenleseçin. Uygun plaka türünü (384 iyi) ve ek birim (50 mL) seçin.
      3. Sıvıları (yani, antibiyotik hisse senetleri) protokole sol panelde sıvıları yanındaki artı işaretini tıklatarak ekleyin. İki sıvı (kolistin ve Minosiklin) ekleyin.
        1. Sıvı 1 için çıktı panelinin üzerine gelin ve kalem düzenlemek için tıklatın. Sıvı "Kolistin" adı, sınıf değiştirme "sulu + ara 20", konsantrasyon 10.000 değiştirin ve konsantrasyon birimleri-e doğru mg/mL (hisse senedi toplama 10 mg/mL, yani bir not, 10,000 mg/mL) değiştirin. Besleme by konsantrasyon bırakın ve alanlarda varsayılan ayarlarına geri kalanı bırakın. Tamam' ı tıklatın.
        2. Sıvı 2 (Minosiklin) için yukarıdaki yordamı yineleyin.
        3. Ekranın en üstündeki Geçerli protokol sekmesini tıklatın ve son de antibiyotik konsantrasyonları için kullanılan birimleri belirlemek için mg/mL konsantrasyonu (kütle) değiştirin.
      4. 10 kuyu kılavuzda tıklatıp sürükleyerek seçin, ardından titrasyon ekranın üst kısmında. Titrasyon belirt kullanarak en yüksek konsantrasyonu, sıvı için kolistinseç, En yüksek konsantrasyon 8 girin (mg/mL birimleridir emin olun) ve dağıtım için 1:2 (% 50)seçin. Değerleri pencerenin geri kalanı için yerleştirin ve Tamam' ı tıklatın varsayılan bırakın.
      5. Minosiklin Minosiklin titrasyon oluşturmak için yukarıdaki yordamı yineleyin.
      6. Kullanılacak protokol kaydetmek ve sonra sol üst Çalıştır düğmesini tıklatın.
      7. Başlat düğmesini tıklatın. 384-şey plaka plaka yuvasına (kaldırıldı kapaklı) yüklemek ve Loaded "Yükleme plakası 1 – sinerji" altında komut istemi tuşuna basın.
        Not: Bu istem yazılım tarafından seçilir ve sinerji test gerçekleştirilmekte olduğunu göstermez. T8 + kaset kaset yuvasına yerleştirin ve Loaded yük T8 + kaset altında komut istemi tuşuna basın.
      8. İstendiğinde, belirtilen rezervuarlar kasetin antibiyotik hisse senedi çözüm ekleyin. Uygun yükleme için ekrandaki yönergeleri izleyin ve çözümde herhangi bir kabarcık önlemek için dikkatli bir şekilde dağıtmak. Her çözüm eklendikten sonra dolu düğmesine basın.
      9. Mürekkep püskürtmeli yazıcı her şey ve Tamamlanan Çalıştır kutusuna uygun birimler antibiyotik stokta görünüyor ekledi sonra Kapat' ı tıklatın, plaka kaldırmak ve D300 açmak.
    3. Bakteriyel süspansiyonlar 384-şey plakasına eklemek ve plaka kuluçkaya.
      1. Önceden hazırlanmış bakteriyel süspansiyon bir steril reaktif rezervuar dökün.
      2. Bir çok kanallı pipet bakteriyel süspansiyon 50 mL tüm antibiyotik içeren wells için eklemek için kullanın. CAMHB 50 mL bakteri olmadan boş bir kuyuya ekleyin; Bu negatif kontrol olacak de kısırlık medya onaylamak için.
      3. Plaka 35 ° C ortam havası kuluçka makinesine koyun ve 16-20 h26için kuluçkaya.
        Not: Organizmalar Enterobacteriaceae diğer test edilen farklı bir kuluçka süresi gerekli olabilir; CLSI M10025 organizma özgü öneriler için başvurun.
    4. Plaka üzerinde bir optik yoğunluk 600 (OD600) bir Mikroplaka okuyucu okumak ve sonuçları analiz.
      1. Shade hücreleri ≥0.07 yeşil, büyüme ve hücre değeri gösteren bir OD600 değerini içeren bir elektronik tablo programı kullanmanız, < 0,07 hiçbir büyüme gösteren kırmızı.
        Not: Bu değerleri görsel muayene vs yok büyüme ve OD okumaları için bu deneyler ile korelasyon büyümenin temel belirlenmiştir; OD600 okuma ortamı yalnız içeren kuyulardan sürekli 0,07 vardı. Uygun cutoffs farklı plaka okuyucu ve bakteri ile farklı olabilir.
      2. Her ilaç için mikrofon belirlemek. Mikrofon, Bakteriyel büyüme inhibe ilaç en düşük bölgedir. Mikrofon CLSI M100 belge25göre beklenen QC aralığında ise, hisse senedi çözüm kullanım için uygundur.
  3. Bakteriyel süspansiyon Dama Tahtası dizi için hazırlayın.
    1. Bakteriyel süspansiyon hazırlarken çözdürme başlatmak için-80 ° C dondurucu çöpten bir aliquot her antibiyotik stokunun alın. Antibiyotik emin olmak için bir kez çözdürülen girdap çözümdür.
    2. ~ 1 mL % 0,9 Sodyum Klorür bir 12 x 75 mm yuvarlak alt cam kültür tüp ekleyin. Bir ya da iki koloninin bir gecede tabak bakterilerde (Bu durumda, e.coli suşu FDA-CDC 0494) ve girdap yavaşça bu % 0,9 Sodyum Klorür askıya almak için seçin.
    3. McFarland reader'ı kullanarak bakteri konsantrasyonu kontrol edin. Okuma bir 0.5 McFarland bulanıklık elde etmek için daha fazla % 0,9 Sodyum Klorür ya da daha fazla bakteri ekleyerek gereken şekilde ayarlayın.
    4. CAMHB 30 ml 5 x 105 CFU/mL27son hücre yoğunluğu ulaşmak için bir 50 mL konik tüp 100 mL süspansiyon ekleyerek 0.5 McFarland süspansiyon 1:300 seyreltme yapın.
  4. Antimicrobials D300 kullanarak bir düz dipli, kare-Peki, açık, tedavi edilmemiş 384-şey plaka için ekleyin.
    Not:
    süspansiyon plakaları için hazırlık2615 dakika içinde eklenebilir böylece hemen bakteriyel süspansiyon hazırladıktan sonra bu adımı gerçekleştirin.
    1. İnkjet Yazıcıyı açın, yeni bir dosya başlatmak ve Protokolü olduğu gibi adımları 1.2.2.1-1.2.2.3 sıvı ekleyin.
    2. Sinerji kılavuz oluşturmak.
      1. Ekranın en üstündeki sinerji simgesini tıklatın ve adım adım devam edin. Türü için iki veya daha fazla sıvı birlikte çarpanlarınaseçin. Plakaiçin herhangi bir kuyu dışlamak gerekli değildir; Bu adım üzerinde değişiklik yapmadan'u tıklatın.
      2. Titrasyon sekmesinde antibiyotik konsantrasyonları ve yerleşim girin.
        1. Minosiklin 0,031 mg/ml, y ekseni aşağı yok antibiyotik ile negatif bir de ek olarak 32 den katlama dilutions göre azalan düzende eklemek için sol panelinde titrasyon düzeyleri için 12 girin. Titrasyon belirt kullanarakiçin en yüksek konsantrasyon seçin; için sıvı, Minosiklin seçin; en yüksek konsantrasyonu, (birimi mg/mL ayarla; Eğer değilse, Synergy iletişim kutusunu kapatın ve Geçerli protokol sekmesi altında değiştirmek emin olun) 32 değerini girin. 0 dahil değer kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Dağıtım 1:2 (% 50) yapın.
        2. Kolistin sağ panelde 12 titrasyon seviyeleri ve 16 yüksek bir konsantrasyon kullanma için bu adımları yineleyin. İleri' yi tıklatın.
      3. Düzen sekmesinde, satırlar ve sütunlar halinde bir düzen kılavuzu sayısı ilk 2 sıvıların titrasyon düzeylerini belirlemekseçin. İleri' yi tıklatın. Izgarayı beklendiği gibi beliriyorsa, son' u tıklatın.
    3. İletişim kuralı kaydedin, sonra sol üst Çalıştır düğmesini tıklatın.
    4. Başlat düğmesini tıklatın. 384-şey plaka plaka yuvasına (kaldırıldı kapaklı) yüklemek ve Loaded yük plaka 1 – sinerji altında komut istemi tuşuna basın. T8 + kaset kaset yuvasına yerleştirin ve Loaded yük T8 + kaset altında komut istemi tuşuna basın.
    5. İstendiğinde, belirtilen rezervuarlar kasetin antibiyotik hisse senedi çözüm ekleyin. Uygun yükleme için ekrandaki yönergeleri izleyin ve çözümde herhangi bir kabarcık önlemek için dikkatli bir şekilde dağıtmak. Her çözüm eklendikten sonra dolu düğmesine basın.
    6. D300 dağıtıcı her şey ve Tamamlanan Çalıştır kutusuna uygun birimler antibiyotik stokta görünüyor ekledi sonra Çıkış' ı tıklatın, plaka kaldırmak ve D300 açmak.
  5. Bakteriyel süspansiyonlar 384-şey plakasına eklemek ve plaka kuluçkaya.
    1. Önceden hazırlanmış bakteriyel süspansiyon bir steril reaktif rezervuar dökün.
    2. Bir çok kanallı pipet Dama Tahtası dizideki bütün wells 50 mL süspansiyon eklemek için kullanın. CAMHB 50 mL bakteri olmadan boş bir kuyuya ekleyin; Bu negatif kontrol olacak de kısırlık medya onaylamak için. 16-20 h2635 ° C ortam havası kuluçka kuluçkaya.
  6. Mikroplaka okuyucu OD600 plaka okumak ve Dama Tahtası dizi sonuçları analiz.
    1. İlk olarak, saflık plaka kontrol ve izole koloniler, test edilen organizma beklenen morfolojisi ile tutarlıdır tek bir kara delik olduğundan emin olun.
    2. Bir elektronik tablo programı kullanmanız, shade hücreleri büyüme ve gelişme yok adım 1.2.4.1 olduğu gibi göstermek için.
    3. Her ilaç için mikrofon belirlemek. Test en yüksek konsantrasyonu, Bakteriyel büyüme inhibe etmez bir uyuşturucu için mikrofon ölçekli kapalı olarak kabul edilir.
    4. İçinde büyüme inhibe her şey için antibiyotik 's MIC dayalı her antibiyotik için kesirli inhibitör konsantrasyonu (FIC) belirlemek (bkz: şekil 1B ve şekil 2B).
      Not: FIC antibiyotik büyüme onun mikrofon engellenir bir iyi konsantrasyon oranıdır; bir de içeren 4 mg/mL bir FIC 0,5 varken 8 mg/mL bir mikrofon ile bir ilaç için bir FIC 1, bu ilaçtan bir de içeren 8 mg/mL sahiptir, bu nedenle.
    5. Her şey içinde büyüme her birinin o kadar iyi ilaçları FICS toplamı olarak inhibe kesirli inhibitör konsantrasyon (FICben) dizin değeri hesaplamak.
    6. Büyüme olduğu en düşük FICben (minimum FICben) inhibe belirlemek. En az FICben £0.5, kombinasyonu sinerjik göz önünde bulundurun; Eğer 0.5-4, kasanın kayıtsız; düşünün ve eğer > 4, kasanın antagonistik düşünün. Kombinasyonu sinerjik ama uzlaşmaz, diğer bazı konsantrasyon kombinasyonları, ise, bu sonucu Not ama kasanın genel olarak antagonistik düşünün.

2. zaman-kill sinerji testi

  1. Antimikrobiyal hisse senedi çözümler olun. Deney öncesinde bu adımı gerçekleştirilirse, kullanım için hazır kadar stokları-80 ° C'de dondurmak.
    1. Antibiyotik hisse senedi çözüm konsantrasyonları antibiyotik çözünürlük üzerinde dayalı ve zaman-kill çalışmalar son konsantrasyonlarda istenen belirler. Bu örnekte, kolistin ve Minosiklin stokları bir konsantrasyonu 1 mg/ml olun. CLSI M100 belge her antibiyotik25için uygun maddeleri belirlemek için kullanın. Su, kolistin ve Minosiklin için tavsiye edilen şekilde kullanmanın.
    2. Analitik dengesi kullanarak antibiyotik tozu tartmak ve hedef hisse senedi toplama almak için gerekli solvent hacmi hesaplamak. Gerekirse, önce 1.1.2.1 yukarıdaki adımda açıklandığı gibi gerekli, solvent miktarı belirleme kudret hesaplama yapmak.
    3. Antibiyotik tozu 15 mL konik tüpler dökün ve uygun su hacmi ekleyin. Girdap eriyene kadar.
  2. CLSI M0726' da açıklanan el ile suyu microdilution yöntemini kullanarak gerçekleştirmek antimikrobiyal QC stokları kullanılmak üzere zaman öldürmek sinerji deneyler. En az bir gün önce QC sonuçları hisse senedi kullanmadan önce gözden geçirilmesi test sinerji bu adımı gerçekleştirin.
    1. Uygun bir QC zorlanma seçin ve test edilen uyuşturucu için kabul edilen mikrofon aralığı tablo 5A-1 üzerinde CLSI M10025bağlı olarak belirler. Burada ilaç, E. coli ATCC 25922 kullanın; Bu zorlanma için mikrofon aralıkları olan 0,25-1 mg/mL Minosiklin ve 0,25-2 mg/mL kolistin için.
    2. Antibiyotik içeren suyu microdilution tabak hazırlamak.
      1. Tüm QC aralığı dahil edilebilir böylece test önlemek için en yoğun seçin. Bir dizi 0.016-8 mg/mL Minosiklin ve kolistin ATCC 25922 için kullanın.
      2. İki kez (seyreltilmiş 1:1 askı bakteri ile olacak çünkü) gerekli en yoğun CAMHB içinde çalışan bir çözüm için antibiyotik hisse senedi sulandırmak. Bu örnekte, her iki hisse senetleri 10 mg/mL den 16 mg/ml seyreltik.
      3. Bir çok kanallı pipet kullanarak, bir de açık, yuvarlak-alt, tedavi edilmemiş 96-şey plaka ilk sütunda her 2 antibiyotik süspansiyonlar x 100 mL ekleyin ve sonraki sütun her şey için (yani, olmadan antibiyotik) düz suyu 50 mL ekleyin.
      4. 50 mL antibiyotik içeren kaldırmak suyu her şey ilk sütunda ve kuyu ikinci sütuna ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez antibiyotik bir konsantrasyon üreten içeriği, yarısını karıştırın bu ilk sütunda konsantrasyon.
      5. Bir dizi seri iki kat dilutions, her biri 50 mL, hacmi hazırlıklı 2.2.2.4 her sütun ile yineleyin. Değişiklik pipet antibiyotik ertelenmiş olasılığını ortadan kaldırmak için istenirse arasında her seyreltme adım ipuçları. Onlar daha sonra bakteriyel süspansiyon ile seyreltilmiş 1:1 olacak gibi sonuç konsantrasyonları tüm hala 2 x son konsantrasyonları olduğunu unutmayın.
      6. Bunlar negatif ve büyüme denetim sütun olarak herhangi bir antibiyotik son iki sütun için eklemeyin.
    3. Bakteriyel süspansiyon hazırlamak.
      1. Bir gecede plaka E. coli ATCC 25922 %0,9 Sodyum Klorür 0.5 McFarland süspansiyon adımları 1.2.1.5-1.2.1.6 açıklandığı şekilde hazırlayın.
      2. 1:150 seyreltme 0.5 McFarland süspansiyon CAMHB için 7,5 mL 50 mL süspansiyon ekleyerek getirin.
        Not: 5 x 105 CFU/mL27CLSI önerilen hücre yoğunluğu ulaşan antibiyotik çözüm ile 1:1 karışınca son bakteriyel süspansiyon seyreltilmiş 1:300 olacak).
    4. Mikroplaka için bakteri ekleyin ve kuluçkaya.
      1. Bakteriyel süspansiyon 50 mL her şey için 11inci sütununda dışında ekleyin. CAMHB 50 mL 11inci sütun (negatif kontrol sütun) ekleyin.
      2. Plaka 16-20 h için 35 ° C'de kuluçkaya.
        Not: Organizmalar Enterobacteriaceae diğer test edilen farklı bir kuluçka süresi gerekli olabilir; CLSI M10025 organizma özgü öneriler için başvurun.
      3. Görsel olarak iletilen ışık kullanarak büyüme için plaka okuma ve her antibiyotik için hiçbir büyüme olduğu en düşük konsantrasyonu belirlemek; Bu mikrofon var. Mikrofon26görsel yorumlanması hakkında daha fazla ayrıntı için CLSI M07 belgelerine başvurun. Mikrofon beklenen QC aralığındaysa, hisse senedi kullanım için uygun çözümdür.
  3. İlk kültür başlatın.
    1. Bir 0,5 yapmak McFarland süspansiyon test organizmanın steril % 0,9 NaCl olarak yukarıda açıklanan.
    2. McFarland süspansiyon CAMHB 5 ml 25 x 150 mm cam alt kültür tüp ile paslanmaz çelik kapanması ve karışımı yavaşça girdap yuvarlak 0,5 100 mL ekleyin.
    3. Steril bir inoculating döngü, yalıtım çizgi seyreltilmiş süspansiyon inoculum saflık onaylamak ve 35 ° c ortam havası içinde kuluçkaya için kan agar plaka üzerine bir damla kullanarak.
    4. Tüp kapatma değiştirin ve logaritmik faz büyüme (bkz. Adım 2.6.1) ulaşılana kadar en az 3 h için bir shaker-35 ° c ortam havası içinde bir test tüpü raf içinde kuluçkaya. Kültür da kuluçka makinesine ise 2.4 adıma geçin.
  4. Antimikrobiyal çözümlerinde 25 x 150 mm cam kültür tüpleri hazırlayın.
    1. Antimikrobiyal hisse senedi aliquots-80 ° C dondurucudan çözülme almak. Antibiyotik emin olmak için bir kez çözdürülen girdap çözümdür.
    2. İlk kültür kuluçka, beş autoclaved 25 mm x 150 mm cam kültür tüpleri için CAMHB 10 mL ekleyin ve antimikrobiyal hisse senedi çözümleri aşağıdaki gibi ekleyin.
      Not: Bir sinerji çalışması için en az bir uyuşturucu olmalıdır büyüme etkilemez bir konsantrasyon tek tek28; eğri Bu bireysel ilaç konsantrasyonları sinerji çalışma öncesinde etkileri değerlendirilerek belirlenir.
      1. Tüp 1: hedef son antibiyotik konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik # 1 uygun miktar ekleyin. Bu durumda, bu bu örnekte kullanılan zorlanma karşı etkisiz bir konsantrasyon gibi bir son kolistin konsantrasyonu 1 mg/mL, elde etmek için 1 mg/mL kolistin stokunun 10 mL ekleyin.
      2. Tüp 2: antibiyotik # 2 test edilmesi için son antibiyotik konsantrasyon elde etmek için uygun miktar ekleyin. Bu durumda, son konsantrasyonu 1 mg/mL, bu örnekte kullanılan zorlanma karşı etkisiz bir konsantrasyon elde etmek için 1 mg/mL Minosiklin stokunun 10 mL ekleyin.
      3. Tüp 3: aynı miktar antibiyotik antibiyotik #1 ve # 1 ve 2 tüplerde kullanılan 2 ekleyin. Bu durumda, 1 mg/mL Minosiklin stokunun 10 mL ve 1 mg/mL kolistin stokunun 10 mL ekleyin.
      4. Tüp 4: yok antibiyotik ekleyin; Bu büyüme denetim tüp olacak.
      5. Tüp 5: yok antibiyotik ekleyin; Bu negatif kontrol tüp olacak.
  5. 2 mL wells ile 96 derin de polipropilen levhalar için satırları B-H sütunları 1-5 ile çok kanallı pipet steril % 0,9 Sodyum Klorür 900 µL ekleyerek seri dilutions için hazır olun.
  6. Başlangıç inoculum hazırlamak ve tüpler için ekleyin.
    1. Bir kez ilk kültür Logaritmik büyüme aşaması ( Klebsiella pneumoniae, bu örnekte kullanılan organizma için ~ 3 h) ulaştı, kültür tüpü çıkarması shaker girdap yavaşça, transfer ~ 1 mL süspansiyon, bir 12 x 75 mm cam kültür tüp ve yoğunluk McFarland okuyucu ile kontrol edin.
      1. Az 1.0 McFarland, tüp shaker için dönmek ve artık kuluçkaya. 1.0 McFarland fazla olursa, CAMHB tüp, eklemek girdap yavaşça ve süspansiyon 1.0 McFarland olana işlemi yinelenen yeniden örnek,.
    2. 100 mL tüpler 1-4 için 1.0 McFarland süspansiyon ve girdap yavaşça ekleyin.
  7. Örnek aliquots her kültür ve seri panolarında dilutions gerçekleştirin.
    1. (Hemen bakteri tüpler için ekledikten sonra) 0 ve 1, 2, 4, 6 ve 24 h, 150 mL aliquot yalnızca steril pipet ucu tüp ve Hayır pipettor mil aliquot çekilmesi sırasında girer böylece tüp eğerek her kültür tüpünden kaldırın. Aliquots, sırasıyla, önceden hazırlanmış 96 derin kuyu plaka ilk satırdaki ardışık wells ekleyin. Tüpler bir tüp raf bir shaker 35 ° C ortam havası kuluçka hemen aliquots, her zaman bir noktada çıkardıktan sonra döndürür.
    2. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 100 mL A satırdan kaldırmak (900 mL % 0,9 Sodyum Klorür içeren) B Satır Ekle ve aşağı yukarı 4 - 5 kere-pipet karışımı, 1:10 oluşturma seyreltme. Ertelenmiş bakterilerin yanlışlıkla yükseltilmiş koloni sayıları için açabilir önlemek için her seyreltme adım takip ipuçları atmak.
    3. Her satır için yeni pipet ipuçları içeren satırları B-H için 2.7.2 arasındaki adımları yineleyin.
  8. Plaka örnekleri için açılan plaka yöntemi29,30kullanarak koloni sayıları seyreltilmiş.
    1. Mueller Hinton agar levha kaplama için seyreltme ve antibiyotik koşulları ile etiketleyin.
    2. Bir çok kanallı pipet ve ekstra uzun ipuçları (ipuçları süspansiyon ulaşmak) sağlamak için kullanarak, her sütun bir kuyuya 10 mL kaldırmak ve dikkatli bir şekilde üst üste uygun şekilde etiketlenmiş plaka üzerine dağıtmak. Küçük (100 mm çap) plakalar kullandıysanız, 3 satır (her damla tek bir sütun A-H satırlardan oluşan) plaka dağıtmak; büyük (150 mm çapında) Tabaklarda plaka başına 8 satır dağıtmak.
    3. Tamamen kurumasını damla izin (~ 15 dk).
    4. 24 h doğrudan negatif kontrol tüp bir plakaların belirtilen bir alanda kısırlık için test etmek için alınan bir 10 mL damla yerleştirin. Tabak ters çevir ve gecede 35 ° c ortam havası içinde kuluçkaya.
  9. Kolonilerin sayımı ve hücre yoğunluğu hesaplayın. Koloniler ince uçlu kalıcı bir kalem çift sayma veya eksik kolonileri önlemek için plaka ters WITH mark.
    1. İlk olarak, saflık plaka kontrol ve izole koloniler, test edilen organizma beklenen morfolojisi ile tutarlıdır tek bir kara delik olduğundan emin olun.
    2. Her seyreltme dizi için damla 3-30 koloniler (genellikle bir damla seyreltme seri başına) tanımlar. Bu damlalar kolonilerde saymak ve sayımın seyreltme faktörü ile birlikte kaydedin.
      1. Bir seyreltme dizisinde yok damla 3-30 koloniler ile varsa, son damla ile kolonilerde saymak > 30 kolonileri ve ilk damla ile < 3 kolonileri (Bunlar bitişik damla olmalıdır).
    3. Her seyreltme serisi için aşağıdaki formülü kullanarak açılan kolonilerde sayısını temel alan örnekteki mililitre (CFU/mL) başına birim oluşturan colony sayısını hesaplayın: CFU/mL n= (1 /d) (100) n koloniler, sayısı olduğu d olduğunu seyreltme faktörü (su katılmamış örnek (a satır) için 1, 0,1 veya 10-1 ilk 1:10 seyreltme (satır B), 0.01 veya 10-2 ikinci 1:10 seyreltme (satır C) ve benzeri ve aslında sürekli 100 hesaplar Bu açılan toplam hacmi ben s 10 son değeri CFU/mL, yani, CFU/1000 mL ifade ederken mL. CFU/mL bu işlemi basitleştirmek için koloni sayısını hesaplayan formüller içeren bir elektronik tablo kullanın.
      1. Burada fazla bir damla sayılabilir (veya nerede çünkü sayılması iki damla vardı hiçbir aralığında düşmüş) seyreltme serisi için ortalama son CFU/mL için tüm sayılan damla sayar.
      2. Algılama alt sınırı 300 £ CFU/mL vardır seyreltme serisinin olarak 300 CFU/mL (içinde belgili tanımlık su katılmamış damla 3 kolonileri), kayıt ve arsa koloni sayımı olduğundan < 3 kolonileri içinde belgili tanımlık su katılmamış damla.
    4. Kısırlık denetim damla zaman 24 incelemek; Eğer herhangi bir büyüme bu düşüş görülmektedir, denemenin sonuçları kullanılmamalıdır.
  10. Grafik ve sonuçları çözümleyebilirsiniz.
    1. Büyüme eğrileri üç antibiyotik içeren kültürler ve aynı grafik üzerinde büyüme denetimi çizmek. X ekseni ve CFU/mL, Logaritmik ölçek, y ekseni üzerinde kullanarak zaman işaretlemek.
    2. Zaman 24 kombinasyon tüp ve en aktif tek Aracısı zaman 24 CFU/ml farkı hesaplar. Fark ≥2 günlük10kombinasyonu sinerjik düşünün. Sonra CFU/mL 24 saat ve zamanda 0 kombinasyonu tüp arasındaki farkı hesaplar. Farkı ≥3 günlük10kasanın bakterisidal düşünün.

Representative Results

Şekil 1A bir Dama Tahtası dizi sinerji deneme yılında hangi Minosiklin 0-32 konsantrasyonlarda μg/mL 0-16 μg/ml konsantrasyonlarda kolistin ile birlikte ve e.coli suşu FDA-CDC 0494 karşı test bir kılavuz sunar. Değerler spektrofotometrik ölçümler, optik yoğunluk 600 nm (OD600) temsil eder. Wells (ki hiçbir büyüme için karşılık gelen görsel denetim tarafından) 0,07 altındaki OD600 değerler ile gölgeli kırmızı, OD600 değerleri (Bu büyüme için karşılık gelen görsel denetim tarafından) 0,07 Wells'le gölgeli yeşil ayrılmıştır. Her için minimum inhibitör konsantrasyonu (mikrofon; kalın) bakterilerin büyüme inhibe ilaç en düşük konsantrasyon ilaçtır. Minosiklin için bu 32 μg/mL ve kolistin için bu 8 μg/mL'dir. Gölgelendirme şekil 1Badımında korunur, ancak içinde büyüme inhibe kuyu içindeki değerleri kesirli inhibitör konsantrasyon (FICben) dizin değerleriyle değiştirilir. Bunlar aşağıdaki gibi belirlenir: her şey, her ilaç kesirli inhibitör konsantrasyon dizin (FIC) ilacın mikrofon tarafından antibiyotik o kadar iyi konsantrasyon bölünerek hesaplanır ve FICben iki FICS toplayarak hesaplanır. Bir kırık çizgili kenarlığı ile Wells bir FICben değerini kesme sinerji için kabul edilir, 0,5 ile belirtilir ve en düşük FICben değeri (0.094) ile iyi kalın olduğunu. Ben en az FIC değer sinerjik aralığında olduğundan kombinasyonu sinerjik olarak kabul edilir.

Şekil 2A ve şekil 2B'yi göstermek Izgaralar şekil 1A ve şekil 1Bbenzer, ancak bu durumda kombinasyon sinerji karşı test izole (K. pneumoniae izole BIDMC 4), çünkü göstermek yok değil hangi büyüme inhibe en az FICben olduğunu 1 > 0,5.

Şekil 3 optik yoğunluk okuma Dama Tahtası sinerji kılavuzundan birkaç atlanan wells (Enterobakter cloacae karmaşık izole BIDMC 27) oluştuğu gösterilmiştir. Atlanan kuyu kuyu içinde bakterilerin büyüme daha yüksek konsantrasyonda antibiyotik Bakteriyel büyüme bitişik Wells varlığıyla rağmen inhibe vardır. Standart MIC de test içinde oluştuğu bilinmektedir, bu olay için iyi ve bazı Antibiyotikler bakteriyel inoculum23 küçük farklılıklar için duyarlılık Bakteriyel büyüme özellikleri gönderen biyolojik değişkenlik nedeniyle muhtemeldir , 31 , 32. birden fazla de meydana gelen bir Dama Tahtası dizideki atladıysanız, sonuçları atılır ve tahlil tekrarladı.

Şekil 4 hediyeler örnekler üç kombinasyonları K. pneumoniae karşı test sonuçlarını zaman-kill sinerji BIDMC 32 yalıtmak. Koloni sayıları ylogaritmik bir ölçekte gösterilir-eksen ve süreyi, saat, x-eksen. Başlangıç inoculum ilaç kombinasyonu ve tüp 24 h, kırmızı çubuk ve numarası, 24 h arasında tüp bakteri konsantrasyonu arasındaki fark ise resimli bakteri konsantrasyonu içeren tüp arasındaki fark Kasanın ve en aktif tek ajan yalnız içeren tüp içeren mavi çubuk ve numarasına göre gösterilmiştir. Şekil 4A kolistin ve Minosiklin sonuçlarını gösterir; Bu kombinasyon ve en aktif Ajan yalnız ≥2 günlük10 CFU/mL 24 h maruz bakteri konsantrasyonları arasındaki sinerjik (fark) oluşuyordu ve (inoculum konsantrasyonu 24 h ≥3 günlük10 başlatılmasını bakterisidal düşüş CFU/mL). Şekil 4B kolistin ve Klindamisin, sinerjik ancak bakteri yok edici değildi bir arada sonuçları gösterir. Bu arada bakterilerin hangi ne ilaç tek başına yaptım ama onları öldürmedim büyüme inhibe. Şekil 4 c kolistin ve bakteri yok edici de sinerjik eritromisin sonuçlarını gösterir.

Figure 1
Resim 1: Dama Tahtası dizi gösteren sinerji (Minosiklin + E. coli karşı test kolistin FDA-CDC 0494 zorlanma) sonuçlanır. (A)spektrofotometrik okuma ve büyüme yorumu bir Dama Tahtası dizi. Hücrelerdeki değerleri çoğu optik yoğunluk okuma 600 nm (OD600). (Görsel denetim tarafından hiçbir büyüme için karşılık gelen) 0,07 aşağıda OD600 değerleri içeren hücreleri gölgeli kırmızı, iken (görsel denetim tarafından büyüme için karşılık gelen) OD600 değerlerle 0,07 gölgeli yeşil hücrelerdir. (B) kesirli inhibitör konsantrasyon dizin (FICben) hesaplama. Büyüme veya hiçbir büyüme gösteren gölgelendirme muhafaza edilmiştir. Kolistin ve Minosiklin x- ve y-eksen, sırasıyla, şimdi temsil kesirli inhibitör konsantrasyon (FIC) veya bu sütun veya satır için minimum inhibitör konsantrasyonu (uyuşturucu konsantrasyon oranı MIC) o ilacın tek başına. FICbenher hücrede değerdir veya iki FICS toplamı o kuyuda uyuşturucu. Büyük kırık çizgi sınır kutusu wells bir FICben 0,5 ile içine alır. Kalın sınırlanmıştır hücre içinde büyüme inhibe en düşük FICben veya en az FICbeniyi gösterir. Çünkü en az FICben 0,5, kombinasyonu sinerjik olarak kabul edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Dama Tahtası dizi sonuçları sinerji (Minosiklin + BIDMC 4 izole K. pneumoniae karşı test kolistin) göstermek değil bir arada. (A)optik yoğunluk değerlerinde şekil 1Aiçin açıklandığı gibi Dama Tahtası dizi sonuçları 600 nm ve büyüme yorumu. (B) kesirli inhibitör konsantrasyon dizin (FICben) hesaplama şekil 1Aiçin açıklandığı gibi. En az FICben çünkü > 0.5, kasanın değil kabul edilir sinerjik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: wells (Minosiklin + Enterobakter cloacae karşı karmaşık test kolistin izole BIDMC 27) nedeniyle uninterpretable Dama Tahtası dizi sonuçları atlandı. Optik yoğunluk değerlerinde şekil 1Aiçin açıklandığı gibi Dama Tahtası dizi sonuçları 600 nm ve büyüme yorumu. Birkaç atlanan wells, hangi Bakteriyel büyüme rağmen büyüme bitişik Wells varlığıyla antibiyotik, daha yüksek konsantrasyonlarda inhibe gösterdi. Sonuçları yorumlanabilir değildir ve tekrarlanması gerekiyor deneme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Zaman-kill sinerji üç kombinasyonları K. pneumoniae ayrı tut BIDMC 32 karşı test sonuçlarını. Koloni sayıları ylogaritmik bir ölçekte gösterilir-eksen ve süreyi, saat, x-eksen. Kırmızı çubuk ve numarasına göre tüp 24 h da arada bakteri konsantrasyonu ve başlangıç inoculum arasındaki fark gösterilmektedir. İnoculum konsantrasyonu, 24 h başlatılmasını düşüş ≥3 günlük10 CFU/mL ise kasanın bakteri yok edici olarak kabul edilir. Şifreyi içeren tüp ve en aktif tek ajan yalnız içeren tüp arasında 24 h bakteri konsantrasyonu arasındaki farkı mavi çubuk ve numarasına göre gösterilmiştir; ≥2 günlük10 CFU/mL azaltma ise kombinasyonu sinerjik olarak kabul edilir. (A)kolistin (CST) + Minosiklin (dk), sinerjik ve bakteri yok edici bir arada. (B) kolistin + Klindamisin (CLI), sinerjik ama değil bakteri yok edici bir arada. (C) kolistin + eritromisin (çok), sinerjik de bakteri yok edici olmadığı bir arada. Bu sonuçlar başlangıçta kolistin içeren sinerjik aktivitesini çalışmanın bir parçası olarak yayımlanan kolistin dirençli Enterobacteriaceaeiçinde o kolistin gösterdi karşı kombinasyonları bir dizi ile sinerjik tek tek yalnızca etkin antibiyotik (örneğin Klindamisin) veya öncelikle (örneğin eritromisin) gram-pozitif bakteri16karşı. (Eritromisin sinerjik Dama Tahtası dizi gösterilen zorlanma karşı tarafından ama değil tarafından zaman öldürmek, yani o seçildi Not burada sigara sinerjik bir arada bir örnek olarak.) Biz bu olan hareket için gram-negatif dış membran permeabilization tarafından bilinen, kolistin, giderek artan giriş Klindamisin gibi ilaçların bu sağlayan bir sub-inhibitory permeabilizing etkisi kolistin dayanıklı Ayagin Gram-negatif bakteri, Ayagin Gram-negatif hücre normalde giremezsiniz. Paneli (A) bu rakamın Brennan Krohn, Pironti ve Kirby 201816, telif hakkı © American Society Mikrobiyoloji, antimikrobiyal ajanlar ve kemoterapi, modifiye edilmiştir 62(10), 2018, PII: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

İki yöntem tanımlamak burada her ikisi birlikte bireysel faaliyetlerini karşılaştırıldığında kullanılan antimicrobials etkinliği hakkında bilgi sağlar. Otomatik, mürekkep püskürtmeli yazıcı destekli dijital dağıtım yöntemi olduğu zaman-kill yöntem daha yakından ilgili iletişim kuralı aynı takip ederken Klinik Mikrobiyoloji yordamlar el kitabı olarak33, açıklanan yöntemi bir adaptasyon 34başvuru.

Dama Tahtası dizi yönteminde antimikrobiyal hisse senedi için her şey eklemek için gerekli hacmi yanı sıra bu birimlere dağıtımı belirlemek için hesaplamalar otomatik, böylece bazı manuel karşılaştı hata büyük potansiyel kaynakları ortadan Dama Tahtası dizi. Ancak, hala temel araştırmacı özgün hisse senetleri hedeflenen konsantrasyon yapılır ve hedefi son konsantrasyonları D300 yazılım doğru olarak girilmesi belirler. Antimikrobiyal süspansiyon 384-şey plaka wells için ilk başta zor olabilir ve bakımı gerektirir ekleme o pipet emin olmak için uygun kuyu ipuçları girin ve o sıvı sıçrama kuyuları kenarlarını yukarı değil. Bir otomatik sıvı işleyicisi bir el çok kanallı pipet yerine hız ve bakteriyel süspansiyon wells için Eklenme doğruluğu artırmak için kullanılabilir. İletişim kuralında açıklandığı gibi D300 yüzey aktif, polysorbate 20 (P-20), uygun sıvı taşıma için eklenmesi gerektirir. Farklı yüzey aktif, polysorbate 80, %0,002, konsantrasyon, kolistin doz ile organizmalar için kolistin mikrofonlar düşürmek için kaydetti < 2 µg/mL standart suyu microdilution deneyleri. 35 , 36 bizim laboratuvar gösterdi daha önce bu P-20 0.0015 kadar % D300 destekli mikrofon sonuçları karşılaştırma ile üzerinde bir etkisi vardı konsantrasyonlarda başvuru BMD14. Burada sunulan tahlil örnekte en fazla P-20 %0.0014 konsantrasyon olmasıdır.

Karşılaştığımız bir sorun bazı Dama Tahtası dizi deneyleri ile çok sayıda atlanan wells yapıldı. Bu bazı antibiyotikler orantısız bir oranla meydana geldi. Özellikle, ekranda kombinasyonları carbapenem dirençli Enterobacteriaceaetopluluğu karşı 521 denemeler (% 9.4) 49 bulduk birden fazla atlanan kuyuları nedeniyle kullanılamaz edildi 2 Bu davalar (% 94) 46 için muhasebeleştirilir test 12 antibiyotik (fosfomycin ve cefepime). Bu tür artış oranları daha büyük olasılıkla için inoculum etkisi31,32,37özellikle duyarlı uyuşturucu olabilir. Not, fosfomycin suyu seyreltme25 sonuçları güvenilirliğini kaygıları nedeniyle bu ilaç ile görülen güvenilmez sonuçlar açıklayabilir bu yöntemle test CLSI tavsiye etmez. Otomatik Dama Tahtası yöntemine göre araştırmacı tercih bazı değişiklikler yapılabilir. Bu laboratuvar iş akışı sebebiyle tercih ise antimicrobials zaten bakteriyel süspansiyon içeren levhalar yerine boş wells, reçete. 384-iyi tabaklar burada kullanılan iken, yöntem aynı zamanda iyi biriminin uygun değişiklik ile 96-şey plaka deneyleri içinde yürütülen olabilir. 96-şey plaka biçimi kullanımı özellikle inoculum küçük değişikliklere duyarlı antibiyotikler için azalan bakiyeli atlanan Wells yardımcı olabilir. BenFIC hesaplanırken, mikrofon (yani, daha yüksek test daha), test edilen uyuşturucu hiçbir etkinlik tek tek test edilen organizma türü karşı sahip olduğu durumlar da dahil olmak üzere kapalı-ölçek olduğu durumlar olabilir. Bu gibi durumlarda, FIC tabanlı mikrofon bir seyreltme test en yüksek konsantrasyonu yüksek olduğunu varsayarak hesaplanabilir. Maksimal olası FIC değer nerede inhibisyon sinerji test sırasında görülmektedir herhangi bir seyreltme için varsayar gibi en koruyucu strateji bu. Gerçek mikrofon yerine iki katlama dilutions yukarıdaki olsaydı o zaman karşılık gelen FICS iki kat muhafazakar atamaları ve benzeri daha düşük olacağını örneğin en yoğun, test.

Doğru bir zaman-kill tahlil ilaçların bakterisidal etkinlik değerlendirmek için özellikle hücre duvarı etkin antibiyotik test28olan zaman kültür evresi logaritmik artış olması esastır. Kuluçka sallayarak ile 3 saat (K. pneumoniae), bu örnekte kullanılan hızla büyüyen bakteriler için bu büyüme aşama ulaşmak uygun, ama zaman farklı miktarda farklı organizmalar için gerekli olabilir. Genel olarak, kültür gözle görülür ama değil ağır bulanık görünmesi gerekir. Zaman uygun miktarda alınan seri zaman puan (örneğin, her 30 dakikada 4-6 h)38, koloni sayıları ile bir büyüme eğrisi oluşturmak yoluyla belirlenebilir. Zaman-kill çalışmada amaçlanan başlangıç inoculum da önemlidir. Başlangıç inoculum hedef konsantrasyonu yaklaşık 5 x 105 ' e 1 x 106 CFU/mL olduğunu. Burada açıklanan seyreltme (1.0 McFarland süspansiyon medya 10 ml, 100 μL) bu inoculum Klebsiella pneumoniae ve hangi biz-si olmak sınav o diğer Enterobacteriaceae türler için oluşturur. Başlangıç inocula farklı organizmalar kullanarak bir deneyde yoğunluğu, önemli ölçüde daha yüksek veya daha düşük ise, o zaman farklı seyreltme gerekli olabilir. (Belirli bir tür için gerekli uygun seyreltme 0.5 veya 1.0 McFarland süspansiyon plaka sayısı gerçekleştirerek bu bulanıklık temsil eder, sonra da hangi tarafından ilk süspansiyon olmalıdır tutarı hesaplamak kaç organizmalar belirlemek için belirlenebilir uygun nihai toplama ulaşmak için seyreltilmiş.) Plaka sayar sinerji çalışma daha gözden geçirme üstünde, herhangi bir antibiyotik içeren tüpler başlangıç inoculum önemli ölçüde büyüme denetim başlangıç inoculum düşük olmuştur fark edilirse, bu her iki antibiyotik ertelenmiş gösterebilir veya çok kaplama kısa süre ek antibiyotik içeren tüp bakteri ve aliquot kaldırılması arasında içinde hızlı öldürme bakteri. Bir dizi su katılmamış düşüş kolonilerde gerçek sayısı alt daha sonraki dilutions kolonilerde sayısı ise, bu antibiyotik ertelenmiş etkisi göstermektedir. Farklı seçenekler bir bütün plaka38 üzerinde tek bir aliquot yayılan veya örnek iplik, süpernatant kaldırma ve yeniden39kaplama önce steril serum fizyolojik içinde askıya almak da dahil olmak üzere bu etkiyi önlemek için tarif edilmiştir. Zaman-kill yöntem her zaman noktasında da verimli bir şekilde ama doğru her kültür tüp sizden bir aliquot çıkarmak ve seri dilutions gerçekleştirmek için dedektif için çok önemlidir. Bu işlem sırasında özellikle yakın art arda meydana erken zaman puan sırasında gecikmeler uzun süre boyunca kültürler değildir neden olabilir inkübe ve sarsıldı, dikkatsiz dağıtımı ve seri dilutions yanlış plakasına açabilir, ancak sayar. Her seyreltme 100 μL bir tüm agar plaka üzerinde yayılmış plaka sayma, formanın plaka yöntemine göre açıklanan bırak plaka yöntemi çok daha hızlı, Ağar kaplamalar bir çok daha az sayıda gerektirir ve daha hızlı, en fazla sayım için izin verir En çok 300 kolonileri genellikle yayılmış tabağı sayılabilir, ancak sayılabilir kolonileri için her damla 30, sayısıdır. Müfettişler bu tekniği ile daha rahat iseniz ancak, formanın plaka yöntemi da bir seçenektir. Damla içine bir çok kanallı pipet ile dağıtımı sonra yayıldı, bir tek kanallı pipet ile daha geniş aralıklı damla bireysel uygulama yerine yapılabilir. Deneyim, soğutucu plakalar 4 ° C'de damla dağıtım öncesinde aşırı yayılmasını azaltmak için görünüyordu.

Burada açıklanan teknikler bir sınırlama sinerji tahlil (Dama Tahtası dizi ve zaman-kill) iki tür sonuçları her zaman uyumlu değildir, ve ondan beri en sinerji makaleleri bir yöntemi veya diğer tercihan--dan her ikisi birlikte kullanma, o-ebilmek değil deneyleri iki tür verileri bütünleştirmek bilmek zor olabilir. Çünkü geliştirdiğimiz otomatik Dama Tahtası array yöntemi basit ve yüksek üretilen iş, biz sonuç olarak ekran bir tür olarak test kombinasyonları karşı yalıtır daha çok sayıda ve hangi konsantrasyon kombinasyonlarını sinerjik belirlemek için kullanmış. Sonra zaman-kill çalışmalar, daha az sayıda kombinasyonları ve Dama Tahtası dizide etkili olmuştu konsantrasyonları seçme gerçekleştirilir. Zaman-kill tahlil daha büyük birimleri (benzer), macrobroth seyreltme için kullanırken Dama Tahtası tahlil genellikle bir microbroth seyreltme ölçekte gerçekleştirildiğinden belirtmek gerekirse biz FICS bazen iki yöntem arasında farklı bulundu ile daha yüksek konsantrasyonları genellikle zaman-kill tahlil faaliyet göstermek için gerekli. Ayagin Gram-negatif basiller26 ve ne zaman daha büyük inocula (saat-kill çalışmalarda kullanılan gibi) kullanılan standart inoculum ile karşılaştırıldığında için macrobroth ve microbroth seyreltme mikrofon tahlil sonuçları karşılaştırıldığında bu olgu daha önce dikkat edilmiştir microbroth seyreltme ve Dama Tahtası dizi32deneyleri. Dama Tahtası dizinin belirli bir sınırlama doğasında değişkenlik microbroth seyreltme22test mikrofon var. Ben FIC cutoffs sinerji hesabı bu değişkenliği için süre matematiksel olarak6 böyle değişkenlik kaçınılmaz olarak yükseltir güvenilirlik ve tutarlılık Dama Tahtası dizi sonuçları hakkında endişe.

Tüm tüp bebek sinerji testi (bakteri tarımı bir yapay büyüme orta, statik antibiyotik konsantrasyonları ve sınırlı bir süre ders dahil) yöntemleri doğal sınırlamaları nedeniyle, bu yöntemlerle elde edilen sonuçlar onaylandığı takdirde ve daha fazla ek teknikleri kullanılarak hesaplandı. Tüp Bebek farmakokinetik/Farmakodinamik (PK/PD) çalışmaları (örneğin, hollow fiber enfeksiyon modeli40), hayvan modelleri, tür yöntemler içerir ve nihayet insan PK/PD ve etkinlik çalışmaları. Daha fazla bilgi için hızlı bir yöntem ile ekran kombinasyonları için potansiyel sinerjik etkinlik, sağlayarak açıklanan otomatik Dama Tahtası dizi yöntem sağlar hedef bu tekniklerin kullanımı. Ayrıca tüp bebek parametreleri ve klinik sonuçlar arasındaki ilişkinin daha iyi olarak sistematik soruşturma olarak tüm bu yöntemlerin otomasyon ölçekleme içinde önemli olacak yukarı testleri ve klinik onun uygulanabilirliği artan sinerji kullanımı.

Disclosures

D300 Dijital dağıtıcı ve ilişkili sarf malzemeleri Tecan (Morrisville, NC) tarafından verilmiştir. Tecan çalışma tasarım, veri toplama/yorumu, el yazması hazırlık veya yayımlamak için karar herhangi bir rolü yoktu.

Acknowledgments

Thea Brennan-Krohn bir Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı Enstitüsü tarafından desteklenen ve eğitim grant (T32HD055148), Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar eğitim grant (insani gelişme Pediatrik Enfeksiyon Hastalıkları Araştırma T32AI007061), bir Boston çocuk öğretim geliştirme fakülte kariyer geliştirme, hastane Office Bursu ve bir Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları kariyer geliştirme Ödülü (1K08AI132716). J.E.K. Ulusal Enstitüsü alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R33 AI119114 altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management. Annals of the New York Academy of Sciences. 1323, (1), 22-42 (2014).
  2. Spellberg, B. The future of antibiotics. Critical Care. 18, (3), (2014).
  3. Spellberg, B., et al. The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46, (2), 155-164 (2008).
  4. Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 48, (10), 3558-3562 (2010).
  5. Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71, (1), 156-161 (2016).
  6. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).
  7. Zusman, O., et al. Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57, (10), 5104-5111 (2013).
  8. Clock, S. A., et al. In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76, (3), 343-346 (2013).
  9. Hirsch, E. B., et al. Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae. Journal of Infectious Diseases. 207, (5), 786-793 (2013).
  10. Tängdén, T., et al. Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, (3), 1757-1762 (2014).
  11. Tascini, C., et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57, (8), 3990-3993 (2013).
  12. Paul, M., et al. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69, (9), 2305-2309 (2014).
  13. Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Infectious Diseases. 27, (6), 479-483 (2014).
  14. Smith, K. P., Kirby, J. E. Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 54, (9), 2288-2293 (2016).
  15. Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology. J Antimicrob Chemother. 72, (10), 2775-2781 (2017).
  16. Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. (2018).
  17. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases. 40, (9), 1333-1341 (2005).
  18. Nation, R. L., Li, J. Colistin in the 21st century. Current Opinion in Infectious Diseases. 22, (6), 535-543 (2009).
  19. Ah, Y. -M., Kim, A. -J., Lee, J. -Y. Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae. International Journal of Antimicrobial Agents. 44, (1), 8-15 (2014).
  20. Bratu, S., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56, (1), 128-132 (2005).
  21. Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, (6), 3596-3597 (2015).
  22. MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing. Appl Microbiol. 20, (1), 46-53 (1970).
  23. Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance. Journal of Clinical Microbiology. 55, (8), 2304-2308 (2017).
  24. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52, (12), 4124-4128 (2014).
  25. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  26. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. (2015).
  27. Clinical and Laboratory Standards Institute. M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2018).
  28. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19, (18), Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 7 (1999).
  29. Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests. Veterinary research forum. 4, (3), 179-183 (2013).
  30. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of Microbiological Methods. 55, (2), 475-479 (2003).
  31. Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology. Journal of Clinical Microbiology. 42, (1), 269-275 (2004).
  32. Smith, K. P., Kirby, J. E. The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. (2018).
  33. Leber, A. L. Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.16.1-5.16.23 (2016).
  34. Leber, A. L. Time-Kill Assay for Determining Synergy. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.3.1-5.14.3.6 (2016).
  35. Hindler, J. A., Humphries, R. M. Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 51, (6), 1678-1684 (2013).
  36. Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls. Journal of Clinical Microbiology. 52, (10), 3810 (2014).
  37. Fuchs, P. C., Barry, aL., Brown, S. D. Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine. European journal of clinical microbiology & infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16, (7), 538-540 (1997).
  38. Leber, A. L. Minimum Bactericidal Concentration Testing. Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. 5.14.1.11 (2016).
  39. Cai, Y., et al. In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, (9), 5238-5246 (2016).
  40. Bulman, Z. P., et al. Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era. mBio. 8, (4), (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics