Polyethyleneimine-belagt jernoxid nanopartikler som et køretøj til levering af små interfererende RNA til makrofager In Vitro og In Vivo

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en metode til at bruge polyethyleneimine (PEI)-belagt superparamagnetisk jernoxid nanopartikler til transfecting makrofager med siRNA. Disse nanopartikler kan effektivt levere siRNA til makrofager i in vitro og i vivo og stilhed target genekspression.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang, Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

På grund af deres vigtige rolle i regulering af immunrespons, makrofager har konstant været genstand for intensiv forskning og repræsenterer et lovende terapeutiske mål i mange lidelser, såsom autoimmune sygdomme, åreforkalkning og kræft. RNAi-medieret genhæmning er en værdifuld tilgang af valg for at undersøge og manipulere makrofag funktion; dog Transfektion af makrofager med siRNA er ofte anset for at være teknisk udfordrende, og på nuværende tidspunkt få metoder dedikeret siRNA overførsel til makrofager er tilgængelige. Vi præsenterer her, en protokol for at bruge polyethyleneimine-belagte superparamagnetisk jernoxid nanopartikler (PEI-SPIONs) som et redskab til målrettet levering af siRNA til makrofager. PEI-SPIONs er i stand til af bindende og helt kondenserende siRNA når Fe: siRNA vægtforhold når 4 og derover. In vitro, disse nanopartikler effektivt kan levere siRNA primære makrofager og til makrofag-lignende RAW 264.7 cellelinje, uden at kompromittere cellernes levedygtighed på den optimale dosis til Transfektion, og i sidste ende, de fremkalde siRNA-medieret target genhæmning. Bortset fra anvendes til in vitro- siRNA Transfektion, er PEI-SPIONs også et lovende redskab til at levere siRNA til makrofager i vivo. I betragtning af sin kombinerede funktioner af magnetiske ejendom og genhæmning evne forventes systemisk administreret PEI-SPION/siRNA partikler ikke kun at modulere makrofag funktion, men også at aktivere makrofager at blive afbildet og spores. I det væsentlige, PEI-SPIONs repræsenterer en enkel, sikker og effektiv nonviral platform for siRNA levering til makrofager både in vitro- og in vivo.

Introduction

Makrofager er en type af medfødte immun celler fordelt i alle kroppens væv, omend i forskellige mængder. Ved at producere en bred vifte af cytokiner og andre mæglere, spiller de vigtige roller i vært forsvaret mod invaderende mikrobielle patogener, væv reparation efter skade og opretholde væv homøostase1. På grund af deres betydning, har makrofager konstant været genstand for intensiv forskning. Men trods dens udbredelse i genregulering og funktion undersøgelser, siRNA-medieret genhæmning er mindre tilbøjelige til at lykkes i makrofager, fordi disse celler — især primære makrofager – er ofte vanskelige at transfect. Dette kan tilskrives en relativt høj grad af toksicitet forbundet med mest veletablerede Transfektion tilgange, hvor cellemembranen er kemisk (f.eks.med polymerer og lipider) eller fysisk (f.eks.af elektroporation og gen kanoner) afbrudt for at lade siRNA molekyler passere membranen, hvorved drastisk at reducere makrofager levedygtighed2,3. Derudover er makrofager dedikeret fagocytter rig på degradative enzymer. Disse enzymer kan skade integriteten af siRNA, svække dens silencing effektivitet selv om gen-specifikke siRNA har været leveret i celle3,4. Derfor, en effektiv makrofag-målrettet siRNA leveringssystemet skal beskytte integritet og stabilitet af siRNA under levering4.

Det bliver stadig mere tydeligt, at dysfunktionel makrofager er impliceret i indledningen og progression af visse fælles kliniske lidelser som autoimmune sygdomme, åreforkalkning og kræft. Derfor modulerende makrofag funktion med eksempelvis siRNA har været fremstår som en attraktiv metode til behandling af disse lidelser5,6,7. Selv om mange fremskridt, er en stor udfordring for siRNA-baseret behandlingsstrategi fattige celle specificiteten af systemisk administreret siRNA og utilstrækkelig siRNA optagelsen af makrofager, hvilket derfor føre til uønskede bivirkninger. Sammenlignet med gratis nukleinsyre therapeutics, der normalt mangler optimal celle-selektivitet og ofte føre til uønskede virkninger, medicin-loaded nanopartikler (NPs), på grund af deres spontane tilbøjelighed for at blive fanget af det Retikuloendoteliale system, off mål kan være udviklet til passiv målretning til makrofager i vivo, giver mulighed for forbedrede terapeutiske virkning med minimale bivirkninger8. Nuværende NPs undersøgt for levering af RNA molekyler omfatter uorganiske nanocarriers, forskellige Liposomer og polymerer9. Blandt dem viser polyethyleneimine (PEI), en type af kationiske polymerer i stand til at binde og kondenserende nukleinsyrer i stabiliseret NPs, den højeste RNA levere kapacitet9,10. PEI beskytter nukleinsyrer fra enzymatiske og nonenzymatic nedbrydning, formidler deres overførsel på tværs af cellemembranen og fremmer deres intracellulære frigivelse. Selvom oprindeligt indført som en DNA levering reagens, blev PEI efterfølgende påvist for at være en attraktiv platform for i vivo siRNA levering, enten lokalt eller systemisk9,10.

Superparamagnetisk jernoxid nanopartikler (SPIONs) har vist gode løfte i biomedicin, på grund af deres magnetiske egenskaber, biokompatibilitet, sammenlignelig størrelse til biologisk vigtige objekter, høj overflade-areal-til-volumen forhold, og let at tilpasse overflade for bioagent vedhæftet fil11. For eksempel, på grund af deres potentielle nytteværdi som et kontraststof og hurtig udbredelse af makrofager, SPIONs er dukket op som en favorit klinisk værktøj til billede væv makrofager12. Mens SPIONs har også blevet grundigt undersøgt som nukleinsyre levering køretøjer11,13,14,15, at vores viden, indeholder litteraturen få rapporter om SPIONs som transportør for makrofag-målrettet siRNA levering. Gen levering af SPIONs, er deres overflade normalt belagt med et lag af hydrofile kationiske polymerer som negativt ladede nukleinsyrer kan elektrostatisk tiltrukket og tøjret. Vi præsenterer her, en metode til at syntetisere SPIONs hvis overflade er modificeret med lav molekylvægt (10 kDa), forgrenede PEI (PEI-SPIONs). Disse magnetiske nanoplatforms er derefter ansat til at kondensere siRNA, danner PEI-SPION/siRNA komplekser, der aktiverer siRNA transport ind i cellen. Vi grund at spontane fagocytose af SPIONs af celler i Retikuloendoteliale system16, kombineret med den stærke evne af bindende og kondenserende nukleinsyrer ved PEI, gengiver PEI-SPIONs egnet til effektiv transport af siRNA ind makrofager. De data præsenteres her støtte gennemførligheden af PEI-SPION/siRNA-medieret genhæmning i makrofager i kultur samt in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder der involverer levende dyr blev udført i overensstemmelse med dyrets pleje og bruge retningslinjerne fra sydøst University, Kina.

1. forberedelse af PEI-SPIONs

  1. Forberedelse af oliesyre-modificerede SPIONs
    1. Opløs FeCl3•6H2O og FeSO4•7H2O i vand under beskyttelse af N2.
      1. Tilføje 28 g FeCl3•6H,2O- og 20 g FeSO4•7H,2O i 80 mL deioniseret vand i et bægerglas. Hældes vandet gennem et glas conduit N2 og rør indtil den faste stoffer er opløst.
      2. Varme reaktionsblandingen til mindst 72 ° C med en omrøring hastighed på 800 rpm, efterfulgt af tilsætning af 40 mL ammoniak vand (28%). Omrøres i 5 min.
    2. Tilføj 9 mL af oliesyre dråbevis i den ovennævnte løsning og rør det ved 72 ° C til 3 h.
    3. Cool den resulterende løsning ved stuetemperatur (RT). Bundfald løsning via magnetisk separation.
    4. Bundfaldet, der indeholder SPIONs 3 x med absolut ethanol og derefter sprede bundfaldet i 100 mL N-hexan.
  2. Forberedelse af dimercaptosuccinic syre-modificerede SPIONs
    1. Tilføje 800 mg af oliesyre (OA)-modificeret SPIONs spredt i 200 mL N-hexan, og 400 mg af dimercaptosuccinic syre (DMSA) spredt i 200 mL acetone, i en tre-hals kolben i et vandbad ved 60 ° C.
      Bemærk: For at bestemme koncentrationen af OA-modificerede SPION fra det forrige trin, tage en lille mængde (fx 1 mL) af SPION dispersion, flygtiggøres N-hexan og vejer den resulterende pulver.
    2. Tilføje 200 µL af triethylamin dråbevis i den ovennævnte løsning med omrøring ved 1000 rpm og refluxerende.
    3. Efter 5 h omrøring og refluxerende, få en sort bundfald af magnetisk separation.
    4. Sprede de hydrofile SPIONs i ionbyttet vand administrationsprocedurerne ved at justere pH af løsningen ved hjælp af tetramethylammonium hydroxid.
  3. Forberedelse af PEI-SPIONs
    1. Tilføje DMSA-modificerede SPION kolloid opløsning dråbevis i PEI løsning (10 kDa) i en 500 mL tre-hals kolbe under mekanisk omrøring ved 1000 rpm for 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Bemærk: Beregning og størrelse af PEI-SPIONs afhænger af forholdet mellem WFe til WPEI. WFe: WPEI forholdet 1:3 kan være et godt udgangspunkt for syntese af PEI-SPIONs egnet til siRNA levering.
    2. Tilføj den deraf følgende løsning i en ultrafiltrering rør har en molekylvægt cutoff af 100 kDa og et indhold af 15 mL; derefter centrifugeres ved 5.400 x g i 10 min indtil de resterende løsning er 1 mL. Der tilsættes deioniseret vand til løsningen at gøre bind 15 mL igen og Gentag ovenstående proces 10 x for at opnå det endelige produkt. Derefter Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm filter og gemme det endelige produkt ved 4 ° C.
    3. Bestemme Fe koncentrationen af PEI-SPIONs af den kolorimetriske metode ved hjælp af phenanthroline17. Fortynd PEI-SPIONs med deioniseret sterilt vand til en koncentration på 1 mg Fe/mL og opbevares ved 4 ° C.
    4. Fortyndet 10 μL af PEI-SPION løsning (1 mg Fe/mL) til 1 mL med deioniseret vand; Afprøv derefter sin hydrodynamiske størrelse og zeta potentiale af en dynamisk lys-spredning enhed.
      Bemærk: Forberede PEI-SPIONs i rækken af omkring 30-50 nm. I denne størrelsesområde synes effekten af NP størrelse på siRNA bindende og cellulære optagelse ikke at være betydelig. PEI-SPIONs forsynet med en gennemsnitlig zeta potentiale over +37 mV kan være giftige i dosis-intervallet Transfektion, og en cytotoksicitet assay bør udføres for at sikre sikkerheden. Overflade afgift og Hydrodynamisk størrelse af nanopartikler kan kontrolleres inden for en ønskede interval ved at justere PEI indhold.

2. forberedelse og Agarosen gelelektroforese af PEI-SPION/siRNA NPs

  1. Fortyndet siRNA med RNase-fri vand til at give en endelig koncentration på 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Udarbejde fem RNase-fri microcentrifuge rør mærket 0, 1, 2, 4 og 8. Etiketter repræsenterer forskellige Fe: siRNA vægt nøgletal. Med pipette overfoeres 3 μL af siRNA løsning til alle rør (~0.8 μg siRNA/rør).
  3. Tilføje 0, 0,8, 1.6, 3.2, og 6,4 μg af Fe i form af PEI-SPIONs til rør mærket 0, 1, 2, 4 og 8, henholdsvis. Holde den samlede prøve volumen af hver tube mindre end 20 μL. Bland forsigtigt når der afpipetteres op og ned.
  4. Inkuber blandinger på RT for 30 min til at tillade PEI-SPION/siRNA kompleks dannelse. I denne periode, foretage en 3% Agarosen gel med høj renhed agarosegelelektroforese.
    Bemærk: Yderligere PEI-SPION/siRNA komplekser med andre Fe: siRNA nøgletal (f.eks.5 eller 6) kan være udarbejdet og testet.
  5. Tilsæt 1 μL af 6 x DNA-loading bufferen pr. 5-μL prøve og bland forsigtigt. Indlæse alle prøver og køre elektroforese på 5 V/cm indtil bromophenol blå trækker så langt som to tredjedele af længden af gelen. Pletten gel med ethidiumbromid (EB) til 15-20 min.
    Bemærk: Frisklavede elektroforese buffer og EB løsning bør anvendes.
  6. Visualisere siRNA bands under en UV-imaging system. Kontrollere Fe: siRNA nøgletal på hvilke siRNA former komplekser med PEI-SPIONs, og som et resultat, de bands, der repræsenterer gratis siRNA er retarderede eller ikke kan påvises.

3. Transfektion af RAW264.7 makrofager In Vitro

  1. Kultur mus makrofag-lignende RAW264.7 celler i en 10-cm parabol ved hjælp af DMEM komplet medium indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) pr. 100 U/mL penicillin per 100 μg/mL streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  2. En dag før Transfektion, Aspirér medium fra cellerne og skyl dem med fosfatbufferet saltopløsning (pH 7,4). Der tilsættes 1 mL af 0,25% trypsin til 10 cm parabol. Trypsinize RAW264.7 celler for ca 5-10 min ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  3. Når hovedparten af cellerne har løsrevet (efter 5-10 min), tilsættes 5 mL af DMEM komplet medium til fadet til at inaktivere trypsin. Med pipette overfoeres op og ned for at sprede celle klynger i enkelte celler.
  4. Overføre cellesuspension til en steril 15 mL konisk slange. Centrifugeres det ved 300 x g i 3 min på RT. Fjern supernatanten.
  5. Resuspend celler med 5 mL frisk DMEM komplet medium og tælle cellerne.
  6. Plade 9 x 104 celler pr godt i en 6-godt plade med 2 mL af komplet DMEM medium og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 rugemaskine til ca 24 h.
    Bemærk: Hvis du bruger en plade af en anden størrelse, Juster forgyldt celle tæthed i forhold til den relative areal således at cellerne nå 80% confluency på tidspunktet for Transfektion.
  7. Når cellen confluency er 80%, fjerne medium fra celler og erstatte det med 1 mL af DMEM komplet medium pr. brønd. Returnere pladen til rugemaskine, indtil PEI-SPION/siRNA komplekser har udarbejdet og er klar til brug (ca. 30 min).
  8. Forberede PEI-SPION/siRNA komplekser: beregning af PEI-SPION/siRNA komplekser behov for en Transfektion eksperiment. I en 1,5 mL RNase-fri microcentrifuge rør, bland en passende mængde af PEI-SPIONs med siRNA på en given Fe: siRNA ratio. For eksempel for at forberede PEI-SPION/siRNA NPs indeholdende 100 µg af Fe i Fe: siRNA forholdet 4, Tilsæt 100 µL (1 mg Fe/mL) af PEI-SPIONs til 96 μL af siRNA (0,26 μg/μL), efterfulgt af blande det forsigtigt med en mikropipette. Inkuber i 30 min. ved RT.
    Bemærk: Forberede et volumen af PEI-SPION/siRNA kompleks, der er 10% mere end den samlede endelige masse at tage højde for eventuelle HÆNDELIGE tab. Gøre PEI-SPION/siRNA komplekser på lav Fe: siRNA nøgletal, hvorunder siRNA molekyler er helt læsset på PEI-SPIONs og, derfor, små mængder af PEI-SPIONs kan bruges til at minimere potentielle cytotoksicitet. Pilotforsøg (gel retardering assay) for optimering af Fe: siRNA-forholdet er nødvendige.
  9. Tag 6-godt plade fra inkubator (trin 3.7). Tilføje en påkrævet volumen af PEI-SPION/siRNA kompleks dråbevis til hver brønd og slyng plade forsigtigt for at sikre en jævn fordeling. Returnere pladen til rugemaskine indtil vurderingen af den cellulære optagelse eller gen knockdown effektivitet (1-3 d).
    Bemærk: Transfecting makrofager med PEI-SPION/siRNA ved en koncentration på ~ 15 μg Fe/mL kan maksimere Transfektion effektivitet og minimere potentielle cytotoksicitet.

4. systemisk levering af siRNA til makrofager i rotter med eksperimentelle gigt

  1. Få specifikt patogenfrie mandlige Wistar rotter, der er 7 uger gammel. Habituate rotter for 7 d inden brug og forsyne dem med tilstrækkelig mad og vand. Fremkalde adjuverende arthritis (AA) i rotter som tidligere beskrevet18.
  2. Forberede PEI-SPION/siRNA komplekser som beskrevet i trin 3.8.
  3. Indsprøjtes PEI-SPION/siRNA NPs (0,3 mg siRNA/kg) i AA rotter via hale vene. Vurdere den cellulære optagelse via, for eksempel, flowcytometri, væv biodistribution via, for eksempel, en real-time fluorescens imaging system, eller terapeutiske virkninger baseret på, for eksempel, klinisk, histologisk og Radiografisk analyser på ønskede tid peger18.
    Bemærk: For cellulære og væv biodistribution undersøgelser, behandling af rotter med en enkelt injektion af de ønskede NPs; til terapeutiske undersøgelser, injicere rotter med de nationale parlamenter skal testet 1 x om ugen i tre på hinanden følgende uger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Størrelse og zeta potentiale af PEI-SPIONs tilberedt med denne protokol var indenfor rækkevidde af 29-48 nm (polydispersity indeks: 0,12 - 0,23) og 30-48 mV, henholdsvis. De var stabile i vand ved 4 ° C for over 12 måneder uden indlysende sammenlægning. For at vurdere deres siRNA bindende evne, blev PEI-SPIONs blandet med siRNA på forskellige Fe: siRNA vægt nøgletal. Figur 1 viser, at når Fe: siRNA vægtforhold når 4 og derover, bandet af gratis siRNA helt mangler, hvilket indebærer vellykket siRNA binding til PEI-SPIONs. En stor bekymring i PEI i biomedicinsk program er dets toksicitet, som er et resultat af den stærke positiv ladning, især ved høj Molekylær vægt og høje doser. Som vist i figur 2A, PEI-SPIONs med en zeta potentiale af 30,5 og 37 mV ikke udviser synlige cytotoksicitet ved koncentrationer op til 30 μg Fe/mL, hvilket er omkring dobbelt højere end koncentrationen (15 μg Fe/mL) bruges normalt til celle Transfektion. Dog PEI-SPIONs med en zeta potentiale af 48 mV var giftig selv ved den laveste dosis undersøgt (10 μg Fe/mL). Derfor, PEI-SPIONs besidder en afgift-afhængige toksicitet. Da kationiske afgift ikke er vigtigt for NP optagelsen af makrofager19, vi foreslår at PEI-SPIONs med en gennemsnitlig zeta potentiale ikke højere end +37 mV bruges til siRNA overførslen, selvom siRNA bindende ville mindske afgiften til et vist omfang og afhjælpe cytotoksicitet18.

For at teste den potentielle anvendelse af PEI-SPIONs siRNA leveres til makrofager, blev in vitro- Transfektion udført med murine makrofager cellelinie RAW 264.7. Som analyseres ved flowcytometri, blev mere end 90% af celler transfekteret med fluorescently mærket PEI-SPION/siRNA komplekser på 15 µg Fe/mL (figur 2B). Med hensyn til Transfektion effektivitet var der faktisk ingen forskel mellem PEI-SPION/siRNA NPs dannet på Fe: siRNA vægt forhold mellem 4 og 8, selv om den sidstnævnte betingelse, de nationale parlamenter, der blev dannet var mindre i størrelse og svagere i positiv ladning fordi en mindre mængde af siRNA blev indlæst pr partikel. Vi vurderede også effekten af PEI-SPION/siRNA koncentration på cellulære internalisering af preussiske blå farvning. Som vist i figur 2 c, var de blå steder inden for de transfected celler minimalt påviselige på 7,5 µg Fe/mL, men klart synlig på 15 µg Fe/mL. Interessant, steg øger PEI-SPION/siRNA koncentrationen til 32 µg Fe/mL ikke de farvning intensiteter, sandsynligvis fordi PEI-SPION/siRNA optagelsen var mættet ved koncentrationer omkring 15 µg Fe/mL. Derudover PEI-SPIONs evne til mægle siRNA overførsel blev bekræftet i primære makrofager18, og den metode, der præsenteres her havde en høj siRNA Transfektion effektivitet i rotte peritoneal makrofager, svarende til det i RAW264.7 celler. De peritoneale makrofager transfekteret med PEI-SPIONs husly specifikke siRNA viste en betydelig nedgang i target mRNA niveau sammenlignet med uspecifikke siRNA (figur 2D), hvilket indebærer, at siRNA kunne flygte fra endocytose vesikler i de cytoplasma og reach RNAi-maskiner.

Vi har tidligere også undersøgt i vivo cellulære optagelse af systemisk administreret PEI-SPION/siRNA komplekser i rotter med adjuverende gigt18. Vi analyserede PEI-SPION/siRNA Transfektion effektivitet i fagocyterende makrofager og nonphagocytic T-lymfocytter. Som vist i figur 3, tog CD11b + celler op PEI-SPION/siRNA komplekser mere effektivt end CD3 + celler på ethvert tidspunkt i alle organer undersøgt, der angiver, at PEI-SPION/siRNA NPs fortrinsvis målrette makrofager18. Især, blev en højtstående ophobning af de nationale parlamenter observeret i betændte led18, tyder på, at PEI-SPION kan være en attraktiv platform for systemisk levering af siRNA therapeutics i reumatoid arthritis hvis patogenesen er knyttet til makrofag dysfunktion, og for hvilke lokale siRNA administration er ikke en favorit valg på grund af inddragelse af flere organer af sygdommen.

Figure 1
Figur 1: Agarosen gelelektroforese af PEI-SPION/siRNA komplekser dannet på forskellige Fe: siRNA (w/w) nøgletal. En Fe: siRNA forholdet mellem 0 repræsenterer gratis siRNA dobbelthuse uden PEI-SPIONS. Den gennemsnitlige størrelse og zeta potentiale af de gratis PEI-SPIONs bruges her var 30 nm og 45 mV. siRNA kunne helt binder sig til PEI-SPIONs når Fe: siRNA forholdet når 4 og derover, i overensstemmelse med de tidligere resultater ved hjælp af PEI-SPIONs med en gennemsnitlig størrelse i 48 nm og zeta potentiale 30,5 mV18. Fravær af retarderede bands (PEI-SPION/siRNA komplekser) kan afspejle utilgængelighed af siRNA til EB under farvningen, en indikation af stærke siRNA bindende, og/eller kondenserende evnen af PEI-SPIONs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: biologiske karakterisering af PEI-SPION og PEI-SPION/siRNA NPs. (A) dette panel viser en celle levedygtighed assay. RAW 264.7 celler blev behandlet for 16 h med de angivne doser af PEI-SPIONs forsynet med forskellige zeta potentiale, og derefter en MTS analyse blev udført. Cellernes levedygtighed var normaliseret mod kontrol (ingen partikel eksponering). Dataene er i gennemsnit ± SD dublerede brønde. (B) dette panel viser en flow cytometric analyse af PEI-SPION/Cy3-siRNA optagelsen af RAW 264.7 celler. Cellerne var inkuberes i 24 timer med 15 µg Fe/mL (øverste panel) eller 5 μg Fe/mL (nederste panel) af PEI-SPIONs kompleksbundet med Cy3-mærket siRNA på en Fe: siRNA (w/w) forholdet mellem 4 og 8, henholdsvis. Uspecifik (NC) siRNA repræsenterer ikke-fluorescerende siRNA. M2: gated region; PE-H: Cy3 fluorescens intensitet. SiRNA Transfektion effektivitet af PEI-SPIONs bruges her (37,8 nm, 48 mV) svarede til en tidligere undersøgelse ved hjælp af PEI-SPIONs med en gennemsnitlig størrelse i 48 nm og zeta potentiale 30,5 mV18. (C) dette panel viser en analyse af PEI-SPION/siRNA optagelse ved at visualisere cellulære jern indskud. RAW 264.7 celler blev inkuberet med 7,5, 15 og 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) kompleksbundet med siRNA (Fe: siRNA = 8) og plettet af preussiske blue. Skala barer er 20 μm. (D) dette panel viser en in vitro- validering af siRNA leveret af PEI-SPIONs silencing effektivitet. En specifik siRNA-targeting rotte IL-2 /-15 receptor β kæde blev læsset på PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) på Fe: siRNA = 8, og derefter transfekteret til rotte peritoneal makrofager. En NC siRNA blev brugt som kontrol. Genhæmning effekt blev vurderet af kvantitativ PCR. Cellerne blev inkuberet med komplekser på 15 μg Fe/mL. Dataene er i gennemsnit ± SD tredobbelt brønde. Panelet D er blevet ændret fra Duan et al. 18 med tilladelse fra udgiveren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: In vivo cellulære optagelse af PEI-SPION/siRNA NPs. Tre arthritic rotter blev injiceres intravenøst med en enkelt dosis på 0,3 mg/kg Cy3-siRNA formuleret med PEI-SPION (48 nm, 30,5 mV). En rotte injiceres med PBS blev brugt som et kontrolelement. Blod, milt, lever, nyre og betændte led blev indsamlet på 2, 8 og 24 timer efter injektionen. Den cellulære optagelse af PEI-SPION/Cy3-siRNA NPs blev vurderet ved flowcytometri ved hjælp af (A) anti-CD3 og (B) anti-CD11b monoklonale antistoffer. Procenterne er af Cy3-siRNA udbredelse inden for gated CD3 + eller CD11b + celler. Resultaterne vist her er repræsentant for to uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret fra Duan et al. 18 med tilladelse fra udgiveren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Makrofager er refraktære over for transfect af almindeligt anvendte nonviral tilgange, såsom elektroporation, kationiske Liposomer og lipid arter. Her beskrev vi en pålidelig og effektiv metode til at transfect makrofager med siRNA. Ved hjælp af denne protokol, kan over 90% af makrofag-lignende RAW 264.7 celler (figur 2B) og rotte peritoneal makrofager18 være transfekteret med siRNA uden væsentlig forringelse af cellernes levedygtighed. Denne metode afhænger leveringsplatform PEI-SPION, som er en nanocarrier bestående af en kerne af jern oxid og en skallen af PEI. Så er det første vigtige skridt i protokollen syntesen af PEI-SPIONs egnet til siRNA levering. Normalt, er PEI-belagt SPIONs udarbejdet fra oliesyre-belagt SPIONs af en ligand-exchange metode hvor udveksles oliesyre direkte fra overfladen af SPIONs af PEI eller dets derivater15, generere hydrofile NPs med et positivt ladede overflade. I sagen forelagt her, oliesyre udjævnede på overfladen af SPIONs blev erstattet af vandopløselige dimercaptosuccinic syre og derefter PEI blev læsset på SPION overflader gennem elektrostatisk interaktioner. Denne metode er blid og nem at tilberede i store mængder, og de syntetiserede NPs har fremragende stabilitet i vand20. Det er velkendt at PEI er cytotoksiske, og toksicitet korrelerer stærkt med dens molekylvægt21. For at sikre sikkerheden, er en vigtig overvejelse når syntese PEI-SPIONs, at disse partikler er belagt med lav molekylvægt PEI, som er 10 kDa i denne protokol. Den uønskede toksiske effekt af PEI er overvejende medieret af dens positiv ladning; Derfor, måling af PEI-SPIONs zeta potentiale er afgørende, og værdien bør ikke være højere end 37 mV. Et fald i positiv ladning kan opnås blot ved at reducere PEI indhold. En anden kritisk trin til vellykket anvendelse af denne siRNA levering system er optimering af Fe: siRNA forholdet af gel retardering. Det forekommer rimeligt at gøre PEI-SPION/siRNA komplekser på lav Fe: siRNA nøgletal under hvilke siRNA molekyler er stadig i stand til at binde sig til PEI-SPIONs. I denne omstændighed, kan små mængder af PEI-SPIONs bruges, hvilket minimerer sine potentielle cytotoksicitet.

I tilfælde af en ønskede silencing effektivitet eller terapeutiske effekt ikke er produceret, kontrollere Transfektion effektivitet ved flow flowcytometri eller Fluorescens mikroskopi ved hjælp af luftfartsselskabet lastet med en fluorescently mærket siRNA. PEI-SPION/siRNA optagelsen kan alternativt undersøges af konventionelle preussiske blå farvning, som er følsom nok til at opdage enkelt granulat af jern i celler. Hvis Transfektion effektivitet er virkelig lav, kan det være forpligtet til at optimere Transfektion betingelser såsom celle tæthed, Transfektion tid og dosis af PEI-SPION/siRNA partikler. Celle passage nummer kan også påvirke effektiviteten af Transfektion22. I de fleste tilfælde, er en utilstrækkelig silencing effekt ikke forårsaget af en utilstrækkelig PEI-SPION/siRNA optagelse, som den nuværende PEI-SPION system er blevet påvist for at lette en effektiv siRNA overførsel til makrofager. Nogle gange, kan kombinere flere siRNAs rettet mod det samme gen være en god strategi til at forbedre knockdown effektivitet. Det er bemærkelsesværdigt, at selv om RNAi generelt opstår inden for 24 timer af Transfektion, indtræden og varighed af genhæmning afhænge af omsætningshastighed af målet, den fortynding og levetiden af siRNA og selv koncentration af serum i mediet. Således tid kursus eksperimenter kan være nødvendigt at bestemme præcist tidspunkt for maksimal effekt2,22. For in vivo application den terapeutiske virkning også afhænger af, om og i hvilket omfang siRNA målet bidrager til sygdom fænotyper; valget af en passende siRNA mål er således afgørende for forventede resultater.

Der er flere fordele ved denne protokol til at levere siRNA til makrofager. (1) metoden er nem at udføre og er en billig måde at producere PEI-SPIONs i store mængder, og NPs produceret er stabile i vand til over 12 måneder, hvis de opbevares ved 4 ° C. (2) spontan fagocytose af SPIONs af makrofager letter en effektiv PEI-SPION-medieret siRNA overførsel, hvilket resulterer i høje Transfektion effektivitet. Det forventes, at udover RAW 264.7 celler og rotte peritoneal makrofager, denne tilgang kan anvendes til andre makrofag cellelinjer og primære makrofager, så længe dosis for Transfektion er optimeret. (3) siRNA Transfektion er hurtigt og nemt at foretage sammenlignet med andre makrofag Transfektion metoder såsom nucleofection, som er tidskrævende og kræver en Nucleofector enhed2. (4) PEI-SPION kan være et ideelt køretøj for makrofag-målrettet systemisk siRNA levering i visse sygdomsmodeller. Makrofager spiller en kritisk rolle i udvikling og progression af forskellige kroniske inflammatoriske lidelser såvel som tumorer; og en iøjnefaldende histologiske funktion af disse sygdomme er de unormale blodkar med utætte endotelet. Derfor, på grund af øget permeabilitet og tilbageholdelse af systemisk administreret stof-loaded NPs tendens til at ophobe sig i syge væv er let fanget af lokale makrofager, fører til øget specificitet, reduceret bivirkninger og forbedret terapeutisk virkning. I en rotte model af adjuverende arthritis, var intravenøst indplantede PEI-SPION/siRNA komplekser taget op af ~ 40% af CD11b + celler under de første 24 timer efter injektion18. Derimod når kationiske Liposom var anvendes som bærestof for systemisk siRNA levering i mus, indesluttet mindre end 5% af CD11b +-cellerne i gigt leddene siRNA lipoplexes23. Desuden, på grund af deres magnetiske egenskaber, anvendelse af et ydre magnetfelt kan yderligere lette akkumuleringen af PEI-SPION/siRNA komplekser i målvæv og øge deres cellulære optagelse. Også er bemærkelsesværdig, at sådanne siRNA-loaded NPs kan bruges ikke blot for modulerende makrofag funktion, men også for billedbehandling makrofag om diagnostiske oplysninger, overvåge behandlingen effektivitet, og forudsige patienternes kliniske resultater12.

Dog findes begrænsninger i forbindelse med denne protokol. PEI-SPION system udstiller en smal vifte af dosering for siRNA levering. Den maksimale udbredelse opstod når RAW264.7 celler blev udsat til PEI - SPION/siRNAs i en koncentration på 15 µg Fe/mL (figur 2B og 2 C). Øger PEI-SPION/siRNA koncentrationen til 32 µg Fe/mL ikke resultere i en stigning i cellulær optagelse (figur 2 c), men tværtimod kan øge risikoen for inducerende celledød på grund af den iboende toksicitet af PEI. På den anden side nedsættes faldende PEI-SPION/siRNA til 5 eller 7,5 µg Fe/mL naturligvis dens optagelse af RAW264.7 celler (figur 2B og 2 C). Vi foreslår således, at den optimale PEI-SPION/siRNA koncentration af in vitro- makrofag Transfektion er ~ 15 µg Fe/mL (den endelige koncentration i en brønd). En anden begrænsning, der skal tages i betragtning er den mulige virkning af PEI-SPIONs på makrofag aktivitet. Nanopartikler kan fremkalde immunrespons24, afhængigt af deres overflade modifikation, overflade charge, størrelse, form, og selv om den metode, der bruges til at syntetisere dem. Mulens-arier et al. har for nylig rapporteret, at PEI-belagt SPIONs udløse makrofag aktivering25. Metoden af PEI-SPION syntese præsenteret her adskiller sig væsentligt fra Mulens-arier et al., og derfor, om PEI-SPIONs rede baseret på den nuværende protokol udløser makrofag aktivering venter yderligere undersøgelse. Men for at utvetydigt imødegå denne bekymring, vi foreslår, at ud over PEI-SPION kompleksbundet med scramble siRNA, selve køretøjet (kun PEI-SPION) kan tjene som et andet kontrolelement, når du bruger denne protokol. Endelig, denne protokol er ikke egnet til levering af DNA på grund af sin relativt store størrelse.

Sammenfattende præsenteres vi her en metode til at bruge PEI-belagt SPIONs som et middel til at siRNA Transfektion i makrofager. Disse nationale parlamenter kan effektivt levere siRNA udødeliggjort makrofag cellelinjer og i primær makrofager i vitroog funktionelt fremkalde genhæmning uden at det påvirker cellernes levedygtighed på den optimale dosis til Transfektion. Derudover PEI-SPIONs kan bruges til i vivo siRNA levering til makrofager, hvilket gør det muligt at billedet, samt modulere, makrofager hvis dysfunktion bidrager til udvikling og progression af mange kronisk inflammatoriske lidelser og kræftformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81772308) og nationale nøglen forskning og udvikling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China
for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11, (11), 723 (2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10, (3), e0118472 (2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52, (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23, (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2, (7), e1600224 (2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5, (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8, (2), 129 (2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7, (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13, (2), 125 (2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861, (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4, (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53, (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27, (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9, (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22, (22), 225703 (2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3, (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2, (1), 39 (2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116, (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151, (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics