Polyethyleneimine-belagt jernoksid nanopartikler som et redskap for levering av lite forstyrrende RNA til makrofager i Vitro og Vivo

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en metode for å bruke polyethyleneimine (PEI)-belagt superparamagnetiske jernoksid nanopartikler for transfecting makrofager med siRNA. Disse nanopartikler kan effektivt levere siRNA til makrofager i vitro i vivo og stillhet målet genuttrykk.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang, Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

På grunn av deres avgjørende rolle i å regulere immunreaksjoner, makrofager kontinuerlig har vært gjenstand for intensiv forskning og representerer en lovende terapeutisk mål i mange lidelser, som autoimmune sykdommer, åreforkalkning og kreft. RNAi-mediert genet stanse er en verdifull tilnærming av valget for å undersøke og manipulere macrophage funksjon; men hva av makrofager med siRNA anses ofte å være teknisk utfordrende, og i dag, noen metoder dedikert til siRNA overføring til makrofager er tilgjengelig. Her presenterer vi en protokoll for å bruke polyethyleneimine-belagt superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (PEI-SPIONs) som et redskap for målrettet levering av siRNA til makrofager. PEI-SPIONs er i stand til å binde og helt kondenserende siRNA når Fe: siRNA vektforholdet når 4 og over. In vitro, disse nanopartikler kan effektivt levere siRNA til primære makrofager, samt i macrophage som rå 264.7 celle linje, uten akkord celle levedyktighet på optimale dosen for hva, og, til slutt, de induserer siRNA-mediert målet genet støydemping. Foruten å være brukt for i vitro siRNA transfection, er PEI-SPIONs også et lovende verktøy for å levere siRNA til makrofager i vivo. I lys av sin kombinert funksjoner av magnetisk egenskap og slå av genet evne forventes systemisk administrert PEI-SPION/siRNA partikler ikke bare å modulere macrophage funksjon, men også aktivere makrofager fotografert og spores. I hovedsak PEI-SPIONs representerer en enkel, sikker og effektiv nonviral plattform for siRNA levering til makrofager både i vitro og i vivo.

Introduction

Makrofager er en medfødt immunceller distribuert i alle kroppens vev, men i forskjellige beløp. Ved å produsere en rekke cytokiner og andre meglere, spiller de avgjørende roller i vert forsvar mot invaderende mikrober patogener i reparasjon av vev etter skade og opprettholde vev homeostase1. På grunn av deres betydning vært makrofager kontinuerlig gjenstand for intensiv forskning. Men til tross for dens utbredelse i genet regulering og funksjon studier, siRNA-mediert genet stanse er mindre sannsynlig å lykkes i makrofager fordi disse cellene, spesielt primære makrofager, er ofte vanskelig å transfect. Dette kan tilskrives en relativt høy grad av toksisitet knyttet mest veletablerte transfection tilnærminger som cellemembranen er kjemisk (f.eksmed polymerer og lipider) eller fysisk (f.eksav electroporation og Gene kanoner) forstyrret la siRNA molekylene krysse membranen, og dermed drastisk redusere makrofager levedyktighet2,3. Videre er makrofager dedikert phagocytes rik på degradative enzymer. Disse enzymene kan skade integriteten til siRNA, svekke effektiviteten stanse selv om gen-spesifikke siRNA er levert til celle3,4. En effektiv macrophage målrettede siRNA leveringssystem må derfor beskytte integritet og stabilitet av siRNA under levering4.

Det er stadig mer tydelig at dysfunksjonelle makrofager er innblandet i initiering og progresjon av visse felles klinisk lidelser som autoimmune sykdommer, åreforkalkning og kreft. Derfor modulerende macrophage funksjon med, for eksempel siRNA, har vært fremstår som en attraktiv metode for behandling av disse lidelser5,6,7. Selv om mye fremgang har blitt gjort, er en stor utfordring for siRNA-basert behandling strategi dårlig celle spesifisitet systemisk administrert siRNA og utilstrekkelig siRNA opptaket av makrofager, som følgelig føre til uønskede bivirkninger. Sammenlignet med gratis nukleinsyre legemiddelselskap som vanligvis ikke optimal celle selektivitet og ofte fører til off-målet bivirkninger, narkotika-lastet nanopartikler (NPs), på grunn av sine spontane tilbøyelighet av tilværelse fanget av reticuloendothelial systemet, kan være konstruert for passiv målretting til makrofager i vivo, muliggjør forbedret terapeutiske effekten med minimale bivirkninger8. Gjeldende NPs utforsket for levering av RNA molekyler inkluderer uorganiske nanocarriers og ulike liposomer polymerer9. Blant dem viser polyethyleneimine (PEI), en type kationisk polymerer bindende og kondenserende nukleinsyrer inn stabilisert NPs, den høyeste RNA levere kapasitet9,10. PEI beskytter nukleinsyrer fra enzymatisk og nonenzymatic fornedrelse, formidler deres overføring over cellemembranen og fremmer deres intracellulær utgivelse. Selv om opprinnelig introdusert som en DNA levering reagens, ble PEI deretter vist for å være en attraktiv plattform for i vivo siRNA levering, enten lokalt eller systemisk9,10.

Superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (SPIONs) har vist store løftet i biomedisin, takket være deres magnetiske egenskaper, biocompatibility, tilsvarende størrelse på biologisk viktig objekter, høy overflate-område-til-volum forhold, og lett å manøvrere overflate for bioagent vedlegg11. For eksempel på grunn av deres potensielle nytte som en kontrast agent og raske opptak av makrofager, SPIONs har dukket opp som en favoritt klinisk verktøy bilde vev makrofager12. Mens SPIONs har også vært grundig studert som nukleinsyre levering biler11,13,14,15, til vår kunnskap, inneholder litteraturen noen rapporter om SPIONs som en bærer for macrophage målrettede siRNA levering. For gen levering av SPIONs, er deres overflate vanligvis belagt med et lag av hydrofile kationisk polymerer som negativt ladde nukleinsyrer kan elektrostatisk tiltrukket og bundet. Her presenterer vi en metode for å syntetisere SPIONs som overflaten er endret med lav-molekylvekt (10 kDa), forgrenede PEI (PEI-SPIONs). Disse magnetiske nanoplatforms er da ansatt å kondensere siRNA, danner PEI-SPION/siRNA komplekser som gjør siRNA transport inn i cellen. Vi grunn at spontan fagocytose av SPIONs av celler reticuloendothelial systemet16, kombinert med sterke evne til binding og kondenserende nukleinsyrer ved PEI, gjengir PEI-SPIONs egnet for effektiv transport av siRNA til makrofager. Dataene som presenteres her støtte muligheten for PEI-SPION/siRNA-mediert genet stanse i makrofager kultur som i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder som involverer bo dyrene ble utført i samsvar med dyret vare og bruk retningslinjer Sørøst University, Kina.

1. utarbeidelse av PEI-SPIONs

  1. Utarbeidelse av oljesyre endret SPIONs
    1. Oppløse FeCl3•6H2O og FeSO4•7H2O i vannet under beskyttelse av N2.
      1. Legge til 28 g av FeCl3•6H2O og 20 g FeSO4•7H2O i 80 mL deionisert vann i et beaker. Innføre N2 i vannet gjennom en glass-kanal og rør til solid saken har oppløst.
      2. Varme reaksjonsblandingen å 72 ° C med en gripende hastighet på 800 rpm, etterfulgt av tillegg av 40 mL ammoniakk vann (28%). Rør i 5 minutter.
    2. Legg 9 mL oljesyre dropwise i ovennevnte løsningen og rør det ved 72 ° C 3 h.
    3. Avkjøle den resulterende løsningen til romtemperatur (RT). Utløse løsning via magnetisk separasjon.
    4. Vask det bunnfall inneholder SPIONs 3 x med absolutt etylalkohol og deretter spre bunnfall i 100 mL av N-Heksan.
  2. Utarbeidelse av dimercaptosuccinic syre-endret SPIONs
    1. Legge til 800 mg oljesyre (OA)-endret SPIONs spredt i 200 mL av N-Heksan og 400 mg av dimercaptosuccinic syre (DMSA) spredt i 200 mL aceton, i en tre-hals kolbe i et vannbad på 60 ° C.
      Merk: For å bestemme konsentrasjonen av OA endret SPION fra forrige trinn, ta et lite volum (f.eks 1 mL) av SPION spredning volatilize N-Heksan og veie den resulterende pulveret.
    2. Legge til 200 µL av triethylamine dropwise i ovennevnte løsningen med stirring på 1000 rpm og refluxing.
    3. Etter 5 h stirring og refluxing, får du en svart utløse av magnetiske separasjon.
    4. Spre de hydrofile SPIONs i deionisert vann homogent ved å justere pH av løsningen bruker tetramethylammonium hydroksid.
  3. Utarbeidelse av PEI-SPIONs
    1. Legge til DMSA-modifisert SPION colloidal løsning dropwise til PEI løsning (10 kDa) i en 500-mL tre-hals kolbe under mekanisk omrøring på 1000 rpm 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Merk: På kostnad og størrelsen på PEI-SPIONs varierer andelen WFe å WPEI. WFe: WPEI forholdet 1:3 kan være et godt utgangspunkt for å syntetisere PEI-SPIONs egnet for siRNA levering.
    2. Legge den resulterende løsningen i et ultrafiltrasjon rør med en molekylvekt cutoff av 100 kDa og et innhold av 15 mL; deretter sentrifuge 5400 x g for 10 min før den gjenværende løsningen er 1 mL. Legge deionisert vann til løsningen gjøre volumet 15 mL igjen og gjenta over prosessen 10 x å få det endelige produktet. Deretter filtrerer løsningen gjennom filtere 0.22-μm og lagre det endelige produktet på 4 ° C.
    3. Bestemme Fe konsentrasjonen av PEI-SPIONs av kolorimetrisk metoden bruker phenanthroline17. Fortynn PEI-SPIONs med deionisert sterilt vann til en konsentrasjon av 1 mg Fe/mL og lagre den på 4 ° C.
    4. Fortynne 10 μL PEI-SPION løsningen (1 mg Fe/mL) til 1 mL med deionisert vann. deretter teste etter størrelsen og zeta potensielle av en dynamisk lys RBS-enhet.
      Merk: Forberede PEI-SPIONs i området om 30-50 nm. I størrelse området vises ikke effekten av NP størrelsen på siRNA binding og mobilnettet opptak å være betydelig. PEI-SPIONs med en gjennomsnittlig zeta potensial over +37 mV kan være giftig i dose området for hva, og en cytotoksisitet analysen skal utføres for å sikre sikkerhet. På overflaten kostnad og etter størrelsen på nanopartikler kan kontrolleres i en ønsket område ved å justere PEI innholdet.

2. forberedelse og Agarose Gel geleelektroforese av PEI-SPION/siRNA NPs

  1. Fortynn siRNA med RNase-fritt vann til en siste konsentrasjon på 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Forberede fem RNase uten microcentrifuge rør merket 0, 1, 2, 4 og 8. Etikettene representerer ulike Fe: siRNA vekt forhold. Pipetter 3 μL siRNA løsning på alle rør (~0.8 μg siRNA/rør).
  3. Legge til 0, 0,8, 1.6, 3.2 og 6,4 μg Fe i form av PEI-SPIONs til rør merket 0, 1, 2, 4 og 8, henholdsvis. Holde totale eksempel volumet av hver mindre enn 20 μL. Bland ved pipettering forsiktig opp og ned.
  4. Inkuber blandinger på RT i 30 min for at PEI-SPION/siRNA kompleks. Gjør en 3% agarose gel med høy renhetsgrad agarose i denne perioden.
    Merk: Ekstra PEI-SPION/siRNA med andre Fe: siRNA forhold (f.eks5 eller 6) kan være forberedt og testet.
  5. Legg 1 μL 6 x DNA-lasting buffer per 5-μL prøve og bland forsiktig. Last alle prøver og kjøre geleelektroforese på 5 V/cm til den bromophenol blå overfører så langt som to tredjedeler av gel. Stain gel med ethidium bromide (EB) i 15-20 min.
    Merk: Ferskt tilberedte geleelektroforese buffer og EB løsningen bør brukes.
  6. Visualisere siRNA band under et UV tenkelig system. Sjekk Fe: siRNA forholdstall på hvilke siRNA skjemaer komplekser med PEI-SPIONs, og resultatet representerer gratis siRNA er tilbakestående eller ikke oppdages.

3. hva RAW264.7 makrofager In Vitro

  1. Kultur musen macrophage-lignende RAW264.7 celler i 10 cm parabol med DMEM komplett middels inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) per 100 U/mL penicillin per 100 μg/mL streptomycin på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  2. Én dag før transfection, Sug opp mediet cellene og skyll med fosfat-bufret saltvann (pH 7.4). Legge til 1 mL av 0,25% trypsin 10 cm parabolen. Trypsinize RAW264.7 celler i ca 5-10 min på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  3. Når fleste cellene har enebolig (etter 5-10 min), legge 5 mL av DMEM komplett medium å retten å deaktivere trypsin. Pipetter opp og ned for å spre celle klynger i enkeltceller.
  4. Overføre celle suspensjon til et sterilt 15-mL konisk rør. Sentrifuge det 300 x g for 3 min på rett fjerne nedbryting.
  5. Resuspend cellene med 5 mL av fersk DMEM fullstendig medium og telle celler.
  6. Plate 9 x 104 celler per bra i en 6-vel plate med 2 mL komplett DMEM medium og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator ca 24 h.
    Merk: Hvis bruker en plate av forskjellig størrelse, justere belagt celle tettheten i forhold til relativ overflaten slik at cellene nå 80% confluency ved transfection.
  7. Når celle confluency er 80%, fjerne mediet fra cellene og erstatte den med 1 mL av DMEM komplett medium per brønn. Returnere platen til inkubator til PEI-SPION/siRNA er utarbeidet og er klar til bruk (ca 30 min).
  8. Forberede PEI-SPION/siRNA komplekser: beregne mengden PEI-SPION/siRNA komplekser nødvendig for en transfection eksperiment. I et selskap 1.5-mL RNase gratis microcentrifuge rør, bland en passende mengde PEI-SPIONs med siRNA i gitt Fe: siRNA forholdet. For eksempel for å forberede PEI-SPION/siRNA NPs som inneholder 100 µg Fe i Fe: siRNA forholdet 4, legge 100 µL (1 mg Fe/mL) av PEI-SPIONs til 96 μL siRNA (0,26 μg/μL), etterfulgt av blande det forsiktig med brønnene. Inkuber i 30 min på RT.
    Merk: Forberede et volum på PEI-SPION/siRNA komplekset som er 10% over totalt siste massen til kontoen for tilfeldig tap. Foreta PEI-SPION/siRNA komplekser på lav Fe: siRNA prosenter, som siRNA molekyler er helt lastet inn PEI-SPIONs og, derfor små mengder PEI-SPIONs kan brukes til å minimere mulige cytotoksisitet. Piloten eksperimenter (gel retardasjon analysen) for optimalisering av Fe: siRNA forholdet er nødvendig.
  9. Ta ut platen 6-vel settefiskanlegg (trinn 3.7). Legg til et bestemt volum av PEI-SPION/siRNA kompleks dropwise i hver brønn og snurr den forsiktig for å sikre en jevn distribusjon. Returnere platen til inkubator til vurdering av mobilnettet opptak eller genet knockdown effektiviteten (1-3 d).
    Merk: Transfecting makrofager med PEI-SPION/siRNA i en konsentrasjon av ~ 15 μg Fe/mL kan maksimere transfection effektiviteten samtidig som potensielle cytotoksisitet.

4. systemisk levering av siRNA til makrofager i rotter med eksperimentelle leddgikt

  1. Hente bestemte patogen-fri Wistar hannrotter som 7 uker gamle. Venne rotter i 7 d før bruk og gi dem tilstrekkelig mat og vann. Indusere adjuvant leddgikt (AA) i rotter som beskrevet tidligere18.
  2. Forberede PEI-SPION/siRNA komplekser som beskrevet i trinn 3.8.
  3. Injisere PEI-SPION/siRNA NPs (0,3 mg siRNA/kg) i den AA rotter via hale venen. Vurdere den cellulære opptak via, for eksempel flowcytometri, vev biodistribution via, for eksempel en sanntid fluorescens tenkelig system, eller terapeutiske effekter basert på, for eksempel klinisk, histologic og røntgen analyser på ønsket tid poeng18.
    Merk: For cellular og vev biodistribution studier, behandle rotter med en enkelt injeksjon av ønsket NPs; for terapeutisk studier, injisere rotter med NPs være testet 1 uke tre påfølgende uker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Størrelsen og zeta potensialet i PEI-SPIONs med denne protokollen var mellom 29-48 nm (polydispersity indeks: 0,12 - 0,23) og 30-48 mV, henholdsvis. De var stabil i vann 4 ° C over 12 måneder uten åpenbare aggregering. For å evaluere deres siRNA bindende evne, ble PEI-SPIONs blandet med siRNA på forskjellige Fe: siRNA vekt forhold. Figur 1 viser at når Fe: siRNA vektforholdet når 4 og over, av gratis siRNA var helt mangler, noe vellykket siRNA binding til PEI-SPIONs. En stor bekymring Pei i biomedisinsk programmet er dens toksisitet, som er et resultat av sterk positiv tillegget, spesielt på høy molekylvekt og høye doser. Som vist i figur 2A, PEI-SPIONs med en zeta potensialet til 30,5 og 37 mV ikke viser tydelig cytotoksisitet i konsentrasjoner opptil 30 μg Fe/mL, som om todelt høyere enn konsentrasjonen (15 μg Fe/mL) normalt anvendt for cellen transfection. Imidlertid PEI-SPIONs med zeta potensial 48 mV var giftige selv på laveste dose undersøkt (10 μg Fe/mL). Derfor har PEI-SPIONs en kostnad-avhengige toksisitet. Siden kationisk ikke er viktig for NP opptaket av makrofager19, vi foreslår at PEI-SPIONs med en gjennomsnittlig zeta potensial ikke høyere enn +37 mV brukes for siRNA overføring, selv om siRNA binding vil redusere kostnader til en viss grad og lindre cytotoksisitet18.

Test potensielle anvendelsen av PEI-SPIONs for siRNA levering til makrofager, ble i vitro transfection utført med murine macrophage cellen linje rå 264.7. Som analyseres av flowcytometri, mer enn 90% av cellene var transfekterte med fluorescently merket PEI-SPION/siRNA komplekser på 15 µg Fe/mL (figur 2B). Med hensyn til hva effektivitet var det faktisk ingen forskjell mellom PEI-SPION/siRNA NPs dannet på Fe: siRNA vekt forhold mellom 4 og 8, selv under den siste tilstanden, NPs som ble dannet var mindre i størrelse og svakere i positive ladningen fordi en mindre mengde siRNA ble lastet inn per partikkel. Vi har også vurdert effekten av PEI-SPION/siRNA konsentrasjon på mobilnettet internalisering av Prussian blå flekker. Som vist i figur 2C, var de blå flekkene i transfekterte cellene minimal synlig på 7,5 µg Fe/mL, men synlig på 15 µg Fe/mL. Interessant, økte øker konsentrasjonen PEI-SPION/siRNA til 32 µg Fe/mL ikke flekker intensiteten, sannsynligvis fordi PEI-SPION/siRNA opptaket var mettet i konsentrasjoner rundt 15 µg Fe/mL. I tillegg evne til PEI-SPIONs for formidling siRNA overføringen ble bekreftet i primære makrofager18, og metoden presenteres her hadde en høy siRNA transfection effektivitet i rotte peritoneal makrofager, tilsvarende som i RAW264.7 celler. Peritoneal makrofager transfekterte med PEI-SPIONs skjuler bestemte siRNA viste en signifikant nedgang i mRNA målnivået sammenlignet med uspesifisert siRNA (figur 2D), noe som tyder på at siRNA kan flykte fra endocytose blemmer i den cytoplasma og nå RNAi maskiner.

Vi har tidligere også undersøkt i vivo mobilnettet opptaket av systemisk administrert PEI-SPION/siRNA komplekser i rotter med adjuvant leddgikt18. Vi analyserte PEI-SPION/siRNA hva effektivitet i phagocytic makrofager og nonphagocytic T-lymfocytter. Som vist i Figur 3, tok CD11b + celler opp PEI-SPION/siRNA komplekser mer effektivt enn CD3 + celler på noe tidspunkt i alle organer undersøkt, indikerer at PEI-SPION/siRNA NPs fortrinnsvis målet makrofager18. Spesielt, ble et høyt nivå opphopning av NPs observert i betente ledd18, antyder at PEI-SPION kan være en attraktiv plattform for systemisk levering av siRNA legemiddelselskap i revmatoid artritt som patogenesen er knyttet til macrophage dysfunksjon og hvilke lokale siRNA administrasjon er ikke en favoritt valg på grunn av involvering av flere organer av sykdommen.

Figure 1
Figur 1: Agarose gel geleelektroforese av PEI-SPION/siRNA komplekser dannet på ulike Fe: siRNA (w/w) prosenter. Fe: siRNA forholdet 0 representerer gratis siRNA duplexes uten PEI-SPIONS. Den gjennomsnittlige størrelsen og zeta potensialet i de gratis PEI-SPIONs brukt her var 30 nm og 45 mV. siRNA kan helt binde til PEI-SPIONs Fe: siRNA forholdet 4 og ovenfor, samsvarer med tidligere resultatene med PEI-SPIONs med en gjennomsnittlig størrelse på 48 nm og et zeta potensial 30,5 mV18. Fravær av tilbakestående band (PEI-SPION/siRNA komplekser) kan gjenspeile veddemålsplasseringer av siRNA til EB under flekker, en indikasjon av sterk siRNA binding og/eller kondenserende evne til PEI-SPIONs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: biologisk karakterisering av PEI-SPION og PEI-SPION/siRNA NPs. (A) dette panelet viser en celle levedyktighet analysen. RÅ 264.7 celler ble behandlet for 16 h med den angitte doser av PEI-SPIONs bærer ulike zeta potensial og deretter MTS analysen ble utført. Cellen levedyktigheten var normalisert mot kontrollen (ingen partikkel eksponering). Dataene er gjennomsnittlig ± SD like brønner. (B) dette panelet viser en flyt cytometric analyse av PEI-SPION/Cy3-siRNA opptak av rå 264.7 celler. Cellene ble inkubert 24 h 15 µg Fe/mL (øvre panel) eller 5 μg Fe/mL (nedre panel) PEI-SPIONs kompleksbundet med Cy3-merket siRNA på Fe: siRNA (w/w) forholdet mellom 4 og 8, henholdsvis. Uspesifikke (NC) siRNA representerer ikke-fluorescerende siRNA. M2: gated regionen. PE-H: Cy3 fluorescens intensitet. SiRNA hva effektiviteten av PEI-SPIONs her (37,8 nm, 48 mV) var en tidligere studie med PEI-SPIONs med en gjennomsnittlig størrelse på 48 nm og et zeta potensial 30,5 mV18. (C) dette panelet viser en analyse av PEI-SPION/siRNA opptak ved å visualisere mobilnettet jern innskudd. RÅ 264.7 celler ble inkubert med 7.5, 15 og 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) kompleksbundet med siRNA (Fe: siRNA = 8) og farget av prøyssiske blå. Skala barer er 20 μm. (D) dette panelet viser en i vitro validering av silencing effektiviteten av siRNA levert av PEI-SPIONs. En bestemt siRNA målretting rotte IL-2 /-15 reseptor β kjeden var lastet inn PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) på Fe: siRNA = 8, og deretter transfekterte i rotte peritoneal makrofager. En NC-siRNA ble brukt som kontroll. Genet stanse effekten ble vurdert av kvantitative PCR. Cellene ble inkubert med komplekser på 15 μg Fe/mL. Dataene er gjennomsnittlig ± SD tre eksemplarer brønner. Panelet D har blitt endret fra Duan et al. 18 med tillatelse fra utgiveren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: I vivo mobilnettet opptak av PEI-SPION/siRNA NPs. Tre leddgikt rotter ble injisert intravenøst med enkeltdoser med 0,3 mg/kg Cy3-siRNA formulert med PEI-SPION (48 nm, 30,5 mV). Rotte injisert med PBS ble brukt som en kontroll. Blod, milt, lever, nyre og betent ledd ble samlet på 2, 8 eller 24 timer etter injeksjon. Mobilnettet opptaket av PEI-SPION/Cy3-siRNA NPs ble vurdert av flowcytometri (A) anti-CD3 og (B) anti-CD11b monoklonale antistoffer. Prosenter er Cy3-siRNA opptak i gated CD3 + eller CD11b + celler. Resultatene vises her er representant for to uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt endret fra Duan et al. 18 med tillatelse fra utgiveren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Makrofager er ildfaste til transfect av brukte nonviral tilnærminger, som electroporation, kationisk liposomer og lipid arter. Her beskrev vi en pålitelig og effektiv metode for å transfect makrofager med siRNA. Bruker stede protokollen, kan over 90% av macrophage som rå 264.7 celler (figur 2B) og rotten peritoneal makrofager18 være transfected med siRNA uten betydelig svekkelse av cellen levedyktighet. Denne metoden avhenger levering plattformen PEI-SPION, som er en nanocarrier består av en kjerne av jernoksid og et skall av PEI. Så er det første viktige skrittet av protokollen syntesen av PEI-SPIONs egnet for siRNA levering. Vanligvis er PEI-belagt SPIONs forberedt fra oljesyre-belagt SPIONs av en ligand-utveksling metode der oljesyre utveksles direkte fra overflaten av SPIONs av PEI eller dets derivater15, genererer hydrofile NPs med et positivt ladet overflaten. I tilfellet her, oljesyre avkortet på overflaten av SPIONs ble erstattet av vannløselige dimercaptosuccinic syre og deretter PEI var lastet inn SPION overflater gjennom elektrostatisk interaksjoner. Denne metoden er lett og enkel å tilberede i store mengder, og syntetisert NPs har utmerket stabilitet i vann20. Det er velkjent at PEI er cytotoksisk, og toksisitet korrelerer sterkt med sine molekylvekt21. For å sikre sikkerhet, er en viktig faktor når syntetisere PEI-SPIONs at disse partiklene er belagt med lav-molekylvekt PEI, som er 10 kDa i denne protokollen. Uønsket giftige effekten av PEI er hovedsakelig formidlet av den positive ladningen; Derfor måling av zeta potensialet i PEI-SPIONs er avgjørende, og verdien bør være ikke høyere enn 37 mV. En nedgang i positive ladningen kan oppnås bare ved å redusere PEI innholdet. En annen kritisk punkt for bruk av denne siRNA levering system er optimalisering av Fe: siRNA forholdet med gel retardasjon. Det synes rimelig å gjøre PEI-SPION/siRNA komplekser på lav Fe: siRNA forhold under hvilke siRNA molekyler er fortsatt i stand til binding til PEI-SPIONs. I denne forholdet, kan små mengder PEI-SPIONs brukes, og således minimere dens potensielle cytotoksisitet.

I tilfelle en ønsket stanse effektivitet eller terapeutisk effekt ikke er produsert, sjekke hva effektiviteten av flyt cytometri eller fluorescens mikroskopi med transportøren lastet med en fluorescently merket siRNA. Alternativt kan PEI-SPION/siRNA opptak undersøkes av konvensjonelle prøyssiske blå flekker, som er sensitive nok til å oppdage enkelt granulater av jern i celler. Hvis transfection effektiviteten er virkelig lav, kan det pålegges å optimalisere transfection forhold som cellen tetthet og hva tid dosen av PEI-SPION/siRNA partikler. Cellen passasje nummeret kan også påvirke effektiviteten av transfection22. I de fleste tilfeller skyldes en tilstrekkelig stanse effekten ikke en utilstrekkelig PEI-SPION/siRNA opptak, som PEI-SPION systemet har vist seg for å gjøre en effektiv siRNA overføring til makrofager. Noen ganger kan kan kombinere flere siRNAs rettet mot det samme genet være en god strategi for å forbedre knockdown effektivitet. Det er bemerkelsesverdig at selv om RNAi vanligvis oppstår innen 24 timer av transfection, starten og varigheten av genet stanse avhenger omløpshastighet av målet, frekvensen av fortynning og lang levetid på siRNA, og selv konsentrasjonen av serum i medium. Dermed tid kurs eksperimenter kan være nødvendig å nøyaktig fastslå tidspunktet maksimal effekt2,22. For in vivo application terapeutiske effekten avhenger også av om og i hvilken grad, siRNA målet bidrar til sykdom fenotyper; Dermed er valget av et riktig siRNA mål avgjørende for forventede resultater.

Det er flere fordeler med denne protokollen for å levere siRNA til makrofager. (1) metoden er enkel å utføre og er en billig måte å produsere PEI-SPIONs i store mengder, og NPs produsert er stabile i vann over 12 måneder hvis de blir holdt på 4 ° C. (2) spontan fagocytose av SPIONs av makrofager muliggjør en effektiv PEI-SPION-mediert siRNA overføring, noe som resulterer i høy transfection effektivitet. Det forventes at foruten rå 264.7 celler og rotten peritoneal makrofager, denne tilnærmingen er andre macrophage linjer og primære makrofager, så lenge dosen for hva er optimalisert. (3) siRNA hva er raskt og enkelt å gjennomføre sammenlignet med macrophage transfection som nucleofection, som er tidkrevende og krever en Nucleofector enhet2. (4) PEI-SPION kan være en ideell kjøretøy for macrophage målrettet systemiske siRNA levering i enkelte sykdom modeller. Makrofager spille viktige roller i utviklingen og progresjon av ulike kroniske inflammatoriske lidelser, samt svulster; og iøynefallende histologiske funksjon av disse sykdommene er unormale blodkar med lekk endotelet. Derfor økt permeabilitet og oppbevaring effekt, systemisk administrert narkotika-lastet NPs pleier å akkumuleres i sykt vev er lett fanget av lokale makrofager, fører til økt spesifisitet, redusert bivirkninger og forbedret terapeutiske effekten. I en rotte modell av adjuvant leddgikt, ble intravenøst injisert PEI-SPION/siRNA komplekser tatt av ~ 40% av CD11b + cellene under første 24 h etter injeksjon18. I kontrast, når kationisk liposome ble brukt som en bærer for systemisk siRNA levering i mus, fanget mindre enn 5% av CD11b + cellene i leddgikt leddene siRNA lipoplexes23. Videre takket være deres magnetiske egenskaper, kan bruk av en ekstern magnetfelt videre lette akkumulering av PEI-SPION/siRNA komplekser i målet vev og øke deres cellular opptak. Bemerkelsesverdig er at slike siRNA lastet NPs kan brukes ikke bare for modulerende macrophage funksjon, men også for bildebehandling macrophage for å gi diagnostisk informasjon, skjerm behandling effekt, og forutsi pasientens kliniske utfall12.

Det eksisterer imidlertid begrensninger forbundet med denne protokollen. PEI-SPION systemet viser en smal rekke dosering for siRNA levering. Maksimal opptaket oppstod når RAW264.7 celler ble utsatt til PEI - SPION/siRNAs i en konsentrasjon av 15 µg Fe/mL (figur 2B og 2 C). Økende PEI-SPION/siRNA konsentrasjonen til 32 µg Fe/mL ikke resulterte i en økning i mobilnettet opptak (figur 2C), men, tvert imot, kan øke risikoen for å indusere celledød på grunn av iboende toksisitet av PEI. På den annen side, redusert redusere PEI-SPION/siRNA til 5 eller 7,5 µg Fe/mL åpenbart sine opptak av RAW264.7 celler (figur 2B og 2 C). Derfor foreslår vi at optimal PEI-SPION/siRNA konsentrasjonen for i vitro macrophage hva er ~ 15 µg Fe/mL (siste konsentrasjonen på et godt). En annen begrensning som må tas i betraktning er mulig effekten av PEI-SPIONs på macrophage aktivitet. Nanopartikler kan indusere immun respons24, avhengig av overflaten modifisering, overflate kostnad, størrelse, form, og selv metodene som er brukt til å syntetisere dem. Mulens-arier et al. nylig rapportert at PEI-belagt SPIONs utløse macrophage aktivisering25. Metoden PEI-SPION syntese presenteres her er betydelig forskjellig fra Mulens-arier et al., og derfor om PEI-SPIONs utarbeidet basert på nåværende protokollen avtrekkeren macrophage aktivering venter ytterligere undersøkelse. Imidlertid å entydig møte denne bekymringen har vi foreslår at du, i tillegg til PEI-SPION kompleksbundet med scramble siRNA, selve kjøretøyet (bare PEI-SPION) kan tjene som en annen kontroll ved stede protokollen. Til slutt er denne protokollen ikke egnet for levering av DNA på grunn av den relativt store størrelsen.

I sammendraget presenterte vi her en måte å bruke PEI-belagt SPIONs som et redskap for siRNA transfection i makrofager. Disse NPs kan effektivt gi siRNA i udødelighet macrophage cellelinjer, samt i primære makrofager i vitro, og funksjonelt indusere genet stanse uten å påvirke celle levedyktighet på optimale dosen for hva. Videre PEI-SPIONs kan brukes i vivo siRNA levering til makrofager, gjør det mulig å bilde, som modulerer, makrofager som dysfunksjon bidrar til utvikling og progresjon av mange kroniske inflammatoriske lidelser og kreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (81772308) og National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China
for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11, (11), 723 (2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10, (3), e0118472 (2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52, (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23, (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2, (7), e1600224 (2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5, (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8, (2), 129 (2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7, (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13, (2), 125 (2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861, (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4, (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53, (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27, (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9, (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22, (22), 225703 (2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3, (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2, (1), 39 (2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116, (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151, (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics