Очистка H3 и H4 Гистоны и количественная оценка ацетилированный гистона знаков в клетках и тканях мозга

Neuroscience
 

Summary

Цель этой статьи заключается в предоставления всеобъемлющей, систематической руководства для эффективной очистки гистонов H3 и H4 и количественная оценка остатков ацетилированный гистонов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Janczura, K. J., Volmar, C. H., Wahlestedt, C. Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue. J. Vis. Exp. (141), e58648, doi:10.3791/58648 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Во всех эукариотических организмах хроматина, физиологические шаблон всех генетической информации, имеет важное значение для наследственности. Хроматин подлежит массив различных Посттрансляционная изменений (PTMs), которые главным образом происходят в амино Термини белков гистонов (то есть, гистонов хвост) и регулировать доступность и функциональное состояние базового ДНК. Гистона хвосты простираются от ядра нуклеосомой и подлежат Добавление ацетильной группы по гистона acetyltransferases (шляпы) и удаление ацетильной группы по гистона комплексы (ГДА) во время клеточного роста и дифференцировки. Конкретные ацетилирования узоры на остатков лизина (K) на хвосты гистона определить динамический гомеостаза между транскрипционно активной или транскрипционно репрессированных хроматина воздействуя основной сборки гистонов (1) и (2) подбор синергетический или антагонистические хроматина связанных белков на сайте транскрипции. Основные механизм регулирования сложного характера хвост гистона PTMs влияет большинство хроматина шаблонов процессов и приводит к изменениям в созревания клеток и дифференциации в нормальных и патологических развития. Цель настоящего доклада — предоставить эффективный метод для очистки ядра гистоны от клеток и тканей мозга и надежно количественно знаков ацетилирование гистонов H3 и H4 новичков.

Introduction

Эпигенетики термин относится к наследственные изменения активности генов, которые происходят независимо от изменений в ДНК последовательности1,2. Транскрипции гена и репрессий, определяются путем (1) доступность хромосомной ДНК, обернутые вокруг octamer основных белков гистонов (две копии каждого из H2A, H2B, H3 и H4) и (2) наличие факторов транскрипции и эшафот белки Набор для конкретной промоутера сайтов3,4. Транскрипции гена регулируется фермента опосредованной изменения конкретной промоутера сайтов ДНК и PTMs гистона хвосты5,6,7. N-Термини гистонов H3 и H4 являются среди наиболее сохранившихся последовательностей, известный в эукариотических организмов3, и их Посттрансляционная модификации широко задокументированы играть центральную роль в определении структуры хроматина и 8,функции9. PTMs на хвосты гистонов (то есть, ацетилирования, метилирование, фосфорилирование и ubiquitination) изменить потенциал взаимодействия хвосты, влияют на структурное состояние и складывающиеся chromatin волокна и, таким образом, регулировать ДНК доступность и обработка4,10,,1112. Ацетильной группы являются добавляется и удаляется из остатков K решкой гистона набором конкретных взаимодействующих гистона эпигеномные ферментов, а именно шляпы и гда, соответственно13. Например для того чтобы активировать транскрипцию генов, связанных с памяти приобретения и консолидации14ранее доказано ацетилирование гистона H4 в лизине 12 (H4K12ac). Кроме того несколько линий доказательств предполагают, что фермент опосредованной эпигеномные контроль транскрипции гена является важнейшим аспектом здорового клеточного роста и дифференцировки6,15. Чередование в эпигенетическую регуляцию экспрессии генов, либо путем эпигеномные изменения ДНК мутации эпигеномные ферментов, сами, было показано, быть dysregulated в заболеваний человека, где изменения в деятельности конкретной гена является визитной карточкой патологии (например, рак)6,16,17. Таким образом оценка изменений в ядро гистона PTMs становится мишенью высокой стоимости для потенциальных терапевтических вмешательств. Однако определение изобилие, взаимодействия партнеров и конкретной роли гистонов PTMs была доказана сложной18.

В нынешнем докладе оптимизированная, средне-пропускная способность стратегия для очистки ядра гистонами от клеток и тканей мозга в одну фракцию и полный протокол для количественной оценки гистонов H3 и H4 PTMs описана. Следует отметить хотя в настоящее время опубликованы на кислотной основе методов очистки и стратегии обнаружения на основе антител гистона широко приняты для характеризации гистонов, им не хватает описательные сведения о критических этапов процедуры, таким образом препятствование быстрый и воспроизводимые гистона добычи и количественной оценки. Например обработка ячейки извлечь и биопсия ткани требует различные инструменты и технологии для успешной добычи. Кроме того оптимизированный протокол, представленный в текущем рукописи демонстрирует практический, средне-пропускная способность подход. Основные гистонами извлекаются как единый, чистая доля, которая позволяет надежный течению антитела опосредованной PTM обнаружения без какого-либо вмешательства от примесей. Кроме того в текущем рукописи, был обход проблемы относительно гистона обнаружения из-за их небольшой молекулярной массой. Как правило отсутствие совместимости между очистки, количественной оценки и Протоколы электрофореза геля помешать ученых получение воспроизводимых и убедительных результатов. Здесь представлен Оптимизированный рабочий процесс для очистки ядра гистонами от клеток и тканей и подготовить их к течению PTM анализов через западную помарку.

Текущий протокол позволяет очистки белков гистонов ядро при сохранении их родной Посттрансляционная модификации (то есть, ацетилирования, метилирование и фосфорилирование). Рисунок 1 изображает Хронология гистона очистки протокола.

Protocol

Все мыши были размещены в контролем влажности и температуры, аккредитованных АААЛЖ животных фонда в Университете Майами Миллер школе медицины. Все эксперименты были одобрены в Университете Майами Миллер школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) и проведены согласно спецификации низ.

1. Подготовка образца экстракт

  1. Адэрентных клеток
    1. Плита клетки в 10 см блюда в соответствующей культуры СМИ (1 х 106 до 1 x 10-9 ячеек на блюдо для клеточных линий, таких как BV2, ГЭС-293 и SH-SY5Y, но ~ 1 x 1015 ячеек на блюдо для начальных ячеек, например первичного корковых нейронов). Заверить, что клетки, равномерно распределенных по всей поверхности пластины и позволяют клеткам расти за 48 ч до впадения ~ 100% (37 ° C, 5% CO2).
    2. После того, как клетки достигли желаемого confluency, нежно аспирационная культуры средств массовой информации и вымыть клетки 2 x с подогретую сыворотки свободных СМИ под капотом культуры ткани.
    3. Аспирационная сыворотки свободных СМИ от блюдо и добавьте 1 mL ледяной извлечения буфера (0,4 М серной кислоты, 1 мм KCl, 1 мм MgCl2, 50 Tris-HCl [рН 8,0] и 1 x коктейль ингибитор протеазы) к каждому блюду.
    4. Используйте пластиковые клетки скребок для собирать все клетки в буфере извлечения (соскоб) и передавать их на 1,5 мл, помечены трубка с 1000 мкл пипетки. Накапайте клетки вверх и вниз 3 x для облегчения гомогенизации.
    5. Закройте все трубы и немедленно положить их на льду.
  2. Ткани мозга
    1. Если используется замороженные ткани, ткани в prechilled 1,5 мл трубку и кратко оттепели на льду. Если используются свежие ткани, немедленно приступить к шаг 1.2.2.
      Примечание: Текущий протокол описывает процедуры с использованием замороженных мыши мозга и мыши префронтальной коры образцов.
    2. Однородный тканей, с использованием карманных Dounce гомогенизатор, используя соответствующее количество извлечения буфера и рекомендуемое количество штрихов (Таблица 1). Чтобы избежать чрезмерного хроматина измельчения, не превышают количество рекомендуемых штрихов.
    3. С помощью пипетки одноканальный 1000 мкл, передать prechilled 1,5 мл огневки. Закройте все трубы и немедленно положить их на льду.

2. подготовка сырой гистона экстракт

  1. Место 1,5 мл пробирки, содержащие клетки или ткани, приостановлено в буфере добычи на вращающейся платформе и повернуть на 15 об/мин при 4 ° C, чтобы позволить добычи нефти гистонами.
    Примечание: Время добыча может различаться для разных клеток и тканей типа и должны быть оптимизированы для каждой процедуры. Текущий протокол представляет результаты, полученные после 15 мин, 2 h и 24 h добычи (Рисунок 2, рис. 3, рис 4и рис. 5).
  2. Prechill microcentrifuge до 4 ° C. После того, как прошло время желаемого извлечения, центрифуга трубы на максимальной скорости на 10 мин при 4 ° C.
  3. Передача супернатанта, включая сырой гистонов к новой, prechilled 1,5 мл. Выбросите гранулы.
  4. Хранить супернатант в-80 ° C (добыча может быть остановлен на этом шаге см «Stop шаг» на рис. 1) или сразу перейти к следующему шагу.
  5. Нейтрализовать сырой гистонами объемом 1/4 5 x нейтрализации буфера (например, 250 мкл 5 x нейтрализации буфера до 1 мл сырой гистонами). Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз 6 x.
  6. Проверьте рН в смеси с рН полоски. Корректировать, добавив больше нейтрализации буфера для достижения рН 7.
  7. Оценивать наличие гистона и nonhistone белков в сырой гистона извлечь следующим образом (рис. 2).
    1. 37,5 мкл пример до 12,5 мкл 4 x буфер образца (Лэмли) и денатурировать 10 мин на 99 ° C.
    2. Загрузить образец на геля SDS-PAGE и Побегите гель для 1 h 100 V.
    3. Пятно гель на ночь с решением Окрашивание Кумасси синим R-250 и Отмойте в течение трех последовательных моек (1 ч/мыть) раствором минигелей Кумасси синим R-250.
      Примечание: Сырой гистонов (рис. 2) можно сравнить с eluted и очищенный гистонов (т.е., столбец ввода [Рисунок 5A]).

3. Очистка Core гистонами

  1. Спиновые столбца уравновешивания
    1. Добавьте 500 мкл буфера уравновешивания каждый спин столбец используется. Не прикасайтесь столбца мембраны.
    2. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Отказаться от потока через. Повторите 1 x.
  2. Очистка гистона
    1. Добавьте 500 мкл пример интерес из шага 2.6 в столбце. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Соберите потока через.
    2. Повторите предыдущий шаг столько раз, сколько необходимо загрузить весь образец на столбец. Не переполняйте столбце спина.
    3. Объединить потока через от каждого шага центрифугирования для анализа эффективности связывание столбцов (рис. 3).
    4. Выполните шаг 2.7 для анализа потока через колонки.
  3. Колонка мыть
    1. 500 мкл буфера мытья, для каждого столбца. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Соберите потока через стирка (стирать #1).
    2. Повторите шаг 3.3.1 для в общей сложности три автомойки. Соберите моет потока через #2 и #3. Не пула последовательных столбцов потока через смывки.
    3. Для дальнейшей оценки эффективности гистон привязка столбца, проанализируйте три колонки моет, выполнив шаг 2.7 (рис. 4).
  4. Элюирующий гистона
    1. Перевести столбец в новой маркировкой 1,5 мл трубки.
    2. Добавьте 50 мкл гистона Элюирующий буфер. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Сохранение потока через содержащих гистоны.
    3. Для дополнительного элюции повторите шаг 3.4.2. Не следует сочетать первого и второго потока через элюаты, как они отличаются в количестве гистона и чистоты.

4. осадки основных гистонами

  1. Добавление очищенный гистонами до конечной концентрации 4% хлорной кислоты (PCA) PCA (например, 3 мкл 70% PCA до 50 мкл очищенный гистонами от шага 3.4.2.
  2. Центрифуги для 3 s для сбора всех остатков жидкости от стенки трубки. Смешайте закупорить вверх и вниз 6 x.
  3. Трубы в стойку и инкубировать в течение 24 ч при 4 ° C.
  4. На следующий день, prechill microcentrifuge до 4 ° C и Центрифугуйте образцы 75 минут на максимальной скорости при 4 ° C.
  5. После центрифугирования, небольшой белые гранулы, содержащие осажденный гистонами будет видна в нижней части трубки. Сделать не вихревой образца.
  6. Тщательно удалить супернатант и, не нарушая гранулы, добавить 500 мкл ледяной 4% PCA образца.
  7. Центрифуга на 4 ° C на 10 мин на максимальной скорости. Тщательно удалить супернатант.
  8. Повторите шаг 4.7 2 x.
  9. Не нарушая гранулы, 500 мкл ледяной ацетона. Центрифуга на 4 ° C на 10 мин на максимальной скорости. Тщательно удалить супернатант.
  10. Повторите шаг 4.9 2 x.
  11. Тщательно удалить супернатант, оставить трубы контаминированных и позволить образца сушиться на льду на 30 мин проверить, если все остаточные ацетон испарилась.
  12. Оставьте трубы контаминированных и позволяют образца высохнуть при комнатной температуре (RT) 5 мин.
  13. Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл стерильной воды. Сделать не накапайте вверх и вниз. Флик трубку осторожно с пальцем.
  14. Cap все трубы и позволяют гистонами воссоздать на льду на 30-50 минут, в зависимости от размера гранул. Проверьте, если высокомобильна гранулы.
  15. Cap все трубы и позволяют гранулы для дальнейшего Ресуспензируйте на RT на 5 мин.
    Примечание: Это решение (первый и второй элюции от шага 3.4.3) состоит из очищенной и обессоленной Гистоны и могут быть использованы для дальнейшего анализа ацетилирования количественной и гистонов.

5. Количественная оценка Eluted гистоны

  1. Используйте спектрофотометр согласно производителя протокол для количественного определения общего гистоны, полученные после окончательного элюции в шаге 4.15. Измерение оптической плотности на 230 Нм. Запись A260/A280 соотношение свидетельствует пример загрязнения с нуклеиновой кислоты.
  2. Используйте следующую формулу для расчета концентрации гистонов (x):
    Equation
    Здесь ОД является оптическая плотность измеряется в A230 Нм.
  3. Гистона концентрации ~1.5 мг/мл считается средняя доходность для клеточных линий, а концентрация гистона ~5.0 мг/мл является средняя урожайность на 30 мг ткани.

6. Западный анализ помаркой

  1. Отрегулируйте очищенный и eluted гистона от шаг 4.15 до ~ 10 мкг белка гистонов/образца.
  2. Добавьте соответствующий объем воды и 4 x Laemmli буфер образца для настройки загрузки томов.
  3. Денатурируйте образцы для 10 мин на 99 ° C. Охладьте их на льду. Центрифуги для 3 s для сбора всех остатков жидкости и конденсации от стенки трубки.
  4. Загрузить образцы на геля SDS-PAGE и Побегите гель для 1 h 100 V.
  5. Для визуализации всего гистоновых белков, пятно гель на ночь с решением Окрашивание Кумасси синим R-250 и Отмойте в течение трех последовательных моек (1 ч/мыть) раствором минигелей Кумасси синим R-250.
    Примечание: Первый элюции гистоны содержит высококачественные гистонов (Рисунок 5A), а второй элюции низкой не уровням гистонов (Рисунок 5B).
  6. Чтобы подсчитать гистона PTMs, используйте систему передачи (см. Таблицу материалы) для передачи белка гистонов от геля SDS-PAGE (шаг 6.4) на PVDF мембрану.
    1. Чтобы собрать передачи сэндвич, Откройте кассетный системы передачи и место PVDF мембрану стека (помечены как дно +) в нижней части кассеты с мембраной, вверх. Roll мембраны нежно с роликом пятно удалить воздух из стека и мембраны.
    2. Положите гель на вершине мембраны, ролл аккуратно с роликом пятно удалить воздух из мембраны и лари и место Топ стека на геле. Рулон осторожно снова поместите крышку кассеты поверх сэндвич, нажмите вниз твердо и поверните по часовой стрелке для блокировки Ноб.
    3. Вставьте кассету в слот системы передачи. На экране аппарата выберите Протокол Turbo. Используйте протокол 3 мин для одной мини-гель или 7 мин протокол для более чем двух мини-гели.
    4. Пятно мембраны с Пуансо пятно на 5 мин и визуализировать всего гистоны.
    5. Мыть их в 1 x трис амортизированное saline (TBS) с 0.1% 20 анимации для 2 h и блокировать их в 5% молока за 1 ч. инкубировать с первичных и вторичных антител (на ночь при 4 ° C или 1 ч на RT, соответственно) или согласно ранее оптимизированный протокол.
      Примечание: В текущей протокол, антител против ацетилированный гистонов H4K12 (Рисунок 6 и рис. 7) и H3K27 (рис. 8) были использованы.

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать прогрессирование гистона очистки протокола и состав всех проанализированных фракций, мы оценивали разные гистона выдержки из клетки микроглии человеческого BV2. Чтобы продемонстрировать количественная оценка гистонов H3 и H4 PTMs (то есть, ацетилирования), мы использовали лизатов ткани мозга.

BV2 клетки были покрытием на 5 х 106 клеток на блюдо в 10 см культуры ткани лечение блюда и позволил расти confluency за 48 ч. Затем были собраны клетки, и гистонов были освобождены от хроматина инкубации в извлечения буфер, содержащий 0,4 М Серная кислота, 1 мм KCl, 1 мм MgCl2, 50 мм трис-HCl (рН 8.0) и 1 x ингибитор протеазы. Извлечение времени, от 15 мин до 24 ч, не затрагивают общий состав сырой гистона выдержки определяется Кумасси синим окрашивание (рис. 2). Далее, сырой гистонами перешли через столбцы уравновешенной гистона и потока через был проанализирован. Высокая эффективность связывание столбцов определяется отсутствие белка гистонов в проточное когда анализируемой Окрашивание Кумасси синим. Мы определили связывание столбцов эффективность на 100% как было не обнаружению гистоновых белков, присутствующих в анализируемого потока через (рис. 3). Все мембраны с привязанного гистонами затем промывали три раза с мыть буфер для удаления любых оставшихся примесей, оставляя только гистоны обязан силикагель. Мы установлено, что для извлечения всех гистона раз (т.е., 15 мин, 2 ч. и 24 ч), наиболее важных для удаления nonhistone загрязнений из столбцов, в то время как второй и третий моет не повлияло чистоты образца первой стирки мембрана. Таким образом в зависимости от типа образца, последние два моет может быть опущен. После первого элюции белка гистонов из столбца (с помощью Элюирующий буфер, содержащий 1 мм NaCl и ЭДТА), гистонов были осаждают на ночь с 4% хлорной кислоты и затем гранулированных, промывают и проанализированы для обогащения очищенный гистонов H3 и H4. Мы наблюдали, что 24 h извлечения время увеличивается количество гистонов H3 и H4 в очищенную фракцию по сравнению с 15 мин и 2 h извлечения времени (Рисунок 5A). Второй элюции из столбца не завершились высокого качества или высокой количество гистонов (Рисунок 5B).

Далее мы использовали ткани гомогенатах мозга для количественного определения гистонов H3 и H4 PTMs, а именно ацетилирования. Одичал тип (C57BL6/J) самцов мышей были ведении широко действующие ингибиторы ГДАЦ (tributyrin) в дозе 5 г/кг внутрь по 3 d. целом мозговой ткани была собрана на 4 день и сырой гистонами были извлечены согласно описанной протокол. Использование непарных t-теста, мы выяснили, что tributyrin увеличивает ацетилирование гистонов в сырой экстракт (t(6) = 6.184, P = 0.0004); Однако примеси обнаруживаются в экстракте (гистона полосы четко не определены). Таким образом H4K12ac антитела не имеют высокую специфичность (рис. 6). Для дальнейшей оценки применимости представленных протокола для небольших разделов ткани, мы собрали префронтальной коры от тройной трансгенных болезни Альцгеймера (3 x Tg-AD) мышей ежедневно обрабатывают 10 мг/кг M344, класс I и АБС битор IIb HDAC, для четырех месяцев. Гистона очищения и осадков была выполнена согласно протокола здесь описано. Использование очищенной гистонов H3 и H4 дроби, мы выяснили, что M344 2.4-fold увеличивает H4K12 ацетилирования (t(6) 13.03, P = < 0.0001), с высокой точностью H4K12ac антител (рис. 7). Аналогичным образом мы наблюдали увеличение ацетилирование гистонов H3 в BV2 клетки в ответ на другой HDAC ингибиторов, а именно селективный ингибитор HDAC3, RGFP-966. 10 мкм RGFP-966 причин приблизительно двукратное увеличение ацетилирования в гистона H3K27 после 24 часов лечения. Студент непарные t-тест был использован для сравнения управления против лечение клетки.

Figure 1
Рисунок 1: Хронология протокола очистки гистонов. Ниже приведены все шаги для анализа гистона наряду с предполагаемое время, необходимое для каждого шага. Рисунки с изображением результатов конкретных шагов и представлены в рамках рукопись упоминаются в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя сырой гистонов, извлеченные из клеток BV2. BV2 клетки были культивировали в течение 48 часов до начала протокол извлечения гистонов. Сырой гистонами были извлечены за 15 мин, 2 ч. и 24 ч, с тремя реплицирует для каждой точки времени (это также в случае рис. 3, рис. 4и 5). Nonhistone и гистонов белки присутствуют в нефти гистона экстракт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя столбец потока через следующие гистона очистки шагов от клеток BV2. После сырой гистонов, проходя через столбец привязки гистонов только nonhistone белки присутствуют в поток через. Гистоны отсутствуют в этой фракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя столбец мыть после шага очистки гистона из клеток BV2. Независимо от извлечения раз гистонов, которые были (A) 15 мин, (B) 2 h, или (C) 24 ч, низкое количество белков nonhistone присутствовали только в столбце первой мойка histonebinding. Гистоны отсутствовали в всех моет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: представитель Кумасси синим-окрашенных гель, демонстрируя смывах после шага очистки гистона из клеток BV2. (A) высокое качество очищенной и обессоленной гистонов H3 и H4 были обнаружены после первого элюции в столбце очистки гистонов. (B) второй элюции гистона Очищение колонки не дали высокое качество или количество гистонов H3 и H4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: широко действующей HDAC ингибиторов, tributyrin, увеличивает H4K12 ацетилирования в весь мозг мышей дикого типа. (A) группа показывает представитель Западной пятно с изображением увеличение H4K12 ацетилирования в сырой гистона извлечь собранные от весь мозг мышей дикого типа в ответ на широко действуя HDAC ингибиторов, tributyrin. (B) Эта группа показывает количественная оценка увеличения в H4K12 ацетилирования в естественных условиях. Непарные t-тест был использован для сравнения групп (t(6) = 6.076, P = 0.0005). Столбцы представляют собой среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). N = 8. P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: класс I и АБС битор IIb HDAC, M344, увеличивает H4K12 ацетилирования в префронтальной коре тройной трансгенных болезни Альцгеймера (3 x Tg-AD) мышах. (A) группа показывает представитель западной помарки, изображающие увеличение H4K12 ацетилирования в очищенной и обессоленной гистона экстракт собранных из префронтальной коры 3 x Tg-AD мышей в ответ на ингибирование гда M344. (B) этой панели отображается количественная оценка увеличения H4K12 ацетилирования в ответ на M344, управляемых в суточной дозе 10 мг/кг за 4 месяца. Непарные t-тест был использован для сравнения групп (t(6) 13.30, P = < 0.0001). Столбцы представляют собой среднее ± SEM. N = 8. P < 0,00001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: селективный ингибитор HDAC3, RGFP-966, увеличивает H3K27 ацетилирования Микроглии клеток BV2. (A) Эта панель показывает представитель западной помарки, изображающие увеличение H3K27 ацетилирования в очищенной и обессоленной гистона экстракт собранных из BV2 клеток в ответ на HDAC3 ингибирования RGFP-966. (B) RGFP-966 вызывает примерно двукратное увеличение ацетилирование гистонов H3 и лизин (K) 27 после 24 часов лечения. Непарные t-тест был использован для сравнения управления против лечение клетки (t(4) = 5.981, P = 0,002). Столбцы представляют собой среднее ± SEM. N = 6. P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Представитель ткани (одно полушарие) * Средняя ткани вес (мг) Извлечения буфер (мл) Количество ударов
Мозжечок мыши 40 1 40
Мышь лобной коры 30 0,3 20
Гиппокамп мыши 27 0,3 18
Мыши entorhinal коры 19 0,3 17
* Все эксперименты были проведены на взрослых самцов мышей.
Средний возраст: 16 месяцев. Средний вес: 30 грамм.

Таблица 1: Оптимизированные условия для гомогенизации ткани мозга.

Discussion

В текущей работе мы продемонстрировали оптимизированный метод для очистки ядра Гистоны и количественно гистонов H3 и H4 PTMs (например, ацетилирования). Представленные протокол является всеобъемлющий рабочий процесс, который включает оптимизированные процедуры в отношении клеток и подготовка тканей мозга, сырой гистона очистки и подробные гистона осадков, элюирование и количественной оценки, которые следуют гистона электрофореза и надежные гистона PTM количественной оценки. Большое количество деталей, здесь позволяет для воспроизводимых поколения высокого качества данных, несмотря на необходимость в длительных манипуляций гистона образцов.

Многие в настоящее время опубликованы протоколы требуют использования ВЭЖХ изолировать чистой доли гистонов H3 и H419. Хотя ВЭЖХ является мощным средством, ее сложности и низкой пропускной способности сдерживать большинство молекулярные биологи и неспециалистов из его частое использование. Действительно ВЭЖХ не доступен для многих лабораториях, и высоко квалифицированного персонала, необходимого для работы инструмента. ВЭЖХ зачастую длительным, дорогостоящим и потенциально опасных. Представленные здесь является недорогой, средне-пропускная способность стратегии для достижения результатов аналогичного качества, который обходит ВЭЖХ. Сообщил стратегия также более практичным и подходит для использования в почти любой лаборатории, как он использует простой спин столбец подход, который не требует навыков работы специализированный инструмент. Кроме того гистонов H3/H4 Тетрамер извлекается как единый, чистая и обильные дроби, позволяя надежной количественной сохранились PTMs на каждом из белков.

PTMs чрезвычайно чувствительны к изменениям в окислительного стресса и изменения рН в20,21. Таким образом в отличие от ранее опубликованные методы18, мы приводим эффективную стратегию полоскания клеток в сыворотке свободных СМИ обеспечить минимальный метаболические нарушения клеток и избегать вмешательства родной PTMs с компонентами сыворотки. Текущий протокол не только обходит изоляции традиционными ядер, но и обеспечивает оптимальное время для лизиса клеток и точное ткани гомогенизации процедура, которая позволяет для сохранения ядерная оболочка избегая ядерной агрегации. Хотя время извлечения можно манипулировать основанные на количество клеток, используется тип ячейки, размер ткани и т.д., расширенный лизис не является желательным, как это может привести к lysis ядер и выпуска ДНК, что делает образец трудно справиться. Важно отметить, что несколько контрольно-пропускных пунктов в рамках протокола существует для проверки успешного гистона очистки (например, шаги 2.7 и 3.2.3). Эта стратегия также облегчает диагностику на протяжении длительной процедурой.

Еще одной важной и уникальной особенностью представленных протокола является его полную совместимость с течению западной помарке инструменты анализа и другие по желанию. Гистоны обнаруживаются на ~ 15 кДа13,,2223 и аналогично для других малых низкомолекулярных белков, оказались сложным для выявления методов стандартных immunoblotting. Использование системы передачи высокой производительности и высокой пропускной способности в сочетании с гелями белка оптимальное разрешение позволяет для поддержания деятельности в отсутствие SDS и высокой эффективности и родной подтверждение белка (в отсутствие SDS) низкомолекулярных белков гистонов таким образом обеспечивая количественную оценку PTM надежный гистонов.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Авторы выражают свою признательность Флорида Департамента здравоохранения Эд и Этель Мур Альцгеймера исследовательской программы (гранты 6AZ08 и 7AZ26), низ-NIAAA (Грант 5R01AA023781-03) и Американской ассоциации сердца (Грант 17PRE33660831).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes ThermoFiser Scientific 05-408-129 or equivalent from other sources
Sterile water Gibco 15-230-204 or equivalent from other sources
70% perchloric acid Sigma Aldrich 311421 or equivalent from other sources
100% acetone Sigma Aldrich 270725 or equivalent from other sources
pH-indicator strips, non-bleeding Milliipore Sigma 1095310001
4x SDS sample buffer BIO-RAD 161-0747
Benchtop rotor Cole-Parmer UX-04397-34 or equivalent from other sources
1.5 mL tube rack ThermoFiser Scientific 05-541 or equivalent from other sources
Histone purification mini kit Active Motif 40026 spin columns included in the kit
Protease Inhibitor Cocktail ThermoFiser Scientific 78430 or equivalent from other sources
Nanodrop instrument ThermoFiser Scientific ND-2000
Tissue culture dishes VWR 10062-880 required for histone extraction from cultured cells
Tissue culute media varies based on cell line used varies based on cell line used required for histone extraction from cultured cells
Low-serum media ThermoFiser Scientific 51985091 required for histone extraction from cultured cells
Plastic cell scraper Falcon 353086 required for histone extraction from cultured cells
SDS-PAGE gradient gel BIO-RAD 456-9035 required for histone extraction from cultured cells
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution BIO-RAD 1610436 required for histone extraction from cultured cells
Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution BIO-RAD 1610438 required for histone extraction from cultured cells
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BIO-RAD 1704156 required for histone extraction from cultured cells
Trans-Blot Turbo Transfer System RIO-RAD 1704150 required for histone extraction from cultured cells
Ponceau S stain CellSignalling 59803S required for histone extraction from cultured cells
Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance Kimble Chase 885302-0007 required for histone extraction from tissues
100% bleach Clorox 68973 required for histone extraction from tissues
H4K12ac antibody Active Motif 39166 required for PTMs quantification via WB
H3K27ac antibody Active Motif 39134 required for PTMs quantification via WB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
  2. DeWoskin, V. A., Million, R. P. The epigenetics pipeline. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).
  3. Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
  4. Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
  5. Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
  6. Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
  7. Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).
  8. Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
  9. Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
  10. Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
  11. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  12. Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
  13. Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
  14. Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
  15. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
  16. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
  17. Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617 (2016).
  18. Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).
  19. Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. Rapid Purification of Recombinant Histones. PLoS ONE. 9, e104029 (2014).
  20. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
  21. Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. e1700309 (2018).
  22. Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).
  23. Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114, (43), E9135-E9144 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics