腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

Cancer Research

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Summary

このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics の開発を加速します。

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Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (143), e58651, doi:10.3791/58651 (2019).

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Abstract

成功したがん免疫療法には、長期的な腫瘍制御を実現する可能性があります。最近の臨床成功にもかかわらず個々 の腫瘍免疫プロファイルに合わせた安全で効果的な治療のための緊急の必要性が残っています。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍によって制限されている遺伝子発現と同様、抗腫瘍免疫応答の誘導を有効にします。このプロトコルでは、免疫調節的ベクトルの生成と ex vivo 解析について説明します。例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコーディング麻疹ワクチン ウイルスを中心に、一般的な方法は他種ウイルスと遺伝子に合わせることができます。提示されたワークフローでは、デザイン、クローニング、救助、および組換えウイルスの伝搬を含まれています。複製の動態と前のヴィヴォ分離に比べて機能だけでなく、ベクトルの溶菌活性を分析するための試金が含まれ、新薬の前臨床モデルの更なる発展のための世代を進め、最終的に臨床の翻訳。

Introduction

腫瘍溶解性ウイルス (OVs) は、特に内のレプリケートし、健康な組織をそのまま残しながら腫瘍細胞を殺す抗がん剤治療として開発されています。効率的なレプリケーションおよびウイルスの広がりによって完全な腫瘍の換散にのみ依存しない理解する腫瘍溶解性 virotherapy (超過)、ほとんどの場合は共通になっている、治療成功のアクションの追加機構を必要とするを含む血管性および間質ターゲット、重要な免疫刺激1,2,3,4。現在の研究理解、潜在的小説 OVs、および高度な OV を作成するために遺伝子工学によって提供される可能性を含むウイルス バイオバンク改善生物から利益を得ている OV の多くの初期の研究は、そのままウイルスを使用プラットフォーム5,6,7

免疫療法の最近の成功を考えると、免疫調節遺伝子、OVs.の遺伝子工学に関する分野OV 感染腫瘍細胞でこれらの遺伝子産物の発現は、全身投与と比較して毒性を低減します。ターゲティングを固有の oncoselectivity ウイルスを用いたまたはウイルスのトロピズム8を変更することにより達成します。ローカル免疫は、超過作業時間の多面的の抗腫瘍メカニズムを強化します。さらに、この戦略は、ウイルス、腫瘍細胞と宿主免疫系との相互作用を尋問に尽力されます。この目的のためには、このプロトコルは、設計、クローン、救助、伝達、および腫瘍溶解性パラミクソ ウイルス (特に麻疹ウイルス) ベクトルのような遺伝子をエンコーディングを検証の適用および調整可能なワークフローを提供します。

さまざまな癌免疫サイクル9、腫瘍抗原の認識 [例えば、腫瘍関連抗原 (TAAs) または誘導剤の強化などの異なるステップをターゲット遺伝子製品により免疫反応の変調が可能します。主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子] 効率的な抗原提示 (サイトカイン); の樹状細胞の成熟を支援を募集し、よう必要な免疫細胞を活性化細胞とヘルパー T 細胞 [ケモカイン、二重特異性 T 細胞化クリニカルパス (BTEs)];制御性 T 細胞、骨髄由来抑制細胞、腫瘍関連マクロファージ癌関連付けられている線維芽細胞 (抗体、BTEs、サイトカイン); など抑制細胞をターゲットエフェクター細胞抑制作用と疲労 (チェックポイント阻害剤) を防止します。したがって、生物学的製剤の茄多は利用できます。このようなウイルスでエンコードされた免疫に関する治療効果とシナジー効果を狙うだけでなく、それぞれのメカニズムの理解の評価は癌治療を改善するために必要です。

ある家族の負の意味一本鎖 RNA ウイルスは、増殖型ベクトルとしていくつかの機能の使用を助長によって特徴付けられます。自然 oncotropism、transgenes (5 kb 以上)10,11, 分離形成や高い免疫原性12など展開して効率的な大容量ゲノムが含まれます。したがって、OV プラットフォームに基づいて犬ジステンパー ウイルス13、流行性耳下腺炎ウイルス14ニューカッスル病ウイルス15、センダイ ウイルス16,17、シミアン ウイルス 518、および Tupaia パラミクソ ウイルス19開発されています。最も目立つライブ弱毒生麻しんウイルス ワクチン前臨床や臨床開発20,21系統 (MV) が進んでいます。これらのウイルスは、優れた安全記録22定期的な予防接種を何十年も使用されています。また、パラミクソ ウイルスの厳密にゾル性細胞質のレプリケーションによる挿入突然変異誘発のリスクはありません。追加転写単位 (ATUs) への遺伝子の挿入を可能にする反ゲノムの cDNA に基づく汎用性の高いリバース ・ ジェネティクス システムは利用可能な11,23,24です。ウイルス遺伝子発現のサロゲート マーカーとして、イメージング、放射線治療や可溶性癌胎児性抗原 (CEA-MV) ヨウ化ナトリウム シンポート (MV NIS) をエンコード MV ベクトル (NCT02962167、NCT02068794、臨床試験で現在評価中NCT02192775、NCT01846091、NCT02364713、NCT00450814、NCT02700230、NCT03456908、NCT00408590、および NCT00408590)。安全管理を確認しており、抗腫瘍効果の場合は、前研究25,26,27,28,29,で報告されている30 (Msaouel et ら31によって再検討されました)、開発とテスト preclinically 追加腫瘍溶解性麻疹ウイルスのための道を舗装します。癌免疫サイクルの多様な手順を標的分子は腫瘍の成長を遅らせるし、同系の長期保護免疫記憶と免疫介在性のエビデンスをマウスの生存を延長する示されている免疫調節をエンコーディング MVマウスのモデル。ベクトルでエンコードされた遺伝子は、顆粒球・ マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)32,33, h. ピロリ菌好中球活性化蛋白質34, 免疫チェックポイント阻害剤35、します。インターロイキン 12 (IL-12)36、TAAs37と BTEs38CD3 と腫瘍表面抗原を架橋し、このように誘発する T 細胞受容体の特異性と共刺激 (に関係なく、取込んだポリクローナルな T 細胞による抗腫瘍活性図 1)。有望な臨床結果は、これらの構造に対する需要さらに並進努力を取得しました。

Talimogene laherparepvec (T VEC)、型私エンコーディング GM-CSF、単純ヘルペス ウイルスはアメリカ合衆国食品薬品局 (FDA) と欧州医薬品庁 (EMA) によって承認された唯一的治療。承認に至る後半 2015 の第 III 相試験のみ高度な黒色39で腫瘍内注入も abscopal 効果 (すなわち、非注入病変の寛解) のサイトで効力を示したないです。T VEC 追加試験他の腫瘍のエンティティ (例えば NCT03458117、非黒色腫皮膚がん; 膵がん、NCT03086642) でアプリケーション、特に免疫チェックポイントとの併用療法の評価に入っているので阻害剤 (NCT02978625、NCT03256344、NCT02509507、NCT02263508、NCT02965716、NCT02626000、NCT03069378、NCT01740297、およびリーバスet ら40)。

これは、腫瘍溶解性免疫療法の潜在的なだけでなく、超過作業時間と抗炎症の優れた組み合わせを識別するためにさらなる研究の必要性を示しています。追加ベクトルおよび前臨床試験の開発の合理的な設計は、この事業への鍵です。これは根本的なメカニズムの理解を進めるよりパーソナライズされた癌の治療への進行に影響しています。このため、この文書の変更およびパラミクソ ウイルスを対象となる癌免疫療法と、T 細胞に魅力的な抗体 (図 2) をエンコードする腫瘍溶解性麻疹ウイルスのより具体的には、開発方法論を提示します。

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Protocol

注:[O]、[P] と [M] に該当するサブセクションを示す: 一般的に、(ほとんどの) のパラミクソ ウイルスや MV のみ、OVs それぞれ。[B] BTE transgenes に固有のセクションを示します。

麻疹ウイルスのベクトルに 1 に比べてエンコード遺伝子クローニング

  1. [O] 設計は、シーケンスを挿入します。
    1. [O] 文学研究または遺伝スクリーン41など探索的データに基づいて関心の免疫調節剤を決定し、適切なデータベース GenBank、欧州のヌクレオチド アーカイブなどから関連する cDNA シーケンスを派生または国際学会情報システム (IMGT)。
    2. [O] 遺伝子シーケンス (図 3) に追加機能を追加します。上記のコザック シーケンスと種特異的なコドンの最適化は、式を強化できます。シグナル配列が分泌を必要です。エンコーディングの検出そして浄化のための42の N および C ターミナル蛋白質のタグ シーケンスが含まれてください。ベクターに挿入するための制限のサイトがあります。
      注:[M] 追加転写単位 (ATUs) MV ポリメラーゼ遺伝子をかくまっている開始し、停止信号が組換え MV ゲノムから遺伝子発現に必要です。適切な反ゲノム cDNA ベクトル, CMV プロモーターと定義された位置で肯定的な感覚の遺伝子の導入のためのユニークな制限のサイトを含む ATUs によって制御は以前11を開発されています。[パラミクソ ウイルス43の典型的な表現の勾配によるウイルスの複製と遺伝子発現に影響を与える遺伝子 P] 適切な位置決め非常に重要です。アンチのゲノムの 3' 末端に近い ATU に導入 (すなわち.、リーダーの位置またはP遺伝子の下流) 一般に減らされたウイルスの複製を犠牲にして高発現の結果します。H遺伝子の下流に ATU を使用する場合、レプリケーションが増えると遺伝子発現の低レベルは期待できます。麻疹ウイルスを含むいくつかのパラミクソ ウイルスのゲノムの包装はそれぞれヌクレオキャプシド蛋白質446 ヌクレオチドの結合を必要とします。このようなウイルスに遺伝子の挿入、完全なゲノムのヌクレオチドの数が 6 で割り切れることを確認します。これを「六つのルール」45,46とも呼びます。必要に応じて、フレーム シフトまたは時期尚早停止コドンを導入することがなく挿入 (コザック シーケンスの上流または終止コドンの下流) ヌクレオチドを含めます。[M] MV 遺伝子開始 (AGGRNCMARGW) に似ていると (RTTAWANAAAA) 信号と RNA シーケンス (AAAAAGGG) を編集停止遺伝子の特定のシーケンスは避けてください。そのようなコンセンサス シーケンスが公開されている (例えば、公園ら47を参照)。
    3. [O] 任意のシーケンスのオリゴヌクレオチドを購入または標準的な分子クローニング48を使用して利用可能なシーケンスから組み立てます。
      注:[O] 遺伝子の PCR 増幅、上流制限サイトと挿入し、最後の 15-20 ヌクレオチドの挿入に続いて下流の制限を含む逆プライマーの最初の 15-20 ヌクレオチドを含む前方プライマーを設計します。サイト。
  2. [O] クローン エンコーディング ウイルス (反) ゲノム DNA に挿入。
    1. [O] 標準的な分子クローニング技術48 (すなわち,酵素制限 DNA の ligation の順) によってベクトル DNA または RNA ウイルスの DNA 反ゲノムに挿入を複製します。
      1. [O]-互換性のない制限のサイトを使用して、または結紮前に解消のリン酸化によるベクトルの再結紮を防止します。
      2. [O] agarose のゲルの電気泳動及び市販のキットを使用してその後ゲル精製結紮製品を分離します。一般的に、最適なライゲーション効率がベクターに挿入の 3:1 のモル比で。
    2. [O] 有能な細菌に結紮製品の大型プラスミドの効率的回収に適した変換 (すなわち, 大腸菌49の熱ショックを実行) のコロニー PCR50 による正しい DNA をかくまっている細菌のクローンを識別して.
    3. [O] 分離は、市販の DNA の準備キットを使用して単一の細菌のクローンから DNA を増幅しました。適切な制限の酵素のダイジェストをコントロールしてゲノムの完全性を確認 (例えばMV ゲノム [M] の同一)。シーケンスによって正しく挿入遺伝子の整合性を確認します。
      注:[M] の transgenes MV H- ATU に挿入実行サンガーによる次のプライマー シーケンス: H-9018 [前方プライマー、MV のゲノム位置 9018 Hオープンリーディング フレーム (ORF) にバインド]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3';L-9249 + (逆プライマー、MV のゲノム位置にバインドL orf 9249): 5' 3' CAGATAGCGAGTCCATAACGG。

2. 免疫調節剤をエンコーディング組換え麻疹ウイルス粒子を救出

  1. [O] (反) ゲノム DNAを介して細胞をトランスフェクション ウイルス生産者それぞれのウイルスの標準的なプロトコルに従ってから組換えウイルス粒子を生成します。無菌条件下での作業のためのガイドラインに従ってください。細胞培養、フードの下で特にのクラス II 生物学的安全キャビネットにウイルスを含むすべての手順に従います。
    1. [M] 麻疹ウイルス cDNA23,24からの救助、プレート MV プロデューサー (アフリカミドリザル腎臓由来ベロ) セル 6 ウェル プレート トランスフェクション前に 24 時間を均等に配分します。種子 2 x 10 の5が、2 mL でトランスフェクション時 65-75% の confluency を達成するためによくあたりのダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を含むをセルします。
      注:[P] セルにはびこるウイルス性分離形成する前に場合細胞の数を減らします。
    2. [P] は、DNA ウイルスのゲノムの対策、必要なヘルパー プラスミドをエンコードとセルを Transfect、プラスミド エンコーディング蛍光レポーター遺伝子導入効率を評価するために必要な場合。
      1. [組換え麻疹ウイルス対策ゲノム、500 をエンコードの M] ミックス 5 μ g 哺乳類発現プラスミド麻疹ウイルス N と L タンパク質と 100 の各 ng プラスミド P 蛋白と総量が 200 μ l 添加 DMEM の蛍光レポーターの各 ng。
      2. リポソーム トランスフェクション試薬の 18.6 μ L を加えてすぐにチューブをフリックで混合室温 (RT) で 25 分間インキュベートします。
      3. [P] 好評につき、媒体を DMEM、2 %fbs、50 μ G/ml カナマイシン (または他の抗生物質の混入を防ぐ) の 1.8 ml 交換井戸の中に滴下トランスフェクション ミックスを追加し、慎重に旋回します。一晩で 37 ° C、5% CO2セルを孵化させなさい。2 ml の新鮮な DMEM、2 %fbs、50 μ g/mL カナマイシンの媒体を交換して次の日培地が酸性になると、この手順を繰り返します。
        注意:[O] ウイルスが以下の手順でトランスフェクションから存在する、細胞とバイオ セーフティ規則に従って材料を処理します。(潜在的に) 感染性廃棄物を適切に破棄します。
  2. [P] を収集し、ウイルス粒子を伝達します。
    1. [P] レポーター遺伝子発現と分離形成 (図 4) 顕微鏡による細胞を毎日観察します。20 個以上の細胞から成る大型の分離が表示されてとき、または細胞があまりにも密になるとウイルスの収穫 (すなわち.、 7-9 日後通常複数のレイヤーで成長を開始するとき)。
      注:[P] 指定したベクター構造体の分離が発生しないこと場合では、救助に失敗したことこれは限りません。ウイルス感染は、サンプルにそれにもかかわらずあるかもしれないと継の新鮮なプロデューサー セルに転送します。
    2. [P] 種子約 1.5 x 106プロデューサー細胞 12 mL に DMEM 10 %fbs、10 cm の予想される収穫または 2.5 倍あたり 10 の6セルの前に 24 h の料理プレート 4-6 時間前 65-75% の confluency ウイルス inoculat の時に達成するためにウイルスの継イオン。
    3. [P] ウイルスの子孫を収集するために慎重に細胞スクレーパーを使用してプレートから付着性細胞をこすり、細胞を遠心管に含む上清を転送します。2,500 x gで 5 分間、4 ° C の遠心分離によって細胞の残骸を削除します。
      注:無断複製されたセルは最適培養条件および潜在的な顕微鏡成果物を犠牲にしてウイルスの持ち越しを最大限に遠心分離せずに直接に譲渡すること。
      注意: [O] 避けるため細胞をこするときにメディアをこぼします。エアロゾルの形成を最小限に抑えます。
    4. [P] 4 mL の最終巻に無血清培地とステップ 2.2.3 から細胞上清を混合して接種を準備します。接種によってプロデューサー細胞の培地を交換し、37 ° C、5% CO2で少なくとも 2 時間細胞を孵化させなさい。10 %dmem の 6 mL を加えて FBS セルを 10% 新鮮な DMEM 12 mL に媒体を変更する前に一晩インキュベートと FBS。
    5. [P] はセルを少なくとも 1 日 2 回と両バーストの前に収穫ウイルスを観察 (すなわち,膜の中断が表示されるとき)。ウイルスの最初の一節を収穫、プレートから上清を除去、無血清培地の 600 μ L を追加、セル リフターで細胞をこすり、きれいなチューブに転送。
      注:[M] ウイルス株51,52感染の進行上によってウイルスの複製と普及を促進する 32 ° C に感染した細胞をプレートを転送します。一般に、MV シュワルツ系統は遅い分離形成が高価の結果、32 ° C エドモンストン B ひずみウイルス感染細胞の転送中の 37 ° C でよく伝播します。
      注:[ウイルス粒子の感染性は低下になるので、収穫時に乾燥する細胞層 P] はできません。いくつかのウイルスは感染細胞の上清を捨てるとき失われたが、高い抗体は細胞層から入手できます。
    6. [P] すぐに液体窒素でウイルスの懸濁液を凍結します。ストア徹底を確保するため、少なくとも 24 時間-80 ° C で凍結。必要な場合は、プロシージャを中断するいくつかの日に拡張します。
    7. 37 ° C で融解してウイルス粒子を解放します。ボルテックス、2,500 x gで 5 分間、4 ° C、遠心分離によって均質化します。ラベル付き cryotubes と-80 ° C で保存場所に培養上清を転送します。
      注:[O] と優先的に一度だけ解凍され使用されてすぐに割り切れるサイズ後で実験のため十分なウイルスを格納します。[P] さらに凍結融解サイクルまたは 4 ° C 以上でウイルス抗体の大幅な削減にいくつかの日の結果でストレージ。
    8. [P] 1 日必要量、力価を達成するためにさらに通過前にシード 4 x 106プロデューサー細胞 10 %dmem の 12 の mL で 15 cm 皿に FBS。0.03 の感染 (MOI) の多様性のウイルスを接種します。無血清培地プレートごとの 8 mL に感染し、10% を DMEM に媒体を変更を複数の板を使用して少なくとも 2 h. スケールのための細胞を培養後 FBS。
    9. 収穫の説明に従ってステップ 2.2.5、分離は全体の細胞層に広がっているとき。手順 2.2.6–2.2.7 で説明したように 50 mL の管およびプロセスで得られた懸濁液をプールします。
      注:[O] それは視覚的に収穫前に細菌および真菌の汚染のすべてのプレートを確認することが重要です。一般に、マイコ プラズマやマルチプレックス PCR による不定ウイルス汚染を定期的にすべての細胞をチェックします。
  3. [P] 評価ウイルス抗体です。96 ウェルのプレートを使用して因数あたり octuplicates のウイルス株の価を決定します。ウイルス救助あたり 3 つの個々 の因数の滴定を行い、平均値を使用して、実験で使用されるウイルスを懸濁液の量を計算します。
    1. [P] プール プロデューサー細胞、カウント、および 10 %dmem で mL あたり 10 の5セル × 1.5 に調整政府短期証券。
    2. [P] ピペット 90 μ L DMEM の 10 %96 ウェル プレートの各ウェルに FBS。
    3. [P] ウイルスの株式市場の 1 つの因数からプレートの最初の列のすべての 8 の井戸に 10 μ L を追加、ピペッティングを上下に少なくとも 10 回で徹底的にミックスします。
    4. [P] ウイルスのシリアルの 10 倍希釈を行います。各ウェルの 10 μ L を転送マルチ チャンネル ピペットを使用して 2 番目の列最初。上下にピペッティングして徹底的にミックスし、各希釈段階の新鮮なピペットのヒントを使用します。最後の列の各ウェルから 10 μ L を破棄します。
      注:各 96 ウェル プレートは、12 ステップのシリアル希釈が可能です。[M] MV ベクトル、10 倍希釈の 8 つのステップは通常十分では、1 x 10 の9セル感染ユニット上の抗体として (ciu)/mL はまれに手順 2.2 で説明した伝搬法によって得られています。[ウイルスなしコントロール P] 井戸は、比較のため、汚染を監視する使用できます。
    5. [P] を各ウェルの細胞懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° c、5% CO2 48 h. 細胞の均一な分布を達成するために懸濁液の細胞塊の不在確認の間加温します。
    6. [P] 光学顕微鏡を使用して分離をチェックします。目に見える分離を含む最高希釈倍率と列の両を数えます。
    7. [P] 8 両の合計数で割ってその列のウェルあたりの両数の平均値を計算します。それぞれの列は、最初の列53 mL あたり 102 ciu で始まるの希釈係数と平均を乗算 (例として図 5を参照)。

3. 免疫調節剤をエンコーディング ウイルスベクターの複製と細胞傷害性の容量を決定します。

  1. [O] 生成された組換えウイルスと 1 つのステップまたは複数のステップの成長曲線 (Gc) と変更されていないベクトルの複製の動態を比較します。ワンステップ Gc のすべてのセル (理論的には、100% 感染症) の同時感染ウイルスの子孫が評価されます。マルチ ステップに従ういくつかの感染細胞の割合が低い Gc 開始ウイルスの複製のラウンド。
    1. [M] の麻疹ウイルス複製の動態の解析、種 10 %dmem の 1 mL で 1 × 105 Vero 細胞 12 ウェル プレート 1 日感染前にウェルあたり FBS。技術的な複製として興味の各 timepoint の少なくとも 2 つの井戸をプレートします。
    2. [O] ワンステップ Gc [M] の高慣性モーメント、または多段低慣性モーメントでウイルスを細胞に感染 (0.03 とベロの MV レプリケーションの 3 セルそれぞれ)。それぞれのウイルス量を含む無血清培地の 300 μ L 中に置き換えると少なくとも 2 h. 削除接種の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい、DMEM の 1 mL の 10% を追加売却、培養を続けると。
    3. [P] 12、24、36、48、72、96 h 感染後など関連する縦長の媒体にセルを直接削ってウイルス子孫を収穫します。各ウェルから個々 のチューブに内容を転送、スナップ-凍結液体窒素で、滴定まで-80 ° C で保存します。
      注:[P] レプリケート サンプルは、平均抗体価の分析のこの段階でプールがあります。
    4. [P] 縦長からサンプルを収集します。ウイルスの子孫の評価の 37 ° C で同時に解凍します。2,500 x gと 4 ° C で 5 分間遠心分離によって渦とペレットの細胞の残骸
    5. [P] 各コンストラクトと前述の timepoint の平均抗体価を計算します。時間の経過とともに抗体をプロットします。ベクトルと挿入された遺伝子、異なる遺伝子または遺伝子の別の位置に挿入なしの成長曲線の比較 (図 6を参照)。
  2. [O] に比べてエンコードと変更されていないウイルスの溶菌活性を比較します。
    1. [O] インピー ダンス測定、乳酸脱水素酵素 (LDH) を含む可能な方法から選択してリリース試金、または代謝ベースの比色セル実行可能性の試金の [例:, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) と 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) 試金]。
      1. [M] 麻疹の細胞毒性を分析するウイルスベクター XTT を使用してアッセイ、種子 Vero 細胞 3.1.1 の手順で説明するよう。各 timepoint の非感染コントロールの複製が含まれます。
        注:[O] に同じサンプル別の縦長の XTT 試金の実行は、技術的なエラーを制限できますが、くり返し洗濯と XTT 試薬への露出に影響を与える実行可能なセルの数。インピー ダンスは、連続測定の代替の読み出しを提供します。
    2. [M] 1 手順 3.1.2 の MOI で Vero 細胞に感染します。
      注:[M] のいくつかのマウス腫瘍細胞株などより少なく任意の標的細胞の感染、3 または 5 の高い慣性モーメントが必要かもしれません。
    3. [O] で関心の縦長 (例えば.、 12、24、36、48、72、96 h 感染後) (すなわち.、よくプラス 10% 超過につき 300 μ L) XTT 試薬の必要量を準備します。光の露出を避けてください。
    4. [M] で各 timepoint それぞれの井戸からメディアを削除します。XTT 試薬 300 μ L で交換し、暗闇の中で 37 ° C で孵化させなさい。コントロール井戸の試薬は通常 15 分と 2 時間の間、深い赤になってとき培養上清を収集し、-20 ° C の凍結
      注:[O] インキュベーション時間はウイルス構造、細胞の種類、密度、および細胞変性効果に依存します。
    5. [O] を収集した後、すべてのサンプルが同時に解凍します。96 ウェル プレートに各サンプルの 100 μ L を転送し、450 の光の吸光度を測定 nm, 630 nm リファレンス波長に。
    6. [O] コントロールをセル実行可能性 (y 軸) のための代理として代謝活性を示す基準としてサンプルの縦長 (x 軸) 対.光吸光度をプロットします。ウイルスの細胞毒性を意味する時間をかけて相対吸光度の減少 (図 6B参照)。

4. 感染した細胞から分泌されるウイルスの免疫調節剤の活動を分析

  1. [O] 分離分泌マウスレニンウイルス感染の標的細胞によって表現される
    1. [P] ウイルス プロデューサー T175 フラスコで 70% の confluency に成長する細胞ができます。
    2. [P] セルからメディアを削除して、12 mL の血清を削除する PBS で 2 回洗います。無血清培地の 0.03 の 12 mL の MOI でウイルスと細胞を接種し、37 ° C および 5% の CO2を一晩インキュベートします。12 ml の新鮮な無血清培地の培地を交換してください。
      1. [M] エドモンストン B ウイルスの 37 から細胞を潜伏感染を容易にするため、分離の早期の破裂を防ぐためのもう一つの 24 h の 40 h 後 32 ° C に転送します。ウイルス株によっては、最適な蛋白質収量、純度の51,52と両の進行、培養温度と時間を調整します。
    3. [P] 慎重に両バーストの前に脱着細胞培養上清を収集します。最適な分離は全体の細胞の層の間で広がっています。50 mL チューブに上清をプールします。
      注:[P] transgene 製品の効率的な精製分離の破裂を避けるため、感染した細胞の培養上清を収穫するときに細胞の残骸を最小限に抑えます。
    4. [P] 細胞の残骸から削除上澄み 2,500 x gと 4 ° C と通過で 5 分間遠心分離によって 0.22 μ m のフィルターを通過します。濾液の容量、に応じて注射器や真空ポンプを使用してこれを実行できます。
    5. [O] させず適切な浄化方法を使用して分離します。によるアフィニティークロマトグラフィーにより exchange Ni NTA ミニ スピン列38ここで簡単に説明 (ステップ 4.1.5.1–4.1.5.4) ヘキサ ヒスチジン (His) の札が付いている蛋白質を浄化します。
      注:[O] 高速かつ氷の上のすべての手順を実行します。バッファーと 4 ° C に前クールなの遠心分離機を事前チルします。
      1. [O] (洗浄液 2、WB2) 20 mM と 500 mM (溶出バッファー、EB) 100 mL の PBS、塩化ナトリウム 200 mM 10 mM (洗濯 1、WB1)、バッファーの最終濃度でイミダゾールとバッファーを準備します。7.0 に pH WB1 と 8.0 WB2 や EB を調整します。精製するタンパク質によってイミダゾールの集中を調整する必要があります。
      2. [O] 平衡 WB1 と 800 × gで遠心するオープン蓋と 2 分のための 600 μ L を持つ列。
      3. [O] 列にフィルターが適用された培養上清の 600 μ L をロードします。コンピューターを閉じたままで 5 分 200 × gで遠心分離して列のマトリックスに彼の付けられた蛋白質の結合を許可します。ロードとバインディングは、300 μ g 列あたりの彼の付けられた蛋白質の合計まで繰り返すことができます。
      4. [O] 三度 WB1 と一度 WB2、またはフロー ・ スルーが無色になるまで洗います。オープンふた付き 2 分 800 x gでバッファーとスピンの 600 μ L を追加します。
      5. [O] 800 x gで 2 分間 EB および遠心分離の 300 μ L で 2 つの溶出のステップを実行することによって新鮮なチューブにタンパク質を溶出します。
      6. [O] 塩分を除く、製品サイズに応じて遠心フィルターを使用して製品を集中します。PBS を 15 mL と 4,000 x gで 10 分間遠心分離フィルターを介してのボリュームに追加します。目的の純度まで繰り返し、濃度を実現します。蛋白質の集中を高めるため 4,000 x gで 40 分間の遠心分離によって約 200 μ L に最終巻を削減します。
  2. [O] 純度と製品の id を確認します。
    1. [O] ビシンコニン酸 (BCA) やブラッドフォードの試金54,55などの標準的な比色試金を使用して分離株における総蛋白質の量を定量化します。[M] 典型的な値は、感染細胞の mL 上清あたり 1-3 μ g 遺伝子製品から設定できます。
    2. [O] タンパク質分離の相対的な定量化のためを介してナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を分離し、Coomassie の56を染色を実行します。
    3. [O] 蛋白質または関連ペプチド タグ57対象とする特定の抗体を用いてイムノブロット精製製品の id を確認します。
    4. [O] 酵素免疫測定法 (ELISA) を含める可能性がありますまたはフローサイトメトリー適切な技術を使用して蛋白質結合特異性の解析 (図 7参照)。セルの結合は、最近記述されている磁気プルダウン分析38を使用して確認できます。
      注:[O] 適切なコントロールを使用します。セル結合アッセイ (図 9) に標的分子を発現していない細胞と非ターゲット蛋白質サロゲート (図 8) のネガティブ コントロールを含めます。流れ cytometry 実験では、正、負、アイソタイプ コントロール (図 7)。
      1. [O] インキュベート共同ターゲット細胞および蛋白質を分離バインディングを許可します。[BTEs の解析を末梢血にバインドするには B] 人間の血58から分離した単核球 (PBMCs) インキュベート 106セル 200 x 2.5 1 %100 μ L の PBS の BTE の ng FBS (結合バッファー、BB) 氷の上に 1 時間。
      2. [1 ml の自由な蛋白質を削除する BB のセルを洗浄する B]。5 分間 300 × gで遠心、上清を破棄し、BB の 100 μ L でペレットを再懸濁します。興味の蛋白質または関連ペプチドのタグのいずれかを標的とするビオチン化抗体を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。BTEs インフルエンザ ヘマグルチニン (HA) タグで、反-ハ-ビオチン (クローン 3F10) の使用 100 ng のため。
      3. [B] BB の 1 mL で 2 回細胞を洗浄し、BB の 80 μ L で再懸濁します。ストレプトアビジン結合磁性ビーズの 20 μ L を追加し、4 ° C で 15 分間インキュベート
      4. [B] 洗浄一度余分なビーズを外し、2 ミリメートルの EDTA (CB 列バッファー) を添加した BB の 500 μ L でペレットを再懸濁します。
      5. [B] 列とプロバイダーのマニュアルによるとマグネット スタンドを持つ細胞を分離します。
        1. [B] 500 μ L CB 重力流によって列を通過するを許可することで平衡します。
          注:[B] 列決して乾燥を実行する必要があります。ピペットで移しなさい慎重にドガの泡を避けるためにバッファーと。
        2. [B] 列の下できれいなチューブを置き、列にセル/ビーズ懸濁液を適用します。3 回洗浄あたり CB の 500 μ L で列を洗います。懸濁液の管内には、少なくとも最初の洗浄のステップの流れをサンプルを収集し、氷の上を格納します。
        3. [B] magnetic field によって保持ビード区切細胞を溶出します。このため、マグネット スタンドから列を削除、クリーン チューブの上に置きます、CB の 1 つの mL を追加、すぐに列をバッファーをプランジャーを使用して管に押し込みます。氷の上の管を保ちます。
      6. [B] 遠心チューブ 16,000 x gと細胞のペレットへの 4 ° C で 20 分間含むフローを通じて、溶出サンプルです。培養上清を破棄し、radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファーに細胞を溶解 (推奨: 75 μ L)。SDS ページ56を実行します。
      7. [B] 適切な一次抗体を用いた免疫ブロットを実行します。遺伝子プロダクトまたは細胞の蛋白質に抗体が対象 (例えば.、 β-アクチン,図 8) BTE セルの結合を評価します。
  3. [O] 孤立した免疫の免疫学的機能を評価します。
    1. [O] エンコードに比べて特性に応じて関連アッセイを識別します。予想される免疫調節活性に関する細胞増殖を評価する方法の移行、成熟、アクティブ化、または細胞毒性を適用できます。
      注:[O] 細胞の増殖は、CFSE59ラベルまたはキ67 染色60で分析できます。Transwell または最初の実験は、細胞移行61を分析に使用できます。成熟と細胞の活性化は、それぞれのマーカーの染色、適切なプロトコルを使用して評価できます。[BTE を介した細胞毒性を評価するために B] 利用可能な技術は、インピー ダンス測定とクロム リリース試金。クロム リリース試金を選ぶ場合、は、放射性物質を処理するときに適切な安全対策を観察します。
    2. [B] 非放射性代わりとして次詳しく説明します (前に説明した簡単な38) LDH リリース試金によって BTE 誘発、細胞媒介性細胞毒性を評価する方法。
      1. [B] 実験中にテストする条件を決定 (例として図 9を参照)。縦長 (数時間数日から) 濃度 (μ g/mL に pg/mL) に比べて、ターゲット セル (E:T) 比 (1:50 と、たとえば 50 分の 1) の間にエフェクターを変えることができます。常に準備をトリプリケートします。
      2. [B] ほか、蛋白質がなければサンプルやエフェクター細胞なし自発 LDH のコントロール リリース (Tspと Esp)、1 つのセル型のターゲット セル換散の最大コントロール (T最大) 洗剤で読み出し、媒体の前に追加のみコントロール、および T最大のボリューム コントロール。
        注:[B] 必要な数の標的細胞と培養時間は、異なります。エフェクター細胞と最適なパラメーターを識別するために免疫なしの初期テストが実行されました。Tspと T最大サンプルと異なる細胞数と縦長の評価に対応するコントロールが含まれます。
      3. [B] (PBMCs58を取得する人間の血液の密度勾配遠心法) またはマウス脾細胞62からマウスの T 細胞の否定的な選択によって例えば、免疫エフェクター細胞を分離します。
      4. [B] シード対象ステップ 4.3.2 に従って細胞 (例えば,ウェルあたり 5 x 10) U 下 96年ウェル プレートで。
      5. [B] 各サンプルに必要な濃度で分離されたタンパク質を追加します。必要な比で免疫エフェクター細胞を追加します。培地を 100 μ L/ウェルの容量に追加します。
      6. [B] 加温時間枠決定のステップ 4.3.2、通常 4 と 48 h (24 h prestimulated 免疫細胞のインキュベーション時間の短縮を適用できます些細 PBMCs の新鮮単離マウス T 細胞の 48 h)、37 ° C および 5% の CO2
      7. [サンプルを収集する前に B] 45 分は T最大サンプルと中の対応するコントロールを含む井戸に 10 x 溶解液の 10 μ L を追加します。潜伏を続けます。
      8. [B] セル 250 x gフラット底 96 ウェル プレートにそれぞれの上清の 4 分転送 50 μ L でスピンダウンします。LDH 細胞結合を避けるためにセルを転送しないでください。
      9. [B]、メーカーによると基板ソリューションを準備します。50 μ L を各ウェルに加えるし、30 分間または T最大サンプルに深い赤まで暗闇の中で RT で孵化させなさい。
      10. [B] 停止液を 50 μ L を各ウェルに加えます。4,000 x gで、手動で中空の針で 1 分間遠心分離によって空気の泡を削除します。490 で光の吸光度を測定 nm。
      11. [B] 各サンプルの % 特定の換散値を計算します。
        1. [B] 換散ソリューションとメディア コントロールの複製の平均を計算します。それぞれ実験サンプルと Tマックスと自発的なリリース コントロールから取得した値を減算します。後続の計算でこれらのバック グラウンド補正の値を使用します。
        2. [B] 背景修正 Tmax、Tsp、および Espコントロールの平均を計算します。これらの平均値を使用して、次の式は、各サンプルの特定の換散の割合を得られます。

          Equation 1
        3. [B] タンパク質濃度% 特定の換散の値または E:T 比率をプロットし、非ターゲット コントロールのサンプルと比較します。

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Representative Results

図 1は、二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコーディング腫瘍溶解性麻疹ウイルスの作用のメカニズムを示しています。このプロトコルのワークフローを示すフローチャートを図 2に示します。変更された腫瘍溶解性麻疹ウイルスのゲノムの例を図 3に示します。これは挿入された遺伝子の麻疹ウイルス対策ゲノムと特定機能に適用される特定の変更の視覚的表現を提供します。典型的な麻疹ウイルスによる分離は、図 4に描かれています。実験を繰り返す場合、細胞数を低下ことがあることを示す救助 (a, B)、収穫の timepoint で高い細胞密度に注意してください。培養温度と時間は、Vero 細胞 (C, D) プレート間の分離の向上普及を達成するために通過の最適化可能性があります。図 5は、典型的な滴定分析の結果を表します。図 6ワンステップ成長曲線 (A)、(B) そのまま (MV)、BTE エンコーディング接種後相対セル実行可能性腫瘍溶解性麻疹ウイルス (MV-H-mCD3xhCD20) が表示されます。Vero 細胞に比較してベクトルの成長曲線と同様、transgene エンコーディング ウイルスの溶菌活性は、マウス腫瘍細胞株で後ろ遅れます。フローサイトメトリー BTEs と 5 つの異なる希釈率で培養したターゲット抗原発現細胞のデータは濃度依存的に細胞によって BTE バインディングを示す図 7で提供されます。図 8は、BTE 関連細胞の磁気プルダウン後模範的なイムノブロットを表します。BTE サンプル (t1, t2) をターゲットにバインドされたセルを示す溶出画分のバンドを認めたに対し、(n1、n2) 非ターゲット BTEs とプルダウンは細胞の検出量を出なかった。BTE を介したマウス T 細胞のターゲット抗原特異的および濃度依存性の細胞毒性は、図 9に代表的な LDH リリース試金によって示されます。

Figure 1
図 1: エンコード二重特異性 T 細胞 (MV BTE)「道具的腫瘍溶解性麻疹ウイルスの作用のメカニズム。腫瘍細胞の感染 (感染: 灰色、感染していない: 水色) MV BTE とウイルス複製と拡散が続くが腫瘍の細胞の換散および免疫の刺激の結果、腫瘍全体。同時に、[抗体 (黄色) の T 細胞と腫瘍表面抗原 (青) で CD3 をターゲットから派生した単一の 2 つの鎖から成る] BTEs が生産し、ローカル ウイルス感染細胞から分泌されます。腫瘍細胞と架橋 BTE を介した休んで、さらに腫瘍細胞の殺害の結果としてポリクローナルの T 細胞の活性化を誘導します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 設計、生成、および免疫調節遺伝子をエンコーディング新規ウイルスベクターを評価のワークフローを記述するフローチャート。ステップ 1 から 4 は、プロトコルのそれぞれのセクションを反映しています。箇条書きは、関連性の高い考慮事項と手順を示します。プロシージャの実証的な性質のため、調整や改良がワークフローのすべてのステップで必要になります。さらに、実験結果は、新しい仮説につながるでき、追加ベクトルまたは併用治療の開発を刺激することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 麻疹ウイルスゲノムの略図。強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) は、リーダー (ld) シーケンスの追加転写ユニットを下流にエンコードされます。N、P、M、F、H、L 指定可視化を発現されるそれぞれ、麻疹ウイルス構造タンパク質核タンパク質、P タンパク質、マトリックス蛋白質、融合タンパク質、ヘマグルチニン蛋白および大きい蛋白質 (ポリメラーゼ) をコードする遺伝子上記。二重特異性 T 細胞「道具的 (BTE) 遺伝子は、追加転写単位 (ATU) 下流H開いたリーディング ・ フレームに挿入されます。遺伝子は、インフルエンザ ヘマグルチニン (HA) と同様に、効率的な分泌の Igκ リーダーのペプチッドとの検出そして浄化のためのヘキサ ヒスチジン (His) タンパク質タグをエンコードします。(VL) ドメインそれぞれ、CD3 や CD20 を対象とした抗体の可変重 (VH) と軽鎖をコードする遺伝子は、グリシン (G) とセリン (S) 残基を含むペプチド リンカー配列を介して接続されています。遺伝子シーケンスには、コザック シーケンスが続きます。コーディングの下流地域、ヌクレオチドは exemplarily 六つのルールに準拠するために含まれています。挿入カセットが隣接している 2 つの制限のサイトそれぞれ ATU に挿入を有効にします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 麻疹ウイルスによる分離します。(A, B)Vero 細胞が強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) と、二重特異性 T 細胞「道具的 (BTE) マウス CD3 とヒト CD20 をターゲット エンコーディング組換え麻疹ウイルス救助ため cDNA をトランスフェクトしました。蛍光シンシチウム (白い矢印) の存在は、感染ウイルスの救助に成功したことを示します。(CD)麻疹ウイルスは救助後に収穫され、ベロ細胞 (1 通路) に反映されます。大規模な分離を形成しているし、バースト (黄色の矢印) を既に始めています。画像は (B, D) 位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡による励起 80 ms (A) と (C) 100 ms 後に買収されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 滴定分析代表結果。MV-H-mCD3xhCD20、BTE エンコーディング腫瘍溶解性麻疹ウイルス、Vero 細胞の 3 分の 1 通過バッチの滴定96 ウェル プレートに 10 倍連続希釈を行った、列 1 のウイルスの懸濁液の 10 μ L から始まる両表示がない欄 7、ゼロによって示される。6 列にウイルス懸濁液の次の最も低い希釈用 mL ウイルス懸濁液あたり約 6 × 107細胞感染単位 (ciu) の最終価結果ウェルあたり 6 両の平均は観察されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 複製の動態と組換え麻疹ウイルスの細胞壁溶解活性します。(A) ワンステップの成長曲線が変更されていない腫瘍溶解性麻疹ウイルス (MV) とエンコーディング、二重特異性 T 細胞「道具的 (MV-H-mCD3xhCD20) 1 の MOI で麻疹ウイルスの Vero 細胞伝染後に生成されました。子孫のウイルスの抗体価は、感染、似たようなウイルス複製の動態を示す後指定された縦長で評価しました。(4 つの技術は timepoint あたりの 2 つの生物学的複製の各レプリケートされます) 8 個のサンプルの標準偏差と意味が表示されます。MC38 マウス大腸癌の生存率が評価された (B) 細胞は人間癌胎児性抗原と MV 受容体ありなさい CD46 を安定に発現する細胞 (MC38-CEA-ありなさい CD46) 中唯一 (もどき) や 1 の MOI で示されたウイルス接種後。XTT セル実行可能性の試金は示された縦長で行われました。セル実行可能性の減少はそのままベクトルの以前の縦長で観察されました。細胞ストレスに起因する可能性があります感染後まもなくしばしば 12 h timepoint で MV H mCD3xhCD20 の計算として、100% 以上の値が観測されるまたはウイルスの懸濁細胞由来因子。各 timepoint の平均値プラス 3 つの技術的な複製の標準偏差が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 二重特異性 T 細胞化クリニカルパス (BTEs) によるターゲット セル結合表現麻疹からウイルス感染細胞。人間のマントル細胞リンパ腫細胞の CD20 を内生的表現 (グランタ-519) それぞれ 2、4、6、8、または 10 μ L (A) 精製 mCD3xhCD20 BTE ソリューションと孵化によってそれに続く Fc 受容体をブロックするひと免疫グロブリン G を添加します。BTE バインドされたセルは、フィコエ リスリン (PE) を使用して検出された-BTE 関連付けられた HA タグを標的と共役する抗体。陽性細胞の割合は、BTE 濃度と相関。選択度と結合の特異性 (B) を制御します。BTE が BTE を対象とした抗体のみ (細胞に対する抗体の非特異的結合をコントロール) または興味のセルにバインドする知られている BTE ない培養細胞のサンプルを含む独立した実験からコントロールをここに示すように、、BTE を対象とした抗体 (肯定的な制御) またはアイソタイプの抗体の孵化が続きます。可能な場合、結合選択性をさらに確認同質細胞選択のターゲット抗原を発現していないが使えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: 磁気プルダウンのひと末梢血単核球 (PBMCs) 麻疹ウイルス エンコード BTEs によってバインドします。それぞれヒト T 細胞を標的 (t1, t2) または非ターゲット コントロール BTEs (n1, n2) の 2 つの異なるバッチ培養細胞。BTE バインド細胞磁気ビーズを用いた柱の保持、ペレット、, 分離.Β-アクチン lysates はイムノブロットによって検出されました。溶出サンプル バンドの強度は、相対的な BTE セルの結合を示します。フロースルー標本は、すべてのサンプルの細胞の存在を確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9: 細胞傷害活性の麻疹ウイルス エンコード BTEs 。標的腫瘍細胞 (5 x 10 B16 CD20-ありなさい CD46 細胞/ウェル) 1:50 の比率でマウスの T 細胞を培養します。BTEs MV H mCD3xhCD20 感染細胞の培養上清より精製した以前は、示された濃度で追加されました。BTE を欠けている 48 h. 細胞を対象と抗原 (B16 ありなさい CD46) 抗原特異的細胞毒性を評価するための参照を務めた後、標的細胞の相対的な換散は LDH リリース試金によって評価されました。手段に加えて、サンプルごとの 3 つの技術的な複製の標準偏差が表示されます。ターゲット抗原発現細胞を特に BTE 濃度依存的に溶解し。BTE 製品とターゲット抗原の発現の純度影響セル殺害をレベルします。現在の例では、15% の特定のセルの殺害は BTE の比較的高い濃度 1 μ G/ml ので達成しました。長い共同インキュベーション時間と準の T 細胞培養条件でこのような実験装置の典型的な値です。その他の設定を 60% に特定の殺害だった使用して実現 BTEs、MV に感染した培養上清より精製した 100 ng/mL の高い38BTE 濃度でプラトーに達すること。これは、反直感的に、この試金の限界は 100% 未満を示します T最大コントロール共培養サンプルと比較して異なる成長の動力学によって説明することができます特定の殺害。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

腫瘍溶解性免疫療法 (すなわち.、免疫との組み合わせで超過) 開発と腫瘍溶解性ウイルス免疫調節蛋白質をコードの最適化をさらに求めて、癌治療のための偉大な約束を保持します。このプロトコルでは、生成および関連する前臨床モデルと抗がん治療に潜在的な将来の臨床翻訳して後続のテストのようなベクトルを検証する方法について説明します。

明確な利点を持つ多数の異なる腫瘍溶解性ウイルス プラットフォームが利用可能な63です。がん特異性、ベクターの安全性、製造要件、腫瘍の細胞の換散と免疫応答の誘導における有効性、に加えて容量をクローニング、免疫調整物質特定の的を使用して成功したベクトル化にとって重要であります。残念ながら、異なる OVs の直接の比較は欠けている現在、個々 の患者に最適な治療法の選択肢を識別するために追求されるべき。MV BTE のここで例示されているよう、これは合理的な開発を促進し、新規の遺伝子符号化ベクトルのテストによって促進することができます。MV (すなわちoncotropism、安全性、fusogenicity、免疫原性、遺伝子組み換えの可能性) の有益な特性の与えられたこのプロトコルはこの腫瘍溶解性ベクトル、その他 OV、特にパラミクソ ウイルスに一般化することができるに焦点を当ててください。.

候補遺伝子 (ステップ 1.1.1) として潜在的に関連する免疫調節剤の合理的な選択は、癌免疫のサイクルの理解不可欠、必要不可欠な体系的文献研究を行うです。さらに、大型スクリーン、しかし高価な新しいターゲットを識別するために貴重な証明することが (例えば、パテルら41を参照)。

組換え OVs のデザインは、必要な発現プロファイルを検討してください。RNA ウイルスの場合遺伝子はそれぞれのポリメラーゼによって RNA レベルで制御されます。MV ゲノム (ステップ 1.1.2) に挿入するため遺伝子カセットを設計するときは、成功ベクトル開発にとって重要が MV ポリメラーゼ遺伝子の開始/停止信号と RNA サイトを編集および六つのルールを次のようにシーケンスを回避します。また、パラミクソ ウイルス遺伝子発現レベルは式勾配43から生じるゲノム内の位置に対応します。一般に、レプリケーションを犠牲にして表現を増加上流位置に遺伝子の位置決め。ただし、これらのパラメーターは、サイズ、構造、およびそれぞれの遺伝子の順序に依存します。したがって、このプロトコルで記述されている方法の制限は、新規ベクター デザインの実証テストの必要性です。内の特定の例、遺伝子シーケンスを調整または配置希望のベクトル特性 (図 2) を達成するために必要があります。チェックポイントの抗体のための異なる位置の体系的な比較は、 HATU (未発表データ), 最適な結果を挿入します。BTE の挿入がある対等な特性 (サイズと免疫グロブリン ドメイン) は、MV BTE ベクトルが同様複製され38

感染粒子ウイルス cDNA (ステップ 2.1) からの救助は、いくつかの構成要素のいくつかの試みを必要があります。セル番号を調整分離形成の細胞密度を最適化できます。特定の密度は効率的な細胞に拡散と細胞膜の融合のために必要な接触阻止はウイルス複製を低減します。さらに、伝染性の粒子の数は目に見える細胞融合を誘発する十分なできない場合があります。しかし、ウイルスは分離のない状態で存在することができます、救助サンプルそれにもかかわらず収穫でき新鮮なプロデューサー細胞電位伝搬のために転送。質の悪い DNA または不適切なまたは劣化したトランスフェクション試薬による非効率なトランスフェクションは、比較的評価し、新しい DNA の準備を生成し、それぞれ異なる試薬を試験によって改善しやすい典型的な問題を表します。

成功したウイルスの伝搬 (手順 2.2) はウイルスの複製と細胞の換散を決定する条件に決定的に依存しています。プロデューサー細胞数の低い通路を使用することをお勧めしますと感染細胞分離進行を定期的にチェックする必要があります。セル番号を調整、温度、およびインキュベーション時間する必要があるウイルスの拡散対.細胞の増殖のバランスをとる。

ウイルスの生産の方法の重要な制限は、原油のセル lysates からウイルスの懸濁液の準備です。研究者は、ウイルスの懸濁液に細胞因子が含まれていることを認識する必要があります。ウイルス粒子は感染粒子および細胞残骸のまた可能性がある濃度の合計数を犠牲にして密度勾配/ショ糖クッション遠心濃縮を介してすることができます。ウイルスは、感染細胞培養上清、純度の増加が、全体の収量を減らすことから集中することができます。GMP と大規模のパラミクソ ウイルスの生産は通常細胞増加価降伏63用バイオリアクターの純フィラメントでシードの複数の層を使用して実行されます。正確な監視、連続メディア交換、無血清条件、その後濾過手順を作り出されたウイルスの高純度を確認します。

経由でウイルス抗体価 (手順 2.3 および 3.1) の評価説明の分離計測法は正確でないが、実行する簡単だし、技術の十分な番号を使用するとき十分に正確な複製。OV 媒介性細胞傷害 (ステップ 3.2) を評価するには、利用可能なアッセイの制限と見なされる必要があります。代謝アッセイでは、細胞増殖抑制と細胞傷害性に及ぼす実験的治療は区別しません。細胞崩壊を測定するには、LDH リリース試金を実行する可能性があります。ただし、両方のタイプの試金は、原油のセル lysates (図 6) からウイルス製剤の内容によって影響を。

ウイルスに感染した細胞 (手順 4.1) が発現するタンパク質の単離収率、純度、それぞれの遺伝子とウイルスの使用によってだけでなく、技術的な正確さで大きく異なります。したがって、蛋白質の浄化の品質管理は関連の実験結果の評価のため重要です。

可能な免疫調節剤等の多岐に渡る潜在的な機能アッセイの網羅的な説明はこのドキュメントの範囲外ですが、このプロトコルは、ex vivo 細胞毒性 (ステップ 4.3) を測定する方法について説明します。Cd 8 + T 細胞によって特に、細胞毒性は成功した免疫療法64免疫腫瘍制御の重要なメディエーターです。特に抗腫瘍免疫応答が全体的に向上する抗体を用いた免疫療法手法と二重特異性 T 細胞化クリニカルパスで重要な意味を持ちます。腫瘍溶解性ベクトルによるローカル BTE 式38 RNA と DNA ウイルス65,66,,6768などを含むいくつかの前臨床試験で有望な結果をもたらした。

腫瘍、ウイルス、transgene 製品、および生きている有機体の宿主免疫系の複雑な相互作用に起因に比べてエンコード腫瘍溶解性の検証は、ここでは十分な治療結果を予測するよう細胞培養のベクトルします。重要なは、ベクトルおよび免疫調節剤の機能の提案された分離評価はそれぞれ、概念実証のために不可欠ですが、潜在的な相乗効果と腫瘍微小環境の複雑な相互作用を記述する失敗します。さらに新規組換えベクターの開発構築しますが、簡単に実現はない、毒性および関連する動物モデルでの有効性のテストは重要です。ニホンザルなど非ひと霊長類における免疫学的安全性を定期的に監視し、体内用マウス モデル有効性分析20,69。これらのモデルの多くは、ホスト組織とホストのウイルス受容体の発現に関する限界があるし、いくつかは不十分だけ OV、腫瘍免疫の微小環境の複雑な相互作用を模倣します。したがって、適切なモデルの注意深い考察は必須です。

MV BTE 治療は以前ひと異種移植と同系マウス モデルで評価されています。BTE 導入遺伝子が製品が BTE エンコーディング MV38を投与したマウスの血清中に検出可能なもの、なくても全身曝露量に関する予防の成功を示すの減衰をさらに、当然のことながら oncotropic ワクチン株ウイルス。ローカル式の全身投与は有害である OV エンコードの免疫にとって重要です。再細胞表面マーカー選択70,71,72と強化された oncotropism73,74 (マイクロ Rna に基づく解除対象に対象指定する場合、必要に応じて腫瘍特異性を高めることができます。ルイス ・ ラッセル75によって再検討されました)。診断目的77,78またはプロドラッグの遺伝子の挿入を含む特定治療用途 (Miest とカッタネーオ76によって再検討されました) のベクトルを最適化する追加の変更が生じます化学療法79,80, 安全性の導入による副作用を最小限に抑えるための変換は、81腫瘍間質や血管系 (例えば、バイスペシフィック抗体82) 経由のターゲットを切り替えます。

別にウイルスのベクトルの遺伝的改変は、レジメンとキメラ抗原受容体 (車) T 細胞と転送83、化学療法84,85,86、または放射線治療87,88,さらに89は、超過作業時間のレパートリーを増大させます。関連のパラミクソ ウイルス90のそれらのための封筒の糖蛋白質の交換など抗体の中和を回避するための戦略が開発されている MV 免疫は非常に普及し、携帯キャリアを用いた微粒子のポリマー コーティングウイルス、および一時的な免疫抑制療法 (ラッセルら6によって再検討されました) を提供します。高度な OV 免疫療法の更なる発展は、安全性と患者材料との適切な動物モデルで、最終的には、臨床試験で治療効果のテストが必要です。

可能な組み合わせの茄多を考えると、包括的なテストは不可能です。数理モデルは、潜在的な組み合わせ療法の優先順位付けと同様、それぞれの投与とインシリコ (サンティアゴら91によって再検討されました) の治療成績を予測することでスケジュールの助けることができます。小説の有効性をテストする場合合理的に設計ベクトル、トランスレーショナルリサーチに伴うサウンドは基になるウイルス学的および免疫学的プロセスのより深い理解に役立ちます。これは一般的に、さらに潜在的なターゲット、および分野の進歩についての適切なモデルの生成に不可欠です。結論としては、ベクトルの設計、生成、および仕事のこの行の特性の関連するメソッドに直接洞察力が開発を加速し、今後臨床の治療薬探索をサポートします。

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Disclosures

西暦 Engeland がん Immunovirotherapy ハイデルベルク大学が所有する特許に関する RNA ウイルスの co 発明家として表示されます。J.P.W. Heidbuechel は、何も開示します。

Acknowledgments

これらのメソッドは、ハイデルベルクの腫瘍疾患国立センター教授博士博士男 Ungerechts が率いる Virotherapy グループで設立されました。彼と特に博士トビアス斑点、博士 Rūta Veinalde、ジュディス ・ フェルスター、ビルギット Hoyler、ジェシカ アルバート研究室チームのすべてのメンバーにお世話になっております。この作業によって、他 Kröner ・ フレゼニウス財団を支えられた (西暦 Engeland に助成金 2015_A78) とドイツ国立科学財団 (DFG、西暦 Engeland に EN 1119/2-1 を付与)。J.P.W. Heidbuechel は、がん研究のため大学院国際ヘルムホルツによって給付金を受け取ります。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Life Science, Mannheim, Germany 4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot K1231
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Germany 28704
NEB 10-beta Competent E. coli New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany C3019I
LB medium after Lennox Carl Roth, Karlsruhe, Germany X964.1
Ampicillin Carl Roth, Karlsruhe, Germany HP62.1
QIAquick Miniprep Kit QIAGEN, Hilden, Germany 27104
Restriction enzyme HindIII-HF New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 31966-021
Fetal bovine serum (FBS) Biosera, Boussens, France FB-1280/500
FugeneHD Promega, Mannheim, Germany E2311 may be replaced by transfection reagent of choice
Kanamycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany K0129
Vero cells ATCC, Manassas, VA, USA CCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg available upon request
Granta-519 DSMZ, Braunschweig, Germany ACC 342
Opti-MEM (serum-free medium) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) PromoKine, Heidelberg, Germany PK-CA20-300-1000 includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns QIAGEN, Hilden, Germany 31014
Sodium chloride Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.3
Imidazole Carl Roth, Karlsruhe, Germany I5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa Merck, Darmstadt, Germany UFC901024
BCA Protein Assay Kit Merck Milipore 71285-3
IgG from human serum Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I4506
Anti-HA-PE Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-257 RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody BD Biosciences, Heidelberg, Germany 555749 RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 12158167001 RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-090-485
MS Columns Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
MiniMACS Separator Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-303
RIPA buffer Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA MB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega, Mannheim, Germany G1780 includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifter Corning, Reynosa, Mexico 3008
10 cm dishes Corning, Oneonta, NY, USA 430167
15 cm dishes Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 639160
96-well plates, U-bottom TPP, Trasadingen, Switzerland 92097
96-well plates, flat bottom Neolab, Heidelberg, Germany 353072
6-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353046
12-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353043
50 mL tubes nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany 02-572-3001
T175 cell culture flasks Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot 159910
0.22 µm filters Merck, Darmstadt, Germany SLGPM33RS

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