בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNAs חוץ-תאית, מחזורי (exRNA) מיוצרים על ידי סוגי תאים רבים של הגוף, קיימים רבים בנוזלי גוף שונים כגון, פלזמה, סרום, חלב שתן ורוק. תת-קבוצה אחת של אלה RNAs הן הרגולטורים posttranscriptional – מיקרו Rna (miRNAs). להתוות את miRNAs המיוצר על ידי סוגי תאים ספציפיים, מערכות התרבות במבחנה ניתן לקצור, פרופיל exRNAs נגזר ערכה אחת של תאים. הגורמים המופרש של גזע mesenchymal הם מעורבים שיכוך במחלות רבות ומשמשת כמערכת מודל במבחנה כאן. מאמר זה מתאר את התהליך של איסוף, טיהור של RNA קטנים, ספריית לדור רצף miRNAs חוץ-תאית. ExRNAs ממדיה תרבות שונים מ- RNA הסלולר על ידי כך נמוך דגימות קלט של RNA, שלאיראן נהלים מיטביים. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף כדי exRNA קטן רצף ממדיה תרבות, מציג בקרת איכות מחסומים בכל שלב במהלך טיהור exRNA ורצף.

Introduction

חוץ-תאית ופיזור RNAs (exRNAs) הן נוכח נוזלי גוף שונים עמידים לכיוון RNases1,2. שפע גבוהה, היציבות וקלות הנגישות שלהם הם אטרקטיביים להערכה קלינית סמנים אבחון ו prognostic3. מצב התחבורה עבור exRNAs כוללים חוץ-תאית שלפוחית (EVs), שיוך lipoproteins (כגון ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה; HDL) ואת מתחמי ribonucleoprotein (כגון עם מתחמי Argonaute2)4.

תת-קבוצה של exRNAs הם מיקרו Rna (miRNAs), אשר הם קטנים ללא קידוד RNAs של 22 nt המווסתים ביטוי גנים posttranscriptional. לשעבר-miRNAs היו מעורבים תקשורת ורגולציה של הומאוסטזיס תא5. לדוגמה, ה-HDL מספק לשעבר-מיר-223 לתאי אנדותל להדחיק אדהזיה המערכת מולקולה 1 (ICAM-1) ודלקת6. מעניין, מיר-223 גם נתפסת מועבר על ידי שלפוחית חוץ-תאי של לויקוציטים לתאי סרטן ריאות, תכנות אותם לקחת על פנוטיפ פולשניים יותר7. לפיכך, transcriptome של לשעבר-miRNAs מ בנוזלי הגוף השונים, תא תרבות בינוני ישפרו הבנתנו לשעבר-miRNA איתות.

RNA קטנים רצף (seq RNA קטנים) הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי להבין את transcriptomics של RNAs קטן. לא רק דוגמאות שונות ניתן להשוות בין ביטוי באופן שונה RNAs ידוע, אבל הרומן RNAs קטן גם ועוזרת מאופיין. כתוצאה מכך, זה גם שיטה חזקה כדי לזהות באופן שונה ביטוי miRNAs בתנאים שונים. עם זאת, אחד הקשיים של seq RNA קטנים הוא הקושי ליצירת ספריות seq RNA קטנות של נוזלים קלט exRNA נמוך כמו נוזלים מוחי שדרתי, רוק, שתן, חלב, סרום ומדיה תרבות. פרוטוקול TruSeq RNA קטנים הספרייה במכינה מ אילומינה דורש כ 1 µg של RNA סך באיכות גבוהה ודורשת פרוטוקול NEBNext קטן RNA הספרייה במכינה להגדיר מ ניו אינגלנד Biolabs 100 µg ng-1 /8,רנ א9. לעיתים קרובות, RNA הכולל מדגימות אלו הם מתחת למגבלה זיהוי עבור מכשירים UV-vis קונבנציונלי.

לשעבר-miRNAs נגזר נוזלי הגוף הם סמנים prognostic ואבחון פוטנציאל טוב. עם זאת, על מנת לחקור את ההשפעות פונקציונלי או כדי לקבוע את מקור ספציפי לשעבר-miRNAs, מערכות התרבות תאים משמשים לעתים קרובות במקום. גזע mesenchymal (MSCs) נחקרו בהרחבה כי היו מעורבים שלהם EVs שיכוך במחלות רבות, כולל אוטם שריר הלב, מחלת אלצהיימר, שתל מול מארח מחלות10. כאן, נדגים הטיהור של לשעבר-miRNAs מ MSCs הנגזרות מח העצם (BMSCs) והשלבים ספציפיים השתמשו כדי לייעל הבנייה ספריית RNA קטנים, רצף וניתוח נתונים (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: מדיום הגידול של תא גזע Mesenchymal (MSC מדיה) מוכן מראש כמצוין בטבלה של חומרים.

1. תרבית תאים

הערה: ניתן לקבל גזע אנושי mesenchymal מח העצם, רקמת שומן או מקורות אחרים11. לחלופין, ניתן לקנות hMSCs דרך הספק. BMSCs בשימוש פרוטוקול זה נגזר ממח העצם של חולים, קנה מחברה.

  1. הפשרת עונה 1 פרק 106 BMSCs לתוך בקבוקון T175 המכיל 20 מ של מדיה MSC. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיה כל 2-3 ימים עד 80% confluency.
  2. לשטוף את התאים עם 5 מ של 1 x PBS וזורקים את PBS.
  3. לנתק את התאים על-ידי הוספת 5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, המקננת את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. הקש על צידי הבקבוק כדי להקל על ניתוק.
  4. להוסיף 15 מ"ל של מדיה MSC כדי להשבית את טריפסין, לנתק את התאים מן השטח, והוא פיפטה למעלה ולמטה כדי להשיג את המתלים תא בודד.
  5. לאסוף את התאים שפופרת 50 מ ל ו ספין למטה בשביל 5 דקות ב x 300 גרם כדי הצניפה התאים.
  6. Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיה MSC ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    הערה: ראשי אנושיים מוח העצם MSCs ב 80% confluency בבקבוקון T175 הוא בסביבות 2 x 106 תאים.
  7. HMSCs צלחת-2,000 תאים/cm2 בתקשורת MSC טריים ב- 5 מבחנות T175. לגדל את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיה כל 2-3 ימים עד 5 מבחנות של 90% confluent T175 מבחנות מתקבלים.

2. EVs ואוסף מולקולות RNA-הקשורים

הערה: EV אוסף המדיה הוא הכין מראש (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco [DMEM] עם 10% סרום שור בעובר [FBS] ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין [P/S]). EV אוסף המדיה מדיה MSC נורמלי, אך המוכנים FBS מדולדל EV מסחרי (טבלה של חומרים). זה כדי למנוע זיהום exRNA שור מ FBS, אשר בדרך כלל מכילה exRNAs המשויך EVs ribonucleoproteins, lipoproteins. הכנה קטנה RNA ספריה, נדרשים exRNAs נגזר 5 מבחנות confluent של MSCs כדי לאפשר בניית ספריה.

  1. לשטוף את התאים 3 x עם 20 מ של PBS לכל T175 את הבקבוק. הוסף 20 מ של EV אוסף המדיה לכל confluent T175 הבקבוק של MSCs, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.
  2. לאסוף את המדיה ואת centrifuge את המדיה עבור 10 min ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס.
  3. לאסוף את תגובת שיקוע, centrifuge את המדיה עבור 20 min ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  4. לאסוף את תגובת שיקוע, centrifuge את המדיה עבור 30 min ב 15,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. ואז לאסוף את תגובת שיקוע.
  5. להעביר את המדיה ultracentrifuge צינורות, גלולה את exRNAs במשך 90 דקות ב-100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. רוטור זווית קבועה משמש כאן ומעוגן בגדר לצד של הצינור. לסמן את הצד של המכסה וצייר מעגל בצד הצינור בו צפוי בגדר.
  6. הסר את תגובת שיקוע, יבש הפנימי של הצינור על ידי היפוך הצינור על נייר סופג ולהשתמש חתיכות קטנות של נייר סופג כדי להסיר את הנוזל בתוך הצינור מבלי לגעת התחתון של הצינור. Resuspend בגדר בμl 200 ל- PBS על ידי vortexing ב-30 s ו- pipetting לאורך 20 x.
  7. להעריך את EVs ואת מולקולות עם nanoparticle מעקב ניתוח (נ) (איור 2).
    הערה: EVs של מולקולות יכול להידרש עם nanoparticle מעקב ניתוח (נ), פיזור אור דינאמי (DLS) או הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)12.
  8. לאחסן את EVs ואת מולקולות ב-80 מעלות צלזיוס עד נוסף במורד הזרם ניסויים.
    הערה: אם EVs עומדים לשמש ללימודי פונקציונלי, 20% גליצרול להתווסף כדי להגן עליהם מפני קריעה. ניתן לאסוף את התאים באמצעות הליכים סטנדרטיים במידת הצורך.

3. EVs ואוסף מולקולות RNA-הקשורים תאים

הערה: EVs ו- RNA הקשורים מולקולות ניתן גם שנאסף מהתקשורת התרבות התא ואילו התאים עוברים התמיינות. הדוגמה מתואר בפרוטוקול מתאר בידול osteoblastic ואוסף exRNA ביום 0 ו- 7 של בידול. אם אין בידול נדרשת, לאחר מכן לדלג על סעיף 3, ללכת בסעיף 4.

  1. להכין בידול osteoblastic מדיה (DMEM עם 10% FBS, 1% P/S, β-glycerophosphate 10 מ מ, 10 nM דקסאמתאזון, 50 μM ascorbate-2-פוספט ו 10 מ מ 1.25-ויטמין-D3) טריים בכל פעם.
  2. לאחר MSCs 80% confluent, לשנות את המדיה MSC בידול osteoblastic מדיה.
  3. לחדש את המדיה בידול osteoblastic לאחר 2-3 ימים.
  4. ביום 5 של בידול, להסיר את המדיה ותרחץ התאים 3 x עם 20 מ של PBS לכל T175 את הבקבוק.
  5. הוסף 20 מ של EV אוסף המדיה המכילה 10 מ מ β-glycerophosphate, 10 ננומטר דקסאמתאזון, 50 μM ascorbate-2-פוספט ו- 10 מ מ 1.25-ויטמין-D3 לכל confluent T175 הבקבוק של MSCs. Incubate התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות על מנת להבטיח המשך בידול תוך איסוף EVs של מולקולות.
  6. לאסוף את המדיה על יום 7 והמשך כדי לבודד את EVs ואת מולקולות כמתואר בצעדים 2.2-2.6.
  7. עבור בקרת איכות, זרע תאים 96-ולס או 6-ולס להעריך בידול באמצעות assay פעילות של phosphatase אלקליין (ALP) או עם תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), בהתאמה.
    הערה: איור 3 הוא דוגמה מציג osteogenic התמיינות של התאים.

4. RNA החילוץ ובקרת איכות

  1. הפשרת דגימות שלב 2.8 על קרח. תמצית ה-RNA באמצעות ערכת בידוד ה-RNA (טבלה של חומרים).
  2. Elute את הרנ א מן העמודה המסופק בערכה בידוד ה-RNA (טבלה של חומרים) בμl 100 RNase ללא מים.
  3. לרכז את הרנ א באמצעות אתנול משקעים על-ידי הוספת 1 μL של גליקוגן, 10 μL של 2 מ' pH 5.5 סודיום אצטט μL 250 של אתנול 99% מראש צונן לתוך μL 100 של RNA מטוהרים.
  4. דגירה בדגימות ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את הרנ א. גלולה את הרנ א מאת צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בגדר הוא לבן עקב משקעים שיתוף עם גליקוגן.
  5. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול. גלולה את הרנ א שוב במשך 5 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  6. להסיר האתנול ולהשאיר המכסה של הצינור RNA פתוח למשך 5-10 דקות אוויר יבש בגדר RNA. Resuspend בגדר RNA ב μL 7 RNase ללא מים.
  7. בדוק את איכות ה-RNA ואת ריכוז בעזרת מכונה מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי כדי לזהות את הרנ א על פי הפרוטוקול של היצרן לפני הבנייה הספרייה.
    הערה: התפלגות גודל נציג של RNA מוצג באיור4.
  8. תמצית RNA הסלולר באמצעות ערכת טיהור מסחרי (טבלה של חומרים) במידת הצורך.

5. ספריית בנייה ובקרת איכות

הערה: ספריות RNA קטנים בנויים באמצעות ערכות מסחריות (טבלה של חומרים) עם התאמות בשל הרנ א נמוכה קלט. ספריית בנייה מתבצע על הבלוק צוננת.

  1. להרגיע את בלוק חימום עבור 0.2 מ"ל המבחנות על קרח, פיפטה 5 μL של RNA מהשלב 4.6 לתוך 0.2 מ"ל נטולת RNase המבחנות על גוש צוננת.
  2. לדלל 3' מתאמי (1:10) במים נטולי RNase בשפופרת 0.2 מ"ל נטולת RNase PCR. להוסיף 0.5 μL של מתאם מדולל ולערבב עם 5 μL של RNA על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x ו צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורית.
  3. דגירה המיקס מתאם ה-RNA ו- 3' ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה תרמיות preheated ולאחר מכן מקם את הדגימה בשכונה צוננת.
  4. להוסיף 1 μL מאגר מצדו, 0.5 μL של מעכב RNase ו- 0.5 μL של T4 RNA ליגאז (מחיקה מוטציה) לתערובת מתאם ה-RNA ו- 3'. לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה.
  5. דגירה הצינור ב 28 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated.
  6. להוסיף 0.5 μL של להפסיק פתרון לאמבטיה מדגם עם הצינור שוהה הצנטרפוגה תרמי, לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, להמשיך דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  7. לדלל 5' מתאמי (1:10) במים נטולי RNase בשפופרת 0.2 מ"ל נטולת RNase PCR. להוסיף 0.5 μL של 5' מתאם נפרד ללא RNase 0.2 מ ל PCR צינור חום מתאם 5' ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה תרמיות preheated, ולאחר מכן מקם את הדגימה על הבלוק צוננת.
  8. להוסיף 0.5 μL של 10 ננומטר ATP, 0.5 μL של T4 RNA ליגאז כדי 5' מתאם צינור, לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה לאיסוף הנוזלים לתוך החלק התחתון.
    הערה: לשמור את מתאם 5' ברחוב צוננת ככל האפשר.
  9. להוסיף 1.5 μL של מתאם תערובת 5' לדגימת מהשלב 5.6, לערבב בעדינות על ידי pipetting 8 x לאט. דגירה המדגם ב 28 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated.
  10. לדלל RT פריימר 1:10 במים נטולי RNase צינור PCR נטולת RNase 0.2 מ"ל. להוסיף 0.5 μL של פריימר RT מדולל הדוגמה מהצעד 5.9, לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x לאט, צנטריפוגה בקצרה.
  11. דגירה המדגם-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה התרמי preheated ולאחר מכן מקם את הדגימה על גוש צוננת.
  12. להוסיף 1 μL של 5 x הראשון מאגר סטרנד, 0.5 μL של מיקס dNTP 12.5 מ מ, 0.5 μL של 100 מ מ dithiothreitol (DTT), 0.5 μL של RNase מעכב, 0.5 μL של רוורס טרנסקריפטאז. לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x לאט, צנטריפוגה בקצרה.
  13. דגירה המדגם ב 50 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated להשיג cDNA.
  14. בוזקים cDNA μL 4.25 מים הנדסה גנטית, μL 12.5 של PCR מיקס, μL 1 של אינדקס פריימר, μL 1 של פריימר אוניברסלי. לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה.
  15. למקם את הדגימה הצנטרפוגה תרמי ולהגדיר הצנטרפוגה כדלקמן: 98 ° C ל 30 s; 15 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C 15 s; סוף המחזור עם 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
    הערה: הספרייה מוכן שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
  16. לטהר את ספריית ה-RNA על-ידי הפרדת את הספרייה על ג'ל DNA וחיתוך הג'ל (ג'ל מיצוי) בין 140 bp ל-160 bp וחברת eluting הספרייה של הג'ל בעקבות פרוטוקול שניתנו על ידי ערכת בנייה הספרייה.
    הערה: במחקר זה, הספרייה מוכן מהשלב 5.15 טעון על גבי ג'ל מסחרי (טבלה של חומרים) ואת הספריה בין 140 bp ל-160 bp מטוהר בחוץ על ידי ממוכנת DNA גודל fractionator (טבלה של חומרים) על פי הפרוטוקול של היצרן.
  17. להתרכז לשטוף את הספריה משלב 5.16 באמצעות מבוססי עמודה PCR ערכת טיהור (טבלה של חומרים), elute הספרייה 10 μL נטולת RNase מים סוף סוף.
  18. לטעון μL 1 של הספרייה מטוהרת על גבי שבב דנ א (טבלה של חומרים) כדי לבדוק את גודל הספרייה ע פ הפרוטוקול של היצרן.
  19. למהול 1 μL של הספרייה מטוהרים (1:1000) ב- 10 מ מ pH 8.0 טריס-HCl עם 0.05% polysorbate 20 ולכמת את ספריית מאת qPCR באמצעות ערכת כימות ספריית מסחרי לכמת את הריכוז הספרייה באמצעות הסטנדרטים DNA בערכה.
  20. בריכה שווה כמויות של ספריות בהתאם לדרישות של המכונה רצף, רצף על מערכת רצף תפוקה גבוהה.
    הערה: הקמת ספריה הסלולר RNA יכול להיעשות באמצעות ערכות אותו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי של ערכות.

6. ביואינפורמטיקה צינור

הערה: זהו צינור ללא צורך במיקור חוץ ואת התוכניות המשמשות כאן מופיעים ברשימה טבלה של חומרים.

  1. לקצץ משם באיכות נמוכה קריאות מתאם רצפים ולהסיר קריאות raw.
  2. למפות את קריאות נקי סוגים שונים של RNAs.
    1. ביאור tRNAs על-ידי מתן אי-התאמות שני כי הרצפים tRNA שונה במידה רבה לגרום misincorporation הבסיס בתדירות גבוהה על-ידי רוורס טרנסקריפטאז.
    2. ביאור miRNAs על ידי מיפוי אנוש miRNAs מ miRBase v21 המאפשר אי-התאמות אפס. מאז miRNAs כפופים A ו U nontemplated 3' סוף תוספות, רצפים שאינן ממופות הם 3' גזוז של עד שלושה A ו/או T nts אחרי אשר ממופים קריאות אנוש miRNAs ו אחרים miRNAs מ miRBase v21 המאפשר אי-התאמות אפס.
    3. ביאור על אחרים רלוונטיים RNAs קטן (snRNA, snoRNA, שמריהו ו Y RNAs) בכך שהוא מאפשר התאמה אחת.
    4. למפות את קריאות לא ממופים הנותרים RNA ארוכה datasets (rRNA, אחרים RNA Rfam, ואת ה-mRNA) כדי להעריך השפלה.
    5. להוסיף את רצפי הגנום האנושי.
    6. להוסיף את רצפי הגנום חיידקי.
    7. לנרמל את הביטוי miRNA באמצעות הנוסחה הבאה: miRNA נחשב / סה כ נחשב של כל miRNAs ממופה) x 106.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ממוטבת כדי לאסוף exRNA מתרבות MSC עבור רצף הדור הבא. המזימה של זרימת העבודה באיור 1 בצד השמאל, המחסומים בקרת איכות המתאימים נמצאים בצד הימין.

המורפולוגיה של תאי ביום של אוסף עבור מובחן (איור 3 א), מבודלים (איור 3B) והתאים מוצגים. יתר על כן, נציג מנורמל רמות של ALP פעילות של תאים המושרה במשך 7 ימים גם מוצגים (איור 3C). הנה, ALP פעילות זה בערך פי 2.5 של תאי uninduced.

שלוש מבחנות T175 של confluent MSCs תשואה 2-5 x10 10 חלקיקים/mL (איור 2). גודל החלקיקים הממוצע הוא כ 160-165 ננומטר ואילו רוב החלקיקים 130-140 ננומטר. היו שם כמה פסגות קטנים יותר בין 200 ל 500 ננומטר, מה שמצביע על מתחמים גדולים או אגרגטים גדולים.

מאז ה-RNA יכול להיות מושפל במהירות, לציית לתנאים של החילוץ-RNA לפי ערכת או פרוטוקול המשמש. להשתמש RNase ללא תנאים, בפרט RNase ללא מים resuspend את הרנ א ולשמור RNA על קרח במידת האפשר. לאחר החילוץ, הרנ א ניתן לכמת באמצעות מכונה מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי. נציג electropherograms של RNA לאחר שעוברים ניתוח מוצגים באיור4. Electropherogram של exRNAs כוללת של מגוון רחב של RNAs (איור 4A). לעומת זאת, RNA הסלולר יש פסגות מאוד ברורה-סביב 70-120, 1800, ו- nt 3800, אשר תואמות את סינתזת/5S rRNA / 5.8S rRNA 18S rRNA, 28S rRNA, בהתאמה (איור 4B). המספר שלמות RNA (RIN) מייצג איכות הרנ א. רין טוב של RNA הסלולר הוא > 8 (המציין כמעט אין השפלה RNA). האלגוריתם שעליו מבוסס רין הוא היחס בין 28S 18S. פירוש הדבר רין הוא לא אינדיקטור טוב של RNA איכות של exRNAs כי rRNAs באורך מלא אינם בדרך כלל לזיהוי ב- exRNAs.

בעקבות ה-RNA החילוץ, הספריות miRNA נבנו, הספריות cDNA היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה בג'ל. CDNA ובין אם-לא מתאם של miRNAs הוא בדרך כלל בין 140, 160 nt. האיכות של הספרייה היה אז דמיינו על מכונה מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי (איור 5). 5A איור , איור 5B מצלילה הספריות של RNA הסלולר יום 0 ו- 7 יום, בהתאמה. 5C איור , איור 5D הינם ספריות exRNA יום 0 ו- 7 יום בהתאמה. כל הארבעה היו פסגות בסביבות 140 nt, אשר מצביעים על בניית ספריה miRNA מוצלח. כמות cDNA בספריות הייתה לכמת על-ידי qPCR באמצעות ערכת כימות הספרייה. מחזור כמת (סי) של הסטנדרטים הייתה להתוות נגד יומן הרישום של ריכוז כדי לקבל עיקול רגיל (איור 6). המשוואה של העקומה סטנדרטי שימש אז כדי לחשב את הריכוז של הספריות (טבלה 1). במדגם שלנו, היה ריכוז הספריות של exRNAs 5-8 nM, אשר היה נמוך באופן משמעותי ספריות של הסלולר RNAs (8-30 ננומטר). הספריות היו לאחר מכן איחדו עם כמות שווה, שלח את רצף.

אחרי הספריות היו וסודרו, הקריאות באיכות נמוכה נגזמו משם עם FASTX-Toolkit, איכות וכתוצאה מכך הספריה exRNAs היה גבוה ולא לזו של הספריות מתאי (איור 7 אב'). אורך הרצף של ספריות מתאי היה יחיד לשיא בסביבות 22 nt (איור 7C), אשר עולה בקנה אחד עם miRNAs. לעומת זאת, הספריות של exRNAs היו יותר הטרוגנית, הכילה 3 הפסגות הגדולות: 22 nt, 30 nt, ו- 33 nt (איור 7D). בדומה לכלים המקבילים הסלולר, לשיא בגיל 22 nt הוא miRNAs. מקרוב חשף כי הפסגות-nt 30, 33 הם tRNAs חצאים/קטעים או piRNAs. ואז שורטטו הביאורים הקריאות ממופה. רוב הקריאות (– 65.1%) מ- RNA הסלולר למפות אנוש miRNAs וכל אחד ממכם RNAs קטנים אחרים היוו רק חלק קטן ממופה קורא (איור 8A). . Contrastingly, רק 8% exRNAs למפות אנוש miRNAs (איור 8 ב'). RNA קטנים הנפוץ ביותר שאליו קריאות ממופה היו tRNAs. רוב הקריאות היו "תחרות קריאות" (43%). בהמשך בחינת קריאות לא תואמות מ exRNAs למסדי נתונים גלובלי הוביל הממצא מפתיע התואמים רובם רצפים חיידקי (74% ו- 85% עבור D0 ו- D7 exRNA, בהתאמה; טבלה 2). לעומת זאת, רק 0.9% של RNA הסלולר היה ללא תחרות,, רק 10% ממופה חיידקים. השוואה עם הגנום שור הראו פחות מ- 1% התאמה רומז כי FBS איננה מקור זיהום (טבלה 2). לפיכך, exRNAs התערוכה פרופיל טיפוסיות בהשוואה ל- RNA סלולרית רגילה.

Figure 1
איור 1: זרימת העבודה של רצף exRNA וניתוח. זרימת העבודה כולו מתואר משמאל בתיבות אפורות, בקרת איכות המשויכים כל שלב בתיבות אדום בצד הימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גודל הפצה של חלקיקים מופרש על ידי תאי-ביום 0 וביום 7 של בידול. נציג נ תוצאות של חלקיקים שנאסף מבחנות x T175 3 ב () ביום 0 וביום (B) 7 של בידול. גודל ממוצע ומצב בהתאמה, כמו גם את ריכוז החלקיקים יערכו מתחת לגרפים מציגות. SD: סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תא מורפולוגיה ובידול osteogenic לפני אוסף RNA חוץ-תאית. (א) Micrograph של BMSCs מובחן תרבותי עם אוסף המדיה ביום של אוסף. Micrograph (B) של BMSCs הבדיל במשך 7 ימים עם אוסף המדיה ביום של אוסף. גודל ברים = 100 מיקרומטר. (ג) ALP פעילותם של התאים היו מנורמל ל viabilities תא המתאימים שלהם. הערכים המותווים היו של 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג electropherogram של RNA תקינות לאחר החילוץ רנ א. RNA ניתוחים של RNA חוץ-תאית (A) ו- RNA הסלולר (B). ציר ה-x הוא אורך RNA (nt) והוא ציר ה-y זריחה. השיא הראשון הוא הסולם בגיל 25 nt. Ribosomal RNAs מוצגים 18S (1,800 nt), 28S (3,800 nt). RNA תקינות מספר (RIN) הוא סימן רנ א איכות המבוססת על תקינות ribosomal RNA 18S, 28S. מספרי רין גבוהים יותר שווים באיכות טובה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: נציג electropherogram של ספריות cDNA לאחר בניית ספריה. ניתוח הדנ א של ספריות מתאי (א) ביום 0, תאים (B) על יום 7, RNA חוץ-תאית (C) מיום 0 ו- RNA חוץ-תאית (D) מ- 7 יום. מספרים ירוק וסגול הסולמות בגיל 35 nt ו 10,380 nt, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: cDNA ספריית כימות וחישוב. ספריות היו מדולל בין 500 - 1000 פעמים עבור אלו exRNA, בין 1,000, 4,000 פעם RNA בתא. הספריות היו להפעיל לצד הסטנדרטים ערכת כימות של הספרייה. הערכים סי הממוצע של הסטנדרטים DNA שורטטו נגד הריכוז10 יומן (pM) ליצירת עיקול רגיל, משוואה עבור העקומה רגיל וערך2 R. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: ציוני איכות והפצה אורך הרצפים. קורא באיכות נמוכה, מתאם רצפים של האורחים נגזמו ע עם FASTX-ערכת כלים עבור תאים (A) ו- (B) exRNAs. חלוקת אורך נקי קורא עבור תאים (ג) ו- (ד) exRNAs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: ביאור של RNAs קטן לאחר רצף. ביאורים מייצגות אחוזים הקריאות נקי עבור תאים (A) ו- (B) exRNAs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מדגם גורם לדילול ערך סי log(pM) ריכוז (pM) ריכוז ממוצע (pM) ריכוז ממוצע * (452/143) להכפיל ב- dillution פקטור (pM)
BMSC D0 exRNA 500 7.72 0.702 5.036 5.276 16.678 8338.993
BMSC D0 exRNA 500 7.57 0.754 5.677
BMSC D0 exRNA 500 7.7 0.709 5.117
BMSC D0 exRNA 1000 8.64 0.383 2.416 2.365 7.477 7476.846
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D7 exRNA 500 8.52 0.425 2.659 3.221 10.182 5090.913
BMSC D7 exRNA 500 8.42 0.459 2.880
BMSC D7 exRNA 500 7.97 0.615 4.125
BMSC D7 exRNA 1000 8.87 0.303 2.011 1.933 6.110 6110.391
BMSC D7 exRNA 1000 8.92 0.286 1.932
BMSC D7 exRNA 1000 8.97 0.269 1.857
BMSC D0 תא 1000 6.86 1.000 10.005 9.810 31.007 31006.974
BMSC D0 תא 1000 6.91 0.983 9.614
BMSC D0 תא 4000 8.68 0.369 2.340 2.398 7.581 30322.041
BMSC D0 תא 4000 8.59 0.400 2.514
BMSC D0 תא 4000 8.68 0.369 2.340
תא BMSC D7 1000 8.44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
תא BMSC D7 1000 8.43 0.456 2.857
תא BMSC D7 1000 8.39 0.470 2.950
תא BMSC D7 4000 10.36 -0.213 0.612 0.702 2.218 8872.689
תא BMSC D7 4000 10.27 -0.182 0.658
תא BMSC D7 4000 9.97 -0.078 0.836
חישובים:
log(pM) =-0.3467 x (מדגם סי ערך) + 3.3786; השתמש עיקול רגיל ונוסחה
ריכוז (pM) = 10^log(pM)
חישוב התאמת גודל = תקן גודל של DNA (452 bp) מחולק באורך ממוצע פרגמנט (143 bp)

טבלה 1: miRNA ספריית כמת.

לדוגמה: # קורא לא מיפוי אנושי # קורא מיפוי חיידקים % חיידקי קורא # קורא מיפוי פרה קורא % שור
BMSC D0 תא 131007 9858 8% 99 0.08%
BMSC D7 תא 169730 7935 5% 188 0.11%
BMSC D0 exRNA 6122833 4551477 74% 891 0.01%
BMSC D7 exRNA 7046691 5970086 85% 771 0.01%

טבלה 2: האחוז של תחרות קורא את המפה כדי חיידקים וקורא שור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור רצף הדור הבא של exRNAs המאפשרת ניתוח דיפרנציאלית ביטוי מדגימות קלט נמוך. הקפדה על פרוטוקול ספציפי לבידוד EV ו exRNA חשוב כי שינויים קטנים אפילו (קרי, השלב ultracentrifugation או שינוי בסוג רוטור) יכולים להשפיע על transcriptome, miRNA רמות13,14'. לפיכך, ללא קשר איך exRNA הוא מבודד, חשוב להחיל את ההליך ניסיוני, bioinformatic על כל הדגימות בניסוי כדי שניתן יהיה להשוות את התוצאות.

RNA שלמות בדרך כלל שקובעת-bioanalyzer. עם זאת, מאחר exRNAs שנגניה הם חסרי באורך מלא rRNA, ערכם רין הוא נמוך מאוד, אבל זה אינן משקפות בהכרח באיכות נמוכה RNA דגימות. בנוסף, RNA ריכוז exRNAs מגוונות מאוד, לעיתים קרובות לא מדויק. לפיכך, במקום הערכת איכות RNA וכימות של RNA-bioanalyzer, להשתמש באותו אמצעי אחסון של מדיה בכל פעם עיבוד נוסף. כמו כן, resuspend את הרנ א שחולצו באמצעי האחסון באותו מאגר resuspension ולהשתמש באותו אמצעי אחסון לבנייה הספרייה.

בניית ספריה RNA קטן היה מותאם על ידי הפחתת כמות מתאמים כדי עשירית הפרוטוקול הסטנדרטי באמצעות למחצית נוגדנים אחרים. לא רק להפחית את מתאמי מונע הדימרים מתאם, הוא גם מונע RNA התפלגות circularization15. הירידה ריאגנטים ממוטב אילומינה TruSeq קטן RNA מדגם הכנה הערכה. יש להשתמש ערכות אחרות, מומלץ גם להוריד מתאם, ריאגנטים בהתאם, אלא אם ערכת מציין כי זה דגימות קלט המותאמים נמוכה. לבסוף, מחזור PCR לבנייה הספריה גדל מ- 12 ל 15 מחזורים של פרוטוקול זה להביא בחשבון הריכוז נמוך של exRNAs. . מצאנו שזה יהיה כוונון אופטימאלי מבלי לראות הגברה הטיות15.

מדדים בקרת איכות שונים ניתן העריך כולל ציוני איכות הבסיס ולקרוא אורך הפרופיל. כאשר עושים ניתוחים ביואינפורמטיקה, איכות הבסיס הקריאות הסלולר RNA ו exRNAs היו דומים; עם זאת, התפלגות אורך המקור מוערת של רצפי היו שונים לחלוטין. רוב הקריאות מ- RNA הסלולר למפות אנוש miRNAs, עם זאת, ניכר קריאות exRNA היו קריאות לא תואמות. במבט קרוב יותר, קורא קריאות לא תואמות התברר להיות חיידקי (טבלה 2). זה היה מפתיע כי אנטיביוטיקה היו בשימוש שגרתי בתרבות שלנו. תוצאה שלנו יישור עם דוחות אחרים זה הראה גם בחלק גדול של קריאות לא תואמות, כאשר רצף תרבית תאים נגזר exRNA16. אחת הסיבות האלה מזהמים היא כי חיידקים חופפים במידה עם מתחמי חוץ-תאית או EVs, ומכאן שיתוף לטהר במהלך שלב ultracentrifugation17. פרסומים קודמים זיהו זיהום נפוץ של חיידקים מסוימים בתקשורת תרבות שנותרו מבלי שיבחינו תחת תאים נורמליים מעבדה הליכים18. עד כה, בעיה זו במידה רבה התעלמה אבל צריכים להילקח בחשבון כאשר לטיהור וניתוח exRNAs.

פרוטוקול זה פרטי המדריך השלם קציר exRNAs ממדיה תרבות, אופטימיזציה של הכנה ספריית ה-RNA קטנים ועיבוד הנתונים ספריית raw. פרוטוקול זה מדגיש במיוחד המחסומים בקרת איכות שונים לאורך כל התהליך להפגין כמה נמוך דגימות קלט (כמו exRNAs) ניתן לסטות מן ההכנות מדגם רגיל כך אחרים העובדים עם דגימות קלט נמוך עשוי לדעת כיצד. מצפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים על מר קלאוס אוטובוס, גב' ריטה Rosendahl-iNANO לסיוע טכני שלהם. תודה מיוחדת ד ר דניאל Otzen להתרת השימוש שלו ultracentrifuge תכופים. מחקר זה נתמך על ידי קרן חדשנות דנמרק (מסדר פרוייקט).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8, (9), e75184 (2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3, (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45, (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26, (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35, (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18, (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14, (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116, (6), 934-942 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics